Summary
Gli organoid della prostata del topo rappresentano un contesto promettente per valutare i meccanismi che regolano la differenziazione. Questo documento descrive un approccio migliorato per stabilire gli organoidi della prostata e introduce metodi per (1) raccogliere il lisato proteico dagli organoidi e (2) fissare e macchiare gli organoidi per la microscopia confocale a cavalcatura completa.
Abstract
L'epitelio della prostata è costituito prevalentemente da cellule basali e luminali. Il tracciamento del lignaggio in vivo è stato utilizzato per definire la capacità di differenziazione delle cellule basali e luminose della prostata del topo durante lo sviluppo, la rigenerazione dei tessuti e la trasformazione. Tuttavia, la valutazione dei regolatori intrinseci ed estrinseci delle cellule della capacità di differenziazione epiteliale della prostata utilizzando un approccio di tracciamento del lignaggio spesso richiede un'ampia riproduzione e può essere proibitiva in termini di costi. Nel saggio organoide della prostata, le cellule basali e luminali generano epitelio prostatico ex vivo. È importante sottolineare che le cellule epiteliali primarie possono essere isolate da topi di qualsiasi background genetico o topi trattati con un numero qualsiasi di piccole molecole prima o dopo la placcatura in coltura tridimensionale (3D). Materiale sufficiente per la valutazione della capacità di differenziazione viene generato dopo 7-10 giorni. La raccolta di organoidi derivati e luminali per l'analisi delle proteine (1) da parte dell'analisi immunohistochimica occidentale e (2) degli organoitidi intatti mediante microscopia confocale a monte completa consente ai ricercatori di valutare la differenziazione ex vivo capacità delle cellule epiteliali della prostata. Se utilizzati in combinazione, questi due approcci forniscono informazioni complementari sulla capacità di differenziazione delle cellule comportamentali e luminose in risposta alla manipolazione genetica o farmacologica.
Introduction
Le cellule basali e luminali costituiscono la maggior parte dell'epitelio prostatico1. Studi di tracciamento del lignaggio hanno rivelato che questi tipi di cellule sono prevalentemente autosufficienti da progenitori distinti nel topo adulto2; tuttavia, la differenziazione luminale da progenitori basali è stata osservata in diversi contesti tra cui lo sviluppo3,4, la rigenerazione dei tessuti5, l'infiammazione6,7 e l'avvio del cancro alla prostata2,8. Inoltre, i dati emergenti supportano l'esistenza di progenitori luminali multipotenti e di progenitori luminosi9. Nel cancro della prostata metastatica, la differenziazione da un lignaggio luminale dipendente dall'AR a un lignaggio INdifferente AR con caratteristiche basali e neuroendocrine rappresenta un meccanismo sempre più apprezzato di resistenza agli inibitori della via androgenia10,11,12. Pertanto, poiché la differenziazione è implicata nella fisiologia normale, l'avvio del cancro e la resistenza alla terapia, è fondamentale chiarire i regolatori molecolari chiave della differenziazione delle cellule epiteliali della prostata.
Il modello organoide della prostata del topo è emerso come un elegante contesto ex vivo per studiare la differenziazione delle cellule epiteliali della prostata9,13,14. In questo saggio, le singole cellule epiteliali sono placcate in una matrice 3D dove generano strutture ghiandolari contenenti cellule basali e luminali entro 1 settimana. Mentre gli approcci esistenti per la placcatura delle cellule in coltura organoide possono essere utilizzati per generare in modo efficiente organoidi, questi approcci richiedonoun'ulterioreottimizzazione 14 . Le sfide più importanti associate alla coltura degli organoidi della prostata includono (1) colonie bidimensionali (2D) che si formano sotto il Matrigel (gel a matrice) dall'analisi, (2) mantenendo l'integrità del gel della matrice durante i cambiamenti dei supporti e (3) il conteggio degli organoidi con precisione. Questo documento delinea un approccio per generare organoidi da cellule epiteliali isolate dalla prostata del topo. L'approccio descritto prevede il rivestimento di piastre con poli(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) per prevenire il verificarsi di colonie 2D. Inoltre, le cellule sono placcate in un anello gel a matrice, piuttosto che in un disco gel a matrice, che rende meno difficile cambiare i supporti e contare gli organoidi. Queste tecniche consentono ai ricercatori di studiare più facilmente il modo in cui le alterazioni genetiche o piccole molecole introdotte prima o durante la formazione di organoidi alterano i processi chiave come la differenziazione.
La raccolta degli organoidi della prostata per l'analisi delle macchie o immunohistochimiche occidentali mediante microscopia confocale integrale può fornire preziose informazioni meccanicistiche sulla differenziazione13, ma mancano protocolli consolidati per preparare gli organoid per tali tecniche. Questo manoscritto descrive gli approcci per raccogliere gli organoidi per (1) la raccolta di proteine lisate, o (2) fissazione e colorazione per la microscopia confocale. È importante sottolineare che l'approccio descritto per fissare e colorare gli organoid della prostata è notevolmente migliorato in relazione ai metodi esistenti. Mentre questi si basano sulla sezionamento organoids15, il metodo descritto in questo manoscritto utilizza organoidi intatti, che aiuta a proteggere contro danni organoidi durante la preparazione del campione. Se utilizzato in combinazione, la microscopia confocale e macchia occidentale può fornire preziose informazioni sui regolatori molecolari della differenziazione. In alternativa, questi approcci possono essere utilizzati per modellare altri processi, ad esempio lo sviluppo e la trasformazione.
Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Review Board dell'Università della California, Los Angeles.
NOT: Uno schema che illustra gli approcci descritti nel documento è disponibile nella Figura 1.
1. Isolamento delle celle epiteliali del mouse Basale e della prostata luminale mediante lo smistamento delle cellule attivato dalla fluorescenza (FACS) - TIMING: 30 Min
NOT: Eseguire i passaggi 1.3-1.5 al buio.
- Dopo aver dissociato le cellule dalla prostata totale del topo come descritto in Lawson et al.16, trasferire le cellule ai tubi FACS e risospendere nuovamente 0,1-5 x 106 cellule in 100 : L di supporti di dissociazione (Tabella 1).
- Aggiungere il volume appropriato dei seguenti anticorpi primari direttamente coniugati: CD45, CD31, Ter-119, EpCAM e CD49f.
- Incubare sul ghiaccio, protetto dalla luce, per 20 min.
NOT: Si raccomanda di utilizzare il 10% delle cellule dissociate totali per i controlli incontaminati e a macchia singola. Questi controlli sono necessari per impostare la compensazione e la tensione corrette per l'ordinamento. - Cocktail anticorpo Quench con l'aggiunta di 1 mL di supporto di dissociazione per ogni campione. Pellere le cellule per centrifugazione a 800 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT) e rimuovere il sovrinterrato aspirando.
- Risospendere le cellule in volume appropriato (250 x L per 1 x 106 cellule) del supporto di dissociazione contenente 1 g/mL 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI). Procedere con FACS. I grafici di citometria di flusso che dimostrano l'isolamento delle cellule epiteliali della prostata comportamentale e basali e luminali del mouse sono illustrati nella Figura 2.
2. Plating Cellule epiteliali ordinate in coltura organoide primarie del topo - TIMING: 2-3 H (esclusa la preparazione della piastra rivestita Poly-HEMA)
NOT: Le piastre sono rivestite con Poly-HEMA per prevenire la formazione di colonia 2D sulla superficie del pozzo sotto il gel a matrice. Preparare le piastre rivestite in poli-HEMA 1 giorno prima della placcatura di cellule epiteliali comportamentali ordinate in basali o luminose in colture organoidi. Scongelare 1 mL di gel a matrice del fattore di crescita ridotto, in seguito indicato come gel a matrice, sul ghiaccio 2 h prima del passaggio 2.1. Y-27632 (inibitore ROCK) deve essere aggiunto ai supporti organoidi del topo immediatamente prima del passaggio 2.1. Eseguire i passaggi 2.1-2.8 sul ghiaccio.
- Pellet le cellule in tubi rotondi da 5 mL per centrifugazione a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e aspirare il supernatante.
- Lavare il pellet cellulare in 500 - L di supporti organoidi del topo (Tabella 2)14.
- Pellet le cellule per centrifugazione a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e aspirare il supernatante.
- Risospendere in supporti organoidi del topo ad una densità di cellule di 1.000 celle/L.
- Per preparare le miscele principali, mescolare le cellule epiteliali sospese in supporti organoidi del topo con gel a matrice per generare una miscela finale che contiene il 25% di cellule/media e il gel a matrice 75%. Le cellule basali sono tipicamente pianti ad una concentrazione di 100-2.000 cellule/80 -L, mentre le cellule luminali sono tipicamente piantiate ad una concentrazione di 2.000-10.000 cellule/80. La densità delle cellule placcate varia a seconda del giorno della raccolta del materiale previsto e dell'applicazione a valle desiderata.
NOT: Raffreddare tubi di dimensioni adeguate per il volume di miscela master previsto 5 min prima della preparazione del mix master. Per garantire che il gel a matrice non si indurisca durante la manipolazione, è fondamentale raffreddare la punta della pipetta pipetta pipetta pipetting il gel a matrice 3-4 volte prima di trasferirlo in un nuovo tubo. - Aggiungete 80 l della miscela di gel/cellule a matrice per pozzo di una piastra di 24 pozzetti. Si raccomanda di pipettare una goccia sulla metà inferiore della parete del pozzo, evitando il contatto diretto con il rivestimento Poly-HEMA. Dopo aver aggiunto il gel a matrice, girare la piastra per consentire alla miscela di gel/ cellula della matrice di formare un anello intorno al bordo del pozzo.
- Mettere la piastra di 24 pozzetto in un'incubatrice di CO2 da 37 gradi a destra per 10 min per consentire al gel a matrice di indurirsi parzialmente.
NOT: Iniziare a riscaldare i supporti organoidi del topo a 37 gradi centigradi subito dopo aver posizionato la piastra di 24 pozze nell'incubatrice. - Dopo aver incubato per 10 min, capovolgere la piastra di 24 pozze e incubare per altri 50 min per consentire al gel a matrice di indurirsi completamente.
- Aggiungere 350 l di supporti organoidi preriscaldati dropwise al centro di ogni pozzo.
NOT: Per mantenere l'integrità del gel matrice, è fondamentale evitare l'anello gel matrice durante l'aggiunta di supporti. - Dopo aver aggiunto il supporto, riportare la piastra 24-po'all'incubatrice di CO2 da 37 gradi.
3. Rifornire il supporto organiide del topo - TIMING: 10-15 Min Per 24-well Plate
NOT: I supporti esistenti devono essere sostituiti con supporti aggiornati ogni 48 ore. Prima di ogni cambiamento multimediale, pre-caldo mouse organoid media. Non è necessario aggiungere l'inibitore ROCK ai supporti utilizzati per il rifornimento.
- Inclinare la piastra di 24 pozze con un angolo di 45 gradi e rimuovere delicatamente i supporti esistenti dal centro di ogni pozzo utilizzando una pipetta p1000, evitando l'anello di gel a matrice.
- Aggiungere 350 -L di supporti organoidi per topi preriscaldati come al punto 2.9. Si raccomanda di aggiungere un volume maggiore di supporti (fino a 1 mL) agli organoidi coltivati per più di 5 giorni al fine di prevenire un rapido esaurimento dei nutrienti chiave e dei fattori di crescita.
4. Estrazione di proteine Lisate dagli organoidi della prostata per l'analisi Western Blot - TIMING: 2.5-4 H
NOT: Prima di raccogliere gli organoidi per l'estrazione del lisato proteico, preparare e pre-caldo supporti contenenti dispasi (Tabella 1).
- Rimuovere il supporto da ogni modo così come nel passaggio 3.1.
- Per raccogliere gli organoidi, far saltare ripetutamente il gel a matrice conlatando 1 mL di supporti contenenti dispasi direttamente sull'anello del gel della matrice fino a quando l'intero anello non viene sloggiato e trasferito in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL.
NOT: È fondamentale evitare il contatto diretto con i pozze rivestiti in poli-HEMA. Il contatto diretto può causare la contaminazione del materiale raccolto con Poly-HEMA, che potrebbe avere un impatto negativo sulla sopravvivenza delle cellule. - Collocare i tubi di microcentrifuga da 1,5 ml in un'incubatrice di CO2 da 37 min per 30 min a 1 h per consentire la digestione completa del gel a matrice mediante dispasi.
- Gli organoidi pellet per centrifugazione a 800 x g per 5 min a RT e rimuovere il supernatante utilizzando una micropipetta.
- Aggiungere la salina con buffer fosfato (PBS) al pellet organoide e sospendere delicatamente.
NOT: La mancata sospensione sufficiente del pellet organoide può comportare la contaminazione di materiale organoide con dispasi residui o gel a matrice. - Pellet gli organoidi con centrifugazione a 800 x g per 5 min a RT e rimuovere il supernatante utilizzando una micropipetta.
- Congelare rapidamente i pellet organoidi mettendo ogni tubo in una soluzione contenente ghiaccio secco e metanolo. Conservare i tubi fino all'uso futuro a -80 gradi centigradi. In alternativa, estrarre le proteine lisate subito dopo il passo 4.6.
- Risospendere i pellet organoidi in 100 gradi di tampone di lisi proteica (tabella 1) per 10 : L di volume cellulare imballato. Scorrere per risospendere.
NOT: Se si riprende dopo il congelamento rapido, assicurarsi che il buffer di lisi di proteine sia scongelato prima di rimuovere i campioni da -80 gradi centigradi, poiché il buffer di lisi deve essere aggiunto ai campioni immediatamente al fine di prevenire l'attività di fosforasi e proteasi. - Incubare i campioni nel buffer di lisi proteica sul ghiaccio per almeno 45 min.
NOT: Si raccomanda di sonicare prima dell'incubazione sul ghiaccio per aumentare l'efficienza del recupero di proteine nucleari; tuttavia, la sonicazione non è necessaria. Se la sonicazione non viene eseguita, procedere al passaggio 4.10.- Per sonicare, immergere i tubi nel ghiaccio bagnato e applicare delicatamente la punta del dismbrator sonico all'esterno del tubo di microcentrifuga. Sonicare per 40 s a 20 kHz.
- Procedere verso la macchia occidentale seguendo i protocolli stabiliti.
5. Fissaggio e colorazione degli organidi della prostata per l'analisi immunoistochimica mediante microscopia confocale all'intero monte
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Raccolta di organoidi della prostata da piastre 24-bene - TIMING: 45-60 min
NOT: Quando si raccolgono gli organoidi della prostata per la microscopia confocale, è fondamentale gestirli con cura per mantenere la loro struttura. Il protocollo di raccolta riportato di seguito è progettato per ridurre l'interruzione della struttura organoide durante l'isolamento.- Rimuovere il supporto da ogni modo così come nel passaggio 3.1.
- Digerire il gel a matrice incubando con 500 gradi di supporti contenenti dispasi (Tabella 1) per 30 min in un'incubatrice di CO2 37 C 5%.
- Raccogliere la sospensione organoide digerita in un tubo di microcentrifuga e pellet gli organoidi per centrifugazione a 800 x g per 3 min a RT. Rimuovere il supernatante.
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Colorazione immunofluorescente a monte intero degli organoidi della prostata - TIMING: 3-4 giorni (1-5 h/giorno)
- Aggiungere in PBS 500 -L del 4% di paraformaldeia e incubare per 2 h a RT con agitazione delicata.
- Pellet gli organoidi con centrifugazione a 800 x g per 3 min a RT, rimuovere il supernatante, e lavare il pellet con 1 mL di PBS per 15 min con agitazione delicata.
- Lavare il pellet come al punto 5.2.2 per altre due volte.
- Pellet gli organoidi da centrifugazione a 800 x g per 3 min a RT e rimuovere il supernatante. Aggiungete 1 DAPI di g/mL nella soluzione di blocco (Tabella 1). Incubare per 2 h a RT o in alternativa durante la notte a 4 gradi centigradi con agitazione delicata.
- Pellet gli organoidi da centrifugazione a 800 x g per 3 min a RT e rimuovere il supernatante. Aggiungere l'anticorpo primario (coniglio anti-p63, topo anti-citokeratina 8) nella soluzione di blocco e incubare durante la notte a 4 gradi centigradi con agitazione delicata.
- Pellet gli organoidi da centrifugazione a 800 x g per 3 min a RT e rimuovere il supernatante. Lavare il pellet con 1 mL di PBS per 15 min con agitazione delicata.
- Lavare il pellet come al punto 5.2.6 per altre due volte.
- Pellet gli organoidi da centrifugazione a 800 x g per 3 min a RT e rimuovere il supernatante. Aggiungere l'anticorpo secondario (capra anti-coniglio IgG-Alexa Fluor 594, capra anti-topo IgG-Alexa Fluor 488) in soluzione di blocco e incubare durante la notte a 4 gradi centigradi con agitazione delicata.
- Pellet gli organoidi con centrifugazione a 800 x g per 3 min a RT, rimuovere il supernatante, e lavare il pellet con 1 mL di PBS per 15 min con agitazione delicata.
- Lavare il pellet come al punto 5.2.9 per altre due volte.
6. Cancellazione dei tessuti e montaggio degli organidi della prostata macchiata per la microscopia confocale all'intero monte - TIMING: 7 H
- Pellet gli organoidi da centrifugazione a 800 x g per 3 min a RT e rimuovere il supernatante.
- Aggiungere 1 mL di saccarosio 30% in PBS con 1% Triton X-100 e incubare per 2 h a RT con agitazione delicata.
- Pellet gli organoidi da centrifugazione a 800 x g per 3 min a RT e rimuovere il supernatante.
- Aggiungere 1 mL di 45% di saccarosio in PBS con 1% Triton X-100 e incubare per 2 h a RT con agitazione delicata.
- Pellet gli organoidi da centrifugazione a 800 x g per 3 min a RT e rimuovere il supernatante.
- Aggiungere 1 mL di saccarosio 60% in PBS con 1% Triton X-100 e incubare per 2 h a RT con agitazione delicata.
- Pellet gli organoidi con centrifugazione a 800 x g per 3 min a RT e rimuovere il 95% del supernatante.
NOT: Il pellet si allenta man mano che la concentrazione di saccarosio aumenta. Si raccomanda di osservare gli organoidi macchiati DAPI sotto la luce UV per confermare che non sono stati persi durante la rimozione del supernatante. - Trasferire una goccia di 10-20 l della sospensione rimanente in un coperchio camerato e procedere alla microscopia confocale.
NOT: I frammenti di Coverslip possono essere posizionati su entrambi i lati della goccia da utilizzare come distanziali (Figura 4C). Questi impediscono ai organoidi di collassare quando un coperchio è posizionato sopra la goccia.
Representative Results
Le cellule epiteliali della prostata sono placcate in colture organoidi del topo dove formano organoidi, che vengono raccolti prima della preparazione per l'analisi a valle (Figura 1).
Le cellule epiteliali basali e luminali sono isolate utilizzando FACS. Dopo l'esclusione dellecelle DAPIe dell'esaurimento delle celle Lin (CD45, CD31, Ter119), le celle basali e luminali sono distinte in base all'espressione differenziale di EpCAM e CD49f (Figura 2). L'approccio descritto per placcare cellule comportamentali e luminali in coltura organoide comporta: (1) placcatura delle cellule in anelli di gel a matrice, e (2) rivestimento pozzi con Poli-HEMA. La placcatura in anelli è stata descritta in precedenza in Agarwal et al9. L'utilizzo di questo approccio (Figura 3A) consente ai ricercatori di evitare più facilmente il gel matrice durante il rifornimento del supporto (Passaggio 3), e più facilmente contare gli organoidi seguendo la circonferenza del pozzo. I pozzi di rivestimento con Poly-HEMA hanno dimostrato di prevenire la formazione di colonia 2D negli organoidi retinici17; tuttavia, questo approccio non è stato utilizzato nel modello organoide della prostata. È importante sottolineare che i pozzi di rivestimento con Poly-HEMA (Tabella 3) eliminano la comparsa di colonie 2D senza interferire con la formazione di organoidi (Figura 3B). Queste modifiche espandono le capacità del saggio organoide della prostata.
Le cellule basali e luminali formano organoidi con morfologie distinte (Figura 4A). Mentre la maggior parte degli organoidi derivati dal basale ha dimensioni simili (100-300 m di diametro) dopo 7 giorni di coltura, gli organoidi derivati dal luminoso presentano un'eterogeneità significativa (30-450 m di diametro). Inoltre, la maggior parte degli organoidi derivati dal basale contiene lumemi circondati da epitelio multistrato (Figura 4A, superiore), mentre i soggetti derivati dal luminalo variano in morfologia da organologi vuoti, con epitelio a singolo strato a solido, con corde multistrato di cellule che non si canalizzano ( Figura4A, fondo). Gli approcci descritti in precedenza per preparare gli organoidi per l'analisi a valle (passaggi 4, 5), sono stati utilizzati per studiare se queste differenze fenotipiche riflettano le differenze nell'espressione del marcatore di lignaggio. L'analisi delle macchie occidentali ha rivelato che gli organoidi basali e luminali conservano le caratteristiche associate alle cellule primarie basali e luminose. Gli organoidi derivati dai basali esprimono livelli più elevati del marcatore basale cytokeratin 5 (K5), mentre gli organoidi di derivazione luminale esprimono livelli più elevati del citokeratina del marcatore luminale 8 (K8) (Figura 4B). Sono stati rilevati sia marcatori basali che luminali negli organoidi basali e luminali nella popolazione sfusa, forse suggestivi di differenziazione (Figura 4B).
Abbiamo cercato di caratterizzare l'espressione del marcatore di lignaggio negli organoidi derivati da basali e di determinare se gli organoidi di derivazione luminosa morfologicamente distinti presentano differenze nell'espressione del marcatore colorando organoidi intatti ed eseguendo microscopia confocale (Figura 4D). Gli organoidi derivati da basali contenevano epitelio multistrato con strati esterni che esprimevano alti livelli del marcatore basale p63 e livelli moderati del marcatore luminale K8 (p63hi, K8metà) e strati interni senza livelli rilevabili di p63 e alti livelli di K8 (p63lo, K8hi) (Figura 4D, superiore). Mentre tutte le cellule in organoidi di derivazione luminosa a strati singolo macchiavano positivamente per K8, solo le cellule selezionate contenevano p63 nucleari (Figura 4D, fondo). Questi dati convalidano gli approcci per raccogliere e preparare gli organoidi per l'analisi mediante microscopia confocale o macchia occidentale, ampliando così la capacità del saggio organoide di studiare i principali processi cellulari, compresa la differenziazione.
Figura 1: Schema che illustra il flusso di lavoro per generare organoid della prostata per la raccolta e l'analisi. La prostata totale del topo è dissociata e le cellule epiteliali della prostata basale e luminale sono isolate dallo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza tramite protocolli stabiliti18,19. Le cellule basali o luminali sospese in una miscela di supporti organoidi del topo e gel a matrice sono placcate in anelli di gel a matrice. Dopo 5-7 giorni di coltura, gli organoidi vengono raccolti per l'analisi da microscopia confocale o macchia occidentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Isolamento delle cellule epiteliali della prostata comportamentale e comportamentale corporea e del mouse utilizzando lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS). Le cellule dissociate dalla prostata del topo sono macchiate con DAPI, per distinguere le cellule morte e gli anticorpi superficiali, per distinguere basale dalle cellule luminali, prima del FACS. Sinistra: portata sulle celle DAPI. FSC-A - dispersione in avanti. Centro - Gated on Lin- celle (CD45lo, CD31lo, Ter119lo). SSC-A - dispersione laterale. Destra: celle basali (Bas) (EpCAMhi, CD49fhi, Cellluminose (Lum) (EpCAMhi, CD49fmid). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Istituzione degli organoidi della prostata del topo. (A) Approccio schematico per generare un anello di gel a matrice in un pozzo di una piastra di 24 pozze. (B) Immagini rappresentative di contrasto di fase di organoidi (piano di crescita 3D) e colonie bidimensionali (piano di crescita 2D) formate 7 giorni dopo la placcatura delle cellule epiteliali in piastre non rivestite (Poly-HEMA) o rivestite (Poly-HEMA () Le regioni boxed all'interno del piano di crescita 2D vengono ingrandite a destra. Barre di scala - 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi dell'espressione del marcatore di lignaggio negli organoidi della prostata da parte della macchia occidentale e della microscopia confocale a cavalcata intera. (A) Immagini rappresentative a contrasto di fase degli organoidi derivati in basal (superiore) e di derivazione luminale (in basso) dopo 7 giorni di cultura. Barra di scala (B) Analisi commerciale delle macchie di basal-derivati (Bas) e organoidi di derivazione luminale (Lum) dopo 5 giorni di cultura. Colorazione per il marcatore basale, cytokeratin 5 (K5), e il marcatore luminale, citokeratina 8 (K8), e un controllo di carico, istone H3 (HH3). (C) Schematico che illustra la copertina a camera con distanziali. (D) Contrasto rappresentativo delle interferenze differenziali (DIC) e immagini immunofluorescenti di organori (in alto) e di derivazione luminale (in basso) dopo 7 giorni di coltura. Colorazione per p63 (rosso), K8 (verde) e DAPI (blu) singolarmente e fusa. Barre di scala : 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Ricette | |
| Supporti contenenti dispasi | 1 dispasi mg/mL - 10 m inibitore ROCK in avanzato DMEM F12. Filtrare sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 m. |
| Mezzi di dissociazione | 10% FBS - 1x Penicillina-Streptomycin in RPMI 1640. Filtrare sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 m. |
| Tampone di lisi proteica | RIPA buffer - inibitori della fosfore - inibitori della proteasi |
| Soluzione di blocco | 10% FBS in PBS con 0,2% Triton X-100 |
Tabella 1: Istruzioni per la preparazione delle soluzioni chiave.
| Componente | Concentrazione |
| B-27 (in modo inademmi) | 1x (diluire da concentrazione 50x) |
| GlutaMAX | 1x (diluire da 100x concentrato) |
| N-acetil-L-cysteine | 1,25 mM |
| Normocina | 50 g/mL |
| EGF umano ricombinante, senza animali | 50 ng/mL |
| Noggin umano ricombinante | 100 ng/mL |
| R-spondin 1-condizionato supporto | 10% di supporti condizionati |
| A83-01 | 200 nM |
| Dht | 1 nM |
| Y-27632 diidrocloruro (inibitore ROCK) | 10 M |
| DMEM/F-12 avanzato | Supporti di base |
| Il supporto R-spondin 1-condizionato viene generato come descritto in Drost, etal. Dopo l'aggiunta di tutti i componenti, filtrare sterilizzare il supporto organoide del topo utilizzando il filtro 0,22 m. L'inibitore del ROCK viene aggiunto solo durante la creazione della coltura e il passaggio degli organoidi. | |
Tabella 2: Istruzioni per la preparazione dei supporti organoidi del topo.
| Protocollo per la preparazione di lastre rivestite Poly-HEMA | |
| 1 | Aggiungere 0,25 g Poly-HEMA a 50 mL 98% EtOH. Sciogliere poly-HEMA a 37 gradi centigradi su uno shaker. Questo processo richiede almeno 4 h. |
| 2 | Filtrare sterilizzare Poly-HEMA utilizzando il filtro 0,22 m. |
| 3 | Aggiungere 200 gradi di soluzione Poly-HEMA per un pozzo o di una piastra o di una/e piastra/i 24 pozzetto. |
| 4 | Rimuovere i coperchi da piastre 24-po'po' dopo l'aggiunta di Poly-HEMA e lasciare che la soluzione evapora durante la notte. |
| 5 | Lavare ogni due volte con PBS e assicurarsi che i pozze siano completamente asciutti prima dello stoccaggio dopo il lavaggio finale. NOTA: Interrompere il rivestimento Poly-HEMA durante il lavaggio potrebbe contribuire alla crescita bidimensionale sulla placcatura delle cellule epiteliali in coltura organoide. Per evitare danni ai pozzi rivestiti in poli-HEMA, evitare il contatto diretto con la punta della pipetta durante il lavaggio. L'integrità dei pozzi rivestiti poly-HEMA rimarrà intatta a meno che il Poly-HEMA non venga raschiato dalla punta della pipetta. |
| 6 | Le lastre rivestite in poli-HEMA possono essere conservate a 4 gradi centigradi per un massimo di due settimane. NOTA: Il confezionamento delle piastre in parafilm prima dello stoccaggio riduce il rischio di contaminazione. |
Tabella 3: Protocollo per la preparazione di piastre rivestite in poli-HEMA.
Discussion
La differenziazione delle cellule epiteliali della prostata è stata implicata sia nella normale biologia della prostata2,3,4,5,6,e biologia della malattia8,10,11,12; tuttavia, le autorità di regolamentazione principali di questo processo rimangono indefinite. Identificare i regolatori chiave della differenziazione delle cellule epiteliali della prostata è stato difficile in parte a causa dell'assenza di contesti consolidati per modellarlo. Mentre la coltura monostrato 2D può essere utilizzata per modellare la differenziazione11,12, questo contesto non riesce a ricapitolare il complesso microambiente della prostata. Inoltre, i contesti in vivo per modellare la differenziazione non si prestano agli studi meccanicistici, in quanto sono difficili da manipolare. Pertanto, l'identificazione di un contesto facile da manipolare, ma fisiologicamente rilevante, per studiare la differenziazione è fondamentale.
Il modello organoide della prostata rappresenta un elegante contesto ex vivo in cui si segnala una differenziazione basale a luminale. I metodi per stabilire gli organoidi della prostata sono ben stabiliti14; tuttavia, è necessaria un'ulteriore ottimizzazione di questi metodi. Inoltre, gli approcci per raccogliere e preparare gli organoidi della prostata per l'analisi non sono chiaramente descritti. Questo documento descrive un approccio alle cellule epiteliali della prostata a lamiche isolate dalla prostata del topo in coltura organoide. Questo approccio consente ai ricercatori di (1) prevenire il verificarsi di colonie 2D durante la formazione di organoidi, (2) ridurre il rischio di interruzione del gel di matrice durante il rifornimento dei media e (3) contare gli organoidi in modo più efficace. Inoltre, questo manoscritto delinea approcci per raccogliere gli organoidi per la preparazione per l'analisi delle macchie occidentali, o microscopia confocale a tutto monte. È importante sottolineare che l'approccio utilizzato per preparare gli organoidi per la microscopia confocale mantiene la struttura intatta degli organoidi per tutta la sua durata, riducendo i danni agli organiidi prima dell'acquisizione dell'immagine. Complessivamente, gli approcci descritti ampliano le capacità dell'analisi organoide della prostata.
In particolare, la capacità di formazione organoide delle cellule basali e luminali può essere alterata sia con metodi utilizzati per isolare le rispettive popolazioni, sia mediante condizioni di coltura. Le condizioni di coltura organoide usate in questo saggio sono state descritte per la prima volta da Karthaus et al.13. Mentre Karthaus et al. hanno riferito che le cellule basali hanno una maggiore capacità di formatura organoide (15%) rispetto alle cellule luminali (1%)13, Chua e altri, utilizzando metodi di isolamento distinti e condizioni di coltura, hanno riferito che le cellule luminali (0,2-0,3%) hanno una capacità di formazione organoide più elevata rispetto alle cellule basali (0,03%)20. Complessivamente, i metodi descritti da Karthaus et al. portano a tassi di formazione organoidi più elevati per le cellule basali e luminose, probabilmente riflettendo le differenze nell'approccio utilizzato per isolare le cellule basali e luminose13, in contrapposizione a condizioni di coltura che sbilanciano contro la formazione di organiidi dalle cellule luminose. Non è chiaro se il protocollo descritto in questo manoscritto favorisca la formazione di organidici luminali da progenitori luminosi multipotenti o progenitori comminati9. Anche se tempestivi e proibitivi in termini di costi, gli studi di tracciamento del lignaggio in vivo possono essere utilizzati per convalidare le caratteristiche progenitorie associate a linee epiteliali prostate distinte chiarite nel saggio organoide.
Processi come lo sviluppo, la differenziazione e la trasformazione non sono rilevanti solo per la biologia della prostata, ma anche rilevanti per la biologia di altri tessuti tra cui il cervello, il polmone, l'intestino, il pancreas e il fegato. I metodi descritti facilitano l'utilizzo del modello organoide per studiare questi processi non solo nella prostata, ma anche in una vasta gamma di tessuti.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
PDC e JMG sono supportati dal Ruth L. Kirschstein National Research Service Award GM007185. JAD è supportato dal National Institute of General Medical Sciences dei National Institutes of Health (R25GM055052) assegnato a T. Hasson e alla borsa di studio Saul Martinez. ASG è sostenuta dallo Spitzer Family Foundation Fund e dal Gill Endowment. Questo lavoro è stato supportato dalla American Cancer Society (RSG-17-068-01-TBG), Department of Defense (W81XWH-13-1-0470), Margaret E. Presto Medical Research Trust, NIH/NCI (P50CA092131/UCLA SPORE in Prostate Cancer), Rose Hills Foundation e il supporto del Jonsson Comprehensive Cancer Center di UCLA, del Broad Stem Cell Research Center, dell'Istituto di Scienze Cliniche e Traslazionali e dell'Istituto di Oncologia Urologica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Dish 35 mm, high | ibidi | 81156 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 μg | BioLegend | 118218 | |
| B-27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11836145001 | |
| (DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one) | Sigma | A-8380 | |
| Dispase II, Powder | Thermo Fisher Scientific | 17-105-041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F8667 | |
| FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) | BioLegend | 102405 | |
| FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) | BioLegend | 103107 | |
| FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) | BioLegend | 116205 | |
| Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | |
| Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Halt Phosphatase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78428 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230C | |
| Mouse anti-cytokeratin 8 | BioLegend | 904804 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | |
| Normocin | Thermo Fisher Scientific | ant-nr-1 | |
| PE anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313612 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) | Sigma | P3932-25G | |
| Rabbit anti-p63 | BioLegend | 619002 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | PI89901 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10) | Thermo Fisher Scientific | 22400105 | |
| Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific | FB120 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-5ML | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Selleck Chemical | S1049-50MG |
References
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