Summary
כאן, אנו מציגים חמצן הדרגתי ektacy, שיטה מהירה ומחודשת כדי למדוד דם אדום דפורמביליות בדגימות מחולים עם מחלת המגל תאים תחת הדלקת החמצן מבוקרת והחמצון. טכניקה זו מספקת דרך ללמוד את תא הדם האדום מחליא ולפקח על יעילות הטיפול במחלות תאים.
Abstract
ב מחלת התא מגל (SCD), מוטציה בנקודה אחת בקידוד הגן עבור בטא-המוגלובין גורם לייצור של ההמוגלובין נורמלי S (HbS). כאשר הדחמצן, HbS יכול לפולימו, ויצרו מוטות נוקשה של המוגלובין, וכתוצאה מכך הבחילה של כדוריות הדם האדומות (RBCs). RBCs מחליא אלה הפחיתו באופן משמעותי deformability, גורם vaso-הסגר, אשר מוביל רבות SCD הקשורות לסיבוכים קליניים, כולל כאב, שבץ, ונזק איברים. הפחתת היכולת של RBC מופחתת גם על ידי התייבשות RBC, וכתוצאה מכך תאי דם אדומים צפופים כי נוטים יותר למגל. עד כה, אין שיטת יחיד זמין, מהירה, וממעבדה הניתנת לחיזוי מסוגל לחזות את חומרת המחלה או ניטור ישיר של אפקטי הטיפול עבור הרומן, הלא עוברי המוגלובין לטיפולים. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול למדוד rbc דפורמביליות כפונקציה של פו2 המאפשר כימות של התנהגות מבחילה בחולים scd. החמצן הדרגתי מודד מדדים RBC deformability, המבוטא כמדד התארכות (EI), כפונקציה של פו2. RBCs חשופים למתח הטיה קבוע של 30 אבא במהלך סיבוב אחד של החמצון והחמצון. שישה פרמטרים לבדיקה מיוצרים. מתוך אלה, הנקודה של מחליא (PoS), מוגדר כ-pO2 שבו ei מקסימום (eimax) מראה 5% ירידה, ומינימום ei במהלך deחמצון(ei)הם אינפורמטיביים ביותר, המשקף את הפו האדם של החולה2 שבו והיעדר מחלות מינימליות של כדוריות הדם האדומות של המטופל, בהתאמה. PoS קשורה לזיקה המוגלובין של מטופל יחיד עבור חמצן, ואילו EImin מראה מתאם חזק עם רמות המוגלובין העובר. אנו מסיקים כי מעבר חמצן ektacy, הוא טכניקה מבטיחה לפקח על הטיפול בחולים עם SCD, כמו בסמנים עבור סוכני אנטי מחליא בניסויים קליניים, טרום קלינית, וכלי חשוב ללמוד התנהגות מבחילה של RBCs מ אנשים עם תכונות SCD ותאים מגל.
Introduction
ב SCD, נקודה אחת מוטציה תוצאות הייצור של HbS, אשר יכול לפולימד על הדגנציה. HbS פילמור גורמת לבחילה של RBCs ומפחית RBC deformability. השילוב של RBC מחליא ודבקות RBC האנדותל מוביל לסיבוכים SCD שונים, כולל vaso-משברים הסגר (VOC), שבץ, נזק איברים, ואנמיה המוליטית כרונית. אפילו בתנאים normoxic, rbc דפורמביליות הוא נפרץ בחולים עם scd. הדיפורביליות נמוכה יותר בריכוזי חמצן נמוכים. שחקני מפתח הקובעים את הדפורמביליות בנורמוסיה הם תאים צפופים, תאים בעלי הפיכה מבחילה (isc), ותאים יבשים, שכולם בעלי יחס משטח לנפח מופחת1,2,3.
Ektacyמנסה היא שיטה הוקמה למדוד RBC deformability, בשימוש נרחב לאבחנה של אנסיאס המוליטית תורשתית, במיוחד membranopathies4. זה יכול לשמש גם כדי ללמוד hemorheology5,6,7,8,9. אוסמוטי הדרגתי ektacy try, שבו rbc דפורמביליות נמדד במהלך שינוי מתמשך ב osmolality, שימש ללמוד scd במשך עשורעשר,11. אחוז המוגלובין העובר (HbF) הוא אחד החזקים מעכבי של Hbf פולימור כי לא HbF ולא היברידית מעורבת שלה (∝ 2βSγ) יכול להיכנס לשלב הפולימר deoxyHbS12. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי הגדלת רמות hbf בחולים scd מוביל ליחס משטח טוב יותר לנפח, ובכך לשפר את מצב המים, ובכך את דפורמביליות בחולים שאינם התמזגו11.
Rbc דפורמביליות נחקרו בעבר כמו סמנים עבור סיבוכים scd, אבל עם תוצאות סותרות. במחקרים המבוצעים באמצעות הצלבה ובמצב יציב, אנשים עם רמות גבוהות יותר של rbc דפורמביליות נמצאו שכיחות גבוהה יותר של אוסטאופהרופזיס ועוד משברים כאב13,14,15. בניגוד לממצאים אלה, בהשוואה לערכי המצב הקבוע במהלך VOC חריפה, rbc דפורמביליות ירד במחקרים האורך בתוך אותם אנשים16. פער זה עשוי להיות תוצאה של לימוד RFORMABILITY בתנאים שונים (כלומר, במהלך המצב הקבוע לעומת VOC). האחוז של התאים מחליא הוא גבוה בתחילת VOC והתאים נהרסים במהירות כמו המשבר מתקדם, אשר עשוי להסביר את ההבדל בין המצב היציב החוצה המדינה מקרה נתונים ונתונים האורך המתקבל במהלך VOC. עם זאת, גורמים אחרים, כגון דבקות של אוכלוסיות משנה RBC למשטח האנדותל, עשויים גם להיות חשובים בהתרחשות של VOC. ב scd, זה רלוונטי יותר קלינית כדי למדוד את דפורמביליות במהלך החמצון, כי vaso-הסגר בדרך כלל מתרחשת בארוי postcapillary והוא לא ברשת פחות ארוי מיקרוקפילר17. בנוסף, הנוכחות של ISCs עשויה לשנות את היכולת של ektacytometer כדי למדוד את הדפורמביליות ב normoxia. עיוות של תבנית עקיפה נגרמת על ידי iscs, הנובעת מחוסר היישור במהלך הזרימה1,2,3.
גישות חלופיות כדי ללמוד את הפתופסולוגיה של VOC כוללים מדידות של הדבקות RBC משטח מלאכותי18, תא יחיד העכבה מיקרופלו cy, מיקרו מודלים מבוססי מיקרופלואידיג19, מבוססות microflu, מודל מבוסס שילוב כמותי מדידות התא מחליקות ומחליקות עם תא בודד מבית מדידה20, ופילמור המושרה לייזר21. למרות ההבטחות, טכניקות אלה יקרות, עבודה אינטנסיבית, דורש הכשרה מפעיל נרחב. בנוסף, התשובה היא כי הם מבוססי מורפולוגיה חוסר יכולת ללמוד התנהגות תאית, כגון deformability, כפונקציה של מעבר חמצן.
במחקר זה, אנו מתארים שיטת מהירה ופונקציונלית תפקודית שבוצעה עם ektacytometer טר. זהו מדידה הדור הבא ektacy, אשר מודד את ההיבטים האיכותניים השונים של rbc דפורמביליות התבטא כמו EI במהלך הדחמצן (1,300 s) ו-החמצן מהירה (280 s). אלה מרווחי זמן לאפשר היווצרות פולימר HbS, ובכך התרחשות של שינויים מורפולוגיים ולאחר מכן התאוששות. הדלקת החמצן מתרחשת על ידי החדרת גז חנקן, אשר מקטין באיטיות את המתח בדגימת הדם בפער שבין בוב והספל של האקטקטומטר. Rbc דפורמביליות נמדד ברציפות בזמן מתח החמצן נמדד כל 20 s באמצעות מקום קטן O2-ספוט בקיר של הספל. במהלך המבחן, כ 80 pO2 מדידות מצמידים את ה-EI מדוד באותו רגע. לחץ החמצן יורד מתחת ל -20 מטרים במהלך הטומאה, והחמצן מונחה על ידי הדיפוזיה הפסיבית של האוויר הסביבתי. הכיוונון הניסיוני של מודול המערכת הבין-מדרגתי והחמצן מוגדר באיור 1 ובאיור 2. העיקרון של ektacy, מבוסס על פיזור RBC המושרה של אור מקרן לייזר. התוצאה היא תבנית עקיפה אליפטית בעת החלת לחץ הטיה באותו זמן (איור 1).
Protocol
כל ההליכים אושרו על ידי ועדה אתית של המרכז הרפואי של האוניברסיטה אוטרכט (UMCU) ובהתאם להצהרת הלסינקי. חולים שהשתתפו במרכז המטולוגיה לילדים בטקסס (TCHC) אושרו על ידי IRB המקומי ובהתאם להכרזת הלסינקי.
1. שיקולים כלליים
- להתחיל בביצוע מדידה בדיקה כדי לחמם את בוב והספל. ודא כי הטמפרטורה של בוב והגביע היא 37 ° c. . זה חשוב לתוכסות טובה
- להבטיח כי הפתרון פוליוינילפירולידון (PVP) נופל בתוך המגבלות הקפדניות עבור osmolarity (282 – 286 mosm/ק"ג), pH (7.35 – 7.45) ו צמיגות (27.5 – 32.5 MPa) בטמפרטורת החדר (22 ° c).
הערה: יש להשתמש ב-PVP בטמפרטורת החדר. אם מאוחסן בטמפרטורה נמוכה יותר, ודא שהוא התחמם לטמפרטורת החדר לפני נטילת כל המידות.
2. הפעלה של האקטטומטר
- הפעל את המחשב ואת האקטקטוטר מאחור. הפעל את תוכנית התוכנה (טבלת חומרים) במחשב.
- ודא החנקן זמין כדי להפוך את המדגם על ידי פתיחת צילינדר חנקן.
- להוריד את בוב בספל ולוודא הגביע יכול להפוך בחופשיות. נקו את הספל מבפנים ומבחוץ עם מטלית רכה ומים מזוקקים, משום שפסולת יכולה לעכב את מדידות ה-EI.
- כאשר תוכנית התוכנה פועלת, בדוק את ההודעה הבאה על המסך: "ודא ששסתום הגז פתוח" ולחץ על אישור.
- ודא ש-ektacytometer מפעיל את תהליך הבדיקה העצמית של ה-pO2 , שיופיע על המסך. בחר באפשרות ' התחל ' (enter). אם היא נכשלת, הפעל משוב את הבדיקה העצמית על-ידי לחיצה על בדיקת חומרה | פו2 | . בדיקה עצמית
הערה: אם הבדיקה העצמית נכשלת שוב, שקול להחליף את הנקודההשנישל O. The O2ספוט מוחלף בעדינות דוחף את הנקודה מתוך החלק הפנימי של הספל עם קצה אצבע. מקום חדש ממוקם על ידי דוחף בעדינות את הנקודה מבחוץ לתוך הספל. - בחר פו2 לסרוק מן המבחנים השונים המפורטים משמאל. בחר ' הגדרות ' מימין למסך וודא שהן מוגדרות לפי הפרמטרים המפורטים בטבלה 1. שמור את אותן הגדרות עבור כל מדידה.
- על מנת לשמור הגדרות אלה, לחץ על אישור | . זה בסדר
הערה: הגדרות מועדפות מפורטות בטבלה 1 אך ניתן להתאימו בהתאם להעדפות המשתמש ולצורכי ההתנסות. לדוגמה, כדי ללמוד את ההתנהגות החולנית יותר בהרחבה, מהירות החמצן והמשך ניתן לשנות.
3. איסוף והכנה לדוגמה
הערה: לצורך אימות הטכניקה, החומצה של ethylenediamine (EDTA)-דם מטופלים מ 38 SCD חולים ו 5 פקדים בריאים כלולים במרכז הרפואי של אוניברסיטת אוטרכט או טקסס המטולוגיה המרכז לילדים, במחקרים קליניים שונים ( הולנד משפט הרישום [NTR] מזהה, NTR 6779 ו-NTR 6462), כמו גם השאריות דגימות דם שאריות של חולים שביקרו במרפאה האשפוז או שהיו מאושפזים שימשו.
- לאסוף דגימות דם על ידי אמת (מינימום של 300 μl/דגימה) בצינור המכיל edta. ודא כי הדם אוחסן לפחות 30 דקות ב -4 ° c, אך לא יותר מ -24 שעות.
הערה: הגנה ציטראט דקסטרוז אדנין (CPDA) או הפארין יכולים לשמש גם כן, אבל ההשפעה של הריאגנטים האלה על השימור לדוגמה ביחס החמצן מעבר בהדרגה הוא לא ידוע היטב. - ערבב את המדגם בעדינות על-ידי היפוך כדי לבצע הומוגון. . אל תנענעי את הדגימה תנו למדגם להתחמם לטמפרטורת החדר על ספסל הרים לפני המדידה.
הערה: שפופרת לדוגמה (9-10 מ"ל) המאוחסנת עבור יותר מ-1 h ב-4 ° צ' צריכה להתחמם למשך 15 דקות. כאשר מאוחסן בפחות מ-1 h ב -4 ° c, הוא חייב להתחמם במשך 10 דקות. שפופרת לדוגמה (2 – 6 מ"ל) המאוחסנת עבור יותר מ-1 h ב -4 ° צ' צריכה להתחמם במשך 10 דקות. כאשר מאוחסן בפחות מ-1 h ב -4 ° c, הוא חייב להתחמם למשך 5 דקות. - למדוד את ספירת הדם המלאה על מנתח המטולוגיה. כדי לעשות זאת, לקחת 20-200 μL של דם שלם בצינור המכיל EDTA. מניחים את המחט שאיפה בצינור ולחץ על הכפתור מאחורי המחט של מנתח המטולוגיה כדי להתחיל את המדידה.
הערה: בספירת הדם המלאה, מספר ה-RBC נמדד, שהוא גורם חשוב לקביעת סטנדרטיזציה של מדידות מעבר הצבע החמצן. ספירת RBC מחושבת מפני פיזור צדדי ומורד על ידי הזרמת cy, try. רגיל RBC לספור פקדים בריאים הוא 3.7 – 5.0 x 1012/l עבור נקבות ו 4.2 – 5.5 x 1012/l עבור זכרים. RBC ספירה בחולים עם SCD הוא ירד בדרך כלל. מנתחי המטולוגיה מסוימים גם למדוד אחוז צפוף כדוריות דם אדומות (% DRBC) אשר יכול להיות ערך נוסף בפרשנות של בודדים חמצן ektacy, הדרגתי עקומות. - לתקנן את דגימת הדם כולו לספירה RBC של 200 x 106 rbcs ב 5 מ"ל PVP (200 x 106 rbcs/בקבוקון) על ידי התאמת נפח המדגם שיתווספו. אם ספירת RBC הכוללת קטנה מ-200 x 106, תבנית העקיפה ו-EI יושפעו.
- השתמש במשוואה שלהלן כדי לבצע את הספירה.
4.0/xx (x 1012/l) x 50 = Yy μl כל דם/בקבוקון PVP
כאשר xx הוא ספירת RBC מחושבת שהושג משלב 3.3 ו-yy הוא כמות הדם השלם הנדרש עבור המדידה בפועל. בהתאם כיתה של אנמיה וגורמים אחרים המשפיעים על RBC ספירות, כמות הדם השלם נדרש הוא 40 – 90 μL.
- השתמש במשוואה שלהלן כדי לבצע את הספירה.
4. מדידת חמצן במילוי מדרגתי
- פיפטה נפח הדגימה המחושב (yy μL של דם) לתוך PVP כדי לקבל נפח כולל של 5 מ ל. להרטיב את העצה על ידי בעדינות מחדש את 3x דם. השתמש בעצת פיפטה עם פתח רחב כדי להימנע מלחץ נוסף על RBCs. בעדינות לערבב את המדגם באופן ידני על ידי היפוך עד שהוא הומוגנית.
הערה: פתח את המבחנה PVP במשך זמן קצר ככל האפשר כדי למנוע מגע אווירי. - לאט לצייר 2.0 mL של התערובת דם/PVP לתוך מזרק 3 מ ל ללא מחט. לדחוף את הבוכנה כדי להסיר כל בועות אוויר גלוי ופתרון לדוגמה מוגזמת עד 1.5-1.8 mL נשאר במזרק (בהתאם לנפח הספל).
- הכנס את אמצעי האחסון הכולל לדוגמה באיטיות ובאופן שווה בתוך המחבר. ודא שרמת המדגם מעל חיישן החמצן (נקודה ורודה) ומעל חור היניקה הקטן. אין להשאיר פתרון לדוגמה במזרק.
- לחץ על חדש ומלא את מזהה המדגם, ההערות, תאריך התרומה וצמיגות של PVP. לחץ על אישור | . מרוב שאיפות אחרי 60 s, הגביע יסתובב ומתה את המדגם עבור 15 s. לחץ על אישור כאשר הסיבוב נפסק. . תסגור את מכסה המכונה לחץ על המשך | התחל עכשיו, כמו מעבר החמצן ektacy, לעשות עם רווח קבוע. המדידה תיקח בערך 28 דקות.
- לאחר המדידה, הדפס את הדוח המציג את העקומה והפרמטרים שמחושבים באופן אוטומטי על-ידי התוכנה. ודא שהנתונים הגולמיים מאוחסנים באופן אוטומטי בתיקיה המיועדת בהגדרות. מרבי EI (eimax), מינימום מזערי (Ei),pO2@ 95% EI (PoS) ואזור (אזור מתחת לעקומה) מחושבים באופן אוטומטי ומתווספים לדוח המודפס ולנתונים הגולמיים.
- השג ידנית את ΔEI על-ידי חישוב ההפרש בין EImax ו-ei. חישוב שחזור האחוזים על-ידי נטילת ההפרש ב-EI לפני ביטול החמצן (pO2 100 – 120 mmhg) וערכי EI במהלך החמצן ב-100 – 120 mhg.
5. ניקוי האקטקמטר
- הסר את המזרק לדוגמה והחלף אותו במזרק המלא במים מזוקקים או במים מפוהים.
- לחץ על נקי, לאט שוטף את המחבר במהלך השטיפה. הקפד לשטוף בשני הכיוונים.
- . הסר את המזרק והרם את הבוב יבש את בוב, הספל והמחבר ביסודיות עם מטלית רכה.
- השתמש במזרק גדול (10 – 50 מ ל) כדי לרוקן את המחבר על מנת להסיר את כל המים שנותרו בצינורות ובבוב. לחסום את התחתון/משקע של בוב כדי לקבל לחץ בחזרה על צינורות, ובכך להסיר את המים הנותרים.
- . הורידו את הבוב בספל המכונה כעת מוכנה. למדידה הבאה
6. כיבוי המכונה
- ודא כי המכונה שטפה כראוי לאחר המדידה האחרונה, כפי שמתואר לעיל. ודא שהצינורות המתאימים מתייחסים לפתרון הניקוי.
- סגור את התוכנה, לחץ על סגור ולחץ על התחל כדי להתחיל תוכנית ניקוי של סוף היום.
- לאחר השלמת כל תוכנית הניקוי, להסיר את המזרק ולהרים את בוב. . רוקן את המחבר עם מזרק גדול
- רוקן את בקבוק הפסולת ויבש את בוב והספל במטלית רכה. ריקון המחבר על מנת להסיר את המים הנותרים בצינורות ובבוב. לחסום את התחתון/משקע של בוב כדי לקבל לחץ בחזרה על צינורות, ובכך להסיר את כל המים הנותרים.
- סגור את המכסה של המכונה. . תסגור את צילינדר החנקן כבה את המחשב ואת המכונה.
Representative Results
ניתן להשתמש במחוון מעבר חמצן לאפיון התנהגות חולנית בחולים עם SCD. במחקר זה, דגימות דם מסכום כולל של 38 SCD חולים וחמישה פקדים בריאים נכללו. בפקדים בריאים, דפוס עקיפה הוא מעגלי במנוחה, אליפטי בהטיה גבוהה יותר לחץ4. מתבנית העקיפה האליפטית, אינדקס התארכות (EI) מחושב על בסיס הגובה והרוחב של תבנית העקיפה. באמצעות מעבר חמצן הדרגתי, הדלקת החמצון איטית ורציפה של המדגם על ידי גז חנקן מלווה בחמצן מהיר על ידי אוויר סביבתי. בתנאים אלה ניתן להבחין בחולי RBC תחת הדגנציה. דבר זה יגרום לעיוות של תבנית העקיפה מכיוון שתאים אדומים מגעילים לא יתיישרו כראוי תחת לחץ ההטיה שהוחל. מכאן, הם נראים פחות deformable לעומת RBCs בריא (איור 2).
איור 3מראה כיצד מגל rbcs משתנה בצורה לחוסר חמצן, אשר מחקה את התנאים במהלך מעבר החמצן באמצעות הדרגתי, ואילו שליטה במגל rbcs ללא החמצן לא מראים שינוי בצורה. תהליך זה מביא לעיוות של תבנית העקיפה במהלך הפחתת מעבר החמצן, וכך בירידה ב-EI. איור 3ב מציג את דפוסי העקיפה השונים שמהם נוצרות פרמטרים שונים.
עקומה ייצוגית המתקבלת על ידי ektacytometer מוצג באיור 3ג. שישה פרמטרים משקפים מאפיינים שונים של התנהגות חולנית של RBCs: EImax הוא ה-ei המירבי בתחילת המדידה לפני ביטול החמצן. פרמטר זה מייצג את המיקום הבסיסי ומשקף את הדפורמביליות הכוללת של אוכלוסיית RBC הכוללת באוויר הסביבתי. EImin הוא ה-ei המינימלי, המייצג את הדיפורמביליות המינימלית לאחר ביטול החמצן. פרמטר זה משקף שינויים בצורה ובכיוון של (מגל) RBCs בעת הדגנציה. ΔEI הוא ההבדל בין EImax ו-eimin, המציין כמה תאים יכולים להיות מגל במהלך סיבוב אחד של החמצון. 5% נקודת המבחילה (PoS5%) הוא ה-pO2 (mmhg) שבו 5% ירידה של EImax במהלך החמצון נמדד. זה מייצג את המתח החמצן. שבו התהליך החולי מתחיל אזור משקף את האזור תחת עקומת, אשר נקבע על ידי חישוב אינטגרלי של EI ו-pO2 מדידות בין 100 mmhg ו-po2דקות (mmhg). זוהי תוצאה של פרמטרים שתוארו בעבר EImax, eiMinו-PoS. Recovery מייצגת את ההפרש של ei במהלך החלק הסופי של החמצן לעומת EI ב-בסיס. שני ערכי EI נמדדים ב-a2 של 100 – 120 mhg. פרמטר זה משקף את הקיבולת של RBCs המגל במהלך חוסר חמצן כדי להפוך מחילה לאחור במהלך החמצן22. פרמטרים ממדידות כפולות היו בדרך כלל מקדם של וריאציה (CV) < 5% (חציון 1.83%). במקרה של CV > 5% הושגה, מדידה שלישית בוצעה. הפרמטרים EImax ושחזור הם הנפוצים ביותר עם קורות חיים חציון < 1%.
מייצגים עקומות של RBCs של פקדים בריאים, חולים עם תכונות HbS (heterozygous HbS), ו מטופל homozygous SCD מוצגים באיור 4א. עקומת המייצג של החולה הבכיר מראה התאוששות נמוכה יותר, אשר עשוי להצביע על תהליך מחליא שונים (איור 4ב). הייצוגי עקומות של חולים HbSS המטופלים עם הידרוקסיראה (HU) ו עירוי מוצגים באיור 4ג ואיור 4D. ברור, יש הבדל גדול בין עקומות הנציג של תכונות HS (התאים HbAS) ו RBCs של חולים HbSS שטופלו עירוי (המורכב של תערובת של homozygous מגל (HbSS) ו homozygous רגיל (הבאא) תאים, איור 4a ,D). ההבדלים ברורים בעקומות של החולה scd מטופל, HU ו-עירוי מטופלים מדגיש את השימושיות של הטיפול הזה (איור 4C,D). רמות של HbF ו Hbf מתאם באופן משמעותי עם EImin ו, במידה פחותה, עם PoS (איור 5a–D). הדבר מצביע על כך שפרמטרי המעבדה החשובים בהערכת המטופל משתקפים גם בתוך מעבר החמצן של המעבר. מספר התאים המגעילים ב normoxia ואחוז של rbcs צפופה (drbcs) הן השפעה על ערכי eimax, כפי שהם בקורלציה משמעותית (איור 5E–F), אשר מציין כי eimax משקף גורם חשוב אחר ב תהליך מחליא תוצאות אלה מראות כיצד מאפיינים שונים כגון% HbS,% Hbs, תאים מחליא ב normoxia, ו-% DRBCs משפיעים על פרמטרים שונים.
איור 1. כיוונון סכמטי של האקטקטומטר. Ektacytometer משתמש מערכת Couette להחיל לחץ הטיה על התאים. צילינדר חיצוני סיבוב (גביע) ו גליל פנימי סטטי (בוב) משמשים כדי לגרום להטות את הלחץ על ידי יצירת זרם למינארי ב 37 ° c. בין בוב לגביע יש פער קטן שבו ההשעיה של הדם מוזרק. קרן לייזר זורחת מבוב דרך ההשעיה דם והוא מפוזר על ידי נוכחות של RBCs. תבנית עקיפה מוקרנת ומנותח על-ידי מצלמה. מדד התארכות (EI) מחושב עם הגובה (a) והרוחב (b) של תבנית העקיפה4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. כיוונון סכמטי של ה-ektacy, עם מודול הדרגתי של חמצן מעבר למודול. תרשים סכמטי של המודול המראה חוסר חמצן של השעיית הדם לאט עם העירוי של גז חנקן (N2). מתח החמצן נמדד על ידי כמות הקוצ'ינג של אות הזרקורים שנשלח מ-LED סיבים אל O2-ספוט. עם הפחתת החמצן, המגל RBCs יתחיל למגל, הדיפורמביליות שלהם יקטן, והם כבר לא להתיישר עם RBCs דעי אליפטי. RBCs החולנית מעוות את תבנית העקיפה, ומשנה את צורתו מאליפסה לצורה מעוין או כצורת יהלום. שינוי זה בצורת תבנית העקיפה מביא לירידה של EI. מדידות של פו2 ו-EI אינם מבוצעים באותו גובה בספל. הדבר מבטיח אפליה טובה יותר בין הטומאה ועקומות החמצון, ומכאן, פרשנות טובה יותר של העקומה. איור זה השתנה מראב ואח '22אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. מייצג הדרגתי של מעבר חמצן בתבניות עקומה ועקיפה. (א) על חוסר חמצן תחת תנאים דומים החמצן מעבר הדרגתי, המגל rbcs תוקנו. ב מגל שליטה RBCs, התנאים שימשו, אך ללא גז חנקן. מגל מחמצן RBCs מראה שינוי בצורה בניגוד לבקרת RBCs. (ב) על הטיית החמצן והטיה (30 Pa), תבנית העקיפה משתנה מאליפסה לתיבה מבלית. (ג) העקומה הייצוגית של החמצן מעבר הדרגתי. מדד התארכות-מרבי (EImax) מייצג את המיקום הבסיסי ומציג את המצב הכללי של אוכלוסיית rbc הכוללת. מינימוםei (ei)מייצג חוסר יכולת מינימלי, הנגרם כתוצאה מהשינוי בצורה ובכיוון של rbcs בעת היעדר חמצון. ΔEI (dEI, ההבדל ב-EI בין EImax ו-eimin) מראה כמה תאים יכולים למגל במהלך סיבוב אחד של חוסר חמצן. נקודה של מחלה (PoS, pO2 ב 5% EI ירידה) מראה את מתח החמצן כאשר rbcs הראשון מתחיל מגל. האזור שמתחת לעקומה (מ-pO2min = 100 mmhg) מחושב באזור הפרמטרים. . זה מסכם את האיימקס, איימיןוהPoS הקיבולת של תאים מגעילים לביטול המגל במהלך החמצן מיוצגת בפרמטר Recovery (אחוז של EImax הגיע במהלך החמצון). כדי לסייע בפרשנות, כל נקודות הנתונים היו מחוברות בכל ניסוי בודד על ידי קו כדי להציג בצורה גרפית את התוצאות. איור זה השתנה מראב ואח '22אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. הפרמטרים של הדרגתי מעבר החמצן לתאם עם גנוטיפ וטיפול משטרי של חולים SCD עם SCD. (א) גרף מייצג של rbcs של נושאות hbs (תכונה hbs) ופקדים בריאים ביחס מטופלים HbSS לא מטופלים. (ב) הגרף המייצג של rbcs של חולים עם מחלת המוגלובין SC (התואר הראשון) ביחס מטופלים HbSS מטופל. (ג) הגרף המייצג של rbcs של הידרוקסייוליון מטופלים HOMOZYGOUS scd חולים (HbSS HU) ביחס מטופלים hbss מטופל. (ד) מייצג גרף של rbcs של חולים hbss שטופלו עירוי דם (hbss עירוי) ביחס מטופלים hbss מטופל. איור זה השתנה מראב ואח '22אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. הפרמטרים של מעבר הצבע החמצן משויכים ל-% HbF,% Hbf,% תאים שעברו בחילה ב-normoxia ו-% RBCs צפופים. (A) מתאם ליניארי של מדד התארכות מינימלי (EImin) ו-% Hbf של 15 Hbss או hbf/β-תלסמיה חולים ללא עירוי. (ב) התאמה לינארית של EImin ו-% hbs. (ג) קורלציה לינארית של pos ו-% hbs. (ד) קורלציה ליניארית של pos ו-% hbs. (ה) קשר ליניארי של מקסימום ei (eimax) ואחוז התאים הפסיכים ב נורמוססיה מוערכת במיקרוסקופיה דיגיטלית. (ו) התאמה ליניארית של EIMax ואחוזי rbcs צפופים (% drbcs) של 21 חולים עם hbss. איור זה השתנה מראב ואח '22אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| גדרות | ||
| קבצים | מדריך אחסון | |
| אפשרויות כלליות | צמיגות בינונית של ברירת מחדל | צמיגות של PVP |
| סריקת pO2 | זמן השאיפה המינימלי | 60 |
| pO2 לסרוק את המתח הטיה (פי אי) | 30 | |
| קביעת pO2 כל (י) | 20 | |
| הזזת גודל ממוצע | 2 | |
| pO2 בצעד הסריקה; ערוך | 0-כבוי; 60-מופעל; 1360 – כבוי; 1640-כבוי | |
| . קאל. האזור שבין (mmHg) | 10 ו-100 | |
| שליטה בpO2 | כבוי (לא מסומן) |
. שולחן 1 ההגדרה המועדפת של ה-ektacytometer.
Discussion
כאן אנו מתארים מעבר חמצן ektacy, שיטה שיכולה לשמש כדי ללמוד את ההתנהגות החולנית של כדוריות דם אדומות מחולים SCD תחת מגוון של ריכוזי חמצן (איור 4 ואיור 5). כדי להשיג תוצאות שאינן מזדהות, חשוב לזהות את הגורמים המשפיעים על התוצאות. למשל, הטמפרטורה יש השפעה גדולה על RBC deformability, בעיקר בשל השפעותיו על העובי של הפתרון הצמיגי (PVP). אנו ממליצים לבצע מדידה בדיקה בתחילת היום כדי לחמם ביסודיות את המכונה עד 37 ° c. פעולה זו תשפר את השגות התוצאות. האוסמולציה של הפתרון הצמיגי צריך להיות בטווח הצר (282 – 286 mOsm/ק ג עבור PVP), כי משפיע על מעמד היום לחות, אשר בתורו משפיע על RBC deformability. ה-pH ו צמיגות של PVP צריך גם להיות מוסדר היטב. הבדלים ב-pH ובטמפרטורה יכולים להשפיע על עקומות באופן דרמטי22. בנוסף, המים הנותרים בספל, בבוב ובצינורות, עלולים לגרום לפירוק של RBCs, ובכך להביא לנתונים שגויים, מכיוון שפחות RBCs בספל הנוכחי יימדד.
ניתן לכוונן הגדרות כדי לבצע שאלות מסוימות לגבי מעבר חמצן. הגדרות מועדפות מפורטות בטבלה 1. זמן הדחמצן של 1,300 s נבחר על בסיס תצפיות המראים כי הארכת הדחמצן לא התוצאה היא EI נמוך יותר עבוררוב המטופלים . לעומת זאת, קיצור הזמן לחוסר החמצן היה מעכב את הכוח המבדיל של החמצן מעבר האנרגיה. זמן החמצון הוגדר 280 s בשל הפתרון המהירות של הפולימרים HbS במהלך החמצן, ושחזור במקביל של EI לעבר ערכים שנמדדו לפני הדחמצון. מתח הטיה הוגדר ל-30 Pa, שהיא אנלוגית ל-אוסמוטי הדרגתי. הנמכת פרמטר זה עלולה לעכב את הכוח המבדיל. ניתן להשתמש בבקרת הדחמצן אם מערכת מהירות החמצון מוחלת על כל דגימת מטופל. בהגדרות המועדפות שלנו, אפשרות זו הוחלפה מכיוון שקצב הדחמצן הוא ספציפי למטופל בשל עקומת דיסוציאציה ייחודית של המוגלובין. מכאן, החלפת בקרת החמצון מבטלת את התכונה הזאת מהשיטת הפעולה. עם זאת, תכונה זו של מעבר החמצן ektacy, הוא עדיין תחת חקירה.
מספר גורמים ידועים המשפיעים על הדרגתי הפרמטרים ektacy, כלומר pH, טמפרטורה, ו-osmolarity. Ektacy, במיוחד PoS, הוא מושפע 2, 3-diphosphoglycerate (2, 3-DPG)22. כמו כן, קיים קורלציה ברורה בין% HbF לבין ה-EImin, ובמידה פחותה יותר של PoS (איור 5a–D). EImax קשורה לתאי מגל ב normoxia, אשר יכול להסביר את התצפית כי זמן קצר לאחר VOC, rbc דפורמביליות ב normoxia (EImax), הוא גבוה יותר. האחרון נגרם על ידי הרס של תאים מחליא ביותר, ומכאן RBCs פחות deformable במהלך VOC16. כפי שמוצג באיור 5F, גבוה יותר% ברבורי צפיפות (המוגדרים כ-rbcs עם ריכוז המוגלובין ≫ 1.11 mg/mL) מוגדרים בחוזקהעם EI נמוך יותר. הדבר מצביע על כך שתאים צפופים הם גורם חשוב ב-rbc דפורמביליות בנורמוקסיה, בדומה לתוצאות שדווחו בעבר1.
סטנדרטיזציה של דגימות חשוב מאוד להשגת תוצאות הגנוזה ולהבחנה בין גנוטיפים שונים וטיפולים. התיקון עבור ספירת RBC חשוב, מאחר שהמספר של RBCs משפיע על עוצמת דוגמת העקיפה. אם מספרי RBC התחתון נמצאים בפער בין בוב והספל, העיקול יהיה לנוע כלפי מעלה ושמאלה. בנוסף, העקומה להשתנות, חישוב מדויק של הפרמטרים, במיוחד את ה-PoS.
מגבלה של טכניקה זו היא שערך ה-EI מייצג ממוצע של כל התאים, לרבות אוכלוסיות משנה שונות. טרוגניות של אוכלוסיות RBC בחולים SCD והשפעתה על המדידה ektacy, כבר נחקרו באופן אינטנסיבי. פעולה זו הביאה לסטנדרטיזציה שבה גודל תבנית העקיפה מותאמת לערך קבוע במקום לתקן את ספירת ה-rbc23,24. בין אם דרך זו של סטנדרטיזציה צריך גם להיות מיושם על מדידת חמצן ektacy, מדידות המדידה נמצאת כעת במחקר.
כמה טכניקות למדוד rbc דפורמביליות תחת ארוי תנאים פותחו בהתבסס על צעד הדחמצן שהתרחש מחוץ ektacytomrra25,26,27. בתנאים אלה, הבדלים בהתנהגות הסלולר לא נצפו בין חולים עם תכונות HbS בקרות בריאות תחת pH פיסיולוגיים25. עם זאת, הדרגתי החמצן מראה בבירור מעולה נמוך אך ברור אצל אנשים עם תכונות HbS (איור 4א). עד היום, בפרקטיקה הקלינית השוטפת, השיטות החלופיות היחידות למדידת הנטייה של RBCs של מטופל יחיד למגל בתחום החוץ, כוללות מכלול מבוסס מורפולוגיה: RBCs מודדות בתנאים המקדמים את ה-HbS פולימור, כגון מתח חמצן נמוך או pH נמוך. התוספת מתווספת לאחר הדגירה ואחוז התאים המבחילה הוא באופן ידני או דיגיטלי באמצעות מיקרוסקופ אור. ניסויים מוקדמים רבים טרום קלינית ומוקדם שלב השימוש הטיפול מחליא ליצור משתנה תוצאה משנית כדי להיות מסוגל לחזות את היעילות הקלינית ב-scd28,29,30,31 ,32 עם זאת, זה זמן רב, השונות גבוהה ורגישות נמוכה, הטכניקה אינה אוטומטית, ולכן, עבודה אינטנסיבית. יתר על כן, שינויים מורפולוגיים עקב מחלות לא יכול להתאים היטב עם פרמטרים פיזיולוגיים, כמו RBC deformability, משום שהיא שיטת 2-מימדי סטטי2.
מעבר החמצן הדרגתי מספק מינון תפקודי של מחלות שהוא מהיר ומלא מתפקד. זהו מבחן בלתי מתורבת שאינו מחשיב את משטח האנדותל. עם זאת, הוא מספק היבטים פונקציונליים של התנהגות חולנית ומאפייני RBC, מה שהופך אותה טכניקה מבטיחה עבור מחקרי תאים מגל. היישומים העתידיים של הטכניקה כוללים ניטור יעילות הטיפול בחולים SCD, המשמש בסמנים עבור אסטרטגיות טיפול חדשות, לימוד התנהגות מבחילה, וניטור הצ לאחר השתלת תא הגזע SCD.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי מענק יורוסטארס estar18105 ועל ידי מענק בלתי מוגבל שסופקו על ידי RR מכטרוניקה. המחברים מודים לסיסטו נדריקס וליאן דה זוטן על תמיכתם הטכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
| Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
| Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
| Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | - | Software |
| Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | - | |
| O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
| Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
| Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
| X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |
References
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. Journal of Clinical Investigation. 65 (1), 189-196 (1980).
- Smith, C., Kuettner, J., Tukey, D., White, J. Variable Deformability of Irreversibly Sickled Erythrocytes. Blood. 58 (1), 71-78 (1981).
- Clark, M., Mohandas, N., Embury, S., Lubin, B. A simple laboratory alternative to irreversibly sickled (ISC) counts. Blood. 60 (3), 659-663 (1982).
- DaCosta, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 56 (1), 9-22 (2016).
- Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
- Ballas, S. K., Mohandas, N. Sickle red cell microrheology and sickle blood rheology. Microcirculation. 11 (2), 209-225 (2004).
- Connes, P., Alexy, T., Detterich, J., Romana, M., Hardy-Dessources, M. D., Ballas, S. K. The role of blood rheology in sickle cell disease. Blood Reviews. 30 (2), 111-118 (2015).
- Hierso, R., et al. Effects of oxidative stress on red blood cell rheology in sickle cell patients. British Journal of Haematology. 166 (4), 601-606 (2014).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformabilityin sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic Gradient Ektacytometry: Comprehensive Characterization of Red Cell Volume and Surface Maintenance. Blood. 61 (5), 899-911 (1983).
- Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 65, 41-50 (2017).
- Steinberg, M. H., Chui, D. H. K., Dover, G. J., Sebastiani, P., Alsultan, A. Fetal hemoglobin in sickle cell anemia: A glass half full. Blood. 123 (4), 481-485 (2014).
- Ballas, S. K., Larner, J., Smith, E. D., Surrey, S., Schwartz, E., Rappaport, E. F. Rheologic predictors of the severity of the painful sickle cell crisis. Blood. 72 (4), 1216-1223 (1988).
- Lande, W. M., et al. The Incidence of Painful Crisis in Homozygous Sickle Cell Disease: Correlation with Red Cell Deformability. Blood. 72 (6), 2056-2059 (1988).
- Lemonne, N., et al. Does increased red blood cell deformability raise the risk for osteonecrosis in sickle cell anemia. Blood. 121 (15), 3054-3057 (2013).
- Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
- Telen, M. Cellular adhesion and the endothelium: E-selectin, L-selectin, and pan-selectin inhibitors. Hematology/Oncology Clinics of North America. 28 (2), 341-354 (2014).
- Papageorgiou, D. P., et al. Simultaneous polymerization and adhesion under hypoxia in sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (38), 201807405 (2018).
- Liu, J., Qiang, Y., Alvarez, O., Du, E. Electrical impedance microflow cytometry with oxygen control for detection of sickle cells. Sensors and Actuators, B: Chemical. 255, 2392-2398 (2018).
- Du, E., Diez-Silva, M., Kato, G. J., Dao, M., Suresh, S. Kinetics of sickle cell biorheology and implications for painful vasoocclusive crisis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1422-1427 (2015).
- Li, Q., et al. Kinetic assay shows that increasing red cell volume could be a treatment for sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (5), 689-696 (2017).
- Rab, M. A. E., et al. Rapid and reproducible characterization of sickling during automated deoxygenation in sickle cell disease patients. American Journal of Hematology. 94, February 575-584 (2019).
- Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization of ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 62 (2), 173-179 (2016).
- Parrow, N. L., et al. Measuring Deformability and Red Cell Heterogeneity in Blood by Ektacytometry. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
- Bessis, M., Feo, C., Jones, E. Quantitation of red cell deformability during progressive deoxygenation and oxygenation in sickling disorders (the use of an automated Ektacytometer). Blood Cells. 8 (1), 17-28 (1982).
- Sorette, M. P., Lavenant, M. G., Clark, M. R. Ektacytometric measurement of sickle cell deformability as a continuous function of oxygen tension. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1987).
- Huang, Z., Hearne, L., Irby, C. E., King, S. B., Ballas, S. K., Kim-Shapiro, D. B. Kinetics of increased deformability of deoxygenated sickle cells upon oxygenation. Biophysical journal. 85 (4), 2374-2383 (2003).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human β-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Abdulmalik, O., et al. Crystallographic analysis of human hemoglobin elucidates the structural basis of the potent and dual antisickling activity of pyridyl derivatives of vanillin. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (12), 1076 (2011).
- Oder, E., Safo, M. K., Abdulmalik, O., Kato, G. J., Discovery, D. New Developments in Anti-Sickling Agents: Can Drugs Directly Prevent the Polymerization of Sickle Haemoglobin In Vivo. British Journal of Haematology. 175 (1), 24-30 (2016).
- Oksenberg, D., et al. GBT440 increases haemoglobin oxygen affinity, reduces sickling and prolongs RBC half-life in a murine model of sickle cell disease. British Journal of Haematology. 175 (1), 141-153 (2016).
- Xu, G. G., et al. Synthesis, and Biological Evaluation of Ester and Ether Derivatives of Antisickling Agent 5-HMF for the Treatment of Sickle Cell Disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3499-3511 (2017).
