Summary
Her presenterer vi oksygen gradient ektacytometry, en rask og reproduserbar metode for å måle røde blodlegemer fleksibilitet i prøver fra pasienter med sigdcellesykdom under kontrollerte deoxygenation og reoksygeneringsskader. Denne teknikken gir en måte å studere røde blodlegemer sickling og å overvåke sigd celle sykdomsbehandling effekt.
Abstract
I sigdcellesykdom (SCD), et enkelt punkt mutasjon i genet koding for beta-globin forårsaker produksjon av unormal hemoglobin S (HbS). Når deoxygenated, HbS kan polymeres, forming stive stenger av hemoglobin, noe som resulterer i sickling av røde blodlegemer (RBC). Disse sickled RBC har betydelig redusert fleksibilitet, forårsaker Vaso-okklusjon, noe som fører til en rekke SCD-relaterte kliniske komplikasjoner, inkludert smerte, hjerneslag, og organskade. RBC fleksibilitet er også redusert med RBC dehydrering, noe som resulterer i tette røde blodlegemer som er mer sannsynlig å sigd. Hittil er det ikke en eneste allment tilgjengelig, rask og reproduserbar laboratorium analysen i stand til å forutsi sykdommen alvorlighetsgrad eller direkte overvåking av behandlingseffekter for romanen, ikke-fosterets hemoglobin inducing terapier. I denne studien, beskriver vi en protokoll for å måle RBC fleksibilitet som en funksjon av pO2 som gjør det mulig for kvantifisering av sickling atferd i SCD pasienter. Oksygen gradering ektacytometry måler RBC fleksibilitet, uttrykt som forlengelse index (EI), som en funksjon av pO2. RBC er utsatt for en fast skjær stress på 30 pa i løpet av en runde deoxygenation og reoksygeneringsskader. Seks avlesning parametere er produsert. Av disse, poenget med sickling (PoS), definert som pO2 hvor maksimal EI (eiMax) viser en 5% NEDGANG, og minimum EI under deoxygenation (eimin) er den mest informative, som reflekterer en individuell pasientens pO2 der sickling starter og den minimale fleksibilitet av pasientens røde blodceller, henholdsvis. PoS er forbundet med en individuell pasientens hemoglobin affinitet for oksygen, mens EImin viser en sterk sammenheng med fosterets hemoglobin nivå. Vi konkluderer med at oksygen gradient ektacytometry er en lovende teknikk for å overvåke behandling av pasienter med SCD, som en biomarkør for anti-sickling agenter i kliniske og prekliniske forsøk, og et viktig verktøy for å studere sickling oppførsel av RBC fra individer med SCD og sigd celle egenskaper.
Introduction
I SCD, et enkelt punkt mutasjon resulterer i produksjon av HbS, som kan polymeres på deoxygenation. HbS polymerisering forårsaker sickling av RBC og reduserer RBC fleksibilitet. Kombinasjonen av RBC sickling og RBC tilslutning til endotelet fører til ulike SCD komplikasjoner, inkludert Vaso-okklusiv kriser (VOC), hjerneslag, organskade, og kronisk Hemolytisk anemi. Selv ved normoxic forhold, er RBC fleksibilitet kompromittert hos pasienter med SCD. Fleksibilitet er ytterligere redusert ved lave oksygen konsentrasjoner. Sentrale aktører som bestemmer fleksibilitet på normoxia er tette celler, irreversibelt sickled celler (ISC), og dehydrert celler, som alle har en redusert overflate-til-volumforhold1,2,3.
Ektacytometry er en etablert metode for å måle RBC fleksibilitet, mye brukt for diagnostisering av arvelig Hemolytisk anemias, spesielt membranopathies4. Den kan også brukes til å studere hemorheology5,6,7,8,9. Osmotisk gradient ektacytometry, der RBC fleksibilitet måles under en kontinuerlig endring i osmolalitet, har blitt brukt til å studere SCD i over ti år10,11. Prosentandelen av fosterets hemoglobin (HbF) er en av de sterkeste hemmere av HbS polymerisering fordi verken HbF eller dets blandede hybrid tetramer (∝ 2βSγ) kan gå inn i deoxyHbS polymer fase12. Nyere studier tyder på at økende HbF nivåer i SCD pasienter fører til en bedre overflate-til-volum ratio, og dermed bedre hydration tilstand og dermed fleksibilitet i nontransfused pasienter11.
RBC fleksibilitet har blitt studert i fortiden som en biomarkør for SCD komplikasjoner, men med motstridende resultater. I studier utført Cross-sectionally og på en stabil tilstand, personer med høyere nivåer av RBC fleksibilitet ble funnet å ha en høyere forekomst av osteonekrose og mer smerte kriser13,14,15. I motsetning til disse funnene, sammenlignet med steady state verdier under en akutt VOC, ble RBC fleksibilitet redusert i langsgående studier innenfor de samme individene16. Dette avviket kan være et resultat av å studere RBC fleksibilitet under ulike forhold (dvs. under steady state versus VOC). Prosentandelen av sickled celler er høy ved starten av en VOC og cellene blir raskt ødelagt etter hvert som krisen utvikler seg, noe som kan forklare forskjellen mellom den stabile tilstanden tverrsnitt data og langsgående data innhentet under VOC. Men andre faktorer, for eksempel overholdelse av RBC subpopulasjoner til endothelial overflaten, kan også være viktig i forekomsten av VOC. I SCD er det mer klinisk relevant å måle fleksibilitet under deoxygenation, fordi Vaso-okklusjon vanligvis oppstår i hypoxic postcapillary venules og ikke i mindre hypoxic microcapillary nettverk17. I tillegg kan tilstedeværelsen av ISCs endre evnen til en ektacytometer å måle fleksibilitet på normoxia. Forvrengning av Diffraksjon mønsteret er forårsaket av ISCs, som er et resultat av ikke-justeringen under flyten1,2,3.
Alternative tilnærminger for å studere patofysiologi av VOC inkluderer målinger av RBC tilslutning til en kunstig overflate18, enkelt celle elektrisk impedans mikrostrømning flowcytometri19, mikrovæskebasert-baserte modeller som kombinerer kvantitative målinger av cellen sickling og unsickling med enkelt celle Reologi20, og laser-indusert polymerisering21. Selv om lovende, disse teknikkene er kostbare, arbeidsintensiv, og krever omfattende operatør opplæring. I tillegg er analysene som er morfologi-baserte mangler evnen til å studere cellulære atferd, slik som fleksibilitet, som en funksjon av en oksygen gradient.
I denne studien beskriver vi en rask og reproduserbar funksjonell analysen utført med en ektacytometer. Dette er en neste generasjon ektacytometry måling som måler de ulike kvalitative aspekter av RBC fleksibilitet uttrykt som EI under deoxygenation (1 300 s) og rask reoksygeneringsskader (280 s). Disse tidsintervallene tillater HbS polymer formasjon, og dermed forekomsten av morfologiske endringer og deretter utvinning. Deoxygenation oppstår ved å innføre nitrogen gass, som langsomt reduserer oksygen spenningen i Blodprøven i gapet mellom Bob og kopp ektacytometer. RBC fleksibilitet måles kontinuerlig mens oksygen spenningen måles hver 20 s ved hjelp av en liten O2-spot til stede i veggen av koppen. Under testen, ca 80 pO2 målinger er KOPLET til ei målt i det øyeblikket. Oksygen trykket synker under 20 mmHg under deoxygenation, og reoksygeneringsskader er tilrettelagt av passiv diffusjon av omgivelsesluft. Den eksperimentelle oppsett av ektacytometer og oksygen gradient ektacytometry modulen er beskrevet i figur 1 og figur 2. Prinsippet om ektacytometry er basert på RBC-indusert spredning av lys fra en laserstråle. Dette resulterer i en elliptisk Diffraksjon mønster når skjær stress påføres samtidig (figur 1).
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av etisk komité ved University Medical Center Utrecht (UMCU) og i henhold til Declaration of Helsinki. Pasienter som ble registrert i Texas Children ' s hematologi Center (TCHC) ble godkjent av den lokale IRB og i samsvar med Declaration of Helsinki.
1. generelle hensyn
- Begynn med å utføre en test måling for å varme opp Bob og Cup. Sørg for at temperaturen på Bob og koppen er 37 ° c. Dette er viktig for god reproduserbarhet.
- Sørg for at den tyktflytende polyvinylpyrrolidon (PVP) faller innenfor de strenge grensene for OSMOLARITETSSYSTEM (282 – 286 mOsm/kg), pH (7.35 – 7.45) og viskositet (27.5 – 32.5 MPa) ved romtemperatur (22 ° c).
Merk: PVP må brukes ved romtemperatur. Hvis den oppbevares ved en lavere temperatur, sørg for at den har varmet opp til romtemperatur før du tar noen målinger.
2. oppstart av ektacytometer
- Slå på datamaskinen og ektacytometer fra baksiden. Start programmet (tabell materiale) på datamaskinen.
- Sørg for at nitrogen er tilgjengelig for å deoxygenate prøven ved å åpne nitrogen sylinderen.
- Senk Bob i koppen og sørg for at koppen kan svinge fritt. Rengjør koppen på innsiden og utsiden med en myk klut og destillert vann, fordi rusk kan hemme EI målinger.
- Når programmet kjører, kan du se etter følgende melding på skjermen: "pass på atgassventilen er åpen" og klikk OK.
- Kontroller at ektacytometer starter pO2 selvkontroll prosessen som vises på skjermen. Velg Start (Enter). Hvis den mislykkes, kjører du selv kontrollen ved å klikke Maskinvarekontroll | pO2 | Selvkontroll.
Merk: Hvis selv kontrollen mislykkes igjen, bør du vurdere å bytte ut O2-punktet. O2-spot er erstattet av forsiktig skyve flekk ut fra innsiden av koppen med en fingertupp. Et nytt sted er plassert ved å forsiktig skyve stedet fra utsiden inn i koppen. - Velg pO2 Skann fra de forskjellige testene som er oppført til venstre. Velg Innstillinger til høyre på skjermen, og kontroller at de er angitt i henhold til parametrene som er oppført i tabell 1. Behold de samme innstillingene for hver måling.
- For å lagre disse innstillingene, trykk OK | Greit.
Merk: foretrukne innstillinger er listet opp i tabell 1 , men kan justeres i henhold til brukerens preferanser og Investigational formål. For eksempel, for å studere sickling atferd mer omfattende, deoxygenation hastighet og varighet kan endres.
3. prøvetaking og forberedelser
Merk: for validering av teknikken, etylendiamin Tetraacetic acid (EDTA)-behandlet blod fra 38 SCD pasienter og 5 sunne kontroller inkludert ved University Medical Center Utrecht eller Texas Children ' s hematologi Center, i ulike kliniske studier ( Nederland Trial Registry [NTR] identifikator, NTR 6779 og NTR 6462), samt anonymisert leftover blodprøver fra pasienter som besøkte poliklinisk klinikk eller ble innlagt på sykehus ble brukt.
- Samle blodprøver ved venepunksjon (minimum 300 μL/Sample) i et rør som inneholder EDTA. Sørg for at blodet er lagret i minst 30 min ved 4 ° c, men ikke lenger enn 24 timer.
Merk: citrate fosfat druesukker adenine (CPDA) eller heparin kan også brukes, men påvirkningen av disse reagensene på prøven bevaring med hensyn til oksygen gradient ektacytometry er ikke kjent. - Bland prøven forsiktig ved å vende til homogenisere. Ikke rist prøven. La prøven varmes opp til romtemperatur på en rulle benk før målingen.
Merk: et prøverør (9 – 10 mL) som oppbevares i mer enn 1 time ved 4 ° c, må varmes opp i 15 minutter. Når den oppbevares i mindre enn 1 time ved 4 ° c, må den varmes opp i 10 min. Et prøverør (2 – 6 mL) som oppbevares i mer enn 1 time ved 4 ° c, må varmes opp i 10 minutter. Når den oppbevares i mindre enn 1 time ved 4 ° c, må den varmes opp i 5 min.. - Mål hele blod tellingen på en hematologi analysator. For å gjøre dette, ta 20 – 200 μL av hele blod i et rør som inneholder EDTA. Plasser aspirasjon nålen i røret og trykk på knappen bak nålen på hematologi analysator for å starte målingen.
Merk: i hele blod tellingen, er RBC nummer målt, som er en viktig faktor for standardisering oksygen gradient ektacytometry målinger. RBC Count beregnes fra fremover og sideover scatter ved flyt flowcytometri. Normal RBC telling i sunne kontroller er 3,7 – 5,0 x 1012/l for kvinner og 4.2 – 5.5 x 1012/l for hanner. RBC teller hos pasienter med SCD er generelt redusert. Noen hematologi analyserer vil også måle prosent tette røde blodlegemer (% DRBC) som kan være av ekstra verdi i tolkningen av individuelle oksygen gradient ektacytometry kurver. - Standardisere hele blodprøve til en RBC greven av 200 x 106 RBC i 5 ml PVP (200 x 106 RBC/hetteglass) ved å justere volumet av prøven som vil bli lagt til. Hvis det sum RBC greven er mindre enn 200 x 106, det Diffraksjon mønster og ei ville være berørt.
- Bruk ligningen nedenfor til å utføre tellingen.
4.0/xx (x 1012/l) x 50 = yy μL hele blod/HETTEglass PvP
der XX er beregnet RBC Count innhentet fra trinn 3,3 og yy er mengden av hele blod som er nødvendig for den faktiske målingen. Avhengig av karakteren av anemi og andre faktorer som påvirker RBC teller, mengden av hele blodet som kreves er 40 – 90 μL.
- Bruk ligningen nedenfor til å utføre tellingen.
4. oksygen gradient ektacytometry måling
- Pipetter det beregnede prøvevolumet (yy μL av blod) i PVP for å oppnå et total volum på 5 mL. Prewet spissen ved å forsiktig blanding blodet 3x. Bruk en pipette tupp med en bred åpning for å unngå ekstra stress på RBC. Bland forsiktig prøven manuelt ved å vende til den er homogen.
Merk: åpne PVP hetteglasset for så kort tid som mulig for å unngå luft kontakt. - Trekk langsomt 2,0 mL av blod/PVP-blandingen til en 3 mL sprøyte uten nålen. Trykk på stempelet for å fjerne eventuelle synlige luftbobler og overdreven prøve løsning inntil 1,5 – 1,8 mL er igjen i sprøyten (avhengig av kopp volumet).
- Injiser det totale prøvevolumet langsomt og jevnt i Bob gjennom kontakten. Sørg for at nivået av prøven er over oksygen sensoren (rosa flekk) og over det lille suge hullet. Ikke la noen prøve løsning i sprøyten.
- Klikk ny og fyll ut eksempel-ID, bemerkninger, dato for donasjon, og VISKOSITET av PvP. Klikk OK | Aspirer. Etter 60 s, vil koppen rotere og aspirer prøven for 15 s. Klikk OK når rotasjonen stopper. Lukk maskin lokket. Klikk på Fortsett | Start nå, som oksygen gradient ektacytometry er gjort med en fast gevinst. Målingen vil ta omtrent 28 min.
- Etter målingen skriver du ut rapporten som viser kurven og parameterne som automatisk beregnes av programvaren. Kontroller at rådata lagres automatisk i den angitte mappen i Innstillinger. Maksimalt EI (EIMaks.), minimum EI (eimin), pO2@ 95% ei (POS) og areal (område under kurven) blir automatisk beregnet og lagt til den utskrevne rapporten og rådata.
- Hente ΔEI manuelt ved å beregne forskjellen mellom EIMax og eimin. Beregn den prosentvise oppgangen ved å ta forskjellen i gjennomsnittlig EI før deoxygenation (pO2 100 – 120 mmHg) og gjennomsnittlig ei-verdier under reoksygeneringsskader ved 100 – 120 mmHg.
5. rengjøring av ektacytometer
- Fjern prøve sprøyten og Bytt den ut med en sprøyte fylt med destillert vann eller deionisert vann.
- Trykk på Clean, trekk forsiktig ut kontakten under skylling. Sørg for å skylle i begge retninger.
- Fjern sprøyten og løft Bob. Tørk Bob, koppen og kontakten grundig med en myk klut.
- Bruk en stor sprøyte (10 – 50 mL) for å skylle kontakten for å fjerne vann som gjenstår i rørene og Bob. Blokker den nedre innløp/utløp av Bob for å få tilbake trykk i rørene, og dermed fjerne gjenværende vann.
- Senk Bob i koppen. Maskinen er nå klar til neste måling.
6. stans av maskinen
- Kontroller at maskinen er riktig skylt etter siste måling, som beskrevet ovenfor. Sørg for at de riktige rørene er knyttet til rengjøringsløsningen.
- Lukk programvaren, trykk på Close, og trykk på Start for å starte rengjøringsprogrammet på slutten av dagen.
- Etter å ha fullført hele rengjøringsprogrammet, Fjern sprøyten og løft Bob. Skyll kontakten med en stor sprøyte.
- Tøm avfallsflasken og tørk Bob og koppen med en myk klut. Skyll kontakten for å fjerne vannet som gjenstår i rørene og Bob. Blokker den nedre innløp/utløp av Bob for å få tilbake trykk i rørene, og dermed fjerne eventuelle gjenværende vann.
- Lukk lokket på maskinen. Steng nitrogen flasken. Slå av datamaskinen og maskinen.
Representative Results
Oksygen gradient ektacytometry kan brukes til å karakterisere sickling oppførsel hos pasienter med SCD. I denne studien, blodprøver fra totalt 38 SCD pasienter og fem sunne kontroller ble inkludert. I sunne kontroller, Diffraksjon mønsteret er sirkulær i ro og elliptiske ved høyere skjær stress4. Fra det elliptiske Diffraksjon mønsteret beregnes forlengelse indeks (EI) basert på høyden og bredden på Diffraksjon mønsteret. I oksygen gradient ektacytometry, langsom og kontinuerlig deoxygenation av prøven ved nitrogen gass etterfølges av rask reoksygeneringsskader av omgivelsesluft. Under disse forholdene, kan RBC sickling observeres under deoxygenation. Dette vil føre til en forvrengning av Diffraksjon mønsteret fordi sickled røde celler ikke vil justere riktig under anvendt skjær stress. Derfor synes de å være mindre deformerbare i motsetning til sunne RBC (figur 2).
Figur 3A viser hvordan sigd RBC endring i Shape på deoxygenation, som etterlignet forhold under oksygen gradient ektacytometry, mens kontroll sigd RBC uten deoxygenation viser ingen endring i form. Denne prosessen resulterer i forvrengning av Diffraksjon mønster under oksygen gradient ektacytometry, og dermed i en nedgang i EI. Figur 3B viser de ulike Diffraksjon mønstrene som ulike parametere genereres fra.
En representativ kurve innhentet av ektacytometer er vist i Figur 3C. Seks parametere reflekterer ulike karakteristikker av sickling virkemåten til RBC: EIMax er den maksimale ei ved starten av målingen før deoxygenation. Denne parameteren representerer den opprinnelige plasseringen og gjenspeiler den totale fleksibilitet til den totale RBC-populasjonen ved omgivelsesluft. EImin er minimum ei, som representerer minimal fleksibilitet etter deoxygenation. Denne parameteren gjenspeiler endringer i formen og retningen til (sigd) RBC ved deoxygenation. ΔEI er forskjellen mellom EIMax og eimin, som indikerer hvor mange celler som kan være sigd i løpet av en runde med deoxygenation. 5% Point of Sickling (PoS5%) er pO2 (mmHg) der en 5% reduksjon av eiMax under deoxygenation måles. Dette representerer oksygen spenningen der sickling prosessen starter. Området reflekterer området under kurven, som bestemmes av en integrert beregning av EI og pO2 målinger mellom 100 MmHg og PO2min (mmHg). Dette er resultatet av tidligere beskrevne parametere EIMax, eiminog POS. Recovery representerer forskjellen på ei under den siste delen av reoksygeneringsskader sammenlignet med ei ved Baseline. Både EI-verdier måles ved en pO2 av 100 – 120 mmHg. Denne parameteren reflekterer kapasiteten til RBC som sigd under deoxygenation for å reversere sickling under reoksygeneringsskader22. Parametere fra dupliserte mål hadde generelt en variasjonskoeffisient (CV) < 5% (median 1,83%). I tilfelle en CV > 5% ble innhentet, ble det utført en tredje måling. Parametrene EIMax og gjenvinning er de mest reproduserbar med median CVs < 1%.
Representative kurver av RBC av sunne kontroller, pasienter med HbS trekk (heterozygot HbS), og en homozygote SCD pasienten er vist i Figur 4a. Den representative kurven til HbSC pasienten viser en lavere utvinning, som kan indikere en annen sickling prosess (Figur 4B). Representative kurver av HbSS pasienter behandlet med hvdroksvurinstoff (HU) og overføring er vist i Figur 4C og Figur 4D. Åpenbart er det en stor forskjell mellom representative kurver av HS trekk (HBA celler) og RBC av HbSS pasienter behandlet med overføring (bestående av en blanding av homozygote sigd (HbSS) og homozygote normal (HbAA) celler, Figur 4a ,D). Den klare forskjeller i kurvene på ubehandlet SCD pasienten og Hu og overføring-behandlede pasienter fremhever nytten av denne analysen (Figur 4C,D). Nivåer av HbF og HbS korrelert betydelig med EImin og i mindre grad, med POS (figur 5a-D). Dette indikerer at de laboratorieparametre som er viktige i evalueringen av pasienten er også reflektert i oksygen gradient ektacytometry. Antall sickled celler på normoxia og prosent av tette RBC (DRBCs) begge påvirker EImax verdier, som de er signifikant korrelert (figur 5E–F), som indikerer at EImax reflekterer en annen viktig faktor i sickling prosessen. Disse resultatene viser hvordan ulike egenskaper som har% HbS,% HbF, sickled celler på normoxia, og% DRBCs påvirker ulike parametre.
Figur 1. Skjematisk oppsett av ektacytometer. Ektacytometer bruker et Couette-system for å bruke skjærbelastning på cellene. En rotasjon ytre sylinder (kopp) og en statisk indre sylinder (Bob) brukes til å indusere skjær stress ved etableringen av laminær Flow ved 37 ° c. Mellom Bob og Cup er det et lite gap der blod suspensjonen injiseres. En laserstråle skinner fra Bob gjennom blod fjæring og er spredt av tilstedeværelsen av RBC. Det Diffraksjon mønsteret projiseres og analyseres av et kamera. Forlengelse index (EI) er beregnet med høyden (a) og bredden (b) av Diffraksjon mønster4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Skjematisk oppsett av ektacytometer med oksygen gradient ektacytometry modul. Skjematisk diagram av modulen som viser deoxygenation av blod suspensjonen langsomt med infusjon av nitrogen gass (N2). Oksygen spenningen måles av mengden av slukke av luminophore signalet sendt fra LED-fiber til O2-spot. Ved deoxygenation vil sigd RBC begynne å sigd, deres fleksibilitet vil avta, og de vil ikke lenger justere med elliptiske RBC. Den sickled RBC vil forvrenge Diffraksjon mønsteret, endre formen fra en ellipse til en rhomboid eller diamant-lignende form. Denne endringen i form av Diffraksjon mønsteret resulterer i en reduksjon av EI. Målinger av pO2 og ei blir ikke utført i samme høyde i koppen. Dette sikrer bedre diskriminering mellom deoxygenation og reoksygeneringsskader kurver og dermed en bedre tolkning av kurven. Dette tallet er endret fra Rab et al.22Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representative oksygen gradient ektacytometry kurve og Diffraksjon mønstre. (A) på deoxygenation under forhold som ligner på oksygen gradient ektacytometry, sigd RBC ble løst. I kontroll sigd RBC, de samme forholdene ble brukt, men uten nitrogen gass. Deoxygenated sigd RBC viser en endring i form i motsetning til kontroll RBC. (B) ved deoxygenation og skjær stress (30 pa), Diffraksjon mønsteret endres fra en ellipse til en rhomboid. (C) representative kurve av oksygen gradient ektacytometry. Den maksimale forlengelse indeksen (EIMax) representerer den opprinnelige plasseringen og viser en samlet fleksibilitet av den totale RBC-populasjonen. Minimum EI (EImin) representerer minimal fleksibilitet, som forårsakes av endring i form og orientering av RBC ved deoxygenation. ΔEI (dEI, forskjellen i EI mellom EIMax og eimin) viser hvor mange celler som kan sigd i løpet av en runde med deoxygenation. Point of sickling (PoS, pO2 ved 5% ei nedgang) viser oksygen spenningen når den første RBC begynner å sigd. Området under kurven (fra pO2min = 100 mmHg) beregnes i parameterområdet. Dette oppsummerer EIMax, eiminog POS. Kapasiteten til sickled celler til unsickle under reoksygeneringsskader er representert i parameteren Recovery (prosentandel av EIMax nådd under reoksygeneringsskader). For å hjelpe til med tolkningen ble alle datapunkter koblet sammen i hvert enkelt eksperiment av en linje for å presentere resultatene grafisk. Dette tallet er endret fra Rab et al.22Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Oksygen gradient ektacytometry parametre samsvarer med genotype og behandling regimer av SCD pasienter med SCD. (A) representative graf av RBC av HbS bærere (HbS trekk) og sunne kontroller i forhold til ubehandlede HbSS pasienter. (B) representative graf av RBC av pasienter med hemoglobin SC sykdom (HbSC) i forhold til ubehandlede HbSS pasienter. (C) representative graf av RBC av hvdroksvurinstoff behandlet homozygote SCD pasienter (HbSS Hu) i forhold til ubehandlede HbSS pasienter. (D) representativ graf over RBC av HbSS-pasienter behandlet med blodoverføring (HbSS-overføring) i forhold til ubehandlede HbSS-pasienter. Dette tallet er endret fra Rab et al.22Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Oksygen graderings ektacytometry parametre er knyttet til% HbF,% HbS,% sickled celler ved normoxia og% tette RBC. (A) lineær korrelasjon minimum forlengelse indeks (eimin) og% HbF av 15 HbSS eller HbS/β-talassemi pasienter uten overføring. (B) lineær korrelasjon av eimin -og% HbS. (C) lineær korrelasjon av POS og% HbF. (D) lineær korrelasjon av POS og% HbS. (E) lineær korrelasjon av maksimalt ei (eiMax) og prosent av sickled celler ved normoxia måles med digital mikroskopi. (F) lineær korrelasjon av eiMax og prosentvis tett RBC (% DRBCs) på 21 pasienter med HbSS. Dette tallet er endret fra Rab et al.22Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Innstillinger | ||
| Filer | Lagring katalog | |
| Generelle alternativer | Standard middels viskositet | Viskositet av PVP |
| pO2-skanning | Minimum aspirasjon tid (er) | 60 |
| pO2 Scan skjær stress (PA) | 30 | |
| Bestem pO2 hver (S) | 20 | |
| Glidende gjennomsnittsstørrelse | 2 | |
| pO2 Skann trinn; Redigere | 0-AV; 60-PÅ; 1360 – AV; 1640-AV | |
| Cal. Area mellom (mmHg) | 10 og 100 | |
| pO2-kontroll | Av (ikke avmerket) |
Tabell 1. Den foretrukne innstillingen for ektacytometer.
Discussion
Her beskriver vi oksygen gradient ektacytometry, en metode som kan brukes til å studere sickling atferden til røde blodlegemer fra SCD pasienter under en rekke oksygen konsentrasjoner (Figur 4 og figur 5). For å oppnå reproduserbar resultater, er det viktig å identifisere faktorene som påvirker resultatene. For eksempel, temperaturen har en stor innvirkning på RBC fleksibilitet, hovedsakelig på grunn av dens virkninger på tykkelsen av viskøs løsning (PVP). Vi anbefaler at du utfører en test måling ved starten av dagen for å varme opp maskinen til 37 ° c. Dette vil forbedre reproduserbarheten for resultatene. OSMOLARITETSSYSTEM av viskøs løsning bør være innenfor et smalt område (282 – 286 mOsm/kg for PVP), fordi OSMOLARITETSSYSTEM påvirker hydration status, som igjen påvirker RBC fleksibilitet. PH og viskositet av PVP bør også være strengt regulert. Forskjeller i pH og temperatur kan påvirke kurver dramatisk22. I tillegg, gjenværende vann i koppen, Bob, og rør, kan føre til lyse av RBC, og dermed resulterer i uriktige data, fordi færre intakt RBC stede i koppen vil bli målt.
Innstillinger for å utføre oksygen gradient ektacytometry kan justeres for å løse spesifikke Investigational spørsmål. Foretrukne innstillinger er listet opp i tabell 1. En deoxygenation tid på 1 300 s ble valgt basert på observasjoner som viste at forlengelsen av deoxygenation ikke resulterte i en lavere EImin for de fleste pasientene. I kontrast, forkorte av deoxygenation tid ville hemme discriminative kraft av oksygen gradient ektacytometry. Den reoksygeneringsskader tiden ble satt til 280 s på grunn av den raskt løse HbS polymerer under reoksygeneringsskader, og samtidig restaurering av EI mot verdier målt før deoxygenation. Shear stress ble satt til 30 pa, som er analogt til osmotisk gradient ektacytometry. Senking av denne parameteren kan hemme den discriminative kraften. Deoxygenation kontroll kan brukes hvis et sett med Deoxygenation hastighet påføres hver pasientprøve. I våre foretrukne innstillinger ble dette alternativet slått av fordi frekvensen av deoxygenation er pasient spesifikk på grunn av den unike hemoglobin dissosiasjon kurven. Derfor vil slå på deoxygenation kontrollen eliminere denne karakteristiske fra analysen. Imidlertid er denne funksjonen av oksygen gradient ektacytometry fortsatt under etterforskning.
Flere velkjente faktorer påvirker oksygen graderings ektacytometry parametre, nemlig pH, temperatur og OSMOLARITETSSYSTEM. Ektacytometry, spesielt PoS, er påvirket av 2, 3-diphosphoglycerate (2, 3-DPG)22. Det er også en klar sammenheng mellom% HbF og EImin, og i mindre grad POS (figur 5a-D). EIMax er assosiert med sigd celler på normoxia, som kan forklare observasjonen som kort tid etter en VOC, RBC fleksibilitet på NORMOXIA (eiMax), er høyere. Sistnevnte er forårsaket av ødeleggelsen av de mest sickled cellene, og dermed mindre deformerbare RBC under VOC16. Som vist i figur 5F, er høyere% tett RBC (definert som rbc med hemoglobinkonsentrasjon ≫ 1.11 mg/ml) i stor grad forbundet med en lavere eiMax. Dette indikerer at tette celler er en viktig faktor i RBC fleksibilitet på normoxia, ligner på tidligere rapporterte resultater1.
Standardisering av prøvene er svært viktig for å oppnå reproduserbar resultater og for å skille mellom ulike genotyper og behandlinger. Korrigering for RBC teller er viktig, som antall RBC påvirke intensiteten av Diffraksjon mønsteret. Hvis lavere RBC tall er til stede i gapet mellom Bob og Cup, kurven vil skifte oppover og til venstre. I tillegg kurven vil svinge, hindrer nøyaktig beregning av parametrene, spesielt PoS.
En begrensning av denne teknikken er at EI-verdien representerer et gjennomsnitt av alle celler, inkludert ulike subpopulasjoner. Heterogenitet av RBC populasjoner i SCD pasienter og dens innflytelse på ektacytometry måling har vært intensivt studert. Dette resulterte i standardisering hvor størrelsen på Diffraksjon mønsteret er justert til en fast verdi i stedet for korrigert for RBC Count23,24. Hvorvidt denne måten standardisering bør også brukes til oksygen gradient ektacytometry målingene er under studien.
Flere teknikker for å måle RBC fleksibilitet under hypoxic forholdene ble utviklet basert på en deoxygenation skritt som fant sted utenfor ektacytometer25,26,27. Under disse forholdene ble forskjeller i cellulære atferd ikke observert mellom pasienter med HbS trekk og sunne kontroller under fysiologisk pH25. Oksygen gradient ektacytometry, men viser tydelig en lav, men tydelig PoS i individer med HbS trekk (Figur 4a). Hittil, i rutinemessig klinisk praksis, den eneste alternative metoder for å måle tendensen til en individuell pasientens RBC til sigd in vitro inkluderer en morfologi-baserte sickling analysen: RBC er inkubert under forhold som fremmer HbS polymerisering, slik som lav oksygen spenning eller lav pH. En bindemiddel legges til etter inkubasjons, og prosentandelen av sickled celler blir manuelt eller digitalt telt opp ved hjelp av lys mikroskopi. Mange prekliniske og tidlig fase Pharmacologic forsøk bruke sickling analysen til å generere en sekundær utfallet variabel for å kunne forutsi klinisk effekt i SCD28,29,30,31 ,32. Men det er tidkrevende, variasjon er høy og følsomhet er lav, teknikken er ikke automatisert, og derfor arbeidsintensiv. Videre kan morfologiske endringer på grunn av sickling ikke samsvarer godt med fysiologiske parametre, for eksempel RBC fleksibilitet, fordi det er en 2-dimensjonal statisk analyse2.
Oksygen gradient ektacytometry gir en funksjonell analysen av sickling som er rask og reproduserbar. Dette er en in vitro-test som ikke anser endothelial overflate. Imidlertid, den does skaffe funksjonell aspektene av sickling opptreden og RBC kjennetegnene, gjør den en lovende teknikk for sigd cellen studier. Fremtidige anvendelser av teknikken inkluderer overvåking behandling effekt i SCD pasienter, som fungerer som en biomarkør for nye behandlings strategier, studere sickling atferd, og overvåking chimerism etter stilk cellen transplantasjon i SCD.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis av en Eurostars Grant estar18105 og av et ubegrenset tilskudd gitt av RR Mechatronics. Forfatterne takker Sisto Hendriks og Jan de Zoeten for deres tekniske støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
| Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
| Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
| Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | - | Software |
| Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | - | |
| O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
| Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
| Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
| X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |
References
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. Journal of Clinical Investigation. 65 (1), 189-196 (1980).
- Smith, C., Kuettner, J., Tukey, D., White, J. Variable Deformability of Irreversibly Sickled Erythrocytes. Blood. 58 (1), 71-78 (1981).
- Clark, M., Mohandas, N., Embury, S., Lubin, B. A simple laboratory alternative to irreversibly sickled (ISC) counts. Blood. 60 (3), 659-663 (1982).
- DaCosta, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 56 (1), 9-22 (2016).
- Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
- Ballas, S. K., Mohandas, N. Sickle red cell microrheology and sickle blood rheology. Microcirculation. 11 (2), 209-225 (2004).
- Connes, P., Alexy, T., Detterich, J., Romana, M., Hardy-Dessources, M. D., Ballas, S. K. The role of blood rheology in sickle cell disease. Blood Reviews. 30 (2), 111-118 (2015).
- Hierso, R., et al. Effects of oxidative stress on red blood cell rheology in sickle cell patients. British Journal of Haematology. 166 (4), 601-606 (2014).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformabilityin sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic Gradient Ektacytometry: Comprehensive Characterization of Red Cell Volume and Surface Maintenance. Blood. 61 (5), 899-911 (1983).
- Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 65, 41-50 (2017).
- Steinberg, M. H., Chui, D. H. K., Dover, G. J., Sebastiani, P., Alsultan, A. Fetal hemoglobin in sickle cell anemia: A glass half full. Blood. 123 (4), 481-485 (2014).
- Ballas, S. K., Larner, J., Smith, E. D., Surrey, S., Schwartz, E., Rappaport, E. F. Rheologic predictors of the severity of the painful sickle cell crisis. Blood. 72 (4), 1216-1223 (1988).
- Lande, W. M., et al. The Incidence of Painful Crisis in Homozygous Sickle Cell Disease: Correlation with Red Cell Deformability. Blood. 72 (6), 2056-2059 (1988).
- Lemonne, N., et al. Does increased red blood cell deformability raise the risk for osteonecrosis in sickle cell anemia. Blood. 121 (15), 3054-3057 (2013).
- Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
- Telen, M. Cellular adhesion and the endothelium: E-selectin, L-selectin, and pan-selectin inhibitors. Hematology/Oncology Clinics of North America. 28 (2), 341-354 (2014).
- Papageorgiou, D. P., et al. Simultaneous polymerization and adhesion under hypoxia in sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (38), 201807405 (2018).
- Liu, J., Qiang, Y., Alvarez, O., Du, E. Electrical impedance microflow cytometry with oxygen control for detection of sickle cells. Sensors and Actuators, B: Chemical. 255, 2392-2398 (2018).
- Du, E., Diez-Silva, M., Kato, G. J., Dao, M., Suresh, S. Kinetics of sickle cell biorheology and implications for painful vasoocclusive crisis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1422-1427 (2015).
- Li, Q., et al. Kinetic assay shows that increasing red cell volume could be a treatment for sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (5), 689-696 (2017).
- Rab, M. A. E., et al. Rapid and reproducible characterization of sickling during automated deoxygenation in sickle cell disease patients. American Journal of Hematology. 94, February 575-584 (2019).
- Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization of ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 62 (2), 173-179 (2016).
- Parrow, N. L., et al. Measuring Deformability and Red Cell Heterogeneity in Blood by Ektacytometry. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
- Bessis, M., Feo, C., Jones, E. Quantitation of red cell deformability during progressive deoxygenation and oxygenation in sickling disorders (the use of an automated Ektacytometer). Blood Cells. 8 (1), 17-28 (1982).
- Sorette, M. P., Lavenant, M. G., Clark, M. R. Ektacytometric measurement of sickle cell deformability as a continuous function of oxygen tension. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1987).
- Huang, Z., Hearne, L., Irby, C. E., King, S. B., Ballas, S. K., Kim-Shapiro, D. B. Kinetics of increased deformability of deoxygenated sickle cells upon oxygenation. Biophysical journal. 85 (4), 2374-2383 (2003).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human β-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Abdulmalik, O., et al. Crystallographic analysis of human hemoglobin elucidates the structural basis of the potent and dual antisickling activity of pyridyl derivatives of vanillin. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (12), 1076 (2011).
- Oder, E., Safo, M. K., Abdulmalik, O., Kato, G. J., Discovery, D. New Developments in Anti-Sickling Agents: Can Drugs Directly Prevent the Polymerization of Sickle Haemoglobin In Vivo. British Journal of Haematology. 175 (1), 24-30 (2016).
- Oksenberg, D., et al. GBT440 increases haemoglobin oxygen affinity, reduces sickling and prolongs RBC half-life in a murine model of sickle cell disease. British Journal of Haematology. 175 (1), 141-153 (2016).
- Xu, G. G., et al. Synthesis, and Biological Evaluation of Ester and Ether Derivatives of Antisickling Agent 5-HMF for the Treatment of Sickle Cell Disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3499-3511 (2017).
