Summary
ここでは、RNAシーケンシングおよびRT-qPCRに対するショウジョウバエ男性アクセサリー腺(二次細胞)から特定の細胞集団を解離し、ソートするプロトコルを提示する。細胞分離は、解剖、プロテアーゼ消化および機械的分散を必要とする多段階解離プロセス後のGFP発現二次細胞のFACS精製によって達成される。
Abstract
臓器の機能を理解するために、多くの場合、その構成細胞集団の役割を理解することが有用である。残念ながら、個々の細胞集団の希少性は、多くの場合、分子研究のための十分な材料を得ることを困難にします。例えば、ショウジョウバエ男性生殖系の付属腺には、2つの異なる分泌細胞タイプが含まれています。主細胞は腺の分泌細胞の96%を占め、二次細胞(SC)は残りの4%の細胞(雄あたり約80細胞)を構成する。両方の細胞型は精液の重要な成分を産生するが、SCに特異的であることが知られている遺伝子はごくわずかである。SCの希少性は、これまでのところ、この重要な細胞型のトランスクリプトーミクス解析研究を妨げている。ここでは、RNA抽出及びシーケンシングのためのSCの精製を可能にする方法を提示する。プロトコルは、最初にSC特異的GFPレポーターを発現するハエから腺を解剖し、次にこれらの腺をプロテアーゼ消化と機械的解離にさらして個々の細胞を得ることで構成される。これらのステップに続いて、個体、生きている、GFPマーク付き細胞は、RNA精製のための蛍光活性化細胞選別機(FACS)を用いてソートされる。この手順では、1日の間に下流RT-qPCRおよび/またはRNAシーケンシングの条件ごとに約40人の男性からSC特異的RNAが得られます。手順の迅速性と簡易性は、異なる種型または環境条件から、多くの異なるハエのトランスクリプトームを短期間で決定することを可能にします。
Introduction
臓器は複数の細胞型で構成され、それぞれが個別の機能を持ち、時には非常に異なる遺伝子のセットを発現します。臓器がどのように機能するかを正確に理解するためには、この臓器を構成するそれぞれの異なる細胞型を研究することがしばしば重要です。可能な機能を探索するために使用される主な方法の 1 つは、トランスクリプトーム分析です。この強力な方法は、細胞内の遺伝子発現のスナップショットを提供し、活性プロセスおよび経路を明らかにする。しかし、この種の分析は、はるかに豊富な隣接細胞から精製しなければならない希少な細胞集団では、しばしば困難である。例えば、ショウジョウバエ男性アクセサリー腺は、主に2つの分泌細胞型からなる器官である。2つの細胞タイプの稀な部分は、この腺の細胞のわずか4%を含むので、細胞型特異的トランスクリプトーム分析の使用は、これらの細胞の機能を決定するのに役立たなかった。
アクセサリー腺(AG)は、昆虫の男性の生殖管の器官です。彼らは精液(精液タンパク質(SGP)および付属腺タンパク質(AAP)のほとんどのタンパク質の生産を担当しています。これらのSAFPのいくつかは、交尾雌における生理的および行動的応答を誘発することが知られており、一般に交尾後応答(PMR)と呼ばれる。一部のPMRには、排卵および卵子産卵率の増加、精子の貯蔵および放出、女性の食事療法の変化、および二次求動男性1、2に対する女性受容性の低下が含まれる。昆虫は人間の健康(致命的な病気のベクターとして)から農業(昆虫は害虫でありながら、受粉や土壌の質にとって重要である)に至る多くの主要な社会的問題に影響を与えるので、昆虫の繁殖を理解することは研究の重要な領域です。AGとAGPの研究は、モデル生物のショウジョウバエメラノガスターで大幅に進められている。これらの研究は、AGと彼らがPMRを作成する際に生成する個々のタンパク質の一部の役割を強調し、疾患ベクターAedes aegypti3、4、および他の昆虫1のような他の種の研究に影響を与えました1 、5.さらに、AGが精液1、6の成分を分泌するように、それらはしばしば哺乳動物前立腺および精液胞の機能的類似体と考えられている。この機能の類似性は、2つの組織型間の分子類似性と組み合わされ、AGをハエ7における前立腺のモデルにした。
ショウジョウバエの男性の中には、アクセサリー腺の2つの葉があります。各葉は、中央のルーメンを取り囲む分泌細胞の単層で構成され、平滑筋で包まれた嚢状の構造として見ることができます。前述のように、この腺を構成する形態学的、発達的および機能的に明確な分泌細胞タイプの2つがあります:多角形形の主細胞(細胞の約96%を構成する)と、より大きな円形の二次細胞(SC)(残りの4%の細胞、またはローブあたり約40細胞)。両方の細胞型がPMRを誘導および維持するためにAAPの異なるセットを作り出すことが示されている。現在までに得られたデータのほとんどは、PMRの特徴的な挙動のほとんどを引き起こす単一のタンパク質の役割を強調しています。このタンパク質は、性ペプチド、主細胞8、9、10によって分泌される小さい、36アミノ酸ペプチドである。性ペプチドはPMRに大きな役割を果たしているように見えるが、主細胞と二次細胞の両方によって産生される他のAPCは、PMR11、12、13、14の様々な側面に影響を与えることも示されている。 ,15,16,17.例えば、我々の現在の知識に基づいて、SCは、それらが産生するタンパク質を介して、最初の18日後のSPシグナル伝達の永続化のために必要とされる。
SCの希少性(男性1人につきわずか80細胞)を考えると、これらの細胞とそれらが産生するタンパク質に関するすべての知識は、遺伝学と候補アプローチから来ています。これまでのところ、比較的小さな遺伝子のリストのみがSC特異的であることが示されている。このリストには、ホメオドメインタンパク質欠陥証明(Dve)19、lncRNA MSA20、Rab6、7、11および1921、CG1656およびCG17575 11、および含まれる。 15,21およびホキオーボックス転写因子腹部 B (Abd-B)18.以前に、二次細胞におけるAbd-BおよびlncRNA MSAの発現に対する変異欠損(iab-6cocuD1変異体)は、PMRの長さを〜10日から1日12日に短縮することを示した。,18歳,20.この表現型は、女性の生殖管12、18、20におけるSPの不適切な貯蔵によって引き起こされるようです。細胞レベルでは、この変異体の二次細胞は異常な形態を示し、その特徴的な真空様構造18、20、21を失う。この変異線を用いて、以前に野生型または変異型アクセサリー腺12から全AGの転写プロファイルを比較することにより、SC機能に関与する遺伝子を同定しようと試みた。また、他の研究室は、SC番号、形態および真空含有量が男性の食事、交配状態および年齢21、25、26に依存することを示した。
これらのアプローチを用いて肯定的な進歩がなされたが、完全なSCトランスクリプトームは達成にはほど遠かった。この器官のこれらの細胞の希少性は、野生型細胞からさらに進歩することを困難にしました。遺伝子発現をテストするために、特定の環境刺激後のこれらの細胞の変化はさらに困難であろう。したがって、異なる遺伝的背景や環境条件下で実行するのに十分な速く、簡単なSC RNAを分離および精製する方法が必要でした。
Abd-BおよびMSA遺伝子の両方は、SC18、20における発現のために、ショウジョウバエビオラビホラックスコンプレックス(D1エンハンサーと呼ばれる)からの特定の1.1 kbエンハンサーを必要とする。このエンハンサーは、以前にUAS-GFPに関連付けられている場合、特にSCで強力なGFP式を駆動することができるGAL4ドライバを作成するために使用されてきました。したがって、この行を FACS プロトコルの基礎として使用して、これらの細胞を野生型とiab-6cocuD1 AG の両方から分離します。iab-6cocuD1変異型SCは異なる細胞形態を示すので、このプロトコルは、非常に異なる条件下でこの希少細胞型から転写物の決定のために細胞を単離するために使用できることを示す。
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Protocol
1.ショウジョウバエライン使用と男性のコレクション
- このプロトコルでは、メインセルではなく、SC で GFP を発現するオスを使用します。ここで、AbdB-GAL4ドライバ(参照18に記載)を、UAS-GFP(染色体2上)と組み合わせて使用する。その他の適切なドライバも使用できます。異なる変異条件下でのSCの単離については、変異をSC特異的GFPラインを含むラインに交差させます。
- 各遺伝子型の約25の健康な、処女の男性の2つのバッチを収集し、新鮮なドロソフィラ食品とバイアルで3〜4日間25°Cでそれらを老化させる。
注:年齢、交配状況、栄養、社会環境がそれぞれ生殖生物学に影響を与えるにつれて、これらのパラメータを制御するために厳格なプロトコルに従う必要があります。処女の男性は、標準的なトウモロコシの食事寒天酵母食品で、バイアル当たり20〜25人の男性のグループで、12 h/12 h光/暗いサイクルで25°Cでプパルエクロシオン後3〜4日間熟成されます。
2. ソリューションと材料の準備
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次の解決策を準備します。
- 血清補充培地(SSM):シュナイダーのショウジョウバエ培地を10%熱不活性化胎児牛血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンで補体した。
- 1xトリプシン酵素(例えば、トリプルエクスプレス酵素)のアリコートを調製し、室温で保存します。
- パパイン[50 U/mL]のアリコートを準備します(-20°Cで保存し、解凍は1回のみ)。
- 1xリン酸バッファー生理食べ物(PBS、室温で保存)を調出します。
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アクセサリー腺の物理的な解離のための複数の炎丸いピペの先端を準備します。
注:未処理のプラスチックに付着する傾向があるため、アクセサリー腺を取り扱うには、保持率の低いヒントを使用してください。炎丸めのプロセスは先端の開始を減らし、先端の端を滑らかにする。これは細胞膜をせん断しないでペプチダーゼ消化後の有効な解離を保障する。- 鋭い刃で200 μLの先端を1つ切り、火の上にそっと渡して先端を丸め、開口部が広いが、ステップ3.7の間に取り扱いのために滑らかになるようにします。
- 炎の近くで先端の開口部を1秒未満渡すことによって、複数の1,000 μLの先端の開口部を狭くする。先端を少し回転させて、過度の溶融や目詰まりを防ぐ。より狭い場所から広い方に作られたヒントを並べ替えます。これは、吸引の速度をタイミングすることによって行うことができます。AG の小さなスケール サンプルを解離して、最も狭いヒントの効率をテストします。
注:これらのヒントは、機械的撹拌に不可欠です(手順 5.2 および 5.3)。質の炎丸いピペの先端は細胞の生存率を維持している間完全な解離を可能にする。したがって、これらの先端は、再利用のための手順の最後に水で完全に洗浄されます。これにより、日々の再現可能な解離が可能になります。
3. アクセサリー腺の解剖
- 20~25人の雄のショウジョウバエを氷の上のガラス皿に入れます。
- SSMで男性1人を解剖する。生殖管を取り外し、消化管から離れて他のすべての組織からアクセサリー腺ペアをクリアします。
注:放出された精子は塊を作成し、解離プロセスを妨げる可能性があるため、精巣を削除します。目次電球を取り外すと、浮遊時の取り扱いが困難になります。 - 鉗子を使用して、室温でSSMで満たされたガラス板に付属品腺を移す。ステップ3.2-3.3を20回繰り返し、SSMで20組の腺のバッチを得る。
注:これらのステップは15~20分で達成され、AGは健康に見えるべきであり、腺の周りの筋肉層の蠕動運動が見えるはずです。GFPは蛍光顕微鏡を用いて監視することができる。 - アクセサリー腺を1x PBSに移し、室温で1~2分の洗浄を行います。
注:より良い解離のためには、PBSで腺をすすいですることが不可欠です。ただし、このステップの期間は、細胞が PBS でストレスの兆候を示すので制限する必要があります。PBSの解離二次細胞は急速に膨れ上がり、死ぬ。 - 20 μL パパイン [50 U/mL] を 1x トリプシン酵素の 180 μL に希釈し、解離溶液を得ます(スケールアップまたはスケールダウンするには、各オスに対して 9 μL のトリプシン酵素と 1 μL のパパインを保持します)。鉗子を使用して、この溶液に付属品腺を移す。
- 近位部分からアクセサリ腺(二次細胞を含む)の先端を分離する。細かい鉗子を使用して、腺ローブの真ん中をしっかりとつまみ、2番目の鉗子の鋭い先端で切断します。アクセサリー腺の近位部分と血行ダクトを取り除き、解離を改善し、細胞の選別時間を短縮します。
注:20組の腺から遠位部分を解剖すると15~20分かかりますが、ペプチダーズによる消化は室温で開始されます。 - すべての腺先端を解剖した後、ステップ2.2.1で調製された特別な200 μLピペット先端を使用して1.5 mLチューブに移します。腺を処理する前に、広く、丸みを帯びて濡れるべきです。
注:ピペ状アクセサリー腺組織には、ヒントは常に適切な溶液(トリプシン酵素またはSSM、この目的のために各チューブを1本ずつ保管)で事前に濡れるべきである。汚染を避けるためにサンプル間の先端を注意深くすすいでください。
4. 組織消化
- マイクロチューブを37°Cシェーカーに60分間置き、1,000rpmで揺れます。
注:撹拌と消化時間の両方が解離を成功させるには重要です。短いまたは動かない消化は、おそらく外側の筋肉層と内側粘性精液がペプチダースからアクセサリー腺細胞を保護するため、解離性が悪くなります。 - 室温でSSMを1mL加えて消化を止め、すぐにステップ5に進みます。
5. 細胞の機械的解離
- 広い丸みを帯びた1,000 μLチップを使用して、SSMで事前に濡れ、サンプルを24ウェルプレートに移します。顕微鏡下でGFP蛍光を監視する:ほとんどの腺先端は無傷に見え、いくつかのSCは取り外す必要があります。
- ステップ2.2.2で生成された丸みを帯びた狭いピペットの先端を使用して、付属の腺組織を破壊するために上下3~5回ピペット。
注:蛍光を監視して、大きな組織パッチが分解されていることを確認します。そうでない場合は、手順 5.2 を繰り返します。 - 非常に狭い丸みを帯びたピペットチップ(ステップ2.2.2で生成)を使用して、ピペットを上下に1~2回使用します。
注:ステップ 5.3 の後に表示されるのは、個々のセルのみです。それらはプロセスの容易な監視を可能にするので24ウェル版を使用することを推薦する。いくつかのサンプルが処理され、満足のいく結果(健康に見える二次細胞が完全に解離された)を与えると、ピペッティングステップはマイクロチューブで実行されます。 - 細胞がウェルの底に落ち着き、余分なSSMを取り除いて選別時間を短縮するために、少なくとも15分待ちます。
注:細胞を定着させることは遠心分離のような代替方法よりも優れていることが証明され、FACSの直前の細胞の最後の目視検査を可能にする。 - きれいな1.5 mLチューブに細胞をピペ状にし、同一のサンプル(各条件に対して20人の男性の2つのバッチ)をプールします。最後の細胞を回収するためにSSMで井戸をすすいで、チューブにピペを入れます(少量を使用)。
- 1.5 mLマイクロチューブで、300 μLの細胞溶解溶液と1 μLのプロテネーゼK[50 μg/μL]を加えます(RNA精製キットで提供される溶液は、ステップ7を参照)。各サンプルに 2 本のチューブを用意します (MC 用と SC 用に 1 つ)。
6. FACS(蛍光活性化細胞選別)
- 並べ替えの数分前に並べ替える各サンプルに生存率マーカーを追加します (0.3 mM Draq7)。
注意:Draq7 は注意して取り扱う必要があります。 -
生きた二次細胞(GFP陽性、Draq7陰性細胞)の均質な集団をソートする。別のマイクロチューブでは、主細胞の集団(より小さい、GFP陰性、Draq7陰性細胞)をソートする。次の FACS ゲーティング戦略を使用します。
注:セルソータの圧力を25 PSIに設定し、100 μmのノズルを通して細胞を通過します。並べ替え速度は約 2,000 セル/s です。- デブリを除外し、FSC-SSC(図2E)に基づいて総セルを選択して、デブリを除外します。
- 死んだセルを除外します。640 nmレーザーでDraq7を励起し、795/70バンドパスフィルタで発光蛍光を収集します。ゲートDraq7陽性細胞アウト(図2F)。
- SSC-H 対 SSC-W および FSC-A 対 FSC-H (図 2H)のダブルゲーティングを使用してダレットを削除します。
注:二重ゲーティングを使用して厳密に細胞を二重に除外し、主細胞汚染を低減します。 - 約550 GFP陽性細胞を、ライシスバッファーとプロテナセKを用いて1.5mLマイクロチューブにソートします。この集団は二次細胞と見なされる(SC,図2G)。488 nmでGFPを励起し、526/52バンドパスフィルタで発光蛍光を収集します。
- 約1,000 GFP陰性細胞を、均質で小さいサイズで、LysisバッファーとプロテナセKを用いた1.5mLマイクロチューブにソートする。この集団は主細胞と考えられている(MC,図2G)。
- 渦はすべてのサンプル。
注:40人の雄(〜40 x 80 SC=3,200の二次細胞)から、600〜800の生きた単一個体二次細胞が得られる(約20〜25%の検索)。サンプルを正規化するために、約 550 SC と 1,000 MC の並べ替えを停止します。
7. RNA抽出
注:我々は、次の適応とRNA抽出のためのエピセンターマスターピュアRNA精製キットを使用しました。他のキットは、収率が~500セルからシーケンスするためのライブラリを準備するのに十分な高さである限り使用できます(ここでは2 ng RNAが使用されました)。
- 65°Cでサンプルを15分間加熱し、5分ごとに渦を加熱し、細胞のライシスを完了します。
- 5分間氷の上にサンプルを置く核酸沈殿物(部品「全核酸の沈殿」および「全核酸製剤からの汚染DNAの除去」)に従ってください。
- RNaseフリーTEバッファの10 μLでRNAペレットを中断します。
- RNase阻害剤を添加する(オプション)。
- サンプルを-80 °C.で保存します。
8. RNA量、品質、特異性の品質管理
- RNAの品質と濃度を推定します。少量と濃度が小さいため、ここでRNA 6000ピコチップを使用してください。良好な品質のRNAは非分解として定義され、rRNAに対応する鋭いピークを持つ低ベースラインとして可視である。
-
ソートされたセルのアイデンティティを制御する RT-qPCR
- プライマーとしてランダムヘキサを使用して、合計RNAの2ngで逆転転写を行います。二次細胞RNAおよび主細胞RNAに対してRTを実行する。
注: cDN は、希釈、引用符で囲まれ、後で使用するために凍結することができます。 - 適切なプライマーペアを用いてリアルタイム定量PCRを行い、ハウスキーピング遺伝子(α-Tubulin,18S rRNA)、二次細胞特異的遺伝子(MSA、Rab19、Abd-B)および主細胞特異的遺伝子(性ペプチド)を定量する。
- プライマーとしてランダムヘキサを使用して、合計RNAの2ngで逆転転写を行います。二次細胞RNAおよび主細胞RNAに対してRTを実行する。
9. シーケンシング(cDNAライブラリの準備、シーケンス、データ分析)
- 合計 RNA の 2 ng を使用して、ポリdT プライマーを使用して cDN を合成します。SMARTer技術を使用して増幅を行います。
- Nextera XT キットを使用してライブラリを準備します。
- 多重化を用いた配列は、100ヌクレオチド単一読み取りシーケンス(たとえ50ヌクレオチド読み取りがほとんどの目的に適している場合でも)を用いて、各サンプルに対して約3,000万回の読み取りを得る。
10. データ分析
- FastQC を実行します。
- STAR アライナーを使用して、UCSC dm6 ショウジョウバエ参照ゲノム上の読み取り値をマップし、.bam ファイルを生成します。統合ゲノムビューア(IGV)を使用して、ゲノムブラウザ上の読み取りを視覚化します。
- HTSeq を使用して遺伝子数を実行します。
- M値のトリム平均(TMM)法を使用して、遺伝子数22を正規化する。edgeR を使用して、微分式、MA プロット、および PCA の統計分析を実行します。
- 遺伝子発現解析および統計には、一般線形モデル、偽検出率(FDR)による準尤度F検定、ベンジャメニ&ホッホバーグ補正(BH)を使用します。
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Representative Results
ここで提示されるプロトコルは、1人の実験者がショウジョウバエの男性アクセサリー腺から二次細胞を分離し、1日の間にRNAを抽出することを可能にする(図1)。
Abd-B-GAL4コンストラクト18を使用して二次細胞 (SC) に標識を付けますが、主細胞 (MC) は GFP (図 2A)で標識しません。この手順の目的の1つは、Scの野生型トランスクリプトームを得ることです(野生型はGFPおよびGAL4を発現するトランスジェニックハエから得られるので逆コンマで書かれています)。もう一つの目的は、異なる条件で遺伝子発現を研究することを可能にする迅速かつ容易な手順を通じてSC RNAを得ることである。そこで、この手順は、SC発現を担うAbd-Bのエンハンサーを取り除く1.1kbの欠失を運ぶ野生型および"iab-6cocuD1"変異体を用いて行った。この欠失はまた、二次細胞の発達、形態および機能18、20(図2B、C)のための重要な転写物であるMSAのプロモーターを除去する。このプロトコルは、生物学的三重化を得るために毎回2つの遺伝子型で3回繰り返した(以下、野生型の場合はWT-1,-2,-3、iab-6 cocuD1の場合はD1-1,-2および-3と称する)。
このプロトコルは、ショウジョウバエのアクセサリー腺からのMCおよびSC解離を数時間で可能にする(図2D)。両方のセル母集団は、MC と SC を分離するために 2 つの異なるチューブでソートされます。FACS のゲーティング戦略は、図 2E-2Gに示されています。Draq7は、サンプル全体について約70%の細胞生存率を推定することを可能にする(図2F)。シングルはSC集団の90%以上を占め、MC集団の80%以上を占め、FSC-A対FSC-HおよびSSC-H対SSC-Wによって推定される。(図 2Hを参照)。これは効率的な解離を反映します。別のセルまたは破片が同じ FACS 液滴に存在していたため、ソートイベントの約 10% が中止されました。通常、40 人の男性から 550 の SC と 1,000 MC を収集し、割り込みソートを行います。1サンプル(6サンプル中)から、550の二次細胞に到達できませんでした。WT-1サンプルは、このようにわずか427 SCから得られたが、他のサンプルと同様の品質および量のRNAを提供した。
細胞は、リシスバッファー(プロテポネアセKを含む)にソートされる。すべてのサンプルの準備が整い次第、RNAは1日の終わりにRNAペレットを持つために各細胞サンプルから抽出される。RNAの品質と量は、低濃度および少量に対処するために適切なチップを備えたバイオアナライザを使用して推定されます。推定濃度はサンプル間で可変であったため(1,300 pg/μL以上から344pg/μLまで、図3Aを参照)、RT-qPCRとcDNAライブラリー合成の両方の開始材料を約2ng(測定) に調整しました。濃度は非常に正確ではありません)。野生型MCとSC抽出物に関するリアルタイムqPCRによる特定遺伝子の発現を定量し、並べ替えた細胞集団の同一性を制御した。図 3Bは、α-チューブリン発現に正規化された相対定量として遺伝子発現を示す。18S rRNAおよびα-tubulinのようなハウスキーピング遺伝子は、期待どおりにすべてのサンプルで検出される。それどころか、SC遺伝子Rab19はSC抽出物からのみ検出され、MC遺伝子性ペプチドはMCからのみ検出される。iab-6cocuD1変異型SCにおけるRab19発現は野生型SCに対して低く、この遺伝子の発現はAbd-BおよびMSAの喪失の影響を受けることを示唆している(一貫して、大きいRab19標識された真空は、iab-6cocuD1変異体21)で失われる。二次細胞特異的転写物MSAは、MCからではなく、MCからではなく、この変異体でMSAプロモーターが削除されてから予想されたiab-6cocuD1 SCからのみ検出される。図 3 に示す QC は、このプロトコルを介して得られた RNA が分解されず、両方の細胞集団 (SC および MC) が、野生型および変異型条件の両方でアクセサリ腺から正常にソートされていることを示しています。ここでは二次細胞のRNAのみが配列決定されたが、この手順により、SCとMCの両方の付着したトランスクリプトームプロファイリングが可能にないことに注意してください。
RNAシーケンシングは標準的な手順を用いて実現した。ここでは、この方法の目的に関連する品質管理分析のみを説明します。配列が得られると、読み取りは、遺伝子に起因する参照ショウジョウバエゲノムにマッピングされ、正規化される。PCA(主成分分析)は、6つのサンプル(3野生型および3 iab-6cocuD1反復)に対して行った。データの変動の多くは PC1 で考慮され、残りの変動の多くは PC2 で考慮されます。図 4Aに示すように、野生型はクラスターを近くに複製し、Iab-6cocuD1サンプルから遠く離れています。これは、WTサンプルが変異体のサンプルよりも互いに類似していることを示しています。これは、変異型二次細胞から異常な遺伝的プログラムを検出する方法の再現性およびその能力を示す。D1-2とD1-3のサンプルが一緒にクラスター化されますが、D1-1サンプルはかなり異なることに注意してください。このレプリケートのすべての QC は良好で、他のすべての反復に匹敵するため、サンプル調製の問題 (合計で 2,900 万件の読み取り、>76% が参照ゲノムに一意に整列します)を除外できます。その中で>77%は遺伝子に起因し、>90%はmRNAであり、<3%はrRNAである。この発散は、SCにおける遺伝子発現がiab-6cocuDで不安定であることを反映する可能性があるが、この仮説をテストするにはより多くの複製が必要となる。
ゲノム上の特定の遺伝子に整列した読み取りを可視化することで、データ品質を視覚的に推定できます。図4は、各遺伝子型に対して1つの代表的な反復からの読み取りと、遺伝子の選択を示す。当然のことながら、Act5Cなどのハウスキーピング遺伝子は、両方の遺伝子型(図4B)、ならびにSC特異的遺伝子Rab19およびDve(図4C,D)で発現される。イントロニック読み取りの欠如は、ポリdTがcDNAライブラリー調製のための成熟したスプライスmRNAからの逆転転写を選択的にプライミングしたことを確認する。特に、野生型とiab-6cocuD1 SCとの間の特定の遺伝子の発現に重要かつ有意な変化が見える。これは、iab-6cocuD1で野生型の強い発現が失われるMSA遺伝子によって図4Eに例示される。MSAは、この方法が変異条件下で誤って調節される遺伝子を同定することを可能にする原理の証明として提示される。これは、この変異体で観察される現象型を理解するのに役立ち、正常な二次細胞機能に関する新しい洞察を与えるかもしれない。
図 1: プロトコルの概要。プロトコルの主要なステップが表示され、右側にタイムラインが表示されます。この手順により、午前中に生きているショウジョウバエから始まるものは、正午までにアクセサリー腺細胞を解離し、GFP発現に基づいてソートし、1日の終わりまでにRNAを抽出することができます。RNA シーケンシングとデータ分析には通常数週間かかります。この図は参照27から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:GFP発現二次細胞の分離とソート。(A) Abd-B:GAL4 UAS-GFPアクセサリー腺の共焦点画像は、二次細胞(SC)でGFPを発現するが、主細胞(MC)では発現しない。核はDAPI(青色)で染色される。点線の白い線は AG ローブを含む。EDは、エジャキュレーションダクトです。左上隅の白いバーは50 μmのスケールです。(B,C)GFPを表現するSCを用いてアクセサリー腺遠位部を拡大し、野生型(B)およびiab-6cocuD1(C)を背景にした。(D)GFP双眼鏡下の低倍率で細胞を解離した。(E-H)SCとMCを浄化するFACSゲーティング戦略は、パネル(G)で定義されているように、すべてのパネル上の赤いドットを示しています。まず、デブリは除外されます(E、ステップ6.2.1)、Draq-7陽性死細胞(F、ステップ6.2.2)。GFP陽性細胞(SC)ならびにGFP陰性細胞(MC)の均質な集団が選択される(G、ステップ6.2.4および6.2.5)。二重はMCおよびSC母集団の両方から除外される(ステップ6.2.3、SCのSSC-H対SSC-Wゲーティングのみが例として2Hに示されている)。この図は参照27から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: RNA の QC: 品質、量、およびセルタイプの特異性。(A)ピコチップ上のRNA品質と濃度推定の制御25 ntピークは定量のための制御である。低ベースラインは低分解を示し、2つの主要なピークはリボソームRNAである。RT-qPCRに使用される3つのサンプルが示され、その品質は本試験で使用されるすべてのRNAサンプルを代表し、それらの推定濃度はサンプル間で得られた総RNAの変動を反映しています。(B)RT-qPCRは、二次細胞(SC)および主細胞(MC)の選別の特異性を示す。遺伝子発現定量はq=2(40-Cq)式を用いて行われる。各条件における各遺伝子の各三重化は、総RNA変動を補償するためにα-チューブリンRNAの平均量に正規化される。誤差バーは標準偏差を示します。WTは野生型を意味し、D1はiab-6cocuD1変異体を指す。この図は参照27から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: RNA シーケンシング データの QC。(A) WT-1,-2,-3(緑のドット)およびD1-1,-2,-3(青いドット)RNAシーケンシングデータセットの主成分分析(PCA)。(B-E)シーケンシングは、IGVソフトウェアを使用してショウジョウバエ参照ゲノムにマッピングされた読み取り。各遺伝子型の代表的なサンプルは、明瞭な酒(WT-1およびD1-2)に対して1つだけ示され、少数の特定の遺伝子座のみが示されている。遺伝子名は各パネルの上に書き込まれ、< 記号は向きを示します。括弧内の数字は、DNA 塩基ペアごとの読み取りの数のスケールを各トラックで表します。このスケールは、特定の遺伝子の両方の条件で同じですが、より良い視覚化のために遺伝子間で異なります。各パネルの下部にある青いバーは、遺伝子のイントロン(細い線)、エキソン(広い線)、ORF(>>を持つ長方形)を示しています。なお、Rab19とArl5は重なり合う収束遺伝子(C)である。この図は参照27から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| この研究で RT-qPCR に使用されるプライマー: | ||
| 標的遺伝子 | フォワードプライマー | リバースプライマー |
| アルファチューブリン | TTTCCTTTCGTGTGAA | CCAGCCTGアカカキャット |
| 18S rRNA | CTガガアググスタッカツ | アカクタクトGCCCAAT |
| ラブ19 | カッガガグット・トククタッタック | TTGGAAAアガアガアガガッカググツTTTG |
| セックスペプチド | ガアッグググッガガ | タカタッチッカッカッチャッグ |
| Msa | CTCATCTGTCTCTCGTG | CAGCTCCGTTTACTCGAGC |
表 1: プライマーシーケンス
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Discussion
虚円盤のようなショウジョウバエ組織からの細胞解離の方法については、既に23について説明されている。単にアクセサリー腺でこれらの手順を使用する試みは失敗し、この新しいプロトコルを開発することを奨励しました。プロテアーゼ消化と機械的トリチュアーションは、手順の成功に向けてトラブルショットを打つ重要なステップであり、実験者が満足のいく結果を得るのを助けるためにセクション2から5に多くの注意事項を配置しました。解離を成功させるためには、ペプチダーズは、内膜の粘性精液および腺の周りの筋肉層によって保護される付属腺細胞に到達する必要があります。腺の遠位部分を解剖することが非常に重要でした(ステップ3.6)。また、少なくとも激しい揺れ(ステップ4.1)で60分間消化する必要があった。トリプシン溶液(例えば、TrypLE)との穏やかな解離は、機械的解離まで腺の完全性および細胞生存率を維持した。トリプシン溶液に関連してパパインまたはコラゲナーゼのいずれかを添加すると、解離が改善されました(完全な解離は、より少ないピペッティングで得られ、より良い細胞生存をもたらす)。しかし、これらの酵素のいずれも、細胞を単独で解離するのに十分ではなかった。パーツ 2.2.2 で生成された丸みを帯びた狭い先端を使用したピペッティングは、この方法の重要なステップです。したがって、このトリチュレーション(ステップ5.2-5.3)は、ヒントの最適な組み合わせを選択するために小規模な実験で最適化する必要があります(ステップ5.3の注を参照)。
このプロトコルを使用すると、40人の男性から500~800個の生きた二次細胞を分離することができる。これは~20%(±5%)を表します。3,200 SCを出発材料として考慮した回復(40オスx80 SC)。1日に複数のサンプルを処理できるため、RNAシーケンシングに20%の効率が十分に高かった。ただし、これは、より大きなバッチでの作業など、いくつかの方法によって改善される可能性があります。消化管でトリチュレーションを行い、転送を減らすためにステップ5.4をスキップします。非常に穏やかにトリキュレーション(一部の解離されたGFP+細胞はステップ5.3の直後に死ぬ)。解離とFACSの間の期間を短縮します。より高濃度でトリプシン溶液を使用して消化時間を減少させる;シングルト選択(ステップ6.2.3)と中止されたソートにはより厳格でないパラメータを使用します。このプロトコルの 1 つの制限は、セルを分離するのに数時間かかることです。したがって、非常に一時的な遺伝子発現変化を研究するのに適していません。このプロトコルにより、4×20人の男性を1人の人(トレーニング付き)で1日で処理することができ、1日で2つの異なる条件のSCからのRNA抽出が可能です(図1)。特に、より多くの実験者は、同じ日に複数のサンプルを処理するために、アクセサリー腺コレクション(手順3.1-3.3)に参加することができます。ただし、3.4 以降の手順は、再現性を最大限に高めるために、同じ人物が優先的に実行します。
二次細胞は、男性の胎児12、20、24に不可欠な機能を果たすが、彼らがこの役割を果たすために発現する遺伝子の全体像はまだ欠けている。ここでは、比較的少数のハエからこれらの細胞の転写産物を得る方法を説明し、異なる条件でSCにおける遺伝子発現の比較を可能にする。ここでは、SC関数と形態に影響を与える変異体を1つ使用し、その転写物の重要な変化が見られる。この方法は、その機能に必要な新しいSC遺伝子の同定に役立つ可能性がある。我々の知るところでは、SCの手動ピッキングによってSCトランスクリプトームを得る唯一の代替方法は、良質のRNAシーケンシングデータが得られたが、手順は複数の条件で行うにはあまりにも多くの労働集約的であった。SC RNASeqデータセットを比較し、SC生物学に関する生物学的意味を別の論文(準備)で分析します。
将来的には、この技術は野生型SCトランスクリプトームに光を当てるだけでなく、アクセサリー腺細胞の転写物に対する環境や遺伝子の変化の影響を研究することを可能にします。SC番号は、形態および真空中含有量が男性の食事、交配状態および年齢21、25、26に依存することが示されている。我々はまだ関与する遺伝経路の限られた理解を持っており、異なる条件でSCトランスクリプトームを比較することは洞察力があるだろう。この高速かつ比較的単純なプロトコルは、そのような研究を可能にします。重要なことに、この方法は、同じ個体から主細胞を分離することを可能にし、したがって、遺伝的および環境パラメータが同時に両方の付属腺細胞タイプに影響を与えるかどうかを決定するために、このように使用することができます。
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Disclosures
著者は開示を持っていません。
Acknowledgments
私たちは、カルチ研究室のメンバー、iGE3ゲノミクスプレートフォーム、ジュネーブ大学のフローサイトメトリーコア施設、およびFACSのプロトコルを設定したジャン=ピエール・オーブリー・ラチャナエ博士に感謝しています。私たちは、IGV上の読み取りを視覚化する彼の助けのためにルカスティックリーに感謝します。フィギュアを再利用する優しい許可を与えてくださったことに感謝し、編集者の皆さんから、書き込みをクリエイティブにするよう促してくれました。
この研究は、ジュネーブ州(CI、RKM、FK)、スイス国立研究基金(www.snf.ch)(FKとRKM)、クララズ財団(FK)からの寄付によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μL graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μL bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
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