Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

הערכת יכולת בידול של העכבר תאים אפיתל הערמונית באמצעות תרבות אורגאיד

Published: November 22, 2019 doi: 10.3791/60223
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2,3,4,5,6
1Molecular Biology Interdepartmental Program, University of California, Los Angeles, 2Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 3Department of Urology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 4Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles, 5Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California, Los Angeles, 6Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles
* These authors contributed equally

Summary

הערמונית העכבר אורגנואידים לייצג הקשר מבטיח להעריך מנגנונים המסדירים בידול. המאמר מתאר גישה משופרת להקמת אורגנואידים הערמונית, ומציג שיטות (1) לאסוף חלבון ליפוסט מאורגנואידים, ו (2) לתקן וכתמי מיקרונואידים עבור מיקרוסקופ ההרכבה המלא.

Abstract

אפיתל הערמונית מורכב בעיקר של תאים בסיס ולומיאל. במעקב vivo השושלת מנוצל כדי להגדיר את יכולת הבידול של העכבר בסיס הערמונית ותאים לומיאל במהלך פיתוח, רקמות התחדשות וטרנספורמציה. עם זאת, הערכת תאים פנימיים והרגולטורים חיצוניים של קיבולת בידול אפיתל הערמונית באמצעות גישה למעקב השושלת דורש לעתים קרובות הרבייה והוא יכול להיות מעולה. ב שיטת הערמונית אורגאיד, תאי בסיס ולומיאל ליצור אפיתל הערמונית לשעבר vivo. חשוב מכך, תאים אפיתל העיקרי יכול להיות מבודד עכברים של כל רקע גנטי או עכברים שטופלו עם מספר כלשהו של מולקולות קטנות לפני, או אחרי, ציפוי לתוך תלת מימדי (3D) תרבות. חומר מספיק להערכת קיבולת הבידול נוצר לאחר 7-10 ימים. אוסף של אורגנואידים בסיס ולומיאל נגזר (1) ניתוח חלבון על ידי אבן חשופה מערבית (2) אימונוהיסטוכימיה ניתוח של אורגנואידים שלמים על ידי מיקרוסקופ כל הר קונפוקלית וקד מאפשר לחוקרים להעריך את הvivo לשעבר הבידול קיבולת של תאים אפיתל הערמונית. כאשר נעשה שימוש בשילוב, שתי גישות אלה לספק מידע משלים על יכולת הבידול של בסיס הערמונית ותאי הלומיליים בתגובה גנטית או תרופתי מניפולציה.

Introduction

בסיס ותאי לומיאל מהווים את רוב אפיתל הערמונית1. מחקרים שושלת היוחסין גילו כי סוגי תאים אלה הם בעיקר עצמית מתמשכת על ידי ושלתי נפרדות בעכבר למבוגרים2; עם זאת, הבדלה בידול מ בסיס ושלתי נצפתה בהקשרים מספר כולל פיתוח3,4, התחדשות רקמות5, דלקת6,7 ו סרטן הערמונית חניכה2,8. יתר על כן, הנתונים המתעוררים תומך הקיום של לומיאל רב עוצמה ושלתי, כמו גם לומיאל מחויבת ושלתי9. בסרטן הערמונית גרורתי, בידול מן השושלת לומיאל התלוי AR השושלת AR עם תכונות בסיס ונוירואנדוקרינים מייצגת מנגנון מוערך יותר ויותר של התנגדות מעכבי מסלול אנדרוגן10,11,12. לכן, כמו בידול מעורב בפיזיולוגיה נורמלי, החניכה סרטן התנגדות לטיפול, בהסבר הרגולטורים מולקולרית מפתח של בידול תא אפיתל הערמונית הוא קריטי.

מודל הערמונית מאורגאיד של העכבר התפתחה כהקשר אלגנטי לשעבר vivo ללמוד תא אפיתל הערמונית בידול9,13,14. באותו מבנה, תאים אפיתל בודדים מצופים לתוך מטריצה תלת-ממדית שבה הם יוצרים מבנים בלוטות המכילים הן תאים בסיס והן בתאי לומיאל בתוך שבוע 1. בעוד גישות קיימות לתאי ציפוי לתוך תרבות ארגונית ניתן להשתמש כדי לייצר ביעילות ארגונית, גישות אלה דורשות אופטימיזציה נוספת14. האתגרים הבולטים הקשורים עם מעצבי הערמונית culturing כוללים (1) למעט דו מימדי (2D) מושבות היוצרות מתחת מטריקס (ג'ל מטריצה) מן הניתוח, (2) שמירה על שלמות ג'ל מטריקס במהלך שינויי מדיה, ו (3) ספירת אורגנואידים במדויק. נייר זה מתווה גישה ליצור אורגנואידים מתאי אפיתל מבודדים מערמונית העכבר. הגישה המתוארת כרוכה בלוחות ציפוי עם פולי (2-הידרוקסיל מתיונין) (פולי-HEMA) כדי למנוע התרחשות של מושבות 2D. יתר על כן, תאים מצופים בטבעת ג'ל מטריצה, במקום דיסק ג'ל מטריצה, מה שהופך את המדיה ואת ספירת ארגונית פחות מאתגרת. טכניקות אלה לאפשר לחוקרים בקלות רבה יותר לחקור כיצד שינויים גנטיים או מולקולות קטנות הציג לפני, או במהלך, היווצרות אורגאיד לשנות תהליכים מפתח כגון בידול.

קציר של אורגנואידים הערמונית עבור כתמי מערבי או ניתוח אימונוהיסטוכיכימיים על ידי מיקרוסקופ ההרכבה מלאה מיקוד יכול לספק תובנה מכניסטית רבת ערך לתוך בידול13, אך היטב הקימו פרוטוקולים להכין אורגנואידים עבור טכניקות כאלה חסרות. כתב יד זה מתאר את הגישות לאורגנואידים של הקציר עבור אוסף של חלבון ליפוסט, או (2) קיבעון וכתמים למיקרוסקופיה קונפוקלית. חשוב מכך, הגישה המתוארת לתיקון וצביעת אורגנואידים של הערמונית שופרה במידה ניכרת ביחס לשיטות הקיימות. בעוד שאלה מסתמכים על הפחתת הארגון15, השיטה המתוארת בכתב יד זה מנצלת אורגנואידים שלמים, אשר מסייעת להגן מפני נזק אורגאיד במהלך הכנת המדגם. כאשר נעשה שימוש בשילוב, האבן החשופה והמיקרוסקופיה המערבית יכולים לספק תובנה רבת ערך לרגולטורים המולקולריים של בידול. לחילופין, ניתן להשתמש בגישות אלה כדי לעצב תהליכים אחרים כגון פיתוח וטרנספורמציה.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי מועצת הסקירה המוסדית באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס.

הערה: סכמטי הממחישות את הגישות המתוארות בעיתון מסופקות באיור 1.

1. בידוד עכבר בסיס ולומיאל תאים אפיתל הערמונית באמצעות הפעלה פלואורסצנטית מיון התא (FACS) — עיתוי: 30 דקות

הערה: בצע את שלבים 1.3-1.5 בחשיכה.

  1. לאחר הניתוק התאים מתוך הערמונית מוחלטת העכבר כמתואר לוסון et al.16, להעביר את התאים צינורות facs ולהשעות מחדש 0.1-5 x 106 תאים ב 100 μl של מדיה דיסוציאציה (שולחן 1).
  2. הוסף את אמצעי האחסון המתאים של הנוגדנים הראשוניים הבאים: CD45, CD31, Ter-119, EpCAM ו CD49f.
  3. , מגנה מפני אור. במשך 20 דקות
    הערה: מומלץ לנצל 10% מהתאים המונתק הכולל עבור פקדים בלתי מוכתמים ומוכתמים בודד. פקדים אלה נחוצים כדי לקבוע את הפיצוי והמתח הנכונים למיון.
  4. קוקטייל של נוגדן כיבוי על-ידי הוספת 1 מ ל של מדיית הדיסוציאציה לכל דוגמה. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולהסיר את supernatant על ידי מתכלה.
  5. השהה מחדש את התאים באמצעי האחסון המתאים (250 μL לכל 1 x 106 תאים) של מדיית דיסוציאציה המכילה 1 μg/mL 4, 6-diamidino-2-פניינילידול (dapi). . המשך לfacs מגרשים זרם cy, להפגין בידוד של העכבר בסיס ותאים אפיתל הערמונית מאוירים באיור 2.

2. ציפוי תאים אפיתל הערמונית לתוך תרבות העכבר הראשי אורגאיד-עיתוי: 2-3 H (למעט פולי HEMA-הכנת הלוח מצופה)

הערה: הצלחות מצופות בפולי-HEMA כדי למנוע היווצרות מושבה דו-ממדית על פני הבאר מתחת לג מטריקס. להכין לוחות פולי HEMA מצופה 1 יום לפני ציפוי בסיס הבסיס או תאים אפיתל הערמונית לתוך התרבות אורגאיד העכבר. הפשרת 1 mL מופחת של גורם צמיחה מופחתת מטריקס ג'ל, להלן המכונה ג'ל מטריצה, על קרח 2 h לפני שלב 2.1. Y-27632 (מעכב רוק) יש להוסיף מדיה ארגונית העכבר מיד לפני שלב 2.1. בצע את שלבים 2.1-2.8 על הקרח.

  1. גלולה את התאים ב 5 מ"ל בתחתית הצינורות על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ו משף את supernatant.
  2. רחץ את הגלולה תא ב 500 μL של מדיה ארגונית של העכבר (שולחן 2)14.
  3. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ומכה את סופרנטאנט.
  4. השהה מחדש במדיה ארגונית של העכבר בצפיפות תא של 1,000 תאים/μL.
  5. כדי להכין mixes מאסטר, לערבב תאים אפיתל מושעה מדיה אורגאיד העכבר עם ג'ל מטריצה כדי ליצור תערובת סופית המכילה 25% תאים/מדיה ו 75% ג'ל מטריצה. התאים הבזליים מצופה בדרך כלל בריכוז של 100-2000 תאים/80 μL, בעוד תאי הלומיליים מצופים בדרך כלל בריכוז של 2000-10000 תאים/80 μL. צפיפות התאים מצופה משתנה בהתאם ליום איסוף החומר הצפוי, ואת היישום הרצוי במורד הזרם.
    הערה: לצנן את שפופרת בגודל כראוי (s) עבור אמצעי אחסון מאסטר מצפה 5 דקות לפני הכנה לערבב הורים. כדי להבטיח את ג'ל המטריקס לא להתקשות בזמן הטיפול, זה קריטי לצנן את העצה הפיפטה על ידי ליטוף ג'ל מטריקס 3-4 פעמים לפני העברתו לשפופרת חדשה.
  6. הוסף 80 μL של מטריצה ג'ל/תא התערובת לכל טוב של צלחת 24. מומלץ ללטף droplet על החלק התחתון של קיר הבאר, תוך הימנעות ממגע ישיר עם ציפוי פולי-HEMA. לאחר הוספת ג'ל מטריצה, מערבולת את הצלחת כדי לאפשר ג'ל למטריקס/תא תערובת ליצור טבעת סביב שפת הבאר.
  7. מניחים את הצלחת 24-הבאר לתוך 37 ° c 5% החממה2 מימין למעלה עבור 10 דקות כדי לאפשר ג'ל מטריקס כדי להקשיח חלקית.
    הערה: בגין התחממות העכבר מדיה ארגונית ב 37 ° c מיד לאחר הצבת צלחת 24 הבאר בחממה.
  8. לאחר הדגירה עבור 10 דקות, להעיף את הצלחת 24-באר הפוכה ו-דגירה עבור 50 דקות נוספות כדי לאפשר ג'ל מטריצה לגמרי הרדן.
  9. הוסף 350 μL של הוספת מדיה מחומם של העכבר מראש מחמם למרכז כל טוב.
    הערה: כדי לשמור על שלמות ג'ל המטריקס, חשוב להימנע מהטבעת ג'ל המטריצה תוך הוספת מדיה.
  10. לאחר הוספת התקשורת, להחזיר את הצלחת 24-הבאר ל37 ° c 5%2 החממה.

3. משוב לעכבר מדיה ארגונית — עיתוי: 10-15 דקות לכל 24-צלחת הלוח

הערה: יש להחליף את המדיה הקיימת במדיה טרייה כל 48 h. לפני שכל מדיה משתנה, המדיה החמה של העכבר מאורגאידית. אין צורך להוסיף מעכבי סלע לאמצעי האחסון המשמשים לחידוש.

  1. להטות את הצלחת 24-באר בזווית 45 ° ולהסיר בעדינות את המדיה הקיימת מהמרכז של כל באר באמצעות p1000, תוך הימנעות טבעת ג'ל מטריקס.
  2. הוסף 350 μL של מדיית מחמם העכבר מראש מחומם כמו בשלב 2.9. מומלץ להוסיף נפח גדול יותר של מדיה (עד 1 מ ל) כדי אורגנואידים תרבותית במשך יותר מ 5 ימים כדי למנוע דלדול מהיר של חומרים מזינים מרכזיים וגורמי גדילה.

4. מחלץ חלבון ליפוסט מן הערמונית אורגנואידים עבור ניתוח כתמי אבן מערבית — עיתוי: 2.5-4 H

הערה: לפני איסוף האורגנואידים להפקת חלבון ליפוסט, להכין ולקדם חם dispase המכיל מדיה (שולחן 1).

  1. הסירו את המדיה מכל השאר בשלב 3.1.
  2. כדי לאסוף אורגנואידים, הפיצוץ שוב ושוב את ג'ל המטריצה על ידי ליטוף 1 מ ל של dispase-המכיל מדיה ישירות על הטבעת ג'ל מטריקס עד הטבעת כולה מחוצה, ולהעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
    הערה: חשוב להימנע ממגע ישיר עם הבארות הצופות בפולי-HEMA. מגע ישיר עלול לגרום לזיהום של החומר שנאסף עם פולי HEMA, אשר יכול להשפיע לרעה על הישרדות התא.
  3. מניחים את 1.5 mL מיקרו צנטריפוגה שפופרת (s) לתוך 37 ° c 5% CO2 חממה עבור 30 דקות עד 1 h כדי לאפשר עיכול מלאה של ג'ל מטריצה ידי dispase.
  4. גלולה אורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב-RT ולהסיר את supernatant באמצעות מיקרופיפטה.
  5. הוסף מלוחים באגירה פוספט (PBS) לגלולה אורגאיד ולהשעות מחדש על ידי מצליף בעדינות.
    הערה: אי השעיה מספקת של הגלולה האורגאידית עלולה לגרום לזיהום של חומר אורגנואיד עם שיורית dispase או ג'ל מטריצה.
  6. גלולה האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב-RT ולהסיר את supernatant באמצעות מיקרופיפטה.
  7. הקפא במהירות את כדורי האורגאיד על-ידי הצבת כל צינור בתמיסה המכילה קרח יבש ומתנול. אחסן את הצינור (ים) עד לשימוש עתידי ב--80 ° c. לחילופין, לחלץ את חלבון ליפוסט מיד לאחר שלב 4.6.
  8. השהה מחדש את כדורי האורגנואיד ב-100 μL של מאגר פירוק חלבון (טבלה 1) לכל 10 μl של נפח תא ארוז. תנועה כדי להשעות מחדש.
    הערה: אם מחדש לאחר הקפאה מהירה, להבטיח מאגר פירוק חלבון הוא המוסדר לפני הסרת דגימות מ-80 ° c, כמו מאגר לפירוק יש להוסיף לדגימות מיד על מנת למנוע את הפעילות פוספספטאז ו פרוטאז.
  9. מודטה את הדגימות במאגר לפירוק חלבון על הקרח לפחות 45 דקות.
    הערה: מומלץ לsonicate לפני דגירה על הקרח כדי להגביר את היעילות של שחזור חלבון גרעיני; עם זאת, אין צורך בsonication. אם sonication לא מבוצע, המשך לשלב 4.10.
    1. כדי sonicate, לטבול את הצינורות בקרח רטוב ולהחיל בעדינות את הקצה של dismembrator סוניק מחוץ הצינורית מיקרוצנטריפוגה. Sonicate עבור 40 s ב 20 kHz.
  10. המשך לאבן החשופה המערבית לאחר הפרוטוקולים הקבועים.

5. תיקון וצביעת אורגנואידים הערמונית לניתוח אימונוהיסטוכימיה על ידי מיקרוסקופ שלם-הר Confocal וקד

  1. איסוף אורגנואידים של הערמונית מצלחות 24-היטב — עיתוי: 45-60 דקות
    הערה: כאשר איסוף אורגנואידים הערמונית לתהליך עבור מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, הוא קריטי לטפל בהם בזהירות על מנת לשמור על המבנה שלהם. פרוטוקול הגבייה שלהלן נועד להפחית את השיבוש של מבנה אורגנואיד בזמן הבידוד.
    1. הסירו את המדיה מכל השאר בשלב 3.1.
    2. לעכל את ג'ל מטריקס על ידי הדגירה עם 500 μL של dispase-המכיל מדיה (טבלה 1) עבור 30 דקות ב 37 ° צ' 5% החממה CO2 .
    3. לאסוף ההשעיה אורגאיד מתעכל בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה ו גלולה אורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 3 דקות ב-RT.. הסר את הסופרנטאנט
  2. כתמים להרכבה מלאה של מארגני הערמונית — עיתוי: 3-4 ימים (1-5 h/יום)
    1. הוסף 500 μL של 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS ו-דגירה עבור 2 h ב RT עם טלטול עדין.
    2. גלולה האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 3 דקות ב-RT, הסר את supernatant, ולשטוף את הגלולה עם 1 ML של PBS עבור 15 דקות עם טלטול עדין.
    3. לשטוף את הגלולה כמו בשלב 5.2.2 עבור שתי פעמים נוספות.
    4. גלולה האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 3 דקות ב-RT ולהסיר את supernatant. להוסיף 1 μg/mL DAPI בפתרון חסימה (טבלה 1). דגירה עבור 2 h ב RT או לחלופין לילה ב 4 ° צ' עם טלטול עדין.
    5. גלולה האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 3 דקות ב-RT ולהסיר את supernatant. הוספת נוגדן עיקרי (ארנב anti-p63, העכבר נגד ציטוקרטין 8) בפתרון חסימה ו-דגירה לילה ב 4 ° צ' עם רעד עדין.
    6. גלולה האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 3 דקות ב-RT ולהסיר את supernatant. שטוף את הגלולה עם 1 מ ל של PBS עבור 15 דקות עם טלטול עדין.
    7. לשטוף את הגלולה כמו בשלב 5.2.6 עבור שתי פעמים נוספות.
    8. גלולה האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 3 דקות ב-RT ולהסיר את supernatant. הוספת נוגדן משני (עז אנטי ארנב IgG-אלקסה Fluor 594, עז אנטי עכבר IgG-אלקסה Fluor 488) בפתרון חסימה ו-מודטה לילה ב 4 ° צ' עם טלטול עדין.
    9. גלולה האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 3 דקות ב-RT, הסר את supernatant, ולשטוף את הגלולה עם 1 ML של PBS עבור 15 דקות עם טלטול עדין.
    10. לשטוף את הגלולה כמו בשלב 5.2.9 עבור שתי פעמים נוספות.

6. ניקוי רקמות והרכבה של מיקרוסקופ הערמונית המוכתמת עבור כל-הר Confocal וקד מיקרוסקופית — עיתוי: 7 H

  1. גלולה האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 3 דקות ב-RT ולהסיר את supernatant.
  2. הוסף 1 מ ל 30% סוכרוז ב-PBS עם 1% טריטון X-100 ו דגירה עבור 2 h ב RT עם טלטול עדין.
  3. גלולה האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 3 דקות ב-RT ולהסיר את supernatant.
  4. Add 1 mL של 45% סוכרוז ב-PBS עם 1% טריטון X-100 ו דגירה עבור 2 h ב RT עם טלטול עדין.
  5. גלולה האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 3 דקות ב-RT ולהסיר את supernatant.
  6. Add 1 mL של 60% סוכרוז ב-PBS עם 1% טריטון X-100 ו דגירה עבור 2 h ב RT עם טלטול עדין.
  7. גלולה האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 3 דקות ב-RT ולהסיר 95% של supernatant.
    הערה: הגלולה הופכת משוחרר יותר כאשר הריכוז של סוכרוז הופך גבוה יותר. מומלץ לבחון את האורגנואידים המוכתמים באמצעות אור UV כדי לוודא שהם לא אבדו במהלך הסרת הסופרנט.
  8. העבר את ה-10-20 μL של ההשעיה הנותרת לתוך שמיכות והמשיכו למיקרוסקופ.
    הערה: שברי כיסוי ניתן להציב משני צדי ה-droplet כדי לשמש כרווחים (איור 4C). אלה מונעות מהאורגנואידים להתמוטט כאשר שמיכות מונחת על ה-droplet.

Representative Results

תאים אפיתל הערמונית מצופים לתוך התרבות אורגאיד העכבר שבו הם יוצרים אורגנואידים, אשר נקצרו לפני הכנה לניתוח במורד הזרם (איור 1).

תאים אפיתל בסיס ולומיאל מבודדים באמצעות FACS. לאחר הכללה של DAPI+ תאים מכלה+ תאים (CD45, CD31, Ter119), תאים בסיס ולומיאל הם נבדלים בהתבסס על הביטוי הדיפרנציאלי של epcam ו CD49f (איור 2). הגישה המתוארת לצלחת הערמונית בסיס ותאי הלומיליים לתוך התרבות האורגאידית כרוכה: (1) תאים הציפוי לתוך טבעות ג'ל מטריקס, ו (2) ציפוי בארות עם פולי HEMA. ציפוי לתוך טבעות תוארה בעבר באגוול ואח '9. ניצול גישה זו (איור 3A) מאפשר לחוקרים בקלות רבה יותר להימנע ג'ל מטריקס תוך הגשת התקשורת (שלב 3), ובקלות יותר לספור אורגנואידים על ידי בעקבות היקף הבאר. בארות ציפוי עם פולי HEMA הוכחו למנוע היווצרות המושבה 2D באורגנואידים רשתית17; עם זאת, גישה זו לא נוצל במודל הערמונית. חשוב לדעת, ציפוי בארות עם פולי-HEMA (שולחן 3) מבטלת את ההתרחשות של מושבות דו-ממדיות ללא הפרעה להיווצרות אורגאיד (איור 3ב'). שינויים אלה מרחיבים את היכולות של שיטת הערמונית.

תאי בסיס ולומיאל טופס מאורגנואידים עם מורפולוגיות נפרדות (איור 4א). בעוד שרוב האורגנואידים הבזליים דומים בגודלם (100-300 יקרומטר קוטר) לאחר 7 ימים בתרבות, התצוגה הנגזרת אורגנואידים התערוכה טרוגניות משמעותית (30-450 יקרומטר קוטר). יתר על כן, הבסיס הנגזר ביותר אורגנואידים מכילים לומן מוקף האפיתל רב שכבתית (איור 4A, למעלה), בעוד לומיאל מגוון אורגנואידים טווח מורפולוגיה מ חלול, עם האפיתל שכבתית יחיד כדי מוצק, עם מיתרים רב שכבתית של תאים שאינם יכולים להעניש (איור 4, למטה). הגישות המתוארות לעיל כדי להכין אורגנואידים לניתוח במורד הזרם (צעדים 4, 5), שימשו כדי לחקור אם הבדלים אלה פנותהם השתקפות של הבדלים ביטוי סמן השושלת. ניתוח כתמי אבן המערבי חשף כי בסיס ומנורות נגזרות הנגזר לשמור על תכונות הקשורות לתאים ראשוניים בסיס ולומיאל. בסיס אורגנואידים מבטאים רמות גבוהות יותר של הסמן הבסיס ציטוקרטין 5 (K5), בעוד הלומיאל נגזר אורגנואידים מבטאים רמות גבוהות יותר של סמן הלומיאל מרקר 8 (K8) (איור 4ב). שני סמנים בסיס ולומינאל זוהו בסיס ומנורות נגזרות הבסיס באוכלוסיה בצובר, אולי רמז של בידול (איור 4ב).

ביקשו לאפיין את הביטוי סמן השושלת באורגנואידים בסיס הבסיס ולקבוע אם מורפולוגית ברורה ברורים מוצגים הבדלים בתערוכה ביטוי סמן על ידי הצביעת אורגנואידים שלמים וביצוע מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (איור 4ד). בסיס הנגזר אורגנואידים הכיל האפיתל רב שכבתית עם השכבות החיצוניות ביטוי רמות גבוהות של סמן בסיס p63 ורמות בינונית של הלומיאל סמן K8 (p63hi, K8אמצע), ושכבות פנימיות ללא הגילוי רמות של p63 ורמות גבוהות של K8 (p63lo, K8hi) (איור 4D, למעלה). בעוד כל התאים באחד שכבתית הלומיאל הנגזרות אורגנואידים מוכתם חיובית עבור K8, רק תאים לבחור הכיל p63 גרעינית (איור 4D, למטה). נתונים אלה מאמתים את הגישות לקציר והכנת אורגנואידים לניתוח של אבן הכתם המערבית או מיקרוסקופ הקוננואיד, ובכך להרחיב את היכולת של שיטת הארגון ללימוד תהליכים סלולאריים מרכזיים, כולל בידול.

Figure 1
איור 1: סכמטי הממחישות את זרימת העבודה כדי ליצור אורגנואידים של הערמונית עבור איסוף וניתוח. הערמונית מוחלטת של העכבר הוא הנתק ואת בסיס תאים אפיתל הערמונית מבודדים על ידי מיון תא המופעל על ידי הקרינה פלואורסצנטית באמצעות פרוטוקוליםהוקמה 18,19. בסיס או תאים לומיאל מושעה בתערובת של מדיה אורגאיד העכבר ומטריקס ג'ל מצופים טבעות ג'ל מטריקס. לאחר 5 עד 7 ימים של תרבות, האורגנואידים נקצרו לניתוח על ידי אבן החשופה המערבית או מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: בידוד של העכבר בסיס ותאים אפיתל הערמונית באמצעות מיון מופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS). תאים הקשורים מערמונית העכבר הם מוכתמים DAPI, כדי להבדיל חי מתאים מתים, ונוגדנים פני השטח, כדי להבחין בסיס מתאי הלומיליים, לפני FACS. שמאל = מגודרת על התאים DAPI. FSC-A = פיזור קדימה. מרכז = מגודרת עלהתאים לין (CD45lo, CD31lo, Ter119lo). . מהאס. ימין = תאי בסיס (Bas) (EpCAMהיי, CD49fhi), תאים לומיאל (לאם) (epcamהיי, CD49fmid). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הקמת אורגנואידים של העכבר הערמונית. (א) סכמטית מפיק גישה ליצירת טבעת ג'ל מטריצה בבאר של צלחת של 24 שעות ביממה. (ב) הדמות הייצוגית הניגוד תמונות של אורגנואידים (3d מטוס גדילה) ומושבות דו מימדי (2d מטוס הצמיחה) הוקמה 7 ימים לאחר ציפוי תאים אפיתל הערמונית לתוך לא מצופה (פולי hema (-)), או מצופה (פולי hema (+)) 24-טוב צלחות. אזורים מארגז בתוך מישור גדילה דו-ממדי מוגדלים מימין. קנה מידה ברים = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח של ביטוי סמן שושלת היוחסין באורגנואידים של הערמונית על ידי אבן החשופה המערבית וההר הקונסקופיה. (א) מייצג תמונות חדות בשלב המייצג של הבסיס (למעלה), והאורגנואידים הנגזרים (למטה) לאחר 7 ימי תרבות. סרגל בקנה מידה = 100 μm. (ב) ניתוח כתמי מערבי של הבסיס (Bas) ו-לומיאל נגזר (לאם) אורגנואידים לאחר 5 ימים של תרבות. כתמים עבור סמן בסיס, ציטוקרטין 5 (K5), ואת סמן הלומיאל, ציטוקרטין 8 (K8), ו בקרת טעינה, היסטון H3 (HH3). (ג) תרשים סכימטי הממחיש שמיכות עם מרווחים. (ד) נציג הפרעות דיפרנציאליות (DIC) ומספר תמונות של הפרעה בסיס (למעלה) ולומינואידים (למטה) לאחר 7 ימי תרבות. צביעת עבור p63 (אדום), K8 (ירוק) ו-DAPI (כחול) בנפרד וממוזג. קנה מידה ברים = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מתכונים
המכיל מדיה 1 מ"ג/mL dispase + 10 μM סלע מעכבי ב DMEM מתקדם F12. מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.
מדיית דיסוציאציה 10% FBS + 1x פניצילין-סטרפטומיצין ב RPMI 1640. מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.
מאגר פירוק חלבון מאגר ריפה + פוספספטאז מעכבי + מעכבי פרוטאז
חסימת פתרון 10% FBS ב-PBS עם 0.2% טריטון X-100

טבלה 1: הוראות להכנת פתרונות מרכזיים.

רכיב ריכוז
בי -27 1x (לדלל את הריכוז 50x)
גלוטמקס 1x (לדלל את הריכוז 100x)
מרחש-ל-ציסטאין 1.25 ממ '
נורמוצין 50 μg/mL
רקומביננטי האדם EGF, ללא חיות 50 ng/mL
רקומביננטי האדם 100 ng/mL
R-הכלה 1-מיזוג מדיה מדיה ממוזגת 10%
A83 200 nM
DHT 1 מיכל
Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון (מעכב רוק) 10 μM
מתקדם זיכרון/F-12 מדיה בסיסית
R-החתן מדיה 1 ממוזג נוצר כמתואר בדרוסט, ואח '13. לאחר הוספת כל הרכיבים, מסנן לעקר מדיה העכבר אורגנואיד באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר. מעכב סלע מתווסף רק במהלך הקמתה של התרבות הפסנואידים של הארגון.

טבלה 2: הוראות להכנת מדיית העכבר הארגונית.

פרוטוקול להכנת צלחות מצופות פולי-HEMA
1 הוסף 0.25 גרם פולי-HEMA ל 50 mL 98% אטוח. התמוססות פולי-HEMA בשעה 37 ° c על שייקר. תהליך זה לוקח לפחות 4 שעות.
2 מסנן לחטא פולי-hema באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.
3 הוסף 200 μl של הפתרון פולי-HEMA לכל טוב של לוח 24-הבאר (s).
4 הסר מכסה (ים) מלוח 24-הבאר לאחר הוספת פולי HEMA ולאפשר פתרון להתאדות בן לילה.
מיכל 5 כביסה היטב פעמיים עם PBS ולהבטיח בארות יבשים לחלוטין לפני אחסון לאחר השטיפה הסופית. הערה: שיבוש הציפוי פולי-HEMA במהלך הכביסה יכול לתרום לצמיחה דו-ממדית על ידי ציפוי תאים אפיתל לתרבות אורגאידית. כדי למנוע נזק לבארות הצופות בפולי-HEMA, הימנע ממגע ישיר עם עצת הפיפטה בזמן השטיפה. השלמות של הבארות הצופות בפולי-HEMA תישאר שלמה, אלא אם כן הפולי-HEMA מרוכך מקצה הפיפטה.
6 ניתן לאחסן צלחות פולי-HEMA ב-4 ° צ' עד שבועיים. הערה: גלישת צלחות בפראפilm לפני האחסון תפחית את הסיכון להידבקות.

שולחן 3: פרוטוקול להכנת צלחות מצופות פולי-חמא.

Discussion

תא אפיתל הערמונית בידול כבר מעורב הן ביולוגיה הערמונית נורמלי2,3,4,5,6,7 ו ביולוגיה של המחלה8,10,11,12; עם זאת, הרגולטורים הראשיים של תהליך זה נותרים לא מוגדרים. זיהוי הרגולטורים מפתח של בידול תא אפיתל הערמונית היה קשה בחלק בשל העדר הקשרים הוקמה היטב כדי לדגמן אותו. בעוד תרבות דו-ממדית מונאולייר יכולה לשמש למודל בידול11,12, הקשר הזה לא מצליח ללכוד את הסביבה המורכבת ממיקרו הערמונית. יתר על כן, בהקשרים vivo למודל בידול לא להשאיל את עצמם למחקרים מכניסטיים, כפי שהם מאתגרים לתמרן. לכן, הזיהוי של קל לתמרן, אך מבחינה פיזיולוגית, ההקשר הרלבנטי, כדי ללמוד בידול הוא קריטי.

המודל של אורגנואיד הערמונית מייצג הקשר אלגנטי לשעבר vivo שבו בסיס בידול הלומיאל מדווח להתרחש. שיטות להקמת אורגנואידים הערמונית מבוססים היטב14; עם זאת, אופטימיזציה נוספת של שיטות אלה הוא הכרחי. יתר על כן, גישות הקציר והכנת אורגנואידים הערמונית לניתוח אינם מתוארים בבירור. מאמר זה מתאר גישה ללוח תאים אפיתל הערמונית מבודדים מערמונית העכבר לתוך התרבות האורגאידית. גישה זו מאפשרת לחוקרים (1) למנוע את התרחשות של מושבות 2D במהלך היווצרות אורגנואיד, (2) להפחית את הסיכון של הפרעה ג'ל מטריקס במהלך חידוש המדיה, ו (3) לספור אורגנואידים ביעילות רבה יותר. בנוסף, כתב היד הזה מתאר את הגישות לאורגנואידים הבציר לקראת ניתוח כתמי מערבי, או מיקרוסקופיה מלאה. וחשוב מכך, הגישה המשמשת להכנת אורגנואידים למיקרוסקופיה מחזיקה את המבנה השלם של האורגנואידים במשך הזמן, אשר מפחית את הנזק האורגאידית לפני רכישת התמונה. בסך הכל, הגישות המתוארות מרחיבות את היכולות של שיטת הערמונית.

בעיקר, היכולת להרכיב אורגאיד של תאים בסיס ולומיאל ניתן לשנות הן על ידי שיטות המשמשות כדי לבודד את האוכלוסיות המתאימות, ועל ידי תנאי התרבות. התנאים של התרבות הארגונית המשמשים באותה שיטת הפעולה תוארו לראשונה על ידי קרהאוס ואח '13. בעוד קרהאוס ואח ' דיווחו כי בתאי בסיס יש קיבולת היוצרים ארגונית גבוהה יותר (15%) מאשר תאי לומיאל (1%)13, צ'ואה et al., באמצעות שיטות בידוד נפרדות ותנאי תרבות, דיווחו כי תאי הלומיאל (0.2-0.3%) יש קיבולת ארגונית גבוהה יותר מאשר תאי בסיס (0.03%) באופן כללי, שיטות שתוארו על ידי Karthaus ואח ' להוביל שיעורי היוצרים גבוה יותר אורגאיד עבור תאים בסיס ולומיאל, כנראה הבדלים ההבדלים בגישה המשמש לבידוד תאים בסיס ולומיאל13, בניגוד לתנאי התרבות הטיה נגד היווצרות אורגאיד מתאי הלומיליים. זה לא ברור אם הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מעדיף היווצרות אורגאיד הלומיאלי מושלתי רב עוצמה, או מחויבת-לומינאל ושלתי9. למרות הזמן והעלות, במחקרים vivo שושלת היוחסין ניתן להשתמש כדי לאמת תכונות של מחולל קדמון הקשורים עם הערמונית שונים אפיתל ליננים באופן מובהר בתוך שיטת אורגנואיד.

תהליכים כגון פיתוח, בידול וטרנספורמציה אינם רלוונטיים רק לביולוגיה של הערמונית, אלא גם רלוונטית לביולוגיה של רקמות אחרות, כולל המוח, הריאות, המעי, הלבלב והכבד. השיטות המתוארות מקלות את הניצול של המודל האורגאיד לחקר תהליכים אלה לא רק את הערמונית, אלא גם מגוון רחב של רקמות.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

ה-PDC ו-JMG נתמכים על ידי פרס שירות המחקר הלאומי רות ל' קירששטיין GM007185. ג'אד נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות (R25GM055052) הוענק ל ט. חסון ולמלגות סול מרטינז. ASG נתמכת על ידי קרן משפחת שפיצר ואת קרן הגיל. עבודה זו נתמכת על ידי האגודה האמריקנית לסרטן (RSG-17-068-01-TBG), משרד ההגנה (W81XWH-13-1-0470), מרגרט E. מוקדם המחקר הרפואי אמון, NIH/NCI (P50CA092131/באוניברסיטת UCLA נבג בסרטן הערמונית), קרן רוז הילס, ותמיכה מרכז הסרטן של UCLA Jonsson, מרכז מחקר של תאי גזע רחב, מכון קליני וטרנסלtional המדע, והמכון לאונקולוגיה באורולוגית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Dish 35 mm, high ibidi 81156
16% Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 50-980-487
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
A83-01 Tocris 2939
Advanced DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 12634010
APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 μg BioLegend 118218
B-27 Supplement (50x), Serum Free Thermo Fisher Scientific 17504044
Complete Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11836145001
(DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one) Sigma A-8380
Dispase II, Powder Thermo Fisher Scientific 17-105-041
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F8667
FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) BioLegend 102405
FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) BioLegend 103107
FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) BioLegend 116205
Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 Invitrogen A28175
Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Halt Phosphatase Inhibitor Thermo Fisher Scientific 78428
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning CB-40230C
Mouse anti-cytokeratin 8 BioLegend 904804
N-acetyl-L-cysteine Sigma A9165
Normocin Thermo Fisher Scientific ant-nr-1
PE anti-human/mouse CD49f Antibody BioLegend 313612
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15-140-122
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) Sigma P3932-25G
Rabbit anti-p63 BioLegend 619002
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) Thermo Fisher Scientific PI89901
Recombinant Human EGF, Animal-Free PeproTech AF-100-15
Recombinant Human Noggin PeproTech 120-10C
RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10) Thermo Fisher Scientific 22400105
Sonic Dismembrator Thermo Fisher Scientific FB120
Sucrose Sigma S0389-500G
Triton X-100 Sigma X100-5ML
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Selleck Chemical S1049-50MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kwon, O. J., Xin, L. Prostate epithelial stem and progenitor cells. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 2 (3), 209-218 (2014).
  2. Choi, N., Zhang, B., Zhang, L., Ittmann, M., Xin, L. Adult Murine Prostate Basal and Luminal Cells Are Self-Sustained Lineages that Can Both Serve as Targets for Prostate Cancer Initiation. Cancer Cell. 21 (2), 253-265 (2012).
  3. Ousset, M., Van Keymeulen, A., et al. Multipotent and unipotent progenitors contribute to prostate postnatal development. Nature Cell Biology. 14 (11), 1131-1138 (2012).
  4. Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 1-13 (2014).
  5. Wang, Z. A., Mitrofanova, A., et al. Lineage analysis of basal epithelial cells reveals their unexpected plasticity and supports a cell-of-origin model for prostate cancer heterogeneity. Nature Cell Biology. 15 (3), 274-283 (2013).
  6. Kwon, O. J., Zhang, B., Zhang, L., Xin, L. High fat diet promotes prostatic basal-to-luminal differentiation and accelerates initiation of prostate epithelial hyperplasia originated from basal cells. Stem Cell Research. 16 (3), 682-691 (2016).
  7. Kwon, O. J., Zhang, L., Ittmann, M. M., Xin, L. Prostatic inflammation enhances basal-to-luminal differentiation and accelerates initiation of prostate cancer with a basal cell origin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 192 (3), 997-999 (2014).
  8. Stoyanova, T., et al. Prostate cancer originating in basal cells progresses to adenocarcinoma propagated by luminal-like cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (50), 20111-20116 (2013).
  9. Agarwal, S., Hynes, P. G., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
  10. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  11. Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
  12. Bishop, J. L., et al. The Master Neural Transcription Factor BRN2 Is an Androgen Receptor-Suppressed Driver of Neuroendocrine Differentiation in Prostate Cancer. Cancer Discovery. 7 (1), 54-71 (2016).
  13. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  14. Drost, J., Karthaus, W. R., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  15. McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), e59051 (2019).
  16. Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 181-186 (2007).
  17. Chen, H. Y., Kaya, K. D., Dong, L., Swaroop, A. Three-dimensional retinal organoids from mouse pluripotent stem cells mimic in vivo development with enhanced stratification and rod photoreceptor differentiation. Molecular vision. 22, 1077-1094 (2016).
  18. Liu, X., et al. Low CD38 Identifies Progenitor-like Inflammation-Associated Luminal Cells that Can Initiate Human Prostate Cancer and Predict Poor Outcome. Cell Reports. 17 (10), 2596-2606 (2016).
  19. Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
  20. Chua, C. W., Shibata, M., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).

Tags

סרטן מחקר סוגיה 153 אורגאיד ערמונית אפיתל מחולל קדמון בסיס לומיאל בידול עכבר
הערכת יכולת בידול של העכבר תאים אפיתל הערמונית באמצעות תרבות אורגאיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crowell, P. D., Giafaglione, J. M.,… More

Crowell, P. D., Giafaglione, J. M., Hashimoto, T., Diaz, J. A., Goldstein, A. S. Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture. J. Vis. Exp. (153), e60223, doi:10.3791/60223 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter