Summary
Здесь мы представляем протокол для разъединения и сортировки определенной популяции клеток из самцов вспомогательных желез Дрозофилы (вторичных клеток) для секвенирования РНК и RT-qPCR. Изоляция клеток осуществляется путем очистки FACS вторичных клеток GFP-выражения после многоступенчатого процесса диссоциации, требующего вскрытия, пищеварения протеаз и механической дисперсии.
Abstract
Чтобы понять функцию органа, часто полезно понять роль его составных популяций клеток. К сожалению, редкость отдельных популяций клеток часто затрудняет получение достаточного количества материала для молекулярных исследований. Например, вспомогательная железа мужской репродуктивной системы Дрозофилы содержит два различных типа секреторных клеток. Основные клетки составляют 96% секреторных клеток железы, в то время как вторичные клетки (SC) составляют оставшиеся 4% клеток (около 80 клеток на мужчину). Хотя оба типа клеток производят важные компоненты семенной жидкости, только несколько генов, как известно, специфичны для SCs. Редкость SCs, до сих пор, препятствует транскриптомического анализа исследования этого важного типа клеток. Здесь представлен метод, позволяющий очищать SCs для извлечения РНК и секвенирования. Протокол состоит в первом рассекать железы от мух, выражающих SC-специфический репортер GFP, а затем подвергая эти железы протеазы пищеварения и механической диссоциации для получения отдельных клеток. После этих шагов, индивидуальные, живые, GFP-отмеченные клетки сортируются с помощью флуоресцентного активированного сортировки клеток (FACS) для очистки РНК. Эта процедура дает SC-специфические РНК от 40 мужчин в состоянии вниз по течению RT-qPCR и / или РНК секвенирования в течение одного дня. Быстрота и простота процедуры позволяет в короткий период времени определить транскриптомы различных мух из разных генотипов или условий окружающей среды.
Introduction
Органы состоят из нескольких типов клеток, каждый из которых имеет дискретные функции, а иногда и выражающие совершенно разные наборы генов. Чтобы получить точное понимание того, как функционирует орган, часто важно изучить каждый отдельный тип клеток, который составляет этот орган. Одним из основных методов, используемых для изучения возможной функции, является анализ транскриптома. Этот мощный метод обеспечивает снимок экспрессии гена в клетке, чтобы выявить активные процессы и пути. Однако, этот тип анализа часто трудн для редких населенностей клетки которые необходимо очистить от далеко более-обидеть соседних клеток. Например, мужская вспомогательная железа Дрозофилы является органом, состоящим в основном из двух типов секреторных клеток. Поскольку редкие из двух типов клеток составляют лишь 4% клеток этой железы, использование специфического анализа транскриптома клеточного типа не было использовано для определения функции этих клеток.
Аксессуарные железы (АГ) являются органами мужского репродуктивного тракта у насекомых. Они отвечают за производство большинства белков семенной жидкости (семенной жидкости (SFPs) и вспомогательных железных белков (ACPs)). Некоторые из этих SFPs, как известно, вызывают физиологические и поведенческие реакции у спаренных женщин, обычно называют после спаривания ответ (PMR). Некоторые из PMRs включают в себя: увеличение овуляции и яйцекладки скорость, хранение и высвобождение спермы, изменение в женской диете, и снижение женской восприимчивости к вторичной ухаживания мужчин1,2. Поскольку насекомые влияют на многие основные социальные проблемы от здоровья человека (как переносчиков смертельных заболеваний) до сельского хозяйства (насекомые могут быть вредителями, но имеют решающее значение для опыления и качества почвы), понимание воспроизводства насекомых является важной областью исследований. Изучение AGs и ACPs было выдвинуто значительно с модельным организмом Drosophila melanogaster. Эти исследования подчеркнули роль AGs и некоторые из отдельных белков, которые они производят в создании ПМР, влияющих на работу в других видах, как болезнь вектор Aedes aegypti3,4, и другие насекомые1 ,5. Кроме того, как AGs выделяют составляющие семенной жидкости1,6 они часто рассматриваются как функциональный аналог железы простаты млекопитающих и семенной везикулы. Эта функция сходство в сочетании с молекулярным сходством между двумя типами тканей, сделали AGs моделью для предстательной железы у мух7.
В Drosophila мужчины, Есть две доли аксессуаров желез. Каждая доли можно рассматривать как мешок, как структура, состоящая из монослой секреторных клеток, окружающих центральный просвет, и обернутые гладкими мышцами. Как уже упоминалось выше, Есть два морфологически, развития и функционально различных секретных типов клеток, составляющих эту железу: полигональной формы основных клеток (составляют 96% клеток), и больше, круглые вторичные клетки (SC) (составление оставшиеся 4% клеток, или около 40 клеток на одну долбу). Было показано, что оба типа клеток производят различные наборы ACPs для индуцирования и поддержания PMR. Большинство данных, полученных на сегодняшний день, подчеркивают роль одного белка в инициировании большинства характерных моделей поведения ПМР. Этот белок, половой пептид, представляет собой небольшой, 36 аминокислотный пептид, который выделяется основными клетками8,9,10. Хотя половой пептид, кажется, играет важную роль в ПМР, другие ACPs, производимые как основными, так и вторичными клетками, также были показаны, чтобы повлиять на различные аспекты PMR11,12,13,14 ,15,16,17. Например, на основе наших текущих знаний, SCs, через белки, которые они производят, как представляется, требуется для увековечения SP сигнализации после первого дня18.
Учитывая редкость SCs (только 80 клеток на мужчину), все наши знания об этих клетках и белках, которые они производят, приходят от генетики и кандидат подходов. До сих пор было доказано, что лишь относительно небольшой список генов специфичен для SC. Этот список включает в себя гомеодомен белка Дефектные proventriculus (Dve)19, lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 и 1921, CG1656 и CG1757511, 15,21 и фактор транскрипции гомеобокса Abdominal-B (Abd-B)18. Ранее мы показали, что мутант дефицит как для выражения Абд-B и lncRNA MSA во вторичных клетках(iab-6cocuD1 мутант) сокращает длину PMR от 10 дней до только один день12 , 18 лет , 20. Этот фенотип, кажется, вызвано ненадлежащим хранением SP в женском репродуктивном тракте12,18,20. На клеточном уровне вторичные клетки этого мутанта показывают аномальную морфологию, теряя свои характерные вакуолоподобные структуры18,20,21. Используя эту линию мутантов, мы ранее пытались определить гены, участвующие в функции SC, сравнивая транскрипционные профили целых AGs либо из дикого типа или мутант аксессуар желез12. Кроме того, другие лаборатории показали, что номер SC, морфология и содержание вакуолярного зависит от мужской диеты, статус спаривания и возраст21,25,26.
Хотя с использованием этих подходов был достигнут позитивный прогресс, полный транскриптом SC был далек от достижения. Редкость этих клеток в этом органе затрудняет дальнейшее продвижение даже от клеток дикого типа. Для тестирования экспрессии генов, изменения в этих клетках после конкретных экологических стимулов будет еще труднее. Таким образом, метод изоляции и очистки SC РНК, который был достаточно быстрым и простым, чтобы работать в различных генетических фонов и условий окружающей среды было необходимо.
Оба гена Abd-B и MSA требуют специфического усилитель 1.1 кБ от комплекса Drosophila Bithorax (так называемый усилитель D1) для их выражения в SCs18,20. Этот усилитель ранее был использован для создания драйвера GAL4, который, когда связан с UAS-GFP, способен управлять сильным выражением GFP специально в SCs. Таким образом, мы использовали эту линию в качестве основы для протокола FACS, чтобы изолировать эти клетки от дикого типа и iab-6cocuD1 AGs). Как iab-6cocuD1 мутант SCs дисплей различных клеточных морфологии, мы показываем, что этот протокол может быть использован для изоляции клеток для определения их транскриптома от этого редкого типа клеток в совершенно разных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila Линии, используемые и сбор мужчин
- Для этого протокола используйте самцов, выражающих GFP в SCs, а не в основных ячейках. Здесь используется водитель AbdB-GAL4 (описанный в справке18),рекомбинирован с UAS-GFP (на хромосоме 2). Другие подходящие драйверы также могут быть использованы. Для изоляции SCs в различных условиях мутантов, пересекать мутации в линии, содержащие SC-специфической линии GFP.
- Соберите две партии около 25 здоровых, девственных самцов для каждого генотипа и стареете их при 25 градусах По Цельсия в течение 3-4 дней во флаконах со свежеприготовленной пищей Дрозофилы.
ПРИМЕЧАНИЕ: По возрасту, статусу спаривания, питанию и социальной среде, каждой из которых влияет на репродуктивную биологию, необходимо соблюдать строгие протоколы для контроля этих параметров. Девственницы выдерживаются в течение 3-4 дней после pupal eclosion при 25-C с светлым/темным циклом 12 ч/12 ч, на стандартной кукурузной муке-агар-дрожжевой пище, в группах по 20-25 самцов на флакон.
2. Решения и подготовка материалов
-
Подготовьте следующие решения.
- Подготовка сыворотки Дополненный средний (SSM): Дрозофила среды Шнайдера дополняется 10% тепла инактивированных сыворотки крупного рогатого скота плода и 1% пенициллина-стрептомицина.
- Приготовьте аликвоты 1x трипсина (например, фермент TrypLE Express) и храните при комнатной температуре.
- Приготовьте аликвоты папаина (50 U/mL) (хранится при -20 градусов по Цельсию и размораживаются только один раз).
- Подготовка 1x фосфат буфера сольник (PBS, хранится при комнатной температуре).
-
Подготовьте несколько огненно-округлых наконечников труба для физической диссоциации вспомогательных желез.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте низкие советы удержания для обработки аксессуаров желез, как они, как правило, придерживаются необработанных пластика. Процесс огнеупорства уменьшает открывание кончика и сглаживает края кончика. Это обеспечивает эффективную диссоциацию после пищеварения пептидаза без стрижки клеточных мембран.- Вырежьте один кончик 200 л с острым лезвием и аккуратно передайте его через пламя, чтобы закруглить его кончик так, чтобы отверстие шире, но гладкой для обработки во время шага 3.7.
- Сужай отверстие нескольких 1000 наконечников, проходя наконечник открытия возле пламени менее чем за одну секунду. Поверните кончик немного, чтобы избежать чрезмерного плавления или засорения. Сортировать советы, сделанные от более узкой к более широкой. Это может быть сделано путем синхронизации скорость аспирации. Попробуйте разобщить небольшой образец АГ, чтобы проверить эффективность самых узких советов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти советы имеют решающее значение для механического возбуждения (шаги 5.2 и 5.3). Качественные огненно-округлые наконечники трубач обеспечивают полную диссоциацию при сохранении жизнеспособности клеток. Таким образом, эти советы тщательно промывают водой в конце процедуры повторного использования. Это позволяет изо дня в день воспроизводимой диссоциации.
3. Рассечение аксессуаров Glands
- Положите от 20 до 25 самцов дрозофилы в стеклянную тарелку на льду.
- Вскрыть 1 мужчину в SSM. Снимите его репродуктивного тракта и очистить пара аксессуаров железы от всех других тканей, кроме эякуляторного протока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удалить яички, потому что освобожденная сперма может создать сгустки и нарушить процесс диссоциации. Удалите эякуляционную лампу, что затрудняет обработку при плавании. - С щипками, передача аксессуаров желез в стеклянную пластину заполнены SSM при комнатной температуре. Повторите шаги 3,2-3,3 раза, чтобы получить партию из 20 пар желез в SSM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги будут достигнуты в 15 до 20 мин. АГ должны выглядеть здоровыми, и перистальтические движения мышечного слоя вокруг желез должны быть видны. GFP можно контролировать с помощью флуоресцентного микроскопа. - Передача вспомогательных желез в 1x PBS для 1-2 мин мыть при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшей диссоциации необходимо промыть железы с помощью PBS. Продолжительность этого шага, однако, должна быть ограничена, поскольку клетки проявляют признаки стресса в PBS; разъединенные вторичные клетки в PBS быстро набухают и умирают. - Разбавить 20 юаней папаин в 180 л фермента 1x трипсина, чтобы получить диссоциационный раствор (для масштабирования или снижения 9 л фермента трипсина и 1 л папаина для каждого самца). С щиптеми, передача аксессуаров желез к этому решению.
- Изолировать кончик вспомогательных желез (содержащих вторичные клетки) от проксимальной части. Используйте мелкие щипцы, чтобы твердо щипать середину железистой доли и вырезать с острым кончиком второй щипцы. Удалите проксимальную часть вспомогательных желез и эякуляционный проток, чтобы улучшить диссоциацию и уменьшить время сортировки клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вскрытие дистальной части от 20 пар желез займет от 15 до 20 мин, а пищеварение пептидазами, таким образом, начнется с комнатной температуры. - После того, как все наконечники железбыли были вскрыты, перенесите их в трубку 1,5 мл с помощью специального наконечника трубы 200 л, подготовленного на шаг 2.2.1. Она должна быть широкой, округлой и влажной до обработки желез.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для pipet аксессуар ткани железы, советы всегда должны быть предварительно мокрые с соответствующим раствором (трипсин фермента или SSM, держать одну трубку каждого для этой цели). Тщательно промыть советы между образцами, чтобы избежать загрязнения.
4. Пищеварение тканей
- Поместите микротрубку в шейкер 37 градусов по Цельсию в течение 60 минут, раскачиваясь при 1000 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как время возбуждения, так и время пищеварения имеют решающее значение для успешной диссоциации. Более короткое или неподвижное пищеварение даст плохую диссоциацию, вероятно, потому, что внешний мышечный слой и внутренняя вязкая семенная жидкость защищают клетки вспомогательных желез от пептидазы. - Добавьте 1 мл SSM при комнатной температуре, чтобы остановить пищеварение и немедленно приступить к шагу 5.
5. Механическая диссоциация клеток
- Используя широкий округлый наконечник 1000 л, предварительно мокрый с SSM, перенесите образец на 24-хорошую пластину. Монитор GFP флуоресценции под микроскопом: большинство железы советы должны выглядеть нетронутыми и несколько SC должны быть отделены.
- Используя закругленный узкий наконечник pipet, генерируемый на шаг 2.2.2, пайпет вверх и вниз от 3 до 5 раз, чтобы нарушить ткани вспомогательного железа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Монитор флуоресценции, чтобы убедиться, что большие патчи ткани были разбиты. Повторите шаг 5.2, если это не так. - Используя очень узкий округлый наконечник трубы (генерируется на шаг 2.2.2), pipet вверх и вниз 1-2 раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Только отдельные ячейки должны быть видны после шага 5.3. Рекомендуется использовать 24-колодные пластины, поскольку они обеспечивают легкий мониторинг процесса. Когда несколько образцов были обработаны и дали удовлетворительный результат (здоровый вид вторичных клеток прекрасно разъединяется), трубопроводные шаги будут выполнены в микротрубке. - Подождите, по крайней мере 15 минут, чтобы клетки оседают в нижней части скважины и удалить избыток SSM, чтобы уменьшить время сортировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сдача клетки поселиться оказалось выше альтернативных методов, таких как центрифугирование, и позволяет последний визуальный осмотр клеток непосредственно перед FACS. - Труба клетки в чистую трубку 1,5 мл и бассейн идентичных образцов (две партии по 20 мужчин для каждого условия). Промыть скважины с SSM для восстановления последних клеток, и пипетка их в трубку (использовать небольшой объем).
- В микротрубках мощностью 1,5 мл добавьте 300 л раствора клеточного лиза и 1 л протеиназа K (решения, представленные в комплекте очистки РНК, см. Шаг 7). Подготовьте две трубки для каждого образца (одна для МС и одна для SCs).
6. FACS (Флуоресцентно-активированная сортировка клеток)
- Добавьте маркер жизнеспособности к каждому образцу, который будет отсортирован за несколько минут до сортировки (0,3 мм Draq7).
ПРЕДЕКТО: К Драк7 следует обращаться с осторожностью. -
Сортировать однородную популяцию живых вторичных клеток (GFP-положительные, Draq7-отрицательные клетки). В другой микротрубке сортируйте популяцию основных клеток (меньшие, GFP-отрицательные, Draq7-отрицательные клетки). Используйте следующую стратегию FACS gating:
ПРИМЕЧАНИЕ: Установите давление сортировки ячейки на 25 PSI и пройдите клетки через сопло 100 мкм. Скорость сортировки составляет около 2000 ячеек/с.- Исключить мусор и выбрать общие ячейки на основе FSC-SSC(рисунок 2E) для того, чтобы исключить мусор.
- Исключить мертвые клетки. Возбуждайте Draq7 лазером 640 нм и собирайте испускаемую флуоресценцию с помощью фильтра диапазона 795/70. Ворота Draq7-положительные клетки из(Рисунок 2F).
- Удалить дублеты с помощью двойного gating на SSC-H против SSC-W и FSC-A против FSC-H(Рисунок 2H).
ПРИМЕЧАНИЕ: Исключите дублеты клетки строго используя двойной gating, для уменьшения основного загрязнения клетки. - Сортируйте 550 GFP-позитивных клеток в микротрубку 1,5 мл с буфером Lysis и Proteinase K. Эта популяция считается вторичными ячейками (SC, Рисунок 2G). Excite GFP на 488 нм и собирать излучаемые флуоресценции с 526/52 диапазон-проход фильтр.
- Сортируйте 1000 GFP-отрицательных клеток, однородных и малых по размеру, в микротрубку объемом 1,5 мл с буфером Lysis и Proteinase K. Эта популяция считается основными ячейками (MC, Рисунок 2G).
- Вихрь все образцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из 40 мужчин (40 х 80 SC и 3200 вторичных клеток), 600 до 800 живых одноместных вторичных клеток получаются (около 20-25% поиска). Прекратите сортировку около 550 SC и 1000 MC для нормализации образцов.
7. Добыча РНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали Epicentre MasterPure РНК очистки Kit для извлечения РНК, со следующими адаптации. Другие наборы могут быть использованы до тех пор, пока выход достаточно высок, чтобы подготовить библиотеку для секвенирования из 500 ячеек (2 нг РНК был использован здесь).
- Нагрейте образцы при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 15 мин и вихря каждые 5 минут для завершения лиза клетки.
- Поместите образцы на лед на 5 мин. Следуйте рекомендациям производителя по осадкам нуклеиновой кислоты (части "Осадки общих нуклеиновой кислоты" и "Удаление загрязняющей ДНК из препаратов общей нуклеиновой кислоты").
- Приостановить РНК гранулы в 10 Зл из RNase-свободного TE буфера.
- Добавьте ингибитор RNase (по желанию).
- Храните образцы при -80 градусах по Цельсию.
8. Контроль качества количества, качества и специфичности РНК
- Оценить качество РНК и концентрацию. Из-за небольшого объема и концентрации, используйте чипсы РНК 6000 Пико здесь. Хорошее качество РНК определяется как недеградированный, видимый как низкий базовый уровень с резкими пиками, соответствующими РНК.
-
RT-qPCR для контроля идентичности отсортированных ячеек
- Выполните обратную транскрипцию с 2 нг всего РНК с использованием случайных hexamers в качестве грунтовки. Выполните RT на вторичной клеточной РНК и основной клеточной РНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: cDNAs могут быть разбавлены, aliquoted, и храниться замороженные для последующего использования. - Выполните в режиме реального времени количественные ПЦР с использованием соответствующих пар грунтовки для количественной оценки генов домашнего хозяйства(альфа-Тубулин, 18S rRNA), вторичные специфические гены клеток(MSA, Rab19, Abd-B) и основной специфический ген клетки (Секс пептид).
- Выполните обратную транскрипцию с 2 нг всего РНК с использованием случайных hexamers в качестве грунтовки. Выполните RT на вторичной клеточной РНК и основной клеточной РНК.
9. Секвенирование (подготовка библиотеки кДНК, секвенирование и анализ данных)
- Используйте 2 нг всего РНК для синтеза cDNA с политТ-праймерами. Используйте технологию SMARTer для их усиления для усиления.
- Используйте комплект Nextera XT для подготовки библиотеки.
- Последовательность с использованием мультиплексных, 100 нуклеотидов одного считывает секвенирование (хотя 50 нуклеотидов читает подходят для большинства целей), чтобы дать около 30 миллионов считывает для каждого образца.
10. Анализ данных
- Выполнить Fast'C.
- Используйте выравниватель STAR для картирования считывателей на справочном геноме UCSC dm6 Drosophila и генерации файлов .bam. Используйте Integrative Genomics Viewer (IGV) для визуализации считывателей на браузере генома.
- Используйте HTSeq для выполнения генов.
- Используйте метод Trimmed Mean of M-values (TMM) для нормализации количества генов22. Используйте edgeR для выполнения статистического анализа дифференциального выражения, участков MA и PCA.
- Для анализа экспрессии генов и статистики используйте General Linear Model, квази-вероятностный F-тест с false Detection Rate (FDR) и коррекцию Бенджамини и Хохберга (BH).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленный здесь протокол позволяет одному экспериментатору изолировать вторичные клетки из самцов вспомогательных желез Дрозофилы и извлекать их РНК в течение одного дня(рисунок 1).
Мы используем Abd-B-GAL4 построить18 для обозначения вторичных клеток (SC), но не основные клетки (MC) с GFP (Рисунок 2A). Одной из целей этой процедуры является получение транскриптома дикого типа SCs (дикий тип написан с перевернутыми запятыми, так как они получены из трансгенных мух, выражающих GFP и GAL4). Другая цель состоит в том, чтобы получить SC РНК через быструю и легкую процедуру, которая позволяет изучать их экспрессию генов в различных условиях. Таким образом, мы выполнили эту процедуру с использованием дикого типа и"iab-6cocuD1" мутантов, которые несут 1,1 кб удаления усилитель Абд-B отвечает за выражение SC. Это удаление также удаляет промоутер MSA, важный транскрипт для развития вторичных клеток, морфологии и функции18,20 (Рисунок 2B, C). Этот протокол был повторен трижды с 2 генотипов каждый раз для получения биологических трипликатов (в дальнейшем называют WT-1,-2,-3 для дикого типа и D1-1,-2 и -3 для iab-6cocuD1).
Этот протокол позволяет MC и SC отделять от Drosophila аксессуар желез в течение нескольких часов(Рисунок 2D). Популяции обеих клеток затем сортируются в двух различных трубках, чтобы изолировать MCs и SCs. Стратегия gating для FACS показана в Рисунке 2E-2G. Draq7 позволяет оценить жизнеспособность клеток около 70% для всей выборки(рисунок 2F). Синглеты составляют более 90% населения СК и более 80% населения МС, по оценкам FSC-A против FSC-H и SSC-H против SSC-W. (см. Рисунок 2H). Это отражает эффективную диссоциацию. Около 10% событий сортировки были прерваны, потому что другая ячейка или мусор присутствовал в той же капле FACS. Из 40 мужчин, мы обычно собираем 550 SCs и 1000 MCs, а затем прервать сортировку. Из 1 образца (из 6) мы не смогли достичь 550 вторичных ячеек. Таким образом, образец WT-1 был получен только из 427 SC, но предоставил РНК аналогичного качества и количества, как и другие.
Клетки сортируются в буфер лиза (содержащий протеиназу K). Как только все образцы будут готовы, РНК извлекаются из каждого образца клетки, чтобы иметь РНК гранулы в конце дня. Качество и количество РНК оцениваются с помощью биоанализа с соответствующим чипом для борьбы с низкими концентрациями и небольшими объемами. Поскольку расчетные концентрации были переменными между образцами (от более чем 1300 пг/ Л до 344 пг/Л, см. Рисунок 3А),мы скорректировали исходный материал как для RT-qPCR, так и для синтеза библиотеки кДНК примерно до 2 нг (измерено концентрации не являются высокоточными). Мы количественно экспрессии конкретных генов в режиме реального времени qPCR на дикий тип MC и SC экстракты для контроля для идентификации популяций клеток мы отсортировали. Рисунок 3 B показывает экспрессию генов как относительную количественную оценку, нормализуемую до экспрессии альфа-тубулина. Гены домашнего хозяйства, такие как 18S rRNA и альфа-тубулин, обнаружены во всех образцах, как и ожидалось. Напротив, ген SC Rab19 обнаруживается только из экстрактов SC, а ген MC Sex Peptide обнаруживается только из MC. Мы отмечаем, что выражение Rab19 в iab-6cocuD1 мутант SC является низким по отношению к дикому типу SC, предполагая, что выражение этого гена зависит от потери Абд-B и MSA (последовательно, большой Rab19-маркированные вакуолы теряются в iab-6cocuD1 мутант21). Вторичный клеточной стенограммы MSA обнаруживается только от дикого типа SC, а не от MC, ни от iab-6cocuD1 SCs, который ожидался, так как промоутер MSA удаляется в этом мутанте. В целом, КК, показанные на рисунке 3, показывают, что РНК, полученные через этот протокол, не деградируют, и что обе популяции клеток (SC и MC) успешно сортируются из вспомогательных желез, как в условиях дикого типа, так и в условиях мутантов. Только вторичная РНК клеток были секвенированы здесь, но обратите внимание, что эта процедура позволяет сопутствующей транскриптом профилирования как SCs и MCs.
РНК-секвенирование было реализовано с использованием стандартных процедур. Здесь мы обсудим только анализ качества, который имеет отношение к цели этого метода. Когда последовательности получены, считываемые отображаются к ссылке родосного генома Дрозофилы, приписываются генаму, и нормализуются. PCA (основной компонентный анализ) был выполнен на 6 образцах (3 диких типа и 3 репликации iab-6cocuD1). Как можно больше изменчивости данных приходится на PC1, и как большая часть оставшейся изменчивости приходится на PC2. Как показано на рисунке 4A, дикий тип повторяет кластер близко друг к другу, и далеко от Iab-6cocuD1 образцов. Это показывает, что образцы WT больше похожи друг на друга, чем на мутантов. Это иллюстрирует воспроизводимость метода и его способность обнаруживать аномальные генетические программы из вторичных клеток мутантов. Хотя образцы D1-2 и D1-3 сгруппированы вместе, мы отмечаем, что образец D1-1 весьма разное. Так как все КК для этой репликации хороши и сопоставимы со всеми другими репликациями, мы можем исключить вопрос подготовки образца (29 миллионов считывает в общей сложности, 76% из которых выравниваются однозначно с эталонным геномом. Среди них, 77% приписываются гену, мРНК, и lt;3% являются rRNA). Это расхождение может отражать, что экспрессия генов в SC нестабильна в iab-6cocuD, хотя тестирование этой гипотезы потребует больше реплик.
Визуализация считывательных считываемых с определенными генами генома позволяет визуально оценить качество данных. На рисунке 4 показан выбор генов, с считываниями от 1 репрезентативной репликации для каждого генотипа. Неудивительно, что гены домашнего хозяйства, такие как Act5C, выражены в обоих генотипах(рисунок 4B),а также SC-специфических генах Rab19 и Dve (Рисунок 4C,D). Отсутствие интронных читает подтверждает, что polydT выборочно загрунтовал обратную транскрипцию от зрелых сращивания мРНК для подготовки библиотеки кДНК. Примечательно, что мы видим важные и значительные различия в экспрессии конкретных генов между диким типом и iab-6cocuD1 SC. Это иллюстрируется на рисунке 4E геном MSA, сильное выражение которого в диком типе теряется в iab-6cocuD1. MSA представлен как доказательство принципа, что этот метод позволяет определить гены, которые неправильно регулируются в условиях мутантов. Это поможет понять фенотипы, наблюдаемые в этом мутанте, и может дать новое понимание нормальных функций вторичных клеток.
Рисунок 1: Обзор протокола. Отображаются ключевые шаги протокола, с временной шкалой на правой стороне. Эта процедура позволяет начать с живой Drosophila утром иметь диссоциированные клетки вспомогательных желез к полудню, сортировать их на основе экспрессии GFP, и получить их РНК извлечены к концу рабочего дня. Секвенирование РНК и анализ данных обычно занимает несколько недель. Эта цифра была изменена со ссылки27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Изоляция и сортировка Вторичных ячеек, выражающих GFP. (A) Конфокальный образ Abd-B:GAL4 UAS-GFP аксессуар железы, выражающие GFP во вторичных ячеек (SC), но не в основных ячеек (MC). Ядра окрашены DAPI (синий). Пунктирная белая линия разграничает доли AG. ED является эякуляционный проток. Белые прутья в левом верхнем углу 50 мкм чешуйки. (B,C) Увеличенные виды аксессуара железы дистальной части с SC, выражающих GFP, в диком типе (B) и iab-6cocuD1 (C) фон. (D) Диссоциированные клетки при низком увеличении под биноклем GFP. (E-H) Стратегия FACS gating для очищения SC и MC. Красные точки на всех панелях показали SCs, как определено в панели (G). Сначала исключаются обломки(E,шаг 6.2.1), а также положительные омертвемые клетки Драка-7(F,шаг 6.2.2). GFP положительные клетки выбраны (SC), а также однородной популяции Отрицательных клеток GFP (MC)(G, шаги 6.2.4 и 6.2.5). Даблты исключаются как из MC, так и из SC (шаг 6.2.3, только SSC-H против SSC-W gating для SC показан на 2H в качестве примера). Эта цифра была изменена со ссылки27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: КК на РНК: качество, количество и специфика типа клеток. (A) Контроль качества РНК и оценки концентрации на PicoChip. Пик 25 nt является контролем для количественной оценки. Низкий базовый уровень указывает на низкую деградацию, а 2 основных пика являются рибосомные РНК. Показаны 3 образца, используемые для RT-qPCR, их качество является репрезентативным для всех образцов РНК, используемых в данном исследовании, и их расчетные концентрации отражают различия в общей РНК, которые мы получили между образцами. (B) RT-qPCR продемонстрировать специфику сортировки вторичных ячеек (SC) и основных ячеек (MC). Количественная оценка экспрессии гена осуществляется с использованием формулы q q-2(40-Cq). Каждая тройная часть каждого гена в каждом состоянии нормализуется до среднего количества альфа-тубулиной РНК, чтобы компенсировать общую вариацию РНК. Ошибки бары показывают стандартное отклонение. WT означает дикий тип, а D1 относится к мутанту iab-6cocuD1. Эта цифра была изменена со ссылки27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: КК по данным секвенирования РНК. (A) Анализ основных компонентов (PCA) на WT-1,-2,-3 (зеленые точки) и D1-1,-2,-3 (синие точки) наборы данных секвенирования РНК. (B-E) Секвенирование считывает отображение в дрозофила ссылка генома с помощью программного обеспечения IGV. Только один репрезентативный образец каждого генотипа показан для ясности сакэ (WT-1 и D1-2), и только несколько конкретных локусов показаны. Имена генов написаны поверх каждой панели, символы , которые относятся к их ориентации. Числа в скобках представляют для каждого трека шкалу количества считываемых на пару оснований ДНК. Эта шкала одинакова для обоих условий для данного гена, но варьируется между генами для лучшей визуализации. Синие полоски в нижней части каждой панели показывают интроны генов (тонкая линия), экзоны (широкая линия) и ORF (прямоугольники с йgt; Обратите внимание, что Rab19 и Arl5 перекрываются, конвергентные гены(C). Эта цифра была изменена со ссылки27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Праймеры, используемые для RT-qPCR в данном исследовании: | ||
| Целевой ген | Передняя грунтовка | Обратная грунтовка |
| альфа-Тубулин | ТТТТТТГГКГКГГТГГААА | CCAGCCTGACCACATGGAT |
| 18S rRNA | CTGAGAAACGGCTACCACATC | АККАГАКТГЦКТККААТ |
| Rab19 | КАГГАГАГТЦКАКТАТАК | TTGGAAAAGGAAGACCGCTG |
| Секс пептид | GGAATGGGTGTGGAATAGGATAGGA | ТААКАТКТЦККСКККККККККККК |
| Msa | CTCATCTGTCTCTCTCGCGTGGGGG | CAGCTCCTGTTTAATCTCTCGAGC |
Таблица 1: Последовательность праймеров
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы клеточной диссоциации от ткани Дрозофилы, такие как воображаемые диски, уже описаны23. Наши попытки просто использовать эти процедуры на вспомогательных желез ахну, не увенчались успехом, поощряя нас к разработке этого нового протокола. Протеазы пищеварения и механической трикуляции были критические шаги мы неприятности для успеха процедуры, и мы, таким образом, размещены многие заметки в разделах 2 до 5, чтобы помочь экспериментаторам получить удовлетворительные результаты. Для того, чтобы диссоциация была успешной, пептидазы должны достичь клеток вспомогательных желез, которые защищены вязкой семенной жидкостью в просвете и мышечным слоем вокруг железы. Таким образом, вскрытие дистальной части желез было критическим (шаг 3.6). Кроме того, переваривание в течение 60 мин по крайней мере с энергичной встряхивания (шаг 4.1) было необходимо. Нежная диссоциация с раствором трипсина (например, TrypLE) сохраняла целостность железы и жизнеспособность клеток до механической диссоциации. Добавление либо папаин или коллагенеза в связи с раствором трипсина улучшило диссоциацию (идеальная диссоциация была получена с меньшим количеством пипетки, что привело к лучшему выживанию клеток). Однако ни одного из этих ферментов не было достаточно, чтобы самостоятельно разъединить клетки. Пелеттинг с использованием закругленных узких наконечников, генерируемых в части 2.2.2, является ключевым шагом для этого метода. Таким образом, эта тритурация (шаги 5.2-5.3) должна быть оптимизирована в небольших экспериментах, чтобы выбрать наилучшее сочетание подсказок (см. примечание в шаге 5.3).
Используя этот протокол, можно будет изолировать от 500 до 800 живых вторичных клеток от 40 мужчин. Это составляет 20% (- 5%) восстановление рассматривает 3200 SC в качестве исходного материала (40 мужчин х 80 SC). 20% эффективность была достаточно высока для секвенирования РНК, так как мы могли обрабатывать несколько образцов в день. Однако это может быть улучшено несколькими методами, включая: работа в больших партиях; делать тритурацию в трубке пищеварения и пропуская шаг 5.4, чтобы уменьшить передачи; тритурации очень мягко (некоторые разъединенные клетки GFP' умирают вскоре после шага 5.3); сокращение периода между диссоциацией и FACS; уменьшение времени пищеварения с помощью раствора трипсина при более высокой концентрации; использование менее строгих параметров для однократного выбора (шаг 6.2.3) и прерванной сортировки. Одним из ограничений этого протокола является то, что на изоляцию клеток уходит несколько часов; следовательно, он не подходит для изучения очень преходящих изменений экспрессии генов. С помощью этого протокола, 4 х 20 мужчин могут быть обработаны одним человеком (с обучением) в одно утро, что позволяет извлечения РНК из SC двух различных условиях в 1 день(рисунок 1). Примечательно, что больше экспериментаторов могут участвовать в сборе вспомогательных желез (шаги 3.1-3.3) для обработки нескольких образцов в один и тот же день. Тем не менее, шаги 3.4 и далее будут преимущественно выполняться тем же лицом, чтобы максимизировать воспроизводимость.
Вторичные клетки выполняют необходимые функции для мужской плодовитости12,20,24, но полная картина генов, которые они выражают, чтобы выполнить эту роль по-прежнему отсутствует. Здесь мы описываем, как получить транскриптом этих клеток от относительно небольшого количества мух, что позволяет сравнение экспрессии генов в SC в различных условиях. Здесь был использован один мутант, влияющий на функцию SC и морфологию, и видны важные изменения в его транскриптоме. Таким образом, этот метод может помочь определить новые гены SC, необходимые для их функции. Насколько нам известно, единственный альтернативный метод получения транскриптома SC был выполнен в нашей лаборатории путем ручного подбора SCs. Хорошее качество РНК секвенирования данных было получено, но процедура была слишком трудоемкой, чтобы быть выполнены в нескольких условиях. Мы сравним наши наборы данных SC RNAseq и проанализируем их биологическое значение о биологии SC в отдельной работе (в стадии подготовки).
В будущем, этот метод не только прольет свет на дикий тип SC транскриптома, но и позволит изучить влияние окружающей среды или изменения генов на транскриптоме клеток вспомогательных желез. Было показано, что номер SC, морфология и содержание вакуоляров зависят от мужской диеты, состояния спаривания и возраста21,25,26. Мы по-прежнему имеют ограниченное понимание генетических путей участие и сравнения SC транскриптомы в различных условиях было бы проницательным. Этот быстрый и относительно простой протокол позволит проводить такие исследования. Важно отметить, что этот метод позволяет изолировать основные клетки от тех же лиц, и, таким образом, может быть использован, как это, чтобы определить, генетические и экологические параметры влияют на оба типа клеток вспомогательных желез одновременно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не разглашаем информацию.
Acknowledgments
Мы признательны членам лаборатории Karch, форме геномики iGE3, основному объекту цитометрии Flow Cytometry в Йеневском университете, а также д-ру Мы благодарим Луку Стикли за помощь в визуализации читает на IGV. Мы благодарим себя за мягкое разрешение на повторное использование цифр, и редакторы для побудило нас быть творческими с письменной форме.
Это исследование финансировалось государством (CI, RKM, FK), Швейцарским национальным фондом исследований (www.snf.ch) (FK и RKM) и пожертвованиями от Фонда Клараза (FK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μL graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μL bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
- Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
- League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
- Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
- Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
- Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
- Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
- Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).
- Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
- Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
- Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
- Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
- Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).
- Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).
- Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).
- Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
- Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
- Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
- Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335 (2019).
