Summary
Muis prostaat organoïden vertegenwoordigen een veelbelovende context voor het evalueren van mechanismen die differentiatie reguleren. Dit artikel beschrijft een verbeterde aanpak om prostaat organoïden vast te stellen, en introduceert methoden om (1) eiwit lysaat van organoïden te verzamelen, en (2) de organoïden voor de confocale microscopie van de hele Mount te fixeren en te vlechten.
Abstract
Het prostaat epitheel bestaat overwegend uit basale en Luminale cellen. In vivo Lineage tracing is gebruikt voor het definiëren van de differentiatie capaciteit van de muis prostaat basale en Luminale cellen tijdens de ontwikkeling, weefsel-regeneratie en transformatie. Echter, het evalueren van cel-intrinsieke en extrinsieke regulatoren van de capaciteit van de prostaat epitheliale differentiatie met behulp van een lineage tracing aanpak vaak vereist uitgebreide fokken en kan kosten-prohibitief. In de prostaat organoïde assay genereren basale en Luminale cellen prostatisch epitheel ex vivo. Belangrijk is dat primaire epitheelcellen kunnen worden geïsoleerd van muizen van elke genetische achtergrond of muizen behandeld met een willekeurig aantal kleine moleculen voorafgaand aan, of na, plating in driedimensionale (3D) cultuur. Er wordt na 7-10 dagen voldoende materiaal voor de evaluatie van de differentiatie capaciteit gegenereerd. Verzameling van basaal afgeleide en Luminale afgeleide organoïden voor (1) eiwitanalyse door Western Blot en (2) immunohistochemische analyse van intacte organoïden door gehele confocale microscopie van de hele Mount stelt onderzoekers in staat de ex vivo-differentiatie te evalueren capaciteit van prostaat epitheelcellen. Bij gebruik in combinatie bieden deze twee benaderingen aanvullende informatie over de differentiatie capaciteit van prostaat basale en Luminale cellen in reactie op genetische of farmacologische manipulatie.
Introduction
Basale en Luminale cellen bestaan uit de meerderheid van het prostaat epitheel1. Lineage tracing studies hebben uitgewezen dat deze celtypen overwegend zelfvolgehouden zijn door verschillende voor ouders in de Adult Mouse2; Luminale differentiatie van basale voor ouders is echter waargenomen in verschillende contexten, waaronder ontwikkeling3,4, weefselregeneratie5, ontsteking6,7 en prostaatkanker initiatie2,8. Bovendien ondersteunt opkomende data het bestaan van multipotente Luminale voor ouders en luminal-geëngageerde voorlopercellen9. Bij gemetastaseerde prostaatkanker vormt de differentiatie van een AR-afhankelijke Luminale afstamming tot een AR-onverschillig Lineage met basale en neuro-endocriene kenmerken een steeds waardelijker mechanisme van resistentie tegen androgeen pathway remmers10,11,12. Daarom, als differentiatie is betrokken bij normale fysiologie, kanker initiatie en resistentie tegen therapie, verhelderende belangrijke moleculaire regulatoren van prostaat epitheliale celdifferentiatie is van cruciaal belang.
De muis prostaat organoïde model is ontstaan als een elegante ex vivo context te bestuderen van de prostaat epitheel celdifferentiatie9,13,14. In deze test worden individuele epitheelcellen in een 3D-matrix verguld, waar ze klierstructuren genereren die zowel basale als Luminale cellen bevatten binnen 1 week. Terwijl de bestaande benaderingen voor het plateren van cellen in de organoïde-cultuur kunnen worden gebruikt om efficiënt organogeniden te genereren, vereisen deze benaderingen verdere optimalisatie14. Opmerkelijke uitdagingen in verband met het kweken van prostaat organoïden zijn (1) met uitzondering van tweedimensionale (2D) kolonies die onder de Matrigel (matrix gel) van de analyse vormen, (2) het behoud van de integriteit van de matrix gel tijdens de veranderingen in de media, en (3) het nauwkeurig tellen van organoïden. Dit artikel schetst een aanpak voor het genereren van organoïden uit epitheelcellen geïsoleerd van muis prostaat. De beschreven aanpak omvat coating platen met poly (2-hydroxyethyl methacrylaat) (poly-HEMA) om het optreden van 2D-kolonies te voorkomen. Bovendien worden cellen in een matrix gelring geplateerd, in plaats van een matrix gelschijf, waardoor het veranderen van de media en het tellen van organoïden minder uitdagend is. Deze technieken stellen onderzoekers in staat om gemakkelijker te onderzoeken hoe genetische veranderingen of kleine moleculen die vóór of tijdens de organoïde vorming worden geïntroduceerd, belangrijke processen zoals differentiatie veranderen.
Het oogsten van prostaat organoïden voor Western Blot of immunohistochemische analyse door Whole-Mount confocale microscopie kan waardevol mechanistisch inzicht geven in differentiatie13, maar er ontbreken ook gevestigde protocollen om organoïden voor dergelijke technieken voor te bereiden. Dit manuscript beschrijft benaderingen voor de oogst van organoïden voor (1) inzameling van proteïne lysaat, of (2) fixatie en kleuring voor confocale microscopie. Belangrijk is dat de benadering beschreven voor de vaststelling en kleuring prostaat organoïden aanzienlijk verbeterd met betrekking tot de bestaande methoden. Hoewel deze afhankelijk zijn van het snijden van organoïden15, gebruikt de in dit manuscript beschreven methode intact organoïden, die helpen beschermen tegen organoïde schade tijdens monstervoorbereiding. Bij gebruik in combinatie kunnen Western Blot en confocale microscopie waardevol inzicht geven in de moleculaire regulatoren van differentiatie. Als alternatief kunnen deze benaderingen worden gebruikt om andere processen zoals ontwikkeling en transformatie te modelleren.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de institutioneel Review Board van de University of California, Los Angeles.
Opmerking: In Figuur 1wordt een schematische voorstelling gegeven van de in het papier beschreven benaderingen.
1. isoleren van muis basale en Luminale prostaat epitheelcellen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) — TIMING: 30 min
Opmerking: Voer stappen 1.3-1.5 in het donker uit.
- Na dissociatie van cellen van de totale muis prostaat zoals beschreven in Lawson et al.16, breng de cellen over naar FACS tubes en regende 0,1-5 x 106 cellen in 100 μL Dissociatiemedia (tabel 1).
- Voeg het juiste volume van de volgende direct geconjugeerde primaire antilichamen toe: CD45, CD31, ter-119, EpCAM en CD49f.
- Incuberen op ijs, beschermd tegen licht, gedurende 20 minuten.
Opmerking: Het wordt aanbevolen om 10% van de totale gezien cellen te gebruiken voor Onbevlekte en enkelwandige controles. Deze controles zijn nodig om de juiste compensatie en spanning voor het sorteren in te stellen. - Cocktail van Quench-antilichamen door 1 mL dissociatie media toe te voegen aan elk monster. Pellet de cellen door centrifugeren bij 800 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) en verwijder het supernatant door aspiratie.
- Respendeer de cellen in het juiste volume (250 μL per 1 x 106 cellen) van dissociatie media die 1 μg/ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) bevatten. Ga naar FACS. Flowcytometrie plots die de isolatie van muizen basale en Luminale prostaat epitheelcellen aantonen, worden geïllustreerd in Figuur 2.
2. plating gesorteerde prostaat epitheelcellen in primaire muis Organoïde cultuur — TIMING: 2-3 u (met uitzondering van poly-HEMA-gecoate plaat voorbereiding)
Opmerking: Platen zijn bekleed met poly-HEMA om te voorkomen dat 2D kolonie vorming op het oppervlak van de put onder de matrix gel. Bereid poly-HEMA-gecoate platen 1 dag vóór het beplating gesorteerd basale of Luminale prostaat epitheelcellen in de muis organoïde cultuur. Ontdooien 1 mL aliquots van de gereduceerde groeifactor matrix gel, hierna aangeduid als matrix gel, op Ice 2 h voorafgaand aan stap 2,1. Y-27632 (Rock remmer) moet direct voorafgaand aan stap 2,1 worden toegevoegd aan de muis organoïde media. Voer de stappen 2.1-2.8 op ijs uit.
- Pellet de cellen in 5 mL ronde bodem buizen door centrifugeren bij 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c en aspireren het supernatant.
- Was de celpellet in 500 μL muis organoïde media (tabel 2)14.
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c en aspireren het supernatant.
- Respendeer in muis organoïde media met een celdichtheid van 1.000 cellen/μL.
- Meng epitheelcellen die zijn opgehangen in muis organoïde media met matrix gel om een eindmengsel te genereren dat 25% cellen/media en 75% matrix gel bevat om meester mixen te bereiden. Basale cellen worden meestal geplateerd met een concentratie van 100-2000 cellen/80 μL, terwijl Luminale cellen gewoonlijk worden verguld met een concentratie van 2000-10000 cellen/80 μL. De dichtheid van de geplateerde cellen varieert afhankelijk van de dag van de verwachte materiaal verzameling en de gewenste downstreamtoepassing.
Opmerking: Chill passend formaat Tube (s) voor verwachte Master Mix volume 5 min vóór Master Mix voorbereiding. Om ervoor te zorgen dat de matrix gel niet verharden tijdens het hanteren, is het essentieel om de pipetpunt te koelen door de matrix gel 3-4 keer te pipetteren voordat deze naar een nieuwe buis wordt overgebracht. - Voeg per put van een 24-put-plaat 80 μL van het matrix-gel/celmengsel toe. Pipetteer een druppel op de onderste helft van de wand van de put, terwijl het vermijden van direct contact met de poly-HEMA coating wordt aanbevolen. Na het toevoegen van de matrix gel, draai de plaat zodat het matrix gel/celmengsel een ring rond de rand van de put vormen.
- Plaats de 24-put plaat in een 37 ° c 5% CO2 incubator aan de rechterkant voor 10 minuten, zodat de matrix gel gedeeltelijk kan verharden.
Opmerking: Begin direct na het plaatsen van de 24-pits plaat in de incubator met de opwarming van de muis organoïde media op 37 °c. - Na 10 minuten incuberen, draai de 24-well plate ondersteboven en inbroed voor een extra 50 min zodat de matrix gel volledig kan verharden.
- Voeg 350 μL voorverwarmde muis organoïde media toe naar het midden van elke put.
Opmerking: Om de integriteit van de matrix gel te behouden, is het essentieel om de matrix gelring te vermijden tijdens het toevoegen van media. - Na het toevoegen van de media, retourneer de 24-put plaat aan de 37 ° c 5% CO2 incubator.
3. aanvullen van de muis Organoid media — TIMING: 10-15 min per 24-well plate
Opmerking: Bestaande media moeten elke 48 h worden vervangen door nieuwe media. Vóór elke media wisseling, pre-warme muis organoïde media. Het is niet nodig om ROCK remmer toe te voegen aan de media die worden gebruikt voor bijvullen.
- Kantel de 24-put plaat in een hoek van 45 ° en verwijder voorzichtig bestaande media uit het midden van elke put met behulp van een P1000 Pipet, terwijl u de matrix gel ring vermijdt.
- Voeg 350 μL pre-warmed Mouse organoïde media toe zoals in stap 2,9. Het wordt aanbevolen om een groter volume aan media (tot 1 mL) toe te voegen aan organoïden die langer dan 5 dagen worden gekweekt om een snelle uitputting van belangrijke nutriënten en groeifactoren te voorkomen.
4. extractie van proteïne Lysaat van prostaat Organoïden voor Western Blot analyse — TIMING: 2.5-4 H
Opmerking: Voorafgaand aan het verzamelen van organoïden voor eiwit lysaat extractie, bereiden en pre-warme dispase-bevattende media (tabel 1).
- Verwijder de media van elke put zoals in stap 3,1.
- Om organoïden te verzamelen, schiet de matrix gel herhaaldelijk door Pipetteer 1 mL dispase-bevattende Media rechtstreeks op de ring van de matrix gel totdat de hele ring is ontzet, en breng deze over in een micro centrifugebuis van 1,5 mL.
Opmerking: Het is essentieel om direct contact met de poly-HEMA gecoate putten te vermijden. Direct contact kan verontreiniging van het verzamelde materiaal veroorzaken met poly-HEMA, wat een negatieve invloed kan hebben op de overleving van de cel. - Plaats de microcentrifuge buis (s) van 1,5 mL in een incubator van 37 °C van 5% CO2 gedurende 30 minuten tot 1 uur, zodat de matrix gel volledig kan worden vergisting door dispase.
- Pellet organoïden door centrifugeren bij 800 x g gedurende 5 minuten bij RT en verwijder het supernatant met behulp van een micro pipet.
- Voeg fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan de organoïde pellet en hervat door zachtjes te flikken.
Opmerking: Het niet voldoende hervatten van de organoïde pellet kan resulteren in de besmetting van organoïde materiaal met rest dispase of matrix gel. - Pellet de organoïden door centrifugeren bij 800 x g gedurende 5 minuten bij RT en verwijder het supernatant met behulp van een micro pipet.
- Snel bevriezen van de organoïde pellets door het plaatsen van elke buis in een oplossing met droogijs en methanol. Bewaar de buis (en) tot toekomstig gebruik bij-80 °C. Of extract eiwit lysaat onmiddellijk na stap 4,6.
- Respendeer de organoïde pellets in 100 μL eiwit lysisbuffer (tabel 1) per 10 μL verpakt celvolume. Veeg naar respenderen.
Opmerking: Als het hervatten na het snel invriezen, zorg ervoor dat de eiwit lysisbuffer wordt ontdooid voordat monsters van-80 °C worden verwijderd, aangezien lysisbuffer onmiddellijk aan monsters moet worden toegevoegd om fosfatase en protease activiteit te voorkomen. - Inbroed de monsters in eiwit lysisbuffer op ijs gedurende ten minste 45 min.
Opmerking: Het wordt aanbevolen om te soniceren voorafgaand aan incubatie op ijs om de efficiëntie van het herstel van kern eiwitten te verhogen; sonicatie is echter niet vereist. Als sonicatie niet wordt uitgevoerd, gaat u verder met stap 4,10.- Om te soniceren, onderdompel buisjes in nat ijs en breng voorzichtig de punt van de sonische dismembraan aan op de buitenkant van de micro centrifugebuis. Sonicaat voor 40 s bij 20 kHz.
- Ga naar Western Blot na de vastgestelde protocollen.
5. fixatie en kleuring van prostaat-Organoïden voor immunohistochemische analyse door hele-Mount confocale microscopie
-
Verzamelen van prostaat organoïden van 24-put platen — timing: 45-60 min
Opmerking: Bij het verzamelen van prostaat organoïden om te verwerken voor confocale microscopie, is het van cruciaal belang om ze met zorg te behandelen om hun structuur te behouden. Het onderstaande collectie protocol is ontworpen om verstoring van de organoïde structuur tijdens isolatie te verminderen.- Verwijder de media van elke put zoals in stap 3,1.
- Verteren van de matrix gel door met 500 μL dispase-bevattende media (tabel 1) gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °c 5% Co2 te incueren.
- Verzamel verteerde organoïde suspensie in een micro centrifugebuis en pellet de organoïden door centrifugeren bij 800 x g gedurende 3 minuten bij RT. Verwijder het supernatant.
-
Whole-Mount immunofluorescentie kleuring van prostaat organoïden — TIMING: 3-4 dagen (1-5 uur/dag)
- Voeg 500 μL van 4% Paraformaldehyde toe in PBS en inincuberen gedurende 2 uur bij RT met zacht schudden.
- Pellet de organoïden door centrifugeren bij 800 x g gedurende 3 minuten bij RT, verwijder het supernatant en was de pellet met 1 ml PBS gedurende 15 minuten met zacht schudden.
- Was de pellet net als in stap 5.2.2 voor extra twee keer.
- Pellet de organoïden door centrifugeren bij 800 x g gedurende 3 minuten bij RT en verwijder het supernatant. Voeg 1 μg/mL DAPI toe in blokkerende oplossing (tabel 1). Inincuberen voor 2 uur bij RT of als alternatief 's nachts bij 4 °C met zacht schudden.
- Pellet de organoïden door centrifugeren bij 800 x g gedurende 3 minuten bij RT en verwijder het supernatant. Voeg primair antilichaam (konijn anti-p63 rooms, muis anti-cytokeratine 8) in blokkerende oplossing en inincuberen 's nachts bij 4 °C met zacht schudden.
- Pellet de organoïden door centrifugeren bij 800 x g gedurende 3 minuten bij RT en verwijder het supernatant. Was de pellet met 1 mL PBS gedurende 15 minuten met zacht schudden.
- Was de pellet als in stap 5.2.6 voor extra twee keer.
- Pellet de organoïden door centrifugeren bij 800 x g gedurende 3 minuten bij RT en verwijder het supernatant. Voeg secundair antilichaam (geit anti-konijn IgG-Alexa Fluor 594, geit anti-muis IgG-Alexa Fluor 488) in blokkerende oplossing en incuberen 's nachts bij 4 ° c met zachte schudden.
- Pellet de organoïden door centrifugeren bij 800 x g gedurende 3 minuten bij RT, verwijder het supernatant en was de pellet met 1 ml PBS gedurende 15 minuten met zacht schudden.
- Was de pellet als in stap 5.2.9 voor extra twee keer.
6. weefsel clearing en montage van de bevlekt prostaat Organoïden voor confocale microscopie van de hele berg — TIMING: 7 uur
- Pellet de organoïden door centrifugeren bij 800 x g gedurende 3 minuten bij RT en verwijder het supernatant.
- Voeg 1 mL 30% sucrose toe in PBS met 1% Triton X-100 en inincuberen gedurende 2 uur bij RT met zacht schudden.
- Pellet de organoïden door centrifugeren bij 800 x g gedurende 3 minuten bij RT en verwijder het supernatant.
- Voeg 1 mL 45% sucrose toe in PBS met 1% Triton X-100 en inincuberen gedurende 2 uur bij RT met zacht schudden.
- Pellet de organoïden door centrifugeren bij 800 x g gedurende 3 minuten bij RT en verwijder het supernatant.
- Voeg 1 mL 60% sucrose toe in PBS met 1% Triton X-100 en inincuberen gedurende 2 uur bij RT met zacht schudden.
- Pellet de organoïden door centrifugeren bij 800 x g gedurende 3 minuten bij RT en verwijder 95% van het supernatant.
Opmerking: De pellet wordt losser naarmate de concentratie van sucrose hoger wordt. Het is raadzaam om de DAPI-gekleurde organoïden onder het UV-licht te observeren om te bevestigen dat ze niet verloren zijn gegaan tijdens het verwijderen van het supernatant. - Breng een druppel van 10-20 μL van de resterende suspensie over in een Chambered-afdek deksel en ga verder naar confocale microscopie.
Opmerking: Afdek fragmenten kunnen aan beide zijden van de druppel worden geplaatst om als afstandhouders te worden gebruikt (figuur 4c). Deze verhinderen dat organoïden samenvouwen wanneer een dekslip over de druppel wordt geplaatst.
Representative Results
Prostaat epitheelcellen worden verguld in de muis organoïde cultuur, waar zij organogeniden vormen, die worden geoogst voorafgaand aan de voorbereiding voor de downstream-analyse (Figuur 1).
Basale en Luminale epitheliale cellen worden geïsoleerd met behulp van FACS. Na het uitsluiten van DAPI+ -cellen en het afbreken van Lin+ -cellen (CD45, CD31, Ter119) worden basale en Luminale cellen onderscheiden op basis van differentiële expressie van Epcam en CD49f (Figuur 2). De op plaat prostaat basale en Luminale cellen beschreven aanpak omvat: (1) plating cellen in matrix gelringen, en (2) coating putten met poly-HEMA. Plating in ringen is eerder beschreven in Agarwal et al9. Door gebruik te maken van deze aanpak (Figuur 3A) kunnen onderzoekers de matrix gel gemakkelijker vermijden terwijl ze de media aanvullen (stap 3), en gemakkelijker organoïden tellen door de omtrek van de put te volgen. Coating putten met poly-HEMA is aangetoond dat het voorkomen van 2D kolonie vorming in retinale organoïden17; echter, deze aanpak is niet gebruikt in de prostaat organoïde model. Belangrijk is dat de coating putten met poly-HEMA (tabel 3) het optreden van 2D-kolonies elimineert zonder de organoïde vorming te verstoren (Figuur 3B). Deze aanpassingen breiden de capaciteiten van de prostaat organoïde assay uit.
Basale en Luminale cellen vormen organoïden met verschillende morfologieën (Figuur 4A). Hoewel de meeste basaalafgeleide organoïden vergelijkbaar zijn in grootte (100-300 μm diameter) na 7 dagen in cultuur vertonen luminal-afgeleide organoïden een significante heterogeniteit (30-450 μm diameter). Bovendien bevatten de meeste basale afgeleide organoïden lumen, omgeven door meerlaagse epitheel (Figuur 4A, boven), terwijl luminal-afgeleide organoïden variëren in morfologie van hol, met enkellaags epitheel tot vaste stof, met meerlaagse koorden van cellen die niet kanaliseren (Figuur 4A, onder). De hierboven beschreven benaderingen voor het bereiden van organoïden voor downstreamanalyse (stappen 4, 5), werden gebruikt om te onderzoeken of deze fenotypische verschillen een afspiegeling zijn van verschillen in de expressie van de Lineage marker. De analyse van Western Blot toonde aan dat basale en Luminale afgeleide organoïden kenmerken behouden die verband houden met basale en Luminale primaire cellen. Basale-afgeleide organoïden uiten hogere niveaus van de basale marker cytokeratine 5 (K5), terwijl luminal-afgeleide organoïden hogere niveaus van de Luminale marker cytokeratine 8 (K8) (Figuur 4B) uitdrukken. Zowel basale als Luminale markers werden gedetecteerd in basale en Luminale afgeleide organoïden in de bulk populatie, misschien suggestief voor differentiatie (Figuur 4B).
We probeerden de expressie van de Lineage marker in basale afgeleide organoïden te karakteriseren en te bepalen of morfologisch verschillende luminal-afgeleide organoïden verschillen in marker expressie vertonen door het intact organoïden en het uitvoeren van confocale microscopie (Figuur 4D). Basale-afgeleide organoïden bevatte meerlaagse epitheel met buitenste lagen uitdrukken van hoge niveaus van de basale marker p63 rooms en gematigde niveaus van de luminal marker k8 (p63 roomsHi, K8Mid), en innerlijke lagen zonder detecteerbare niveaus van p63 rooms en hoge niveaus van k8 (p63 roomslo, K8Hi) (Figuur 4D, Top). Terwijl alle cellen in enkellaags luminal-afgeleide organoïden positief gekleurd voor K8, alleen geselecteerde cellen bevatte nucleaire p63 rooms (Figuur 4D, onder). Deze gegevens valideren de benaderingen om te oogsten en bereiden organoïden voor analyse door Western Blot of confocale microscopie en vergroten daarmee het vermogen van de organoïde assay om belangrijke cellulaire processen, waaronder differentiatie, te bestuderen.
Figuur 1: schematische werkstroom voor het genereren van prostaat organoïden voor inzameling en analyse. Totale muis prostaat is gezien en basale en Luminale prostaat epitheelcellen worden geïsoleerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering via gevestigde protocollen18,19. Basale of Luminale cellen opgehangen in een mengsel van muis organoïde media en matrix gel worden verguld in matrix gelringen. Na 5 tot 7 dagen cultuur worden organoïden geoogst voor analyse door Western Blot of confocale microscopie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: isolatie van muizen basale en Luminale prostaat epitheelcellen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Dissociated cellen van de prostaat van de muis zijn gekleurd met DAPI, om levend te onderscheiden van dode cellen, en oppervlakte antilichamen, om basale te onderscheiden van Luminale cellen, voorafgaand aan FACS. Left = gated op DAPI-cellen. FSC-A = voorwaartse spreiding. Center = omheind op Lin- cellen (CD45lo, CD31lo, Ter119lo). SSC-A = Side-Scatter. Rechts = basale cellen (bas) (EpCAMHi, CD49fHi), Luminale cellen (Lum) (epcamHi, CD49fMid). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: oprichting van muis prostaat organoïden. A)schematische illustrerende benadering voor het genereren van een matrix gelring in een put van een 24-Well plaat. B) representatieve fase contrast beelden van organoïden (3D-groei vlak) en tweedimensionale kolonies (2D-groei vlak) gevormd 7 dagen na het bekleden van prostaat epitheelcellen in un-Coated (poly-HEMA (-)), of gecoat (poly-HEMA (+)) 24-Well platen. Boxed regio's binnen 2D-groei vlak worden aan de rechterkant vergroot. Schaal staven = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: analyse van de expressie van de Lineage marker in de prostaat organoïden door Western Blot en de confocale microscopie van de hele berg. A) representatieve-fase contrast beelden van basale afgeleide (boven) en Luminale afgeleide (onder) organoïden na 7 dagen cultuur. Schaalbalk = 100 μm.B) de analyse van de Western-Blot van basale (bas) en luminal-afgeleide (Lum) organoïden na 5 dagen cultuur. Kleuring voor de basale marker, cytokeratine 5 (K5), en de luminal marker, cytokeratine 8 (K8), en een laadregelaar, Histon H3 (HH3). C) Schematische illustratie van de Afdeklijst van de Chambered met afstandhouders. D) representatieve differentiële interferentie contrast (DIC) en immunofluorescentie beelden van basale afgeleide (boven) en Luminale afgeleide (onder) organoïden na 7 dagen cultuur. Kleuring voor p63 rooms (rood), k8 (groen) en DAPI (blauw) afzonderlijk en samengevoegd. Schaal staven = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Recepten | |
| Dispase-bevattende media | 1 mg/mL dispase + 10 μM ROTSREMMER in geavanceerde DMEM F12. Filter steriliseren met behulp van 0,22 μm filter. |
| Dissociatie media | 10% FBS + 1x Penicillaire-streptomycine in RPMI 1640. Filter steriliseren met behulp van 0,22 μm filter. |
| Eiwit lysisbuffer | RIPA-Buffer + fosfatase remmers + proteaseremmers |
| Blokkerende oplossing | 10% FBS in PBS met 0,2% Triton X-100 |
Tabel 1: instructies voor het opstellen van belangrijke oplossingen.
| Component | Concentratie |
| B-27 | 1x (verdunnen met 50x concentraat) |
| GlutaMAX | 1x (verdunnen met 100x concentraat) |
| N-acetyl-L-cysteïne | 1,25 mM |
| Normocin | 50 μg/mL |
| Recombinant humaan EFG, dier vrij | 50 ng/mL |
| Recombinant humaan Noggin | 100 ng/mL |
| R-spondin 1-media met airconditioning | 10% geconditioneerde media |
| A83-01 | 200 nM |
| Dht | 1 nM |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK remmer) | 10 μM |
| Advanced DMEM/F-12 | Basismedia |
| R-spondin 1-geconditioneerde media wordt gegenereerd zoals beschreven in Drost, et al.13. Na toevoeging van alle componenten, filter steriliseren muis organoïde media met behulp van 0,22 μm filter. ROTSREMMER wordt alleen toegevoegd tijdens de totstandbrenging van de cultuur en het doorvoeren van organoïden. | |
Tabel 2: instructies voor de bereiding van de muis organoïde media.
| Protocol voor de bereiding van poly-HEMA-gecoate platen | |
| 1 | Voeg 0,25 g poly-HEMA toe aan 50 mL 98% EtOH. Los poly-HEMA op bij 37 °C op een shaker. Dit proces duurt minimaal 4 uur. |
| 2 | Filter steriliseren poly-HEMA met behulp van 0,22 μm filter. |
| 3 | Voeg 200 μl poly-HEMA oplossing per put van een 24-well plate (s) toe. |
| 4 | Verwijder deksel (en) van 24-well plate (s) na het toevoegen van poly-HEMA en laat de oplossing 's nachts verdampen. |
| 5 | Was elk putje twee keer met PBS en zorg ervoor dat putten volledig droog zijn voor opslag na de laatste wasbeurt. Opmerking: het verstoren van de poly-HEMA coating tijdens het wassen kan bijdragen aan 2-dimensionale groei bij het beplating van epitheelcellen in de organoïde cultuur. Om schade aan poly-HEMA gecoate putten te voorkomen, Vermijd direct contact met de pipetpunt tijdens het wassen. De integriteit van de poly-HEMA gecoate putten blijft intact, tenzij de poly-HEMA wordt afgeschuurd door de pipetpunt. |
| 6 | Poly-HEMA-gecoate platen kunnen gedurende maximaal twee weken bij 4 °C worden bewaard. Opmerking: het verpakken van platen in Parafilm voorafgaand aan de opslag zal het risico op verontreiniging verminderen. |
Tabel 3: protocol voor de bereiding van poly-HEMA-gecoate platen.
Discussion
Prostaat epitheel celdifferentiatie is betrokken bij zowel normale prostaat biologie2,3,4,5,6,7 en ziekte biologie8,10,11,12; de Master regulators van dit proces blijven echter ongedefinieerd. Het identificeren van belangrijke regulatoren van prostaat epitheliale celdifferentiatie is deels moeilijk te wijten aan het ontbreken van een goed opgezette context om het te modelleren. Hoewel 2D-monolaag-cultuur kan worden gebruikt voor het modelleren van differentiatie11,12, slaagt deze context er niet in om de complexe prostaat microomgeving te recapituleren. Bovendien, in vivo contexten voor model differentiatie lenen zich niet voor mechanistische studies, omdat ze een uitdaging zijn om te manipuleren. Daarom is de identificatie van een gemakkelijk te manipuleren, maar toch fysiologisch relevante context, om differentiatie te bestuderen van cruciaal belang.
Het prostaat-organoïde model vertegenwoordigt een elegante ex vivo-context waarin wordt gerapporteerd dat de basale Luminale differentiatie optreedt. Methoden voor het vaststellen van prostaat organoïden zijn goed vastgesteld14; echter, verdere optimalisatie van deze methoden is noodzakelijk. Verder worden de benaderingen voor de oogst en het bereiden van prostaat organoïden voor analyse niet duidelijk beschreven. Dit artikel beschrijft een benadering van plaat prostaat epitheelcellen geïsoleerd van muis prostaat in organoïde cultuur. Deze aanpak stelt onderzoekers in staat om (1) het optreden van 2D-kolonies tijdens organoïde vorming te voorkomen, (2) het risico op verstoring van de matrix gel tijdens de media-aanvulling te verminderen en (3) de organoïden effectiever te tellen. Daarnaast schetst dit manuscript benaderingen voor de oogst van organoïden voor de voorbereiding van de analyse van Western Blot of de confocale microscopie van de hele berg. Belangrijk is dat de aanpak die wordt gebruikt voor het bereiden van organoïden voor confocale microscopie de intact-structuur van organoïden gedurende de looptijd handhaaft, wat organoïde schade vermindert voorafgaand aan beeld verwerving. In totaal breiden de beschreven benaderingen de capaciteiten van de prostaat organoïde test uit.
Met name kan de organoïde vormende capaciteit van basale en Luminale cellen worden gewijzigd, zowel door middel van methoden die worden gebruikt om de respectieve populaties te isoleren, als door cultuuromstandigheden. De organoïde cultuuromstandigheden die in deze test werden gebruikt, werden voor het eerst beschreven door karthaus et al.13. Overwegende dat Karthaus et al. hebben gemeld dat basale cellen een hogere organoïde vormende capaciteit hebben (15%) dan Luminale cellen (1%)13, Chua et al., met behulp van verschillende isolatie methoden en cultuuromstandigheden, hebben gemeld dat Luminale cellen (0,2-0,3%) hebben een hogere organoid-vormende capaciteit dan basale cellen (0,03%)20. In het algemeen leiden de door Karthaus et al. beschreven methoden tot hogere organoïdevorming voor zowel basale als Luminale cellen, die waarschijnlijk verschillen vertonen in de benadering die wordt gebruikt om basale en Luminale cellen13te isoleren, in tegenstelling tot cultuuromstandigheden die vooroordelen tegen organoïde vorming uit Luminale cellen. Het blijft onduidelijk of het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, de Luminale organoïde vorming van multipotente luminal-voorlopercellen bevordert, of toegewijd-luminal voor ouders9. Hoewel tijdige en kosten-prohibitieve, in vivo Lineage tracing studies kunnen worden gebruikt voor het valideren van de eigenschappen van de voorlopercellen in verband met verschillende prostaat epitheel kilometerstanden opgehelderd in de organoïde assay.
Processen zoals ontwikkeling, differentiatie en transformatie zijn niet alleen relevant voor de prostaat biologie, maar ook relevant voor de biologie van andere weefsels, waaronder de hersenen, longen, darmen, pancreas en lever. De beschreven methoden vergemakkelijken het gebruik van het organoïde model om deze processen te bestuderen in niet alleen de prostaat, maar ook een breed scala aan weefsels.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
PDC en JMG worden ondersteund door de Ruth L. Kirschstein National Research Service Award GM007185. JAD wordt gesteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health (R25GM055052) toegekend aan T. Hasson en de beurs Saul Martinez. ASG wordt ondersteund door het Spitzer Family Foundation Fund en de Gill Endowment. Dit werk werd gesteund door de American Cancer Society (RSG-17-068-01-TBG), departement van defensie (W81XWH-13-1-0470), Margaret E. Early Medical Research Trust, NIH/NCI (P50CA092131/UCLA SPORE bij prostaatkanker), Rose Hills Foundation en ondersteuning van het uitgebreide Kankercentrum van de UCLA Jonsson, het Broad stamcel onderzoekscentrum, het klinisch en translationeel wetenschaps Instituut en het Instituut voor urologische oncologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Dish 35 mm, high | ibidi | 81156 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 μg | BioLegend | 118218 | |
| B-27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11836145001 | |
| (DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one) | Sigma | A-8380 | |
| Dispase II, Powder | Thermo Fisher Scientific | 17-105-041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F8667 | |
| FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) | BioLegend | 102405 | |
| FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) | BioLegend | 103107 | |
| FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) | BioLegend | 116205 | |
| Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | |
| Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Halt Phosphatase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78428 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230C | |
| Mouse anti-cytokeratin 8 | BioLegend | 904804 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | |
| Normocin | Thermo Fisher Scientific | ant-nr-1 | |
| PE anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313612 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) | Sigma | P3932-25G | |
| Rabbit anti-p63 | BioLegend | 619002 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | PI89901 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10) | Thermo Fisher Scientific | 22400105 | |
| Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific | FB120 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-5ML | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Selleck Chemical | S1049-50MG |
References
- Kwon, O. J., Xin, L. Prostate epithelial stem and progenitor cells. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 2 (3), 209-218 (2014).
- Choi, N., Zhang, B., Zhang, L., Ittmann, M., Xin, L. Adult Murine Prostate Basal and Luminal Cells Are Self-Sustained Lineages that Can Both Serve as Targets for Prostate Cancer Initiation. Cancer Cell. 21 (2), 253-265 (2012).
- Ousset, M., Van Keymeulen, A., et al. Multipotent and unipotent progenitors contribute to prostate postnatal development. Nature Cell Biology. 14 (11), 1131-1138 (2012).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 1-13 (2014).
- Wang, Z. A., Mitrofanova, A., et al. Lineage analysis of basal epithelial cells reveals their unexpected plasticity and supports a cell-of-origin model for prostate cancer heterogeneity. Nature Cell Biology. 15 (3), 274-283 (2013).
- Kwon, O. J., Zhang, B., Zhang, L., Xin, L. High fat diet promotes prostatic basal-to-luminal differentiation and accelerates initiation of prostate epithelial hyperplasia originated from basal cells. Stem Cell Research. 16 (3), 682-691 (2016).
- Kwon, O. J., Zhang, L., Ittmann, M. M., Xin, L. Prostatic inflammation enhances basal-to-luminal differentiation and accelerates initiation of prostate cancer with a basal cell origin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 192 (3), 997-999 (2014).
- Stoyanova, T., et al. Prostate cancer originating in basal cells progresses to adenocarcinoma propagated by luminal-like cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (50), 20111-20116 (2013).
- Agarwal, S., Hynes, P. G., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
- Bishop, J. L., et al. The Master Neural Transcription Factor BRN2 Is an Androgen Receptor-Suppressed Driver of Neuroendocrine Differentiation in Prostate Cancer. Cancer Discovery. 7 (1), 54-71 (2016).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Drost, J., Karthaus, W. R., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), e59051 (2019).
- Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 181-186 (2007).
- Chen, H. Y., Kaya, K. D., Dong, L., Swaroop, A. Three-dimensional retinal organoids from mouse pluripotent stem cells mimic in vivo development with enhanced stratification and rod photoreceptor differentiation. Molecular vision. 22, 1077-1094 (2016).
- Liu, X., et al. Low CD38 Identifies Progenitor-like Inflammation-Associated Luminal Cells that Can Initiate Human Prostate Cancer and Predict Poor Outcome. Cell Reports. 17 (10), 2596-2606 (2016).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
- Chua, C. W., Shibata, M., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
