Summary
이 방법은 급진적 인 전립선 절제술을 따르는 바이오 뱅킹 조직이 샘플링 절차를 안내하기 위해 전립선 암 환자에 대한 임상 진단 데이터를 활용하는 것을 포함합니다. 이것은 다운스트림 응용의 넓은 범위에 대한 새로운 조직의 효율성과 가용성에 관한 이전에 게시 된 방법과 문제를 극복한다.
Abstract
바이오 뱅킹 전립선 조직에 대한 이전 방법, 급진적 인 전립선 절제술다음, 일반적으로 무작위 샘플링을 포함. 효율성을 높이고 더 넓은 범위의 다운스트림 응용을 가능하게 하기 위해 전립선 조직을 샘플링하는 보다 표적화된 방법이 개발되었습니다. 여기에서 우리는 자기 공명 화상 진찰 (MRI) 및 생검 데이터를 둘 다 샘플링을 위한 기관의 특정 지역을 표적으로 하기 위하여 이용합니다. 이 방법은 전립선의 소정의 영역에서 5mm 횡방향 슬라이스를 제거하고, 이 슬라이스의 소정의 영역에서 6mm 펀치 생검을 제거한 다음 이전에 출판된 전립선 슬라이스 장치의 사용을 포함한다. 이러한 샘플은 바이오뱅킹 을 목적으로 냉동 또는 고정저장될 수 있거나, 무작위 샘플링 접근법으로부터 10% 신뢰와 비교하여 종양 함량의 70% 신뢰도를 가지고 즉시 신선히 사용할 수 있다. 이것은 게놈, proteomics 또는 조직학 일과 같은 모든 표준 다운스트림 기술의 사용을 가능하게 합니다, 그러나 또한 살아있는 조직 화상 진찰 또는 ex vivo 문화와 같은 신선한 조직을 요구하는 작동합니다.
Introduction
고품질 인간 전립선암 조직에 대한 접근은 현장에서 효과적인 연구를 추진하는 데 중요한 요구 사항입니다. 연구를 위한 급진적인 전립선 절제술다음 전립선 조직을 견본하는 기존 방법의 수가 있습니다. 전형적으로 이들은 전립선 조직의 신선, 동결 또는 고정된 조각에서 무작위 견본을 취하기 위하여 펀치 생검을 사용하여 관련시키고, 에 의해 평가된 것과 같이 헤마톡실린 & 에오신 (H&E)에 의해 각 견본에서 종양이 존재하는지 여부를 소급확인합니다 비뇨기과 의사1,2,3,4,5. 최근 검토는 이러한 기존 방법의 개요를컴파일했다 6. 이러한 방법은 국제 암 게놈 컨소시엄 (ICGC) 및 암 게놈 아틀라스 (TCGA)와 같은 대규모 게놈 분석과 같은 나중에 종양 함량을 위해 조직을 저장하고 평가 할 수있는 특정 다운 스트림 응용 프로그램에 유용합니다. 4,7. 그러나, 이 방법은 우리가 자기 공명 화상 진찰 (MRI) 및/또는 생검 데이터를 표본 추출을 위한 전립선의 특정 지역을 표적으로 하기 위하여 이용하는 경우에 에 향상될 수 있었습니다. 이렇게 하면 두 가지 방법으로 방법론이 향상됩니다. 첫째, 수집된 조직 샘플의 수를 줄이고, 효율성을 높이고, 병리학 부서에 대한 압력과 저장 비용을 감소시킴으로써, 둘째, 신선한 조직이 즉각적인 확인 없이 즉시 사용될 수 있도록 함으로써 종양 함량, 살아있는 조직 화상 진찰, 오르가노이드 생성 또는 생체 배양과 같은 예술 다운스트림 기술의 새로운 상태에 대한. 이러한 연구의 필요성은 PEOPLE(rEsearch용 PatiEnt prOstate samPLes) 방법의 개발로 이어졌으며, PEOPLE을 이용한 바이오뱅크의 첫 84례의 결과는 최근8건의공표되었다. 이 방법의 변형은 또한 3차원(3D) 인쇄슬라이싱 장치 및 환자 특이적 몰드와 함께 출판되었으며, 사전 및 사후 고정 조직9,10에생체 내 MRI를 용이하게 하기 위해.
Protocol
이 프로토콜은 현지 지침을 준수하며 UCL/UCLC 바이오뱅크 연구 윤리 위원회(참조 15/YH/0311)의 승인을 받았습니다.
참고: 이 방법은 인체 조직의 샘플링을 포함하므로 프로토콜을 시작하기 전에 윤리 및 동의에 관한 모든 국소 절차를 준수해야합니다. 급진적 전립선 절제술 케이스는 MRI와 생검 데이터가 수술 의 앞에 유효하다면, 종양 직경 ≥5 mm. 케이스는 색인 병변이 잘 정의되지 않는 경우에 제외되어야 합니다, 즉, 단지 확산 변경은 MRI에 의해 보입니다.
1. 전립선 슬라이스 장치
- 전립선 슬라이스 장치(재료 표)를구입 하십시오. 또는 이전에 게시된10과같이 3D 프린터를 사용하여 블레이드 핸들을 인쇄합니다.
참고: 여기에 사용되는 장치와 일회용 블레이드는 영국 런던 암 연구소에서 재료 이전 계약에 따라 구입했습니다.
2. 종양 표적
- 진단 생검에 의해 지시된 것과 같이 색인 병변을 확인하기 위하여 임상 노트를 검토하십시오, 예를 들면, 좌측 후방.
- MRI 이미지를 검토하여 위 종양의 위치를 측정합니다.
- 종양이 축 평면에서 가장 눈에 띄는 서열을 찾습니다(예: T2 가중치)
- 축 이미지를 스크롤하여 종양이 가장 큰 이미지를 찾고 참조용 이미지를 인쇄합니다.
- 상응하는 관상 이미지에서, 선택한 축 위치까지의 전립선 기저부로부터의 거리, 그리고 정점에서 염기(mm)까지의 전립선의 전체 길이를 측정하고, 참조를 위해 인쇄한다.
3. 전립선의 컬렉션
- 환자 노트를 확인하여 이 절차 및 다운스트림 연구 응용 프로그램에 대해 적절한 정보에 입각한 동의가 얻어졌음을 확인하십시오.
- 급진적 인 전립선 절제술에 따라 마른 냄비에 전립선을 수집하십시오. 포르말린이나 다른 고정제가 전립선에 첨가되지 않았는지 확인하십시오.
- 샘플링을 위한 적합한 멸균 위치로 이송, 예를 들어, 병리학 실험실에서 층류 후드.
- 신선한 조직이 필요한 경우 가능한 한 빨리 샘플링을 진행하십시오.
참고: 특정 응용 프로그램 (예를 들어, RNA만큼 빨리 저하되지 않아야 하는 DNA의 평가)를 위해, 견본을 냉장하고 다음날 견본을 취하는 것이 적색일지도 모릅니다.
4. 표본 준비
- 멸균 기술을 사용하여 국소 오염 제거 절차에 따라 라미나 흐름 후드 및 전립선 슬라이싱 장치를 준비합니다. 여기서 70% 에탄올을 분사하고 모든 표면을 닦으소세요. 멸균 일회용 바늘과 메스를 사용하십시오. 슬라이서 블레이드를 최대 3 회 사용하십시오. 뜨거운 비눗물에 사용할 때마다 씻은 다음 70 % 에탄올로 스프레이하고 닦으하십시오.
- 표준 척도를 사용하여 전립선 (g)을 계량하십시오.
- 전립선에 잉크를. 왼쪽에 파란색 잉크를, 오른쪽은 검은색 잉크로 칠합니다. 나중에 수술 마진을 나타내기 위해 잉크로 전체 캡슐과 정액 소포를 덮습니다.
참고: 수동 처리 절차는 로컬로 다를 수 있으며 그에 따라 수정할 수 있습니다.
5. 전립선 슬라이스
- 벽을 스탠드의 베이스에 수직으로 삽입하여 슬라이싱 장치를 조립합니다(그림1A).
- 전립선을 배치하여 전립선과 정점을 반대쪽 벽을 향하여 뒤쪽쪽을 아래로 그리고 앞쪽으로 향합니다. 전립선 주위에 금핀을 놓습니다. 슬라이스 하는 동안 전립선을 지원 하는 아늑한 적합을 얻기 위해 필요한 경우 약간 안쪽으로 전립선을 밀어.
- 눈금자를 사용하여 기지에서 정점에 이르기까지 전립선 길이를 측정하고 MRI로 측정한 전립선 길이와 비교합니다. 전립선이 줄어든 경우, 기지에서 대상 횡방향 슬라이스까지 예상 거리에 임시 보정을 적용합니다. 예를 들어, MRI 이미지에서 전립선의 전체 길이가 50 mm이지만 이 시점에서 눈금자로 측정하면 45mm로 축소된 경우 예상 슬라이싱 위치를 10% 줄입니다.
- 베이스에서 원하는 횡방향 슬라이스로 측정합니다. 이 측정값에 가장 가까운 핀을 선택하여 슬라이스합니다.
- 부상을 방지하기 위해 체인 메일 장갑을 착용하고 슬라이스 장치(그림 1B)를잡고 식별 된 핀의 양쪽에 블레이드를 배치하고 스페이서를 사용하여 블레이드를 5mm 간격으로 유지하십시오. 긴스트로크(그림 1C)를통해 블레이드를 아래, 앞뒤로 천천히 단단히 움직여 슬라이스합니다. 장치를 분해하기 전에 전체 슬라이스가 분리되었는지 확인합니다.
- 벽과 핀을 제거하고 조심스럽게 장갑을 사용하여 코르크 보드의 멸균 시트에 슬라이스를 꺼내.
6. 조직 샘플링
- 가로 슬라이스를 시각적으로 검사하고 축 MRI 이미지와 비교합니다. 어떤 경우에, 종양 지역은 주변 조직 보다는 창백한 나타날 수 있습니다.
- 가로 슬라이스를 부드럽게 만져주세요. 어떤 경우에, 종양은 주변 조직 보다는 더 단단하게 느낄 수 있습니다.
- 축 MRI 이미지를 가이드로 사용하여 샘플링을 위해 하나 이상의 영역을 선택합니다.
-
조직의 원하는 영역의 생검 펀치를 가져 가라.
- 6mm 펀치를 사용하여 원하는 조직 부위를 밀어 내세요.
- 조직 펀치를 코르크에 대고 비틀어 완전히 분리하고 필요한 경우 날카로운 메스를 사용하여 분리하십시오.
- 플런저를 사용하여 분출하여 필요에 따라 펀치를 제거하고 튜브/몰드에 넣습니다.
- 필요에 따라 별도의 멸균 생검 펀치로 추가 종양 및 양성 샘플을 반복하십시오. 펀치가 빨간색으로 찍은 구멍을 잉크로 만듭니다.
- 전립선의 무게와 조직 색상 / 견고성에 대한 관찰과 함께 각 펀치의 위치를 주목하십시오.
7. 지역 진단을 위한 전립선 제출
- 조직 수축 및 뒤틀기를 방지하기 위해 고정하기 전에 멸균 일회용 바늘로 코르크에 전립선을 고정, 이는 수술 마진의 모양을 변경할 수 있습니다.
- 코르크에 고정 한 후, 표준 임상 진단을위한 조직 병리학 부서에 전립선을 제출하십시오.
8. 장치의 오염 제거
- 일회용 모든 장비는 생의학 폐기물 스트림 및/또는 현지에서 지정된 용기에 버리십시오.
- 인간 조직에 적합한 국소 위험 평가에 따라 층류 후드 및 전립선 슬라이스 장치를 오염 제거합니다(예를 들어, 70% EtOH 및 닦아내).
Representative Results
PEOPLE 방법을 사용하여 샘플링된 신선한 전립선 조직은 게놈 염기서열 분석 및 생체 내 배양을 포함하는 다양한 다운스트림 기술에 사용될 수 있다. 이 메서드를 사용하여 샘플링된 처음 59개의 사례는 초기 다운스트림 데이터8과함께 메서드의 이전 버전과 비교하여 이전에 게시되었습니다. 전립선을 처음 슬라이스에서 펀치 생검을 동결/고정하는 데까지의 시간은 약 1분이었으며, RNA의 분해를 피하기 위해 최소한으로 유지되었습니다. 전립선 슬라이스의 제거에서 전립선 슬라이스에 시간 또한 최소로 유지 되어야 한다, 비록 여기이 약 했다 20 다른 위치에 있는 우리의 극장 및 병 리 실험실 으로 인해 분.
다운스트림 적용에 따라, 전형적으로 적어도 2개의 견본은 취합니다: 예상되는 종양 조직의 지역에서 하나 및 예상되는 양성 조직의 지역에서 하나. 샘플링 방법 자체에 대한 성공의 주요 척도는 주어진 샘플에서 종양 함량을 평가하는 것이다.
100,000게놈 프로젝트에 진입하려면 H&E 염색 된 조직 섹션은 비뇨기과 의사에 의해 평가되어야하며 샘플에는 적어도 40 % 종양 세포가 포함되어야합니다. 40% 미만의 종양을 포함하는 견본은 성공적으로 macrosected인 경우에 프로젝트에 아직도 포함될 수 있습니다. 이러한 방식으로 샘플링된 처음 92건 중 64%는 적어도 40% 종양을 포함하고 거시적 해부 없이 100,000게놈 프로젝트에 제출하였다. DNA를 추출하고 모든 경우에 충분한 수율 및 품질을하였다(표 1). 이러한 샘플 중 59개의 초기 하위 집합은 이전 방법8과비교하여 이전에 게시되었습니다.
ex vivo 배양물의 경우, 일치하는 종양 및 양성 조직은 현저한 분해 없이 72시간 배양을 견딜 수 있는 충분한 품질이어야 한다. 총 3명의 환자로부터다중의 다중 조직 샘플을 성공적으로배양하였고 8.
그림 1: 전립선 슬라이스 장치. 이 장치는 암 연구 연구소로부터 물질 이전 계약에 따라 수득되었다. (A)벽은 염기에 수직으로 삽입되고, 금 핀은 전립선을 둘러싼 염기에 삽입된다 (전립선은 그림이 아님). (B)교체 가능한 병렬 블레이드가 블레이드 핸들에 삽입됩니다. (C)블레이드는 전립선의 5mm 부분을 슬라이스하기 위해 골드 핀 사이를 통과합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| n (%) | |
| 히트 (>40% 종양) | 59 (64%) |
| 부분 적중 (5-30 % 종양) | 6 (7%) |
| 미스 (0% 종양) | 27 (29%) |
| 총 | 92 (100%) |
표 1: 종양 적중률. 종양 적중률은 H&E 염색 된 조직의 검토에 따라 전립선암 전문 컨설턴트 병리학자에 의해 결정되었습니다. >40%의 종양 세포 함량은 유전체학 영국 지침에 따라 100,000 게놈 프로젝트에 포함시키기에 적합한 것으로 결정되었다.
Discussion
이 프로토콜 내의 중요한 단계는 샘플링을 위한 종양 지역, 전립선의 측정 및 조직 샘플링을 포함합니다. 첫째, 샘플링의 정확한 영역을 식별하기 위한 MRI의 측정이 중요합니다. 우리는 함께 비디오에서이 방법을 보여 줍니다. 그러나, 우리는 또한 첫번째 인스턴스에 있는 방사선 전문의와 측정을 확인하는 것을 추천합니다. 인덱스 병변을 포함하는 MRI 심상의 지역을 향해 연구원을 가리키는 명확한 임상 노트는 이상적이다. 둘째, 전립선의 측정은 눈금자가 전립선의 앞쪽과 평행하게 기지에서 정점에 이르는 전체 길이를 측정하기 위해 각도로 유지되도록주의하여 수행되어야합니다. 셋째, 종양 부위는 원래 MRI 이미지와 관련하여 조직 조각을 육안으로 검사하고 조직을 촉지 (어떤 경우에는 종양 영역이 더 조밀하게 느낄 수 있음) 및 조직의 색상을 시각적으로 평가하여 샘플링하기 전에 확인되어야합니다 (일부 경우) 종양이 주변 양성 조직보다 더 창백하게 나타날 것입니다).
이 프로토콜은 비 임상 박사 후 연구원, 병리학 연구원, 병리학 컨설턴트 및 연구 기술자에 의해 UCL/UCLH에서 전체적으로 수행되었습니다. 우리의 경험에서 프로토콜의 모든 단계는 기술적 배경에 관계없이 10 가지 미만의 사례에서 배울 수 있습니다. 그러나, 우리는 MRI 측정및 첫번째 인스턴스에 있는 슬라이스에 관하여 병리학자에게서 훈련에 관하여 방사선학자에게서 훈련을 추천합니다. 프로토콜은 이전에 게시된10과같이 3D 인쇄 슬라이싱 핸들을 사용하여 수정할 수 있습니다.
기술의 잠재적인 한계는 진단에 방해의 리스크를 포함합니다. 전립선을 자르는 것은 중요한 단계이며, 잘못 수행하면 등급 또는 양수 마진율에 방해가 될 수 있습니다. 여기에는 두 가지 잠재적인 문제가 있습니다. 첫째, 모든 색인 병변이 제거되고 신선한 조직 실험을 위해 즉시 사용되는 경우, 일상적인 임상 진단은 이 병변에 대해 수행되지 않으며 환자는 더 낮은 등급의 암을 갖는 것으로 잘못 진단될 수 있다. 이를 피하기 위해 연구원은 샘플링 전에 사례를 정기적으로 검토하고 촬영 할 샘플의 수와 위치에 동의하는 컨설턴트 병리학자와 샘플링 계획을 논의해야합니다. 작은 종양은 이러한 이유로 국소적으로 제외될 수 있다. 둘째, 전립선 캡슐이 고정하기 전에 코르크 보드에 올바르게 고정되지 않으면 내부 조직이 고정 중에 바깥쪽으로 부풀어 오르도록하여 수술 마진을 변경할 수 있습니다. 이것은 거짓 양성 마진으로 이끌어 낼 수 있었습니다, 나머지 종양은 조직 뒤틀기 때문에 순전히 캡슐에 상주하는 것처럼 보입니다.
기존 방법에 관하여 이 기술의 중요성은 주로 종양 표적으로 거짓말. 급진적 인 전립선 절제술 표본을 샘플링하기위한 방법의 범위는 현재까지 출판되었습니다; 그러나, 이들은 모두 완전히 또는 부분적으로 임의의 샘플링 접근 방식에 의존1,2,3,4,5,6,7. 여기에서 생검 및 특히 MRI 데이터의 사용은 종양 조직을 얻기의 증가한 신뢰와 감소된 표본 추출을 허용하는 효율성을 향상시켰습니다8.
이 방법의 향후 응용 프로그램은 이전 샘플링 방법보다 더 넓은 범위의 다운스트림 기술을 채택할 수 있습니다. 예를 들면, 종양인의 높은 확률이 있는 신선한 조직의 가용성은 많은 견본이 종양의 존재를 지키기 위하여 요구되지 않기 때문에 더 비싸고 노동 집약적인 신선한 조직 기술이 이용될 수 있다는 것을 의미합니다. 이는 전 생체 배양, 생체 내 MRI, 고급 이미징 및 전사체를 포함하며 이에 한정되지 않을 수 있다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 전립선 암 영국 우수 및 여행 상 펠로우십 (TLD-PF16-004)와 혁신 (PG14-018-TR2)에서 HP의 밑에 자금 조달을 위한 전립선 암 UK를 인정하고 자합니다. 이 일은 건강 연구 대학 대학 런던 병원 생물 의학 연구 센터에 있는 연구원에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 mm biopsy punch | Fisher Scientific | 13404607 | Disposable biopsy punches for removing 6 mm tissue samples |
| Black Ink | Leica Biosystems | 3801753 | Tissue marking & margin dye |
| Blue Ink | Leica Biosystems | 3801751 | Tissue marking & margin dye |
| Chainmail hand glove | Arco | 1456803 | Chainmail gloves to protect hand during slicing |
| Cork board | Fisher Scientific | 12396447 | Cork board for pinning prostate to following sampling procedure |
| Needles | SLS (Scientific Laboratory supplies) | SYR6112 | Sterile needles to use to pin tissue to cork board following sampling |
| Prostate slicing aparatus | Insitute of Cancer Research, London | NA - must be obtained under MTA | A kit containing the slicer handle, blades, spacer, base, walls and pins |
References
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