Summary
Aqui, apresentamos a ektacytometria de gradiente de oxigênio, um método rápido e reproduzível para medir a deformabilidade das células vermelhas do sangue em amostras de pacientes com doença falciforme desoxigenação controlada e reoxigenação. Esta técnica fornece uma maneira de estudar a noigestação de células vermelhas do sangue e monitorar a eficácia do tratamento da doença falciforme.
Abstract
Na doença falciforme (SCD), uma mutação de ponto único na codificação de genes para beta-globina causa a produção de hemoglobina anormal S (HbS). Quando desoxigenado, hbs pode polimerizar, formando hastes rígidas de hemoglobina, resultando na noigização de glóbulos vermelhos (RBCs). Estes RBCs sickled reduziram significativamente a deformabilidade, causando vaso-oclusão, que conduz às complicações clínicas SCD-relacionadas numerosas, incluindo a dor, o curso, e dano do órgão. A deformabilidade da RBC também é reduzida pela desidratação da RBC, resultando em células vermelhas densas do sangue que são mais propensas a ser ceimais. Até à data, não há um único ensaio laboratorial amplamente disponível, rápido e reprodutível capaz de prever a gravidade da doença ou monitorar diretamente os efeitos do tratamento para terapias novas e não fetais de hemoglobina. Neste estudo, descrevemos um protocolo para medir a deformabilidade da RBC em função do pO2 que permite a quantidade de comportamento de doente em pacientes com DSD. A ektacytometria de gradiente de oxigênio mede a deformabilidade da RBC, expressa como o índice de alongamento (IE), em função do pO2. Rbcs são expostos a um estresse fixo cisalhamento de 30 Pa durante uma rodada de desoxigenação e reoxigenação. Seis parâmetros de leitura são produzidos. Destes, o ponto de engenamento (PoS), definido como o pO2 em que o EI máximo (EImax)mostra uma diminuição de 5%, e ei mínimo durante a desoxigenação (EImin)são os mais informativos, refletindo o pO2 de um paciente individual em que início de enomental e a deformabilidade mínima dos glóbulos vermelhos de um paciente, respectivamente. O PoS está associado à afinidade de hemoglobina de um paciente individual por oxigênio, enquanto o EImin mostra uma forte correlação com os níveis de hemoglobina fetal. Concluímos que a ektacytometria de gradiente de oxigênio é uma técnica promissora para monitorar o tratamento de pacientes com SCD, como um biomarcador para agentes anti-emifiqueimento em ensaios clínicos e pré-clínicos, e uma ferramenta importante para estudar o comportamento de enominagem de RBCs de indivíduos com SCD e traços falciformes.
Introduction
Em SCD, uma mutação de ponto único resulta na produção de HbS, que pode polimerizar após a desoxigenação. A polimerização do HbS causa a noi da enoização dos RBCs e reduz a deformabilidade da RBC. A combinação de adesão à adesão à Adesão à Adesão ao endotelio da RBC leva a várias complicações do SCD, incluindo crises vaso-oclusivas (VOC), acidente vascular cerebral, danos nos órgãos e anemia hemolítica crônica. Mesmo em condições normoxic, a deformabilidade de RBC é comprometida nos pacientes com SCD. A deformabilidade é ainda mais diminuída em baixas concentrações de oxigênio. Os principais intervenientes que determinam a deformabilidade na normoxia são células densas, células irreversivelmente doentes (ISC) e células desidratadas, todas com uma diminuição da relação superfície-volume1,2,3.
A ektactometria é um método estabelecido para medir a deformabilidade da RBC, amplamente utilizada para o diagnóstico de anemias hemolíticas hereditárias, particularmente membranopatias4. Ele também pode ser usado para estudar hemorheologia5,6,7,8,9. A ektacytometria de gradiente osmótico, na qual a deformabilidade da RBC é medida durante uma mudança contínua na osmolalidade, tem sido usada para estudar SCD por mais de uma década10,11. A porcentagem de hemoglobina fetal (HbF) é um dos inibidores mais fortes da polimerização do HbS porque nem o HbF nem seu tetramer híbrido misto (2βSγ) podem entrar na fase12do polímero deoxyHbS. Estudos recentes sugerem que o aumento dos níveis de HbF em pacientes com SCD leva a uma melhor relação superfície-volume, melhorando assim o estado de hidratação e, portanto, a deformabilidade em pacientes não transfundidos11.
A deformabilidade da RBC tem sido estudada no passado como um biomarcador para complicações de SCD, mas com resultados conflitantes. Em estudos realizados transversalmente e em estado estável, indivíduos com níveis mais elevados de deformabilidade da RBC apresentaram maior incidência de osteoneconese e mais crises de dor13,14,15. Em contraste com esses achados, quando comparados aos valores estávels do Estado durante um VOC agudo, a deformabilidade da RBC foi diminuída em estudos longitudinais dentro dos mesmos indivíduos16. Essa discrepância pode ser o resultado do estudo da deformabilidade da RBC em diferentes condições (ou seja, durante o estado estável versus O VOC). A porcentagem de células doentes é alta no início de um VOC e as células são rapidamente destruídas à medida que a crise progride, o que pode explicar a diferença entre os dados de incidência transversal estável do estado e dados longitudinais obtidos durante o VOC. No entanto, outros fatores, como a adesão das subpopulações da RBC à superfície endotelial, também podem ser importantes na ocorrência de TA. Em SCD, é mais clinicamente relevante medir a deformabilidade durante a desoxigenação, pois vaso-oclusão geralmente ocorre nos venules postcapilares hipóxicos e não na rede microcapilar menos hipóxica17. Além disso, a presença de ISCs pode alterar a capacidade de um ektacytometer para medir a deformabilidade na normoxia. A distorção do padrão de difração é causada por ISCs, que resulta do não alinhamento durante o fluxo1,2,3.
Abordagens alternativas para estudar a fisiopatologia do VOC incluem medições da adesão da RBC a uma superfície artificial18,microtometria de microfluxo elétrico de impedância de célulaúnica19,modelos baseados em microfluídicos combinando quantitativa medições da célula falciforme e dessaudade com reologia celular única20,e polimerização induzida por laser21. Embora promissoras, essas técnicas são caras, trabalhosas e exigem treinamento extensivo do operador. Além disso, os ensaios que são baseados em morfologia não têm a capacidade de estudar o comportamento celular, como a deformabilidade, em função de um gradiente de oxigênio.
Neste estudo, descrevemos um ensaio funcional rápido e reproduzível realizado com um ektacytometer. Trata-se de uma medida de ektacytometria de próxima geração que mede os diferentes aspectos qualitativos da deformabilidade da RBC expressos como EI durante a desoxigenação (1.300 s) e reoxigenação rápida (280 s). Esses intervalos de tempo permitem a formação de polímeros HbS e, assim, a ocorrência de alterações morfológicas e, em seguida, a recuperação. A desoxigenação ocorre apartir da introdução de gás nitrogênio, o que diminui lentamente a tensão de oxigênio na amostra de sangue na lacuna entre o bob e o copo do ektacytometer. A deformabilidade da RBC é continuamente medida, enquanto a tensão de oxigênio é medida a cada 20 s por meio de um pequeno ponto O2presente na parede do copo. Durante o teste, aproximadamente 80 medidas de pO2 são acopladas ao EI medido naquele momento. A pressão de oxigênio cai abaixo de 20 mmHg durante a desoxigenação, e a reoxigenação é facilitada pela difusão passiva do ar ambiente. A configuração experimental do módulo ektacytometer e de ektacytometry de oxigênio é descrita na Figura 1 e na Figura 2. O princípio da ektacytometria é baseado na dispersão induzida pela RBC da luz de um feixe de laser. Isso resulta em um padrão de difração elíptica quando o estresse da cisalhamento é aplicado ao mesmo tempo(Figura 1).
Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê ético do Centro Médico Universitário Utrecht (UMCU) e de acordo com a Declaração de Helsínquia. Os pacientes inscritos no Texas Children's Hematology Center (TCHC) foram aprovados pelo IRB local e de acordo com a Declaração de Helsínquia.
1. Considerações gerais
- Comece realizando uma medida de teste para aquecer o bob e o copo. Certifique-se de que a temperatura do bob e copo é de 37 °C. Isso é importante para uma boa reprodutibilidade.
- Certifique-se de que a solução viscosa de polivinilpirrolido (PVP) caia dentro dos limites estritos para a osmolaridade (282-286 mOsm/kg), pH (7,35-7,45) e viscosidade (27,5-32,5 MPa) à temperatura ambiente (22 °C).
NOTA: O PVP deve ser usado à temperatura ambiente. Se armazenado em uma temperatura mais baixa, certifique-se que aqueceu até a temperatura ambiente antes de tomar todas as medidas.
2. Start-up do ektacytometer
- Ligue o computador e o ektacytometer pelas costas. Iniciar o programa de software(Tabela de Materiais)no computador.
- Certifique-se de que o nitrogênio está disponível para desoxigenar a amostra abrindo o cilindro de nitrogênio.
- Abaixe o bob no copo e certifique-se que o copo pode girar livremente. Limpe o copo no interior e fora com um pano macio e água destilada, porque os detritos podem dificultar as medições de EI.
- Quando o programa de software estiver em execução, verifique se há a seguinte mensagem na tela:"Certifique-se de que a válvula de gás está aberta" e clique em OK.
- Certifique-se de que o ektacytometer inicia o processo de auto-verificação do pO2 que aparecerá na tela. Selecione iniciar (digite). Se ele falhar, reexecutar a auto-verificação clicando hardware verificar | pO2 | Auto-check.
NOTA: Se a auto-verificação falhar novamente,considere substituir o O 2-spot. O O2-spoté substituído por empurrar suavemente o local para fora do interior do copo com uma ponta do dedo. Um novo local é colocado por suavemente empurrando o local do lado de fora para o copo. - Escolha a varredura pO2 dos diferentes testes listados à esquerda. Escolha as configurações à direita da tela e certifique-se de que elas sejam definidas de acordo com os parâmetros listados na Tabela 1. Mantenha as mesmas configurações para cada medição.
- A fim de salvar essas configurações, pressione OK | Ok.
NOTA: As configurações preferenciais estão listadas na Tabela 1, mas podem ser ajustadas de acordo com as preferências do usuário e os propósitos de investigação. Por exemplo, para estudar o comportamento de noi, a velocidade e a duração da desoxigenação podem ser alteradas.
3. Coleta e preparação de amostras
NOTA: Para a validação da técnica, o sangue tetraacético de etilediamina (EDTA) tratado de 38 pacientes com DSt e 5 controles saudáveis incluídos no Centro Médico Universitário de Utrecht ou no Centro de Hematologia Infantil do Texas, em diferentes estudos clínicos ( Identificador de Registro de Ensaios Clínicos da Holanda [NTR], NTR 6779 e NTR 6462), bem como amostras anorésias de sangue sobras de pacientes que visitaram o ambulatório ou foram hospitalizados.
- Coletar amostras de sangue por venitura (um mínimo de 300 μL/sample) em um tubo contendo EDTA. Certifique-se de que o sangue foi armazenado por pelo menos 30 min a 4 °C, mas não mais do que 24 h.
NOTA: Fosfato de citrato dextrose adenina (CPDA) ou heparina também pode ser usado, mas a influência desses reagentes na preservação da amostra no que diz respeito à ektacytometria gradiente de oxigênio não é bem conhecida. - Misture a amostra suavemente por inversão para homogeneizar. Não agite a amostra. Deixe a amostra aquecer à temperatura ambiente em um banco do rolo antes da medida.
NOTA: Um tubo de amostra (9-10 mL) que é armazenado por mais de 1 h a 4 °C deve aquecer por 15 min. Quando armazenado por menos de 1 h a 4 °C, ele deve aquecer por 10 min. Um tubo de amostra (2-6 mL) que é armazenado por mais de 1 h a 4 °C deve aquecer por 10 min. Quando armazenado por menos de 1 h a 4 °C, ele deve aquecer por 5 min. - Medir a contagem completa de sangue em um analisador de hematologia. Para fazer isso, pegue 20-200 μL de sangue inteiro em um tubo contendo EDTA. Coloque a agulha de aspiração no tubo e pressione o botão atrás da agulha do analisador de hematologia para iniciar a medição.
NOTA: Na contagem de sangue completa, o número RBC é medido, o que é um fator importante para padronizar as medições de ektacytometria de gradiente de oxigênio. A contagem de RBC é calculada a partir de dispersão para a frente e para o lado pela citometria do fluxo. Contagem normal de RBC em controles saudáveis é 3.7-5.0 x 1012/L para fêmeas e 4.2-5.5 x 1012/Lpara machos. A contagem de RBC em pacientes com SCD é geralmente diminuída. Alguns analisadores de hematologia também medirão por cento de nsa glóbulos vermelhos (% DRBC), que podem ser de valor adicional na interpretação de curvas individuais de ektacytometria de gradiente de oxigênio. - Padronizar a amostra de sangue inteiro para uma contagem de RBC de 200 x 106 RBCs em 5 mL PVP (200 x 106 RBCs/frasco) ajustando o volume de amostra que será adicionado. Se a contagem total de RBC for inferior a 200 x 106,o padrão de difração e a IE serão afetados.
- Use a equação abaixo para realizar a contagem.
4.0/xx (x 1012/L) x 50 = yy μL sangue inteiro/ viaduto PVP
onde xx é a contagem calculada rbc obtida a partir do passo 3.3 e yy é a quantidade de sangue inteiro que é necessário para a medição real. Dependendo do grau de anemia e outros fatores que influenciam a contagem de RBC, a quantidade de sangue inteiro necessária é de 40 a 90 μL.
- Use a equação abaixo para realizar a contagem.
4. Medida da ektacytometria do gradiente do oxigênio
- Pipette o volume calculado da amostra (yy μL do sangue) em PVP para obter um volume total de 5 mL. Prewet a ponta delicadamente resuspendendo o sangue 3x. Use uma ponta de pipeta com uma ampla abertura para evitar estresse adicional sobre os RBCs. Misture suavemente a amostra manualmente por inversão até que seja homogênea.
NOTA: Abra o frasco pvp por um tempo tão curto quanto possível para evitar o contato aéreo. - Lentamente desenhar 2,0 mL do sangue / Mistura PVP em uma seringa de 3 mL sem a agulha. Empurre o desentupidor para remover quaisquer bolhas de ar visíveis e solução de amostra excessiva até que 1,5-1,8 mL seja deixado na seringa (dependendo do volume do copo).
- Injete o volume total da amostra lenta e uniformemente no bob através do conector. Certifique-se de que o nível da amostra está acima do sensor de oxigênio (local rosa) e acima do pequeno buraco de sucção. Não deixe nenhuma solução de amostra na seringa.
- Clique novo e preencha o identificador da amostra, observações, data de doação e viscosidade do PVP. Clique OK | Aspirate. Após 60 s, o copo vai girar e aspirar a amostra para 15 s. Clique OK quando a rotação pára. Feche a tampa da máquina. Clique em Continuar | Comece agora,como ektacytometria gradiente de oxigênio é feito com um ganho fixo. A medida levará cerca de 28 min.
- Após a medição, imprima o relatório que mostra a curva e os parâmetros que são calculados automaticamente pelo software. Certifique-se de que os dados brutos são armazenados automaticamente na pasta designada em Configurações. EI máximo (EImax),EI mínimo (EImin),pO2@95%EI (PoS) e área (área abaixo da curva) são automaticamente calculados e adicionados ao relatório impresso e aos dados brutos.
- Obter manualmente ΔEI calculando a diferença entre EImax e EImin. Calcule a recuperação percentual tomando a diferença na EI média antes da desoxigenação (pO2 100-120 mmHg) e valores de EI média durante a reoxigenação em 100-120 mmHg.
5. Limpeza do ektacytometer
- Retire a seringa da amostra e substitua-a por uma seringa cheia de água destilada ou água desionizada.
- Pressione Limpo,lentamente rubor o conector durante a lavagem. Certifique-se de lavar em ambas as direções.
- Retire a seringa e levante o bob. Seque o bob, copo, e conector completamente com um pano macio.
- Use uma seringa grande (10-50 mL) para lavar o conector, a fim de remover qualquer água restante nos tubos e bob. Bloqueie a enseada/tomada inferior do bob para recuperar a pressão nos tubos, removendo assim a água restante.
- Abaixe o bob no copo. A máquina está agora pronta para a próxima medição.
6. Desligamento da máquina
- Certifique-se de que a máquina seja devidamente enxaguada após a última medição, conforme descrito acima. Certifique-se de que os tubos adequados se relacionam com a solução de limpeza.
- Feche o software, pressione Close e pressione start to start end-of-day cleaning program.
- Depois de completar todo o programa de limpeza, retire a seringa e levante o bob. Lave o conector com uma seringa grande.
- Esvazie a garrafa de lixo e seque o bob e o copo com um pano macio. Lave o conector, a fim de remover a água restante nos tubos e bob. Bloqueie a enseada/tomada inferior do bob para recuperar a pressão nos tubos, removendo assim qualquer água restante.
- Feche a tampa da máquina. Feche o cilindro de nitrogênio. Desligue o computador e a máquina.
Representative Results
A ektacytometria do gradiente de oxigênio pode ser usada para caracterizar o comportamento de enmeamento em pacientes com SCD. Neste estudo, foram incluídas amostras de sangue de um total de 38 pacientes com DST e cinco controles saudáveis. Em controles saudáveis, o padrão de difração é circular em repouso e elíptico em maior estresse de cisalhamento4. A partir do padrão de difração elíptica, o índice de alongamento (IE) é calculado com base na altura e largura do padrão de difração. Na ektacytometria de gradiente de oxigênio, a desoxigenação lenta e contínua da amostra por gás nitrogênio é seguida por reoxigenação rápida pelo ar ambiente. Nessas condições, a noigização da RBC pode ser observada desoxigenação. Isso causará uma distorção do padrão de difração porque as células vermelhas doentes não se alinharão adequadamente o estresse de cisalhamento aplicado. Assim, eles parecem ser menos deformáveis em oposição aos RBCs saudáveis (Figura 2).
A Figura 3A mostra como os RBCs falciformes mudam de forma após a desoxigenação, que imitou as condições durante a ektacytometria de gradiente de oxigênio, enquanto o controle de RBCs falciforme sem desoxigenação não mostra nenhuma mudança de forma. Este processo resulta em distorção do padrão de difração durante a ektacytometria de gradiente de oxigênio e, portanto, em uma diminuição da IE. A Figura 3B mostra os diferentes padrões de difração dos quais são gerados diferentes parâmetros.
Uma curva representativa obtida pelo ektacytometer é mostrada na Figura 3C. Seis parâmetros refletem características diferentes do comportamento falciforme dos RBCs: EImax é o EI máximo no início da medição antes da desoxigenação. Este parâmetro representa a posição de base e reflete a deformabilidade geral da população total de RBC no ar ambiente. EImin é o EI mínimo, que representa deformabilidade mínima após a desoxigenação. Este parâmetro reflete mudanças na forma e orientação de RBCs (foice) após a desoxigenação. ΔEI é a diferença entre EImax e EImin, o que indica quantas células podem foice durante uma rodada de desoxigenação. 5% Ponto de Nai (PoS5%)é o pO2 (mmHg) em que uma diminuição de 5% domáximo de EI durante a desoxigenação é medida. Isso representa a tensão de oxigênio onde o processo de noigamento começa. A área reflete a área a curva, que é determinada por um cálculo integral das medições de EI e pO2 entre 100 mmHg e pO2min (mmHg). Este é o resultado dos parâmetros previamente descritos EImax,EImin,e PoS. Recuperação representa a diferença de EI durante a parte final da reoxigenação em comparação com EI na linha de base. Ambos os valores de EI são medidos em um pO2 de 100-120 mmHg. Este parâmetro reflete a capacidade dos RBCs que foram ceimes durante a desoxigenação para reverter a noiginização durante a reoxigenação22. Os parâmetros das medidas duplicadas geralmente tinham um coeficiente de variação (CV) <5% (mediana de 1,83%). Caso tenha sido obtido um CV > 5%, foi realizada uma terceira medida. Os parâmetros EImax e Recovery são os mais reproduzíveis com currículos medianos e lt;1%.
Curvas representativas de RBCs de controles saudáveis, pacientes com traços HbS (heterozygous HbS) e um paciente de SCD homozygous são mostrados na Figura 4A. A curva representativa do paciente hbsc mostra uma menor recuperação, o que pode indicar um processo de enervação diferente (Figura 4B). As curvas representativas dos pacientes com HbSS tratados com hidroxiureia (HU) e transfusão são mostradas na Figura 4C e na Figura 4D. Claramente, há uma grande diferença entre as curvas representativas das características HS (células HbAS) e RBCs de pacientes com HbSS tratados com transfusão (consistindo de uma mistura de foice homozigous (HbSS) e células homozygous normal (HbAA), Figura 4A D). As diferenças claras nas curvas do paciente scd não tratado e dos pacientes tratados com HU e transfusão destacam a utilidade deste ensaio (Figura 4C,D). Os níveis de HbF e HbS correlacionaram-se significativamente com eImin e, em menor grau, com pos (Figura 5A-D). Isso indica que os parâmetros laboratoriais importantes na avaliação do paciente também se refletem na ektacytometria de gradiente de oxigênio. O número de células doentes na normoxia e a porcentagem de RBCs densos (DRBCs) influenciam os valores eimax, pois estão significativamente correlacionados (Figura 5E-F),o que indica que a EImax reflete outro fator importante processo de noi. Esses resultados mostram como diferentes características, como tem %HbS, %HbF, células doentes na normoxia e %DRBCs influenciam diferentes parâmetros.
Figura 1. Configuração esquemática do ektacytometer. O ektacytometer usa um sistema Couette para aplicar o estresse da cisalhamento nas células. Um cilindro exterior de rotação (copo) e um cilindro interno estático (bob) são usados para induzir o estresse da cisalhamento pela criação de fluxo laminar a 37 °C. Entre o bob e copo há uma pequena lacuna em que a suspensão de sangue é injetada. Um feixe de laser brilha do bob através da suspensão de sangue e está espalhado pela presença de RBCs. O padrão de difração é projetado e analisado por uma câmera. O índice de alongamento (IE) é calculado com a altura (a) e a largura (b) do padrão de difração4. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2. Configuração esquemática do ektacytometer com módulo de ektacytometria de gradiente de oxigênio. Diagrama esquemático do módulo que mostra desoxigenação da suspensão sanguínea lentamente com a infusão de gás nitrogênio (N2). A tensão de oxigênio é medida pela quantidade de extinção do sinal de luminoforre enviado da fibra LED para o ponto O2. Após a desoxigenação, os RBCs falciformes começarão a ser ceimais, sua deformabilidade diminuirá e não se alinharão mais com os RBCs elípticos. Os RBCs doentes distorcerão o padrão de difração, mudando sua forma de uma elipse para uma forma de rodoídia ou diamante. Essa mudança na forma do padrão de difração resulta em uma diminuição da IE. As medições do pO2 e do EI não são executadas na mesma altura no copo. Isso garante uma melhor discriminação entre as curvas de desoxigenação e reoxigenação e, portanto, uma melhor interpretação da curva. Este número foi modificado a partir de Rab et al.22Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Curva representativa de inclinação de oxigênio e padrões de difração. (A)Após a desoxigenação em condições semelhantes à ektacytometria de gradiente de oxigênio, os RBCs falciformes foram corrigidos. No controle foice RBCs, as mesmas condições foram utilizadas, mas sem gás nitrogênio. Rbcs foice desoxigenado mostram uma mudança de forma em contraste com o controle RBCs. (B) Após a desoxigenação e estresse cisalhamento (30 Pa), o padrão de difração muda de uma elipse para um rodoíbio. (C)Curva representativa de ektacytometria de gradiente de oxigênio. O índice máximo de alongamento (EImax)representa a posição de base e mostra uma deformabilidade geral da população total de RBC. O EI mínimo (EImin)representa uma deformabilidade mínima, causada pela mudança de forma e orientação dos RBCs após a desoxigenação. ΔEI (dEI, a diferença na EI entre EImax e EImin)mostra quantas células podem ser ceimedurante uma rodada de desoxigenação. Ponto de enemissão (PoS, pO2 em 5% ei diminuição) mostra a tensão de oxigênio quando os primeiros RBCs começam a ser ceificar. A área a curva (do pO2min = 100 mmHg) é calculada na área do parâmetro. Isso resume EImax,EImine PoS. A capacidade das células doentes para não enjoar durante a reoxigenação é representada no parâmetro de recuperação (porcentagem doEI máximo alcançado durante a reoxigenação). Para auxiliar na interpretação, todos os pontos de dados foram conectados em cada experimento individual por uma linha para apresentar graficamente os resultados. Este número foi modificado a partir de Rab et al.22Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Parâmetros de ektacytometria de gradiente de oxigênio correlacionam-se com genótipo e regimes de tratamento de pacientes com DSC com SCD. (A) Gráfico representativo de RBCs de portadores de HbS (traço de HbS) e controles saudáveis com relação aos pacientes não tratados de HbSS. (B) Gráfico representativo de RBCs de pacientes com doença de Hemoglobina SC (HbSC) em relação aos pacientes não tratados de HbSS. (C)Gráfico representativo de RBCs de hidroxiureia tratados pacientes homozigêus SCD (HBSS HU) em relação aos pacientes não tratados HbSS. (D)Gráfico representativo de RBCs de pacientes com HbSS tratados com transfusão de sangue (transfusão de HbSS) em relação a pacientes com SHS não tratados. Este número foi modificado a partir de Rab et al.22Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Os parâmetros de ektacytometria de gradiente de oxigênio estão associados a %HbF, %HbS, células doentias em normoxia e RBCs densos. (A)Correlação linear do índice mínimo de alongamento (EImin)e %HbF de 15 pacientes com HbS ou HbS/β-talassemia sem transfusão. (B) Correlação linear de EImin e %HbS. (C)Correlação linear de PoS e %HbF. (D)Correlação linear de PoS e %HbS. (E)Correlação linear de EI máximo (EImax)e por cento das células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doentes em células doente normoxia medida com microscopia digital. (F)Correlação linear de RBCsdensas de EI e percentual (%DRBCs) de 21 pacientes com HbSS. Este número foi modificado a partir de Rab et al.22Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Configurações | ||
| Arquivos | Diretório de armazenamento | |
| Opções gerais | Viscosidade média padrão | Viscosidade de PVP |
| exame de pO2 | Tempo mínimo de aspiração (s) | 60 |
| estresse de cisalhamento da varredura pO2 (Pa) | 30 | |
| Determine pO2 cada (S) | 20 | |
| Tamanho médio móvel | 2 | |
| etapa da varredura pO2; Editar | 0-OFF; 60 -ON; 1360 -OFF; 1640 -OFF | |
| Cal. Área entre (mmHg) | 10 e 100 | |
| controle de pO2 | Off (sem controle) |
Tabela 1. A configuração preferida do ektacytometer.
Discussion
Aqui descrevemos a ektacytometria de gradiente de oxigênio, um método que pode ser usado para estudar o comportamento falciforme dos glóbulos vermelhos de pacientes com SCD uma variedade de concentrações de oxigênio (Figura 4 e Figura 5). Para obter resultados reproduzíveis, é importante identificar os fatores que influenciam os resultados. Por exemplo, a temperatura tem um grande impacto na deformabilidade da RBC, principalmente devido aos seus efeitos sobre a espessura da solução viscosa (PVP). Recomendamos a realização de uma medição de teste no início do dia para aquecer completamente a máquina a 37 °C. Isso melhorará a reprodutibilidade dos resultados. A osmolaridade da solução viscosa deve estar dentro de uma faixa estreita (282-286 mOsm/kg para PVP), pois a osmolaridade influencia o status de hidratação, o que, por sua vez, afeta a deformabilidade da RBC. O pH e a viscosidade do PVP também devem ser rigorosamente regulamentados. Diferenças no pH e temperatura podem influenciar curvas dramaticamente22. Além disso, a água restante no copo, bob, e tubos, pode causar a linse de RBCs, resultando em dados incorretos, porque rbcs menos intactos presentes no copo será medido.
As configurações para realizar a ektacytometria de gradiente de oxigênio podem ser ajustadas para responder a questões de investigação específicas. As configurações preferidas estão listadas na Tabela 1. Um tempo de desoxigenação de 1.300 s foi escolhido com base em observações mostrando que a extensão da desoxigenação não resultou em um menorEI min para a maioria dos pacientes. Em contraste, o encurtamento do tempo de desoxigenação dificultaria o poder discriminativo da ektacytometria de gradiente de oxigênio. O tempo de reoxigenação foi fixado para 280 s devido aos polímeros HbS rapidamente resolutivos durante a reoxigenação, e restauração concomitante da IE para valores medidos antes da desoxigenação. O estresse da cisalhamento foi definido como 30 Pa, o que é análogo à ektacytometria de gradiente osmótico. A redução deste parâmetro pode dificultar o poder discriminativo. O controle de desoxigenação pode ser usado se um conjunto de velocidade de desoxigenação for aplicado a cada amostra do paciente. Em nossas configurações preferidas, essa opção foi desligada porque a taxa de desoxigenação é específica do paciente devido à curva única de dissociação de hemoglobina. Assim, ligar o controle de desoxigenação eliminaria essa característica do ensaio. No entanto, esta característica da ektacytometria de gradiente de oxigênio ainda está investigação.
Vários fatores bem conhecidos influenciam parâmetros de ektacytometria de gradiente de oxigênio, ou seja, pH, temperatura e osmolaridade. Ektacytometry, especialmente PoS, é influenciado por 2,3-difosofadeglicetria (2,3-DPG)22. Além disso, há uma clara correlação entre o %HbF e o EImin,e em menor medida PoS (Figura 5A-D). EImax está associado com as células falciformes na normoxia, o que pode explicar a observação de que logo após um VOC, rbc deformabilidade na normoxia (EImax),é maior. Este último é causado pela destruição das células mais doentes e, portanto, RBCs menos deformáveis durante o VOC16. Como mostrado na Figura 5F, RBCs mais ricos em % (definidos como RBCs com uma concentração de hemoglobina >1.11 mg/mL) correlacionam-se fortemente com ummáximode EI mais baixo. Isso indica que as células densas são um fator importante na deformabilidade da RBC na normoxia, semelhante aos resultados relatados anteriormente1.
A padronização das amostras é muito importante para a obtenção de resultados reproduzíveis e para a distinção entre diferentes genótipos e tratamentos. A correção para a contagem de RBC é importante, pois o número de RBCs influencia a intensidade do padrão de difração. Se os números mais baixos de RBC estão atuais na abertura entre o bob e o copo, a curva deslocará para cima e à esquerda. Além disso, a curva flutuará, dificultando o cálculo preciso dos parâmetros, especialmente o PoS.
Uma limitação desta técnica é que o valor do EI representa uma média de todas as células, incluindo subpopulações diferentes. A heterogeneidade das populações de LIN em pacientes com DST e sua influência na medição da ektacytometria têm sido intensamente estudadas. Isso resultou em padronização em que o tamanho do padrão de difração é ajustado a um valor fixo em vez de corrigido para a contagem RBC23,24. Se essa forma de padronização também deve ser aplicada ou não às medições de ektacytometria de gradiente de oxigênio está atualmente em estudo.
Várias técnicas para medir a deformabilidade da RBC em condições hipóxicos foram desenvolvidas com base em uma etapa de desoxigenação que ocorreu fora do ektacytometer25,26,27. Nessas condições, diferenças no comportamento celular não foram observadas entre pacientes com traços de HbS e controles saudáveis pH fisiológico25. Ektacytometry do gradiente do oxigênio, entretanto, mostra claramente um PoS baixo mas evidente nos indivíduos com traços de HbS (figura 4A). Até o momento, na prática clínica de rotina, os únicos métodos alternativos para medir a tendência dos RBCs de um paciente individual para a foice in vitro incluem um ensaio de eroto à base de morfologia: OS RBCs são incubados em condições que promovem a polimerização do HbS, baixa tensão de oxigênio ou baixo pH. Um fixador é adicionado após a incubação e a porcentagem de células doentes é contada manual ou digitalmente usando microscopia de luz. Muitos ensaios farmacológicos pré-clínicos e de fase inicial usam o ensaio de doie para gerar uma variável de desfecho secundário para ser capaz de prever a eficácia clínica em SCD28,29,30,31 32de pessoas. No entanto, é demorado, a variabilidade é alta e a sensibilidade é baixa, a técnica não é automatizada e, portanto, trabalhosa. Além disso, as alterações morfológicas devido à noidura podem não se correlacionar bem com parâmetros fisiológicos, como a deformabilidade da RBC, pois é um ensaio estática de 2 dimensões2.
A ektacytometria do gradiente do oxigênio fornece um ensaio funcional do sickling que é rápido e reproducible. Este é um teste in vitro que não considera a superfície endotelial. No entanto, ele fornece aspectos funcionais do comportamento falciforme e características RBC, tornando-se uma técnica promissora para estudos de células falciformes. Futuras aplicações da técnica incluem monitoramento da eficácia do tratamento em pacientes com SCD, atuando como biomarcador para novas estratégias de tratamento, estudo do comportamento de noie, e monitoramento do quimerismo após o transplante de células-tronco em SCD.
Disclosures
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte por uma subvenção Eurostars estar18105 e por uma subvenção irrestrita fornecida pela RR Mechatronics. Os autores agradecem a Sisto Hendriks e Jan de Zoeten por seu apoio técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
| Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
| Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
| Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | - | Software |
| Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | - | |
| O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
| Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
| Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
| X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |
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