Summary
Aquí, presentamos un protocolo para disociar y ordenar una población celular específica de las glándulas accesorias masculinas Drosophila (células secundarias) para la secuenciación de ARN y RT-qPCR. El aislamiento celular se logra a través de la purificación FACS de células secundarias que expresan GFP después de un proceso de disociación de múltiples pasos que requiere disección, digestión de proteasas y dispersión mecánica.
Abstract
Para entender la función de un órgano, a menudo es útil entender el papel de sus poblaciones celulares constituyentes. Desafortunadamente, la rareza de las poblaciones celulares individuales a menudo hace que sea difícil obtener suficiente material para estudios moleculares. Por ejemplo, la glándula accesoria del sistema reproductor masculino Drosophila contiene dos tipos distintos de células secretoras. Las células principales conforman el 96% de las células secretoras de la glándula, mientras que las células secundarias (SC) conforman el 4% restante de las células (alrededor de 80 células por macho). Aunque ambos tipos de células producen componentes importantes del líquido seminal, sólo unos pocos genes son conocidos por ser específicos de los SC. La rareza de los SC ha obstaculizado hasta ahora el estudio del análisis transcriptomico de este importante tipo de célula. Aquí, se presenta un método que permite la purificación de SC s c. para la extracción y secuenciación de ARN. El protocolo consiste primero en disección de glándulas de moscas que expresan un reportero de PfP específico de SC y luego sometiendo estas glándulas a digestión proteasa y disociación mecánica para obtener células individuales. Siguiendo estos pasos, las células individuales, vivas, marcadas con GFP se clasifican utilizando un clasificador de células activado sfluorescentes (FACS) para la purificación del ARN. Este procedimiento produce ARN específicos de SC de 40 machos por condición para la secuenciación de RT-qPCR y/o ARN aguas abajo en el transcurso de un día. La rapidez y simplicidad del procedimiento permite determinar en un corto período de tiempo los transcriptomas de muchas moscas diferentes, de diferentes genotipos o condiciones ambientales.
Introduction
Los órganos se componen de múltiples tipos de células, cada una con funciones discretas y a veces expresando conjuntos muy diferentes de genes. Para obtener una comprensión precisa de cómo funciona un órgano, a menudo es fundamental estudiar cada tipo de célula distinta que compone este órgano. Uno de los métodos principales utilizados para explorar la posible función es el análisis del transcriptoma. Este potente método proporciona una instantánea de la expresión génica en una célula, para revelar los procesos y vías activas. Sin embargo, este tipo de análisis es a menudo difícil para las poblaciones de células raras que deben ser purificadas a partir de células vecinas mucho más abundantes. Por ejemplo, la glándula accesoria masculina Drosophila es un órgano compuesto principalmente de dos tipos de células secretoras. Como el más raro de los dos tipos de células comprende sólo el 4% de las células de esta glándula, el uso de un análisis de transcriptoma específico de tipo celular no se había utilizado para ayudar a determinar la función de estas células.
Las glándulas accesorias (AG) son órganos del tracto reproductivo masculino en insectos. Son responsables de la producción de la mayoría de las proteínas del líquido seminal (proteínas de líquido seminal (SFP) y proteínas de la glándula accesoria (ACL)). Algunos de estos SFP son conocidos por inducir las respuestas fisiológicas y conductuales en las hembras apareadas, comúnmente llamada la respuesta post-acoplamiento (PMR). Algunos de los PMR incluyen: un aumento de la ovulación y la tasa de puesta de óvulos, el almacenamiento y liberación de espermatozoides, un cambio en la dieta femenina, y una disminución en la receptividad femenina a los varones de cortejo secundario1,2. Dado que los insectos afectan a muchas de las principales cuestiones sociales, desde la salud humana (como vectores de enfermedades mortales) hasta la agricultura (los insectos pueden ser plagas, pero son críticos para la polinización y la calidad del suelo), la comprensión de la reproducción de insectos es un área importante de investigación. El estudio de los AG y los ACP se ha avanzado significativamente con el organismo modelo Drosophila melanogaster. Estos estudios han puesto de relieve el papel de los AG y algunas de las proteínas individuales que producen en la creación del PMR, impactando el trabajo en otras especies como el vector de la enfermedad Aedes aegypti3,4,y otros insectos1 ,5. Además, como los aGs secretan los componentes del fluido seminal1,6 son a menudo considerados como el análogo funcional de la glándula prostática de mamíferos y la vesícula seminal. Esta similitud de función combinada con similitudes moleculares entre los dos tipos de tejido, han hecho de los AG un modelo para la glándula prostática en moscas7.
Dentro del macho Drosophila, hay dos lóbulos de glándulas accesorias. Cada lóbulo puede ser visto como una estructura similar a un saco compuesto por una monocapa de células secretoras que rodean un lumen central, y envuelto por músculos lisos. Como se mencionó anteriormente, hay dos tipos de células secretoras morfológica, de desarrollo y funcionalmente distintas que componen esta glándula: las células principales en forma poligonal (que componen el 96% de las células), y las células secundarias redondas (SC) más grandes (que componen el 4% restante de las células, o alrededor de 40 células por lóbulo). Se ha demostrado que ambos tipos de celda producen conjuntos distintos de ACL para inducir y mantener el PMR. La mayoría de los datos obtenidos hasta la fecha destacan el papel de una sola proteína en la activación de la mayoría de los comportamientos característicos de la PMR. Esta proteína, el péptido sexual, es un pequeño péptido de 36 aminoácidos que es secretado por las células principales8,9,10. Aunque el péptido sexual parece desempeñar un papel importante en el PMR, otros ACP, producidos por las células principales y secundarias, también han demostrado afectar a varios aspectos de la PMR11,12,13,14 ,15,16,17. Por ejemplo, sobre la base de nuestros conocimientos actuales, los SC, a través de las proteínas que producen, parecen ser necesarios para la perpetuación de la señalización SP después del primer día18.
Dada la rareza de los SC (sólo 80 células por macho), todo nuestro conocimiento sobre estas células y las proteínas que producen proviene de la genética y los enfoques candidatos. Hasta ahora, sólo se ha demostrado que una lista relativamente pequeña de genes es específica de SC. Esta lista incluye la proteína homeodominio Proventriculus defectuoso (Dve)19, el lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 y 1921, CG1656 y CG1757511, 15,21 y el factor de transcripción homeobox Abdominal-B (Abd-B)18. Anteriormente, hemos demostrado que un mutante deficiente tanto para la expresión de Abd-B como para el LncRNA MSA en células secundarias(iab-6cocuD1 mutante) acorta la longitud de la PMR de 10 días a solo un día12 , 18 , 20. Este fenotipo parece ser causado por el almacenamiento inadecuado de SP en el tracto reproductivo femenino12,18,20. A nivel celular, las células secundarias de este mutante muestran morfología anormal, perdiendo sus características estructuras similares a la vacuola18,20,21. Usando esta línea mutante, previamente intentamos identificar los genes involucrados en la función SC comparando los perfiles transcripcionales de los aGenteros de tipo salvaje o glándulas accesorias mutantes12. Además, otros laboratorios mostraron que el número de SC, la morfología y el contenido vacuolar dependen de la dieta masculina, el estado de apareamiento y la edad21,25,26.
Aunque se lograron progresos positivos utilizando estos enfoques, un transcriptoma completo de SC dista mucho de lograrse. La rareza de estas células en este órgano hizo difícil progresar aún más incluso desde células de tipo salvaje. Para probar la expresión génica, los cambios en estas células después de estímulos ambientales particulares serían aún más difíciles. Por lo tanto, se necesitaba un método para aislar y purificar el ARN SC que fuera lo suficientemente rápido y simple como para funcionar bajo diferentes orígenes genéticos y condiciones ambientales.
Tanto los genes Abd-B como MSA requieren un potenciador específico de 1,1 kb del Complejo Drosophila Bithorax (llamado potenciador D1) para su expresión en SCs18,20. Este potenciador se ha utilizado anteriormente para crear un controlador GAL4 que, cuando se asocia con un UAS-GFP,es capaz de impulsar la expresión GFP fuerte específicamente en SCs. Por lo tanto, usamos esta línea como base para un protocolo FACS para aislar estas células del tipo salvaje y del iab-6cocuD1 AG). Como los SC mutantes iab-6cocuD1 muestran una morfología celular diferente, mostramos que este protocolo se puede utilizar para aislar las células para la determinación de su transcriptoma de este tipo de célula rara en condiciones muy diferentes.
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Protocol
1. Líneas de Drosophila Utilizadas y Colección de Hombres
- Para este protocolo, utilice machos que expresen GFP en los SC y no en las células principales. Aquí, se utiliza un controlador AbdB-GAL4 (descrito en la referencia18),recombinado con UAS-GFP (en el cromosoma 2). También se pueden utilizar otros controladores apropiados. Para el aislamiento de SC sbajo diferentes condiciones mutantes, cruce la mutación en líneas que contengan la línea GFP específica de SC.
- Recoger dos lotes de unos 25 machos vírgenes sanos por cada genotipo y envejecerlos a 25 oC durante 3-4 días en viales con alimentos Drosophila recién hechos.
NOTA: A medida que la edad, el estado de apareamiento, la nutrición y el entorno social afectan cada uno a la biología reproductiva, se deben seguir protocolos estrictos para controlar estos parámetros. Los machos vírgenes envejecen durante 3-4 días después de la eclosión pupal a 25oC con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h, en alimentos estándar de harina de maíz-agar-levadura, en grupos de 20-25 machos por vial.
2. Soluciones y preparación de materiales
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Prepare las siguientes soluciones.
- Preparar medio suplementado en suero (SSM): Medio Drosophila de Schneider complementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor y 1% Penicilina-Streptomicina.
- Prepare alícuotas de 1x enzima trippsina (p. ej., TrypLE Express Enzyme) y guárdelas a temperatura ambiente.
- Preparar alícuotas de papaína [50 U/ml] (almacenadas a -20 oC y descongeladas una sola vez).
- Preparar 1x solución salina tampón de fosfato (PBS, almacenado a temperatura ambiente).
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Prepare múltiples puntas de pipeta redondeadas por llama para la disociación física de las glándulas accesorias.
NOTA: Utilice puntas de baja retención para manipular las glándulas accesorias, ya que tienden a adherirse al plástico no tratado. El proceso de redondeo de llama reduce la abertura de la punta y suaviza los bordes de la punta. Esto asegura una disociación eficiente después de la digestión de la peptidasa sin cortar las membranas celulares.- Corta una punta de 200 s con una cuchilla afilada y pásala suavemente sobre una llama para redondear su punta de modo que la abertura sea más ancha pero lisa para su manejo durante el paso 3.7.
- Acotar la abertura de múltiples puntas de 1.000 l pasando la abertura de la punta cerca de una llama durante menos de un segundo. Gire ligeramente la punta para evitar el sobre-fusión o obstrucción. Ordena las puntas hechas de más estrecha a más ancha. Esto se puede hacer cronometrando la velocidad de la aspiración. Trate de disociar una muestra a pequeña escala de aGs para probar la eficiencia de las puntas más estrechas.
NOTA: Estas puntas son fundamentales para la agitación mecánica (pasos 5.2 y 5.3). Las puntas de pipeta redondeadas con llama de calidad permiten una disociación completa mientras se preserva la viabilidad celular. Como tal, estos consejos se lavan a fondo con agua al final del procedimiento para su reutilización. Esto permite la disociación reproducible del día a día.
3. Disección de glándulas de accesorios
- Ponga de 20 a 25 Drosophila masculina en un plato de vidrio sobre hielo.
- Diseccionar 1 macho en SSM. Quítese el tracto reproductivo y despeje el par de glándulas accesorias de todos los demás tejidos, aparte del conducto eyaculatorio.
NOTA: Retire los testículos porque los espermatozoides liberados pueden crear grumos y perturbar el proceso de disociación. Retire la bombilla eyaculatoria, lo que dificulta el manejo cuando flota. - Con fórceps, transfiera las glándulas accesorias a una placa de vidrio llena de SSM a temperatura ambiente. Repita los pasos 3.2-3.3 20 veces para obtener un lote de 20 pares de glándulas en SSM.
NOTA: Estos pasos se lograrán en 15 a 20 min. Los AG deben verse sanos, y los movimientos peristálticos de la capa muscular alrededor de las glándulas deben ser visibles. GFP se puede monitorear con un microscopio fluorescente. - Transfiera las glándulas accesorias a 1pbS para un lavado de 1-2 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Para una mejor disociación, es imperativo enjuagar las glándulas con PBS. La duración de este paso, sin embargo, debe ser limitada ya que las células muestran signos de estrés en PBS; células secundarias disociadas en PBS se hinchan rápidamente y mueren. - Diluir la papaína de 20 ml [50 U/ml] en 180 ml de enzima trippsina 1x para obtener la solución de disociación (para escalar hacia arriba o hacia abajo mantenga 9 ml de enzima tripsina y 1 l de papaína para cada macho). Con fórceps, transfiera los prensaestopas a esta solución.
- Aísle la punta de las glándulas accesorias (que contienen células secundarias) de la parte proximal. Usa fórceps finos para pellizcar firmemente el centro de un lóbulo glandular y cortar con la punta afilada de un segundo fórceps. Retire la parte proximal de las glándulas accesorias y el conducto eyaculatorio para mejorar la disociación y reducir el tiempo de clasificación celular.
NOTA: Disecting la parte distal de 20 pares de glándulas tomará de 15 a 20 min y la digestión por peptidasas comenzará así a temperatura ambiente. - Después de que todas las puntas de la glándula hayan sido diseccionadas, transfiéralas en un tubo de 1,5 ml utilizando una punta especial de pipeta de 200 ml preparada en el paso 2.2.1. Debe ser ancho, redondeado y húmedo antes de manipular las glándulas.
NOTA: Para pipetear el tejido de la glándula accesoria, las puntas siempre deben estar premojadas con la solución adecuada (enzima de trippsina o Musin, mantener un tubo de cada uno para este propósito). Enjuague cuidadosamente las puntas entre las muestras para evitar la contaminación.
4. Digestión de tejidos
- Colocar el microtubo en una coctelera de 37oC durante 60 minutos, balanceándose a 1.000 rpm.
NOTA: Tanto el tiempo de agitación como el tiempo de digestión son fundamentales para una disociación exitosa. La digestión más corta o inmóvil dará una baja disociación, probablemente porque la capa muscular externa y el líquido seminal viscoso interno protegen las células de la glándula accesoria de las peptidasas. - Añadir 1 ml de SSM a temperatura ambiente para detener la digestión y proceder inmediatamente al paso 5.
5. Disociación mecánica de las células
- Usando una punta ancha redondeada de 1.000 l, premoja con SSM, transfiera la muestra a una placa de 24 pocillos. Monitor e fluorescencia gFP bajo el microscopio: la mayoría de las puntas de las glándulas deben verse intactas y unas pocas SC deben separarse.
- Usando una punta de pipeta estrecha redondeada generada en el paso 2.2.2, entuba hacia arriba y hacia abajo de 3 a 5 veces para interrumpir el tejido de la glándula accesoria.
NOTA: Supervise la fluorescencia para asegurarse de que se han roto los parches de tejido grandes. Repita el paso 5.2 si este no es el caso. - Usando una punta de pipeta redondeada muy estrecha (generada en el paso 2.2.2), pipetea hacia arriba y hacia abajo 1-2 veces.
NOTA: Solo las celdas individuales deben ser visibles después del paso 5.3. Se recomienda el uso de placas de 24 pocillos porque permiten una fácil supervisión del proceso. Cuando se procesaron algunas muestras y se dio un resultado satisfactorio (células secundarias de aspecto saludable perfectamente disociadas), los pasos de pipeteo se realizarán en el microtubo. - Espere al menos 15 minutos para permitir que las células se asienten en la parte inferior del pozo y elimine el exceso de SSM para reducir el tiempo de clasificación.
NOTA: Dejar que las células se acomoden resultó superior a métodos alternativos como la centrifugación, y permite una última inspección visual de las células justo antes de FACS. - Pipet las células en un tubo limpio de 1,5 ml y la piscina de muestras idénticas (dos lotes de 20 machos para cada condición). Enjuague los pozos con SSM para recuperar las últimas células y encofrelas en el tubo (utilice un pequeño volumen).
- En microtubos de 1,5 ml, añada 300 ml de solución de lisis celular y 1 l de proteinasa K [50 g/L] (soluciones proporcionadas en el kit de purificación de ARN, ver Paso 7). Prepare dos tubos para cada muestra (uno para MCs y otro para SCs).
6. FACS (Clasificación celular activada por fluorescencia)
- Agregue el marcador de viabilidad a cada muestra que se va a ordenar unos minutos antes de la clasificación (0,3 mM Draq7).
PRECAUCION: Draq7 debe manejarse con precaución. -
Ordenar una población homogénea de células secundarias vivas (GFP-positivas, células Draq7-negativas). En otro microtubo, clasifique una población de células principales (células más pequeñas, GFP negativas, Draq7 negativas). Utilice la siguiente estrategia de gating FACS:
NOTA: Ajuste la presión del clasificador de celdas a 25 PSI y pase las células a través de una boquilla de 100 m. La tasa de clasificación es de alrededor de 2.000 celdas/s.- Excluya los desechos y seleccione el total de celdas en función del FSC-SSC(Figura 2E)para excluir los desechos.
- Excluya las células muertas. Emocione Draq7 con un láser de 640 nm y recoja la fluorescencia emitida con un filtro de paso de banda 795/70. Salida de celdas positivas de la puerta Draq7(Figura 2F).
- Elimine los dobletes usando un doble gating en SSC-H vs SSC-W y FSC-A vs FSC-H(Figura 2H).
NOTA: Excluya los dobletes celulares rigurosamente usando doble gating, para reducir la contaminación de la célula principal. - Ordene las células positivas de 550 GFP en un microtubo de 1,5 ml con tampón de lysis y Proteinase K. Esta población se considera células secundarias (SC, Figura 2G). Emocione GFP a 488 nm y recoja la fluorescencia emitida con un filtro de paso de banda 526/52.
- Ordenar 1.000 células GFP-negativas, homogéneas y de pequeño tamaño, en un microtubo de 1,5 ml con tampón de Lysis y Proteinase K. Esta población se considera células principales (MC, Figura 2G).
- Vórtice todas las muestras.
NOTA: De 40 machos (40 x 80 SC a 3.200 células secundarias), se obtienen 600 a 800 células secundarias individuales vivas (alrededor del 20-25% de recuperación). Deje de clasificar alrededor de 550 SC y 1.000 MC para normalizar las muestras.
7. Extracción de ARN
NOTA: Utilizamos Epicentre MasterPure RNA Purification Kit para la extracción de ARN, con las siguientes adaptaciones. Se pueden utilizar otros kits siempre y cuando el rendimiento sea lo suficientemente alto como para preparar una biblioteca para la secuenciación a partir de 500 celdas (2 NG RNA se utilizaron aquí).
- Muestras de calor a 65oC durante 15 min y vórtice cada 5 min para completar la lisis celular.
- Colocar muestras en hielo durante 5 min. Siga las recomendaciones del fabricante para precipitaciones de ácidos nucleicos (partes "Precipitación de ácidos nucleicos totales" y "Eliminación del ADN contaminante de preparaciones totales de ácido nucleico").
- Suspenda el gránulo de ARN en 10 ml de tampón TE libre de RNase.
- Añadir inhibidor de la RNase (opcional).
- Almacene las muestras a -80 oC.
8. Controles de calidad de la cantidad, calidad y especificidad del ARN
- Estimar la calidad y concentración del ARN. Debido al pequeño volumen y la concentración, utilice chips de ARN 6000 Pico aquí. ARN de buena calidad se define como no degradado, visible como una línea de base baja con picos agudos correspondientes a arNM.
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RT-qPCR para controlar la identidad de las células ordenadas
- Realice la transcripción inversa con 2 ng de RNA total usando hexamers aleatorios como imprimadores. Realice RT en ARN de célula sócitor secundario y ARN de célula principal.
NOTA: los cDNAs se pueden diluir, acicalar y mantener congelados para su uso posterior. - Realizar PCR cuantitativo en tiempo real utilizando pares de imprimación adecuados para cuantificar los genes de limpieza (alfa-tubulina, 18S rRNA), genes específicos de células secundarias (MSA, Rab19, Abd-B) y gen específico de células principales (péptido sexual).
- Realice la transcripción inversa con 2 ng de RNA total usando hexamers aleatorios como imprimadores. Realice RT en ARN de célula sócitor secundario y ARN de célula principal.
9. Secuenciación (Preparación de la Biblioteca de ADNc, Secuenciación y Análisis de Datos)
- Utilice 2 ng de ARN totales para sintetizar cDNAs con imprimaciones políditas. Utilice la tecnología SMARTer para amplificarlos para la amplificación.
- Utilice un kit Nextera XT para preparar la biblioteca.
- Secuencia con múltiplexód, 100 nucleótidos de una sola lectura secuenciación (aunque 50 lecturas de nucleótidos son apropiados para la mayoría de los propósitos) para producir alrededor de 30 millones de lecturas para cada muestra.
10. Análisis de datos
- Ejecute FastQC.
- Utilice el alineador STAR para asignar las lecturas en el genoma de referencia UCSC dm6 Drosophila y generar archivos .bam. Utilice Integrative Genomics Viewer (IGV) para visualizar las lecturas en el navegador del genoma.
- Use HTSeq para realizar recuentos de genes.
- Utilice el método Media recortada de valores M (TMM) para normalizar los recuentos de genes22. Utilice edgeR para realizar análisis estadísticos de la expresión diferencial, las gráficas MA y el PCA.
- Para el análisis y las estadísticas de la expresión génica, utilice el Modelo Lineal General, la prueba F cuasi-probable con La Tasa de Detección Falsa (FDR) y la Corrección de Benjamini & Hochberg (BH).
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Representative Results
El protocolo presentado aquí permite a un experimentador aislar las células secundarias de las glándulas accesorias masculinas Drosophila y extraer su ARN en el transcurso de un solo día(Figura 1).
Usamos la construcción Abd-B-GAL4 18 para etiquetar las células secundarias (SC) pero no las células principales (MC) con GFP(Figura 2A). Uno de los objetivos de este procedimiento es obtener el transcriptoma de tipo salvaje de SCs (el tipo salvaje está escrito con comas invertidas ya que se obtienen de moscas transgénicas que expresan GFP y GAL4). Otro objetivo es obtener ARN SC a través de un procedimiento rápido y fácil que permita estudiar su expresión génica en diferentes condiciones. Por lo tanto, realizamos este procedimiento utilizando el tipo salvaje y "iab-6cocuD1" mutantes que llevan una eliminación de 1,1 kb eliminando el potenciador de Abd-B responsable de la expresión SC. Esta eliminación también elimina el promotor de MSA,una transcripción importante para el desarrollo de células secundarias, morfología y función18,20 (Figura 2B,C). Este protocolo se repetía tres veces con 2 genotipos cada vez para obtener triplicados biológicos (en adelante denominado WT-1,-2,-3 para el tipo salvaje y D1-1,-2 y -3 para el iab-6cocuD1).
Este protocolo permite la disociación MC y SC de las glándulas accesorias Drosophila en pocas horas(Figura 2D). Ambas poblaciones celulares se clasifican en dos tubos diferentes para aislar los m.m. y los SC. La estrategia de gating para FACS se muestra en la Figura 2E-2G. Draq7 permite estimar la viabilidad celular alrededor del 70% para toda la muestra(Figura 2F). Los singlets representan más del 90% de la población de SC, y más del 80% de la población de MC, según lo estimado por FSC-A vs FSC-H y SSC-H vs SSC-W. (véase la Figura 2H). Esto refleja una disociación eficiente. Alrededor del 10% de los eventos de clasificación fueron abortados porque otra célula o escombros estaban presentes en la misma gota de FACS. De 40 machos, normalmente recogemos 550 SCs y 1.000 MCs y luego interrumpimos la clasificación. A partir de 1 muestra (de 6), no pudimos llegar a 550 células secundarias. Por lo tanto, la muestra WT-1 se obtuvo de sólo 427 SC, pero proporcionó ARN de calidad y cantidad similares a los demás.
Las células se clasifican en tampón de lisis (que contiene proteinasa K). Tan pronto como todas las muestras están listas, los ARN se extraen de cada muestra de célula para tener pellets de ARN al final del día. La calidad y la cantidad de ARN se estiman utilizando un Bioanalizador con un chip adecuado para hacer frente a bajas concentraciones y pequeños volúmenes. Debido a que las concentraciones estimadas fueron variables entre muestras (que van desde más de 1.300 pg/L hasta 344 pg/L, véase la Figura 3A),ajustamos el material de partida para la síntesis de la biblioteca RT-qPCR y cDNA a aproximadamente 2 ng (medido concentraciones no son muy precisas). Cuantificamos la expresión de genes específicos por qPCR en tiempo real en extractos de MC y SC de tipo salvaje para controlar la identidad de las poblaciones celulares que clasificamos. Figura 3 B muestra la expresión génica como cuantificaciones relativas normalizadas a la expresión alfa-tubulina. Los genes de limpieza como el ARNm 18S y la alfa-tubulina se detectan en todas las muestras, como se esperaba. Muy al contrario, el gen SC Rab19 se detecta sólo a partir de extractos de SC, y el gen MC péptido sexual se detecta sólo de MC. Observamos que la expresión Rab19 en iab-6cocuD1 mutante SC es baja en relación con el tipo salvaje SC, lo que sugiere que la expresión de este gen se ve afectada por la pérdida de Abd-B y MSA (consistentemente, el gran Las vacuolas etiquetadas con Rab19 se pierden en el mutante iab-6cocuD1 21). La transcripción específica de la célula secundaria MSA se detecta sólo desde el tipo salvaje SC y no de MC, ni de iab-6cocuD1 SCs, que se esperaba ya que el promotor de MSA se elimina en este mutante. En conjunto, los QCs mostrados en la Figura 3 demuestran que los ARN obtenidos a través de este protocolo no se degradan, y que ambas poblaciones celulares (SC y MC) se ordenan con éxito a partir de glándulas accesorias, tanto en condiciones de tipo salvaje como de mutantes. Aquí solo se secuenciaron los ARN de las células secundarias, pero tenga en cuenta que este procedimiento permite la elaboración de perfiles de transcriptoma concomitantes de SC y MCs.
La secuenciación del ARN se realizó mediante procedimientos estándar. Aquí, sólo discutiremos los análisis de control de calidad que son pertinentes para el propósito de este método. Cuando se obtienen secuencias, las lecturas se asignan al genoma de Drosophila de referencia, se atribuyen a genes y se normalizan. El PCA (Análisis de Componentes Principales) se realizó en las 6 muestras (3 muestras de tipo salvaje y 3 réplicas de iab-6cocuD1). La mayor cantidad posible de variabilidad en los datos se tiene en cuenta en PC1, y la mayor parte de la variabilidad restante se tiene en cuenta en PC2. Como se muestra en la Figura 4A, el tipo comodín replica el clúster cerca, y lejos de Iab-6cocuD1 muestras. Esto muestra que las muestras de WT son más similares entre sí que de las mutantes. Esto ilustra la reproducibilidad del método y su capacidad para detectar programas genéticos anormales a partir de células secundarias mutantes. Mientras que las muestras D1-2 y D1-3 se agrupan, observamos que la muestra D1-1 es bastante divergente. Dado que todos los QCs para esta réplica son buenos y comparables a todas las demás réplicas, podemos excluir un problema de preparación de muestras (29 millones de lecturas en total, >76% de los cuales se alinean exclusivamente con el genoma de referencia. Entre ellos, >77% se atribuyen a un gen, >90% son ARNm y <3% son ARNm). Esta divergencia podría reflejar que la expresión génica en SC es inestable en iab-6cocuD,aunque probar esta hipótesis requeriría más réplicas.
Visualizar lecturas alineadas con genes particulares en el genoma permite una estimación visual de la calidad de los datos. La Figura 4 muestra una selección de genes, con lecturas de 1 réplica representativa para cada genotipo. Como era de esperar, los genes de limpieza como Act5C se expresan tanto en genotipos(Figura 4B),como en los genes específicos de SC Rab19 y Dve (Figura 4C,D). La falta de lecturas intronic confirma que la transcripción inversa de polídt ceba selectivamente de arnm empalmados maduros para la preparación de la biblioteca de ADNc. En particular, podemos ver variaciones importantes y significativas en la expresión de genes específicos entre el tipo silvestre y iab-6cocuD1 SC. Esto se ejemplifica en la Figura 4E por el gen MSA cuya fuerte expresión en tipo salvaje se pierde en iab-6cocuD1. MSA se presenta como una prueba de principio que este método permite identificar genes que están mal regulados en condiciones mutantes. Esto ayudará a entender los fenotipos observados en este mutante, y podría dar nuevas perspectivas sobre las funciones normales de las células secundarias.
Figura 1: Descripción general del protocolo. Se muestran los pasos clave del protocolo, con la línea de tiempo en el lado derecho. Este procedimiento permite que uno a partir de Drosophila viva por la mañana tenga células de la glándula accesoria disociadas al mediodía, ordenarlas en función de la expresión GFP y obtener sus ARN extraídos al final de la jornada laboral. La secuenciación del ARN y el análisis de datos suelen tardar unas semanas. Esta cifra se ha modificado de la referencia27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Aislar y clasificar las células secundarias que expresan GFP. (A) Imagen confocal de la glándula accesoria Abd-B:GAL4 UAS-GFP que expresa GFP en células secundarias (SC), pero no en células principales (MC). Los núcleos están manchados con DAPI (azul). La línea blanca punteada delimita los lóbulos AG. El ED es un conducto eyaculatorio. Las barras blancas en la esquina superior izquierda son escalas de 50 m. (B,C) Vistas ampliadas de la parte distal de la glándula accesoria con SC que expresa GFP, en tipo salvaje (B) y iab-6cocuD1 (C) fondo. (D) Células disociadas con bajo aumento bajo bajo el binocular GFP. (E-H) Estrategia de gating FACS para purificar SC y MC. Puntos rojos en todos los paneles mostrados SC como se define en el panel (G). En primer lugar se excluyen los escombros (E, paso 6.2.1), así como las células muertas positivas Draq-7 (F, paso 6.2.2). Se seleccionan células positivas GFP (SC), así como una población homogénea de células negativas de GFP (MC)(G, pasos 6.2.4 y 6.2.5). Los dobletes se excluyen de la población MC y SC (paso 6.2.3, solamente el gating SSC-H vs SSC-W para SC se muestra en 2H como un ejemplo). Esta cifra se ha modificado de la referencia27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: QC en ARN: calidad, cantidad y especificidad del tipo de celda. (A) Control de la estimación de la calidad y concentración del ARN en PicoChip. El pico de 25 nt es el control para la cuantificación. La línea de base baja indica una baja degradación y los 2 picos principales son los ARN ribosomales. Se muestran las 3 muestras utilizadas para RT-qPCR, su calidad es representativa de todas las muestras de ARN utilizadas en este estudio, y sus concentraciones estimadas reflejan la variación en el ARN total que obtuvimos entre las muestras. (B) RT-qPCR demuestra la especificidad de la clasificación de células secundarias (SC) y células principales (MC). La cuantificación de la expresión génica se realiza utilizando la fórmula q-2(40-Cq). Cada triplicado de cada gen en cada condición se normaliza a la cantidad media de ARN alfa-Tubulina para compensar la variación total del ARN. Las barras de error muestran la desviación estándar. WT significa tipo salvaje y D1 se refiere al mutante iab-6cocuD1. Esta cifra se ha modificado de la referencia27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: QC en los datos de secuenciación de ARN. (A) Análisis de componentes principales (PCA) en conjuntos de datos de secuenciación de ARN WT-1,-2,-3 (puntos verdes) y D1-1,-2,-3 (puntos azules). (B-E) Secuenciación de lecturas asignadas al genoma de referencia drosophila utilizando el software IGV. Sólo se muestra una muestra representativa de cada genotipo por motivos de claridad (WT-1 y D1-2), y solo se muestran unos pocos loci específicos. Los nombres de los genes se escriben en la parte superior de cada panel, > y < símbolos se refieren a su orientación. Los números entre corchetes representan para cada pista la escala para el número de lecturas por par de base de ADN. Esta escala es la misma para ambas condiciones para un gen dado, pero varía entre genes para una mejor visualización. Las barras azules en la parte inferior de cada panel muestran los intrones de los genes (línea delgada), exons (línea ancha) y ORF (rectángulos con >>). Tenga en cuenta que Rab19 y Arl5 son genes convergentes superpuestos (C). Esta cifra se ha modificado de la referencia27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Primers utilizados para RT-qPCR en este estudio: | ||
| Gen objetivo | Imprimación delantera | Imprimación inversa |
| alfa-Tubulin | TTTTCCTTGTCGCGTGAGAA | CCAGCCTGACCAACATGGAT |
| 18S rRNA | CTGAGAAACGGCTACCACATC | ACCAGACTTGCCCTCCAAT |
| Rab19 | CAGGAGAGGTTTCGCACTATTAC | TTGGAAAAGGAAGACCGCTTG |
| Péptido sexual | GGAATGGCCGTGGAATAGGA | TAACATCTTCCACCCCAGGC |
| Msa | CTCATCTGCGTCTTCGCGTG | CAGCTCCGTTTGTACTCTCGAGC |
Tabla 1: Secuencia de imprimaciones
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Discussion
Los métodos para la disociación celular del tejido Drosophila como los discos imaginativos ya se describen23. Nuestros intentos de simplemente utilizar estos procedimientos en las glándulas accesorias fracasaron, animándonos a desarrollar este nuevo protocolo. La digestión de la proteasa y la trituración mecánica fueron pasos críticos que tenemos problemas para el éxito del procedimiento, y por lo tanto colocamos muchas notas en las secciones 2 a 5 para ayudar a los experimentadores a obtener resultados satisfactorios. Para que la disociación tenga éxito, las peptidasas deben llegar a las células de la glándula accesoria, que están protegidas por el líquido seminal viscoso en el lumen y la capa muscular alrededor de la glándula. Por lo tanto, la diseción de la parte distal de las glándulas fue fundamental (paso 3.6). Además, era necesario digerir durante 60 minutos al menos con agitación vigorosa (paso 4.1). La disociación suave con solución de trippsina (por ejemplo, TrypLE) conservó la integridad de la glándula y la viabilidad celular hasta la disociación mecánica. La adición de papaína o colagenasa en asociación con la solución de trippsina mejoró la disociación (se obtuvo una dissociación perfecta con menos pipeteo, lo que resulta en una mejor supervivencia celular). Sin embargo, ninguna de esas enzimas fue suficiente para disociar las células por sí sosociadas. El pipeteo con puntas estrechas redondeadas generadas en la parte 2.2.2 es un paso clave para este método. Por lo tanto, esta trituración (pasos 5.2-5.3) debe optimizarse en experimentos a pequeña escala para elegir la mejor combinación de consejos (ver nota en el paso 5.3).
Usando este protocolo, uno será capaz de aislar 500 a 800 células secundarias vivas de 40 machos. Esto representa el 20 % (5 %) recuperación considerando 3.200 SC como el material de partida (40 machos x 80 SC). La eficiencia del 20% fue lo suficientemente alta para la secuenciación de ARN, ya que podíamos procesar varias muestras en un día. Sin embargo, esto podría mejorarse mediante varios métodos, entre ellos: trabajar en lotes más grandes; hacer la trituración en el tubo de digestión y saltarse el paso 5.4 para reducir las transferencias; trituración muy suavemente (algunas células GFP+ disociadas mueren poco después del paso 5.3); acortar el período entre la disociación y el FACS; disminuyendo el tiempo de digestión mediante el uso de solución de tripsina a mayor concentración; utilizando parámetros menos estrictos para la selección de singlet (paso 6.2.3) y la clasificación anulada. Una limitación de este protocolo es que toma varias horas aislar las células; por lo tanto, no es adecuado para estudiar cambios muy transitorios en la expresión génica. Con este protocolo, 4 x 20 machos pueden ser procesados por una sola persona (con entrenamiento) en una mañana, permitiendo la extracción de ARN de SC de dos condiciones diferentes en 1 día(Figura 1). En particular, más experimentadores pueden participar en la recolección de glándulas accesorias (pasos 3.1-3.3) con el fin de procesar múltiples muestras en el mismo día. Sin embargo, los pasos 3.4 en adelante serán realizados preferentemente por la misma persona para maximizar la reproducibilidad.
Las células secundarias llevan a cabo funciones esenciales para la fecundidad masculina12,20,24,pero todavía falta la imagen completa de los genes que expresan para cumplir este papel. Aquí, describimos cómo obtener el transcriptoma de estas células de un número relativamente pequeño de moscas, lo que permite la comparación de la expresión génica en SC en diferentes condiciones. Aquí, se utilizó un mutante que afectaba a la función y morfología de SC, y los cambios importantes en su transcriptoma son visibles. Por lo tanto, este método podría ayudar a identificar los nuevos genes SC necesarios para su función. Hasta nuestro conocimiento, el único método alternativo para obtener el transcriptoma SC se realizó en nuestro laboratorio mediante la selección manual de SC. Se obtuvieron datos de secuenciación de ARN de buena calidad, pero el procedimiento fue demasiado laborioso para ser realizado en múltiples condiciones. Compararemos nuestros conjuntos de datos SC RNAseq y analizaremos su significado biológico sobre la biología SC en un papel distinto (en preparación).
En el futuro, esta técnica no sólo arrojará luz sobre el transcriptoma sC de tipo salvaje, sino que también permitirá estudiar el impacto del medio ambiente o la alteración genética en el transcriptoma de células de la glándula accesoria. Se ha demostrado que el número de SC, la morfología y el contenido vacuolar dependen de la dieta masculina, el estado de apareamiento y la edadde 21años,25,26. Todavía tenemos una comprensión limitada de las vías genéticas involucradas y comparar los transcriptomes de SC en diferentes condiciones sería perspicaz. Este protocolo rápido y relativamente simple permitirá este tipo de estudios. Es importante destacar que este método permite aislar las células principales de los mismos individuos, y por lo tanto podría ser utilizado como lo es para determinar si los parámetros genéticos y ambientales afectan ambos tipos de células de la glándula accesoria simultáneamente.
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Disclosures
Los autores no tienen ninguna divulgación.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Karch, a la forma de placa de genómica iGE3, a las instalaciones centrales de Flow Cytometry de la Universidad de Ginebra y al Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye, que estableció el protocolo para FACS. Agradecemos a Luca Stickley por su ayuda para visualizar las lecturas en IGV. Nos damos las gracias por el permiso suave para reutilizar figuras, y a los editores por incitarnos a ser creativos con la escritura.
Esta investigación fue financiada por el Estado de Ginebra (CI, RKM, FK), el Fondo Nacional Suizo de Investigación (www.snf.ch) (FK y RKM) y donaciones de la Fundación Claraz (FK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μL graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μL bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
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