Summary
Mus prostata organoids representerer en lovende sammenheng for å evaluere mekanismer som regulerer differensiering. Dette papiret beskriver en forbedret tilnærming for å etablere prostata organoids, og introduserer metoder for å (1) samle protein lysat fra organoids, og (2) fikse og beis organoids for hel-Mount konfokalmikroskopi mikroskopi.
Abstract
Prostata epitel består hovedsakelig av basal og luminal celler. In vivo avstamning tracing har blitt benyttet for å definere differensiering kapasitet mus prostata basal og luminal celler under utvikling, vev-regenerering og transformasjon. Imidlertid, evaluering av celle-iboende og ytre regulatorer av prostata epitel differensiering kapasitet ved hjelp av en avstamning tracing tilnærming ofte krever omfattende avl og kan være kostnads uoverkommelige. I prostata organoid analysen, basal og luminal celler genererer prostata epitel ex vivo. Viktigere, kan primære epitelceller isoleres fra mus av genetisk bakgrunn eller mus behandlet med en rekke små molekyler før, eller etter, plating i tredimensjonale (3D) kultur. Tilstrekkelig materiale for evaluering av differensiering kapasitet er generert etter 7-10 dager. Innsamling av basal-avledet og luminal-avledet organoids for (1) proteinanalyse av Western Blot og (2) immunhistokjemiske analyse av intakt organoids av hel-Mount konfokalmikroskopi mikroskopi gjør det mulig for forskere å evaluere ex vivo differensiering kapasitet av prostata epitelceller. Når den brukes i kombinasjon, disse to tilnærminger gir utfyllende informasjon om differensiering kapasitet av prostata basal og luminal celler som svar på genetisk eller farmakologisk manipulasjon.
Introduction
Basal og luminal celler utgjør flertallet av prostata epitel1. Slekts sporing studier har avdekket at disse celletyper er overveiende selv-opprettholdes av distinkte forfedre i den voksne musen2; men luminal differensiering fra basal forfedre har blitt observert i flere sammenhenger, inkludert utvikling3,4, vevgjenfødelse 5,betennelse 6,7 og prostata kreft Initiation2,8. Videre støtter nye data eksistensen av Multipotent luminal forfedre så vel som luminal-begått forfedre9. I metastatisk prostatakreft, differensiering fra en AR-avhengige luminal avstamning til en AR-likegyldig avstamning med basal og Nevroendokrine funksjoner representerer en stadig mer verdsatt mekanisme motstand mot androgen Pathway hemmere10,11,12. Derfor, som differensiering er innblandet i normal fysiologi, kreft initiering og resistens mot terapi, Elucidating viktigste molekylære regulatorer av prostata epitel celle differensiering er kritisk.
Musen prostata organoid modellen har dukket opp som en elegant ex vivo kontekst for å studere prostata epitel celle differensiering9,13,14. I denne analysen, individuelle epitelceller er belagt inn i en 3D-matrise der de genererer kjertel strukturer som inneholder både basal og luminal celler innen 1 uke. Mens eksisterende tilnærminger for plating celler i organoid kultur kan brukes til å effektivt generere organoids, disse tilnærmingene krever ytterligere optimalisering14. Bemerkelsesverdige utfordringene forbundet med dyrking prostata organoids inkluderer (1) unntatt to-dimensjonale (2D) kolonier som danner under Matrigel (Matrix gel) fra analyse, (2) opprettholde integriteten til matrisen gel under Media endringer, og (3) telle organoids nøyaktig. Dette papiret skisserer en tilnærming til å generere organoids fra epitelceller isolert fra mus prostata. Tilnærmingen beskrevet innebærer belegg plater med Poly (2-hydroxyethyl akrylat) (Poly-HEMA) for å hindre forekomsten av 2D kolonier. Videre er celler belagt i en matrise gel ring, snarere enn en matrise gel plate, noe som gjør endring av media og telling organoids mindre utfordrende. Disse teknikkene gjør det lettere for forskerne å undersøke hvordan genetiske endringer eller små molekyler som introduseres før, eller under, organoid formasjon endrer nøkkelprosesser som differensiering.
Høsting av prostata organoids for Western Blot eller immunhistokjemiske analyse av hel-Mount konfokalmikroskopi mikroskopi kan gi verdifull mekanistisk innsikt i differensiering13, men godt etablerte protokoller for å forberede organoids for slike teknikker mangler. Dette manuskriptet beskriver tilnærminger for å høste organoids for (1) samling av protein lysat, eller (2) fiksering og farging for konfokalmikroskopi mikroskopi. Viktigere, tilnærmingen beskrevet for innfesting og farging prostata organoids er betydelig forbedret i forhold til eksisterende metoder. Selv om disse er avhengige av snitting organoids15, utnytter metoden som er beskrevet i dette manuskriptet intakt organoids, som bidrar til å beskytte mot organoid Kader under prøve forberedelser. Når den brukes i kombinasjon, kan Western Blot og konfokalmikroskopi mikroskopi gi verdifull innsikt i den molekylære regulatorer av differensiering. Alternativt kan disse tilnærmingene brukes til å modellere andre prosesser som utvikling og transformasjon.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her har blitt godkjent av den institusjonelle Review styret ved University of California, Los Angeles.
Merk: En skjematisk fremstilling av tilnærmingsmåtene som er beskrevet i papiret er gitt i figur 1.
1. isolere mus basal og Luminal prostata epitelceller ved hjelp av fluorescens-aktivert Cell sortering (FACS)-TIMING: 30 min
Merk: Utfør trinn 1,3-1.5 i mørket.
- Etter dissociating celler fra total mus prostata som beskrevet i Lawson et al.16, overføre CELLENE til FACS rør og resuspend 0,1-5 x 106 celler i 100 μL av dissosiasjon Media (tabell 1).
- Legg til riktig volum av følgende direkte bøyd primære antistoffer: CD45, CD31, ter-119, EpCAM og CD49f.
- Ruge på is, beskyttet mot lys, i 20 min.
Merk: Det anbefales å utnytte 10% av den totale dissosiert celler for unstained og Single-farget kontroller. Disse kontrollene er nødvendig for å stille inn riktig kompensasjon og spenning for sortering. - Slukke antistoff cocktail ved å tilsette 1 mL dissosiasjon Media til hver prøve. Pellet cellene ved sentrifugering ved 800 x g i 5 min ved romtemperatur (RT) og fjern supernatanten ved aspirating.
- Resuspend cellene i passende volum (250 μL per 1 x 106 celler) av dissosiasjon medium inneholdende 1 μg/ml 4 ', 6-diamidino-2-PHENYLINDOLE (DAPI). Gå videre til FACS. Flow flowcytometri tomter demonstrere isolering av mus basal og luminal prostata epitelceller er illustrert i figur 2.
2. plating sortert prostata epitelceller i primær mus Organoid kultur-TIMING: 2-3 H (unntatt Poly-HEMA-belagt plate forberedelse)
Merk: Platene er belagt med Poly-HEMA for å hindre 2D koloni formasjon på overflaten av brønnen under matrisen gel. Forbered Poly-HEMA-belagt plater 1 dag før plating sortert basal eller luminal prostata epitelceller til mus organoid kultur. Tine 1 mL alikvoter av redusert vekstfaktor matrise gel, heretter referert til som matrise gel, på is 2 h før trinn 2,1. Y-27632 (ROCK-inhibitor) bør legges til mus organoid medier umiddelbart før trinn 2,1. Utfør trinn 2.1-2.8 på isen.
- Pellet cellene i 5 mL rund bunn rør ved sentrifugering ved 800 x g i 5 min ved 4 ° c og aspirer supernatanten.
- Vask celle pellet i 500 μL av mus organoid Media (tabell 2)14.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 800 x g i 5 min ved 4 ° c og aspirer supernatanten.
- Resuspend i mus organoid medier ved en celle tetthet på 1 000 celler/μL.
- For å forberede Master mikser, bland epitelceller suspendert i mus organoid Media med matrise gel å generere en endelig blanding som inneholder 25% celler/Media og 75% matrise gel. Basal celler er vanligvis belagt ved en konsentrasjon på 100-2000 celler/80 μL, mens luminal celler er vanligvis belagt med en konsentrasjon på 2000-10000 celler/80 μL. Tettheten av celler belagt varierer avhengig av dagen i forventet materiale samling, og ønsket nedstrøms søknad.
Merk: Chill riktig størrelse rør (er) for forventet Master Mix volum 5 min før Master Mix forberedelse. For å sikre at Matrix gel ikke stivne under håndtering, er det avgjørende å chill pipette spissen ved pipettering matrisen gel 3-4 ganger før du overfører den til en ny tube. - Tilsett 80 μL av matrisen gel/celle blanding per brønn av en 24-brønn plate. Pipettering en dråpe på den nedre halvdelen av veggen av brønnen, mens du unngår direkte kontakt med Poly-HEMA belegg er anbefalt. Etter å legge til matrisen gel, virvel platen slik at matrisen gel/celle blandingen å danne en ring rundt kanten av brønnen.
- Plasser 24-brønn plate i en 37 ° c 5% CO2 inkubator høyre side opp i 10 min slik at matrisen gel å delvis stivne.
Merk: Begynn oppvarmingen mus organoid Media ved 37 ° c umiddelbart etter å plassere 24-brønn plate i inkubator. - Etter incubating i 10 min, flip 24-brønn plate opp-ned og ruge for ytterligere 50 min slik at matrisen gel til helt stivne.
- Tilsett 350 μL av pre-varmet mus organoid Media dråpevis til sentrum av hver brønn.
Merk: For å opprettholde integriteten til matrisen gel, er det avgjørende å unngå Matrix gel ringen mens du legger til Media. - Etter å ha lagt til Media, returnere 24-brønn plate til 37 ° c 5% CO2 inkubator.
3. supplerende Mouse Organoid Media-TIMING: 10-15 min per 24-brønn plate
Merk: Eksisterende medier bør erstattes med ferske medier hver 48 h. Før hver Media endring, pre-varm mus organoid Media. Det er ikke nødvendig å legge ROCK inhibitor til mediene som brukes for påfyll.
- Vipp 24-brønn plate ved en 45 ° vinkel og fjern forsiktig eksisterende medier fra midten av hver brønn ved hjelp av en P1000 pipette, samtidig som du unngår matrisen gel ringen.
- Tilsett 350 μL av pre-varmet mus organoid medier som i trinn 2,9. Det anbefales å legge til et større volum av medier (opp til 1 mL) for å organoids kultivert i mer enn 5 dager for å hindre rask nedbryting av viktige næringsstoffer og vekstfaktorer.
4. utdrager protein Lysat fra prostata Organoids for Western Blot analyse-TIMING: 2.5-4 H
Merk: Før innsamling organoids for protein lysat ekstraksjon, forberede og pre-varm dispase som inneholder medier (tabell 1).
- Fjern mediene fra hver brønn som i trinn 3,1.
- Å samle organoids, gjentatte ganger blast matrisen gel ved pipettering 1 mL av dispase medier direkte på matrisen gel ringen til hele ringen er forskyves, og overføre til en 1,5 mL mikrosentrifugen tube.
Merk: Det er viktig å unngå direkte kontakt med Poly-HEMA-belagte brønner. Direkte kontakt kan forårsake forurensning av det innsamlede materialet med Poly-HEMA, som kan ha negativ innvirkning på celle overlevelse. - Plasser 1,5 mL mikrosentrifugen røret (e) i en 37 ° c 5%2 inkubator i 30 min til 1 time for å muliggjøre fullstendig fordøyelse av Matrix gel ved å dispase.
- Pellet organoids av sentrifugering på 800 x g for 5 min på RT og fjern supernatanten ved hjelp av en micropipette.
- Legg fosfat-bufret saltvann (PBS) til organoid pellet og resuspend ved å sveipe forsiktig.
Merk: Hvis ikke tilstrekkelig resuspend organoid pellet kan føre til forurensning av organoid materiale med rester dispase eller matrise gel. - Pellet det organoids av sentrifugering for 800 x g for 5 min for RT og fjerne det supernatanten benytter en micropipette.
- Fast fryse organoid pellets ved å plassere hvert rør inn i en løsning som inneholder tørr is og metanol. Oppbevar slangen (e) til fremtidig bruk ved-80 ° c. Alternativt, ekstrakt protein lysat umiddelbart etter trinn 4,6.
- Resuspend organoid pellets i 100 μL av protein lyseringsbuffer (tabell 1) per 10 μL av pakket celle volum. Sveip til resuspend.
Merk: Hvis du gjenopptar etter hurtig frysing, må du sørge for at protein lyseringsbufferen er tint før du fjerner prøver fra-80 ° c, da lyseringsbuffer skal legges til prøvene umiddelbart for å forhindre fosfatase og protease aktivitet. - Ruge prøvene i protein lyseringsbuffer på isen i minst 45 min.
Merk: Det anbefales å sonikere før inkubasjons på isen for å øke effektiviteten av kjernefysisk protein utvinning; Imidlertid er sonikering ikke nødvendig. Hvis sonikering ikke utføres, går du videre til trinn 4,10.- For å sonikere, Senk rørene i vått is og påfør forsiktig tuppen av den soniske dismembrator på utsiden av mikrosentrifugen røret. Sonikere for 40 s ved 20 kHz.
- Fortsett til Western Blot følgende etablerte protokoller.
5. festing og farging prostata Organoids for Immunhistokjemiske analyse av Whole-Mount Konfokalmikroskopi mikroskopi
-
Innhenting prostata organoids fra 24-brønn plater-timing: 45-60 min
Merk: Når du samler prostata organoids å behandle for konfokalmikroskopi mikroskopi, er det avgjørende å håndtere dem med forsiktighet for å opprettholde sin struktur. Samlingen protokollen nedenfor er utformet for å redusere avbrudd av organoid struktur under isolasjon.- Fjern mediene fra hver brønn som i trinn 3,1.
- Fordøye matrisen gel ved incubating med 500 μL av dispase medier (tabell 1) i 30 minutter i en 37 ° c 5% co2 inkubator.
- Samle fordøyd organoid suspensjon i en mikrosentrifugen tube og pellet den organoids av sentrifugering på 800 x g for 3 min på RT. Fjern supernatanten.
-
Hel-Mount immunofluorescent farging av prostata organoids-TIMING: 3-4 dager (1-5 h/dag)
- Tilsett 500 μL av 4% paraformaldehyde i PBS og ruge for 2 timer ved RT med skånsom risting.
- Pellet organoids ved sentrifugering ved 800 x g for 3 min på RT, Fjern supernatanten, og vask pellet med 1 ml PBS i 15 minutter med skånsom risting.
- Vask pellets som i trinn 5.2.2 for ytterligere to ganger.
- Pellet det organoids av sentrifugering for 800 x g for 3 min for RT og fjerne det supernatanten. Tilsett 1 μg/mL DAPI i blokkerings løsningen (tabell 1). Ruge for 2 timer ved RT eller alternativt over natten ved 4 ° c med lett risting.
- Pellet det organoids av sentrifugering for 800 x g for 3 min for RT og fjerne det supernatanten. Legg primære antistoff (kanin anti-p63, mus anti-cytokeratin 8) i blokkerende løsning og ruge over natten ved 4 ° c med forsiktig risting.
- Pellet det organoids av sentrifugering for 800 x g for 3 min for RT og fjerne det supernatanten. Vask pellet med 1 mL PBS i 15 minutter med skånsom risting.
- Vask pellets som i trinn 5.2.6 for ytterligere to ganger.
- Pellet det organoids av sentrifugering for 800 x g for 3 min for RT og fjerne det supernatanten. Legg sekundære antistoff (geit anti-kanin IgG-Alexa fluor 594, geit anti-mus IgG-Alexa fluor 488) i blokkering løsning og ruge over natten ved 4 ° c med mild risting.
- Pellet organoids ved sentrifugering ved 800 x g for 3 min på RT, Fjern supernatanten, og vask pellet med 1 ml PBS i 15 minutter med skånsom risting.
- Vask pellets som i trinn 5.2.9 for ytterligere to ganger.
6. vev clearing og montering av farget prostata Organoids for Whole-Mount Konfokalmikroskopi mikroskopi-TIMING: 7 H
- Pellet det organoids av sentrifugering for 800 x g for 3 min for RT og fjerne det supernatanten.
- Tilsett 1 mL 30% sukrose i PBS med 1% Triton X-100 og ruge for 2 timer ved RT med mild risting.
- Pellet det organoids av sentrifugering for 800 x g for 3 min for RT og fjerne det supernatanten.
- Tilsett 1 mL 45% sukrose i PBS med 1% Triton X-100 og ruge for 2 timer ved RT med mild risting.
- Pellet det organoids av sentrifugering for 800 x g for 3 min for RT og fjerne det supernatanten.
- Tilsett 1 mL 60% sukrose i PBS med 1% Triton X-100 og ruge for 2 timer ved RT med mild risting.
- Pellet det organoids av sentrifugering for 800 x g for 3 min for RT og fjerne 95% av supernatanten.
Merk: Pellet blir løsere som konsentrasjonen av sukrose blir høyere. Observere DAPI-beiset organoids under UV-lys for å bekrefte at de ikke var tapt under fjerning av supernatanten anbefales. - Overfør en 10-20 μL dråpe av gjenværende fjæring til en kamret dekkglass og Fortsett til konfokalmikroskopi mikroskopi.
Merk: Dekkglass fragmenter kan plasseres på hver side av dråpe som skal brukes som avstandsstykker (figur 4c). Disse hindrer organoids i å kollapse når en dekkglass er plassert over dråpe.
Representative Results
Prostata epitelceller er belagt i mus organoid kultur hvor de danner organoids, som høstes før forberedelse til nedstrøms analyse (figur 1).
Basal og luminal epitelceller er isolert ved hjelp av FACS. Etter eksklusive DAPI+ celler og tappe Lin+ celler (CD45, CD31, Ter119), basal og luminal celler skilles basert på differensial uttrykk for EpCAM og CD49f (figur 2). Tilnærmingen beskrevet til plate prostata basal og luminal celler i organoid kultur innebærer: (1) plating celler i matrise gel ringer, og (2) belegg brønner med Poly-HEMA. Plating i ringer har tidligere vært beskrevet i Agarwal et al9. Bruk av denne tilnærmingen (Figur 3A) lar forskere lettere unngå Matrix gel mens påfyll av Media (trinn 3), og lettere telle organoids ved å følge omkretsen av brønnen. Coating brønner med Poly-HEMA har vist å hindre 2D koloni formasjon i retinal organoids17; imidlertid har denne tilnærmingen ikke blitt utnyttet i prostata organoid modellen. Viktigere, eliminerer belegg brønner med Poly-HEMA (tabell 3) forekomsten av 2D kolonier uten å forstyrre organoid formasjon (Figur 3B). Disse endringene utvide egenskapene til prostata organoid analysen.
Basal og luminal celler danner organoids med distinkte morfologier (Figur 4A). Mens de fleste basal-avledet organoids er like i størrelse (100-300 μm diameter) etter 7 dager i kultur, luminal-avledet organoids utstillingen betydelig heterogenitet (30-450 μm diameter). Videre mest basal-avledet organoids inneholder lumen omgitt av flerlags epitel (Figur 4a, Top), mens luminal-avledet organoids rekkevidde i morfologi fra hul, med enkelt lags epitel til fast, med flerlags snorer av celler som ikke canalizar (Figur 4a, Bottom). Fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor for å forberede organoids for nedstrøms analyse (trinn 4, 5), ble brukt til å undersøke om disse fenotypiske forskjellene reflekterer forskjellene i slekts markerings uttrykk. Western Blot analyse avdekket at basal og luminal-avledet organoids beholde funksjoner knyttet basal og luminal primære celler. Basal-avledet organoids uttrykker høyere nivåer av basal markøren cytokeratin 5 (K5), mens luminal organoids uttrykker høyere nivåer av luminal merket cytokeratin 8 (K8) (Figur 4B). Både basal og luminal markører ble påvist i basal og luminal-avledet organoids i bulk befolkningen, kanskje antyder differensiering (Figur 4B).
Vi søkte å karakterisere avstamning markør uttrykk i basal-avledet organoids og avgjøre om morfologisk distinkte luminal organoids viser forskjeller i markør uttrykket ved farging intakt organoids og utføre konfokalmikroskopi mikroskopi (Figur 4D). Basal-avledet organoids inneholdt flerlags epitel med ytre lag uttrykker høye nivåer av basal markør p63 og moderate nivåer av luminal markør K8 (p63Hi, K8midten), og indre lag uten synlige nivåer av p63 og høye nivåer av K8 (p63lo, K8Hi) (Figur 4D, topp). Mens alle celler i single-lags luminal-avledet organoids farget positivt for K8, bare velge celler inneholdt kjernefysiske p63 (Figur 4D, Bottom). Disse dataene validerer tilnærminger for å høste og forberede organoids for analyse av Western Blot eller konfokalmikroskopi mikroskopi og dermed utvide evnen til organoid analysen for å studere viktige cellulære prosesser, inkludert differensiering.
Figur 1: skjematisk illustrerer arbeidsflyt for å generere prostata organoids for innsamling og analyse. Total Mouse prostata er dissosiert og basal og luminal prostata epitelceller er isolert av fluorescens-aktivert celle sortering via etablerte protokoller18,19. Basal eller luminal celler suspendert i en blanding av mus organoid Media og matrise gel er belagt i matrise gel ringer. Etter 5 til 7 dager med kultur, organoids høstes for analyse av Western Blot eller konfokalmikroskopi mikroskopi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: isolering av mus basal og luminal prostata epitelceller ved hjelp av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). Dissosiert celler fra mus prostata er farget med DAPI, for å skille Live fra døde celler, og overflate antistoffer, å skille basal fra luminal celler, før FACS. Venstre = inngjerdet på DAPI-celler. FSC-A = Forward-Scatter. Center = gated på Lin- celler (CD45lo, CD31lo, Ter119lo). SSC-A = side-Scatter. Høyre = basal celler (BAS) (EpCAMHi, CD49fHi), Luminal celler (Lum) (EpCAMHi, CD49fMid). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: etablering av mus prostata organoids. (A) skjematisk illustrerer tilnærming til å generere en matrise gel ring i en brønn av en 24-brønn plate. (B) representative fase kontrast bilder av Organoids (3D vekst plan) og to-dimensjonale kolonier (2D vekst plan) dannet 7 dager etter plating prostata epitelceller i un-belagt (Poly-HEMA (-)), eller belagt (Poly-HEMA (+)) 24-brønn plater. Innrammet områder innenfor 2D vekst plan er forstørret til høyre. Skala bars = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: analyse av avstamning markør uttrykk i prostata organoids av Western Blot og hel-Mount konfokalmikroskopi mikroskopi. (A) representative fase kontrast bilder av basal-avledet (øverst), og luminal-avledet (nederst) organoids etter 7 dager med kultur. Scale bar = 100 μm. (B) Western Blot analyse av basal-avledet (BAS) og luminal-avledet (Lum) organoids etter 5 dager med kultur. Farging for basal markør, cytokeratin 5 (K5), og luminal markør, cytokeratin 8 (K8), og en laste kontroll, histone H3 (HH3). (C) skjematisk illustrerer kamret dekkglass med avstandsstykker. (D) representative differensial forstyrrelser kontrast (dic) og immunofluorescent bilder av basal-avledet (øverst) og luminal-avledet (nederst) organoids etter 7 dager med kultur. Farging for p63 (rød), K8 (grønn) og DAPI (blå) individuelt og fusjonert. Skala bars = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Oppskrifter | |
| Dispase medier | 1 mg/mL dispase + 10 μM ROCK-inhibitor i avansert DMEM F12. Filteret steriliseres med 0,22 μm-filter. |
| Dissosiasjon medier | 10% FBS + 1x penicillin-Streptomycin i RPMI 1640. Filteret steriliseres med 0,22 μm-filter. |
| Protein lyseringsbuffer | RIPA buffer + fosfatase hemmere + protease hemmere |
| Blokkering løsning | 10% FBS i PBS med 0,2% Triton X-100 |
Tabell 1: instruksjoner for utarbeidelse av nøkkel løsninger.
| Komponent | Konsentrasjon |
| B-27. | 1x (fortynne fra 50x konsentrat) |
| GlutaMAX | 1x (fortynnet fra 100 x konsentrat) |
| N-acetyl-L-cystein | 1,25 mM |
| Normocin | 50 μg/mL |
| Rekombinant Human EGF, Animal-fri | 50 ng/mL |
| Rekombinant Human noggin | 100 ng/mL |
| R-spondin medier med ett medium | 10% conditioned Media |
| A83-01 | 200 nM |
| Dht | 1 nM og |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK-hemmer) | 10 μM |
| Avansert DMEM/F-12 | Grunnleggende medier |
| R-spondin medier med 1 conditioned genereres som beskrevet i Drost, et al.13. Etter tilsetning av alle komponenter, filter sterilisere mus organoid medier ved hjelp 0,22 μm filter. ROCK inhibitor er bare lagt under etablering av kultur og passaging av organoids. | |
Tabell 2: instruksjoner for utarbeidelse av mus organoid medier.
| Protokoll for fremstilling av Poly-HEMA-belagte plater | |
| 1 | Tilsett 0,25 g Poly-HEMA til 50 mL 98% EtOH. Løs opp Poly-HEMA ved 37 ° c på en shaker. Denne prosessen tar minst 4 timer. |
| 2 | Filter sterilisere Poly-HEMA ved hjelp av 0,22 μm filter. |
| 3 | Tilsett 200 μL av Poly-HEMA oppløsning per brønn av en 24-brønn plate (er). |
| 4 | Fjern lokk (er) fra 24-brønn plate (er) etter å ha lagt Poly-HEMA og la løsningen fordampe over natten. |
| 5 | Vask hver brønn to ganger med PBS og sørg for at brønnene er helt tørre før oppbevaring etter siste vask. Merk: forstyrre Poly-HEMA belegg under vasking kan bidra til 2-dimensjonal vekst ved plating epitelceller i organoid kultur. For å unngå skader på Poly-HEMA-belagte brønner må det unngås direkte kontakt med pipette spissen mens du vasker. Integriteten av Poly-HEMA-belagte brønner vil forbli intakt med mindre Poly-HEMA er skrapet av av pipette spissen. |
| 6 | Poly-HEMA-belagte plater kan oppbevares ved 4 ° c i opptil to uker. Merk: innpaknings plater i parafilm før lagring vil redusere risikoen for forurensning. |
Tabell 3: protokoll for utarbeidelse av Poly-HEMA-belagte plater.
Discussion
Prostata epitel celle differensiering har vært innblandet i både normal prostata biologi2,3,4,5,6,7 og sykdom biologi8,10,11,12; imidlertid forblir Master regulatorer i denne prosessen udefinert. Identifisere sentrale regulatorer av prostata epitel celle differensiering har vært vanskelig delvis på grunn av fravær av veletablerte kontekster å modellere den. Mens 2D monolag kultur kan brukes til å modellere differensiering11,12, denne konteksten unnlater å recapitulate den komplekse prostata mikromiljøet. Videre, in vivo sammenhenger til modellen differensiering ikke egner seg til mekanistisk studier, som de er utfordrende å manipulere. Derfor er identifisering av en lett å manipulere, men fysiologisk-relevant sammenheng, for å studere differensiering kritisk.
Prostata organoid modell representerer en elegant ex vivo kontekst hvor basal å luminal differensiering rapporteres å forekomme. Metoder for å etablere prostata organoids er godt etablert14; Imidlertid er ytterligere optimalisering av disse metodene nødvendig. Videre tilnærminger for å høste og forberede prostata organoids for analyse er ikke klart beskrevet. Dette papiret beskriver en tilnærming til plate prostata epitelceller isolert fra mus prostata i organoid kultur. Denne tilnærmingen gjør forskerne til (1) hindre forekomsten av 2D kolonier under organoid formasjon, (2) redusere risikoen for avbrudd til matrisen gel under Media etterfylling, og (3) telle organoids mer effektivt. I tillegg skisserer dette manuskriptet tilnærminger for å høste organoids for forberedelse til Western Blot analyse, eller hel-Mount konfokalmikroskopi mikroskopi. Viktigere tilnærmingen benyttet for å forberede organoids for konfokalmikroskopi mikroskopi opprettholder intakt struktur av organoids gjennom sin varighet, noe som reduserer organoid Kader før bildet oppkjøpet. Alt i alt, tilnærminger beskrevet utvide egenskapene til prostata organoid analysen.
Spesielt kan organoid-forming kapasitet av basal og luminal celler endres både ved metoder som brukes til å isolere de respektive populasjoner, og av kultur forhold. De organoid kultur forholdene som ble brukt i denne analysen ble først beskrevet av Karthaus et al.13. Mens Karthaus et al. har rapportert at basal celler har en høyere organoid forming kapasitet (15%) enn luminal celler (1%)13, Chua et al., ved hjelp av distinkte isolasjons metoder og kultur forhold, har rapportert at luminal celler (0,2-0,3%) har en høyere organoid kapasitet enn basal celler (0,03%)20. Overall, metoder beskrevet av Karthaus et al. føre til høyere organoid-forming priser for både basal og luminal celler, sannsynligvis reflekterer forskjellene i tilnærmingen brukes til å isolere basal og luminal celler13, i motsetning til kultur forhold som bias mot organoid formasjon fra luminal celler. Det er fortsatt uklart om protokollen som er beskrevet i dette manuskriptet favoriserer luminal organoid formasjon fra Multipotent luminal forfedre, eller begått-luminal forfedre9. Selv om rettidig og kostnads uoverkommelige, in vivo avstamning tracing studier kan brukes til å validere stamfar funksjoner forbundet med distinkte prostata epitel linjene belyst i organoid analysen.
Prosesser som utvikling, differensiering og transformasjon er ikke bare relevant for prostata biologi, men også relevant for biologi av andre vev, inkludert hjernen, lunge, tarm, bukspyttkjertel og lever. Metodene beskrevet tilrettelegge for utnyttelse av organoid modellen til å studere disse prosessene i ikke bare prostata, men også et bredt spekter av vev.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
PDC og JMG støttes av Ruth L. Kirschstein National Research Service Award GM007185. JAD er støttet av National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health (R25GM055052) tildelt T. Hasson og Saul Martinez Scholarship. ASG er støttet av Spitzer Family Foundation Fund og Gill legat. Dette arbeidet ble støttet av American Cancer Society (RSG-17-068-01-TBG), Department of Defense (W81XWH-13-1-0470), Margaret E. Early medisinsk forskning Trust, NIH/NCI (P50CA092131/UCLA SPORE i prostatakreft), Rose Hills Foundation, og støtte fra UCLA ' s Jonsson Comprehensive Cancer Center, Broad Stem Cell Research Center, klinisk og translational Science Institute, og Institutt for Urologiske onkologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Dish 35 mm, high | ibidi | 81156 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 μg | BioLegend | 118218 | |
| B-27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11836145001 | |
| (DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one) | Sigma | A-8380 | |
| Dispase II, Powder | Thermo Fisher Scientific | 17-105-041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F8667 | |
| FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) | BioLegend | 102405 | |
| FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) | BioLegend | 103107 | |
| FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) | BioLegend | 116205 | |
| Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | |
| Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Halt Phosphatase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78428 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230C | |
| Mouse anti-cytokeratin 8 | BioLegend | 904804 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | |
| Normocin | Thermo Fisher Scientific | ant-nr-1 | |
| PE anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313612 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) | Sigma | P3932-25G | |
| Rabbit anti-p63 | BioLegend | 619002 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | PI89901 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10) | Thermo Fisher Scientific | 22400105 | |
| Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific | FB120 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-5ML | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Selleck Chemical | S1049-50MG |
References
- Kwon, O. J., Xin, L. Prostate epithelial stem and progenitor cells. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 2 (3), 209-218 (2014).
- Choi, N., Zhang, B., Zhang, L., Ittmann, M., Xin, L. Adult Murine Prostate Basal and Luminal Cells Are Self-Sustained Lineages that Can Both Serve as Targets for Prostate Cancer Initiation. Cancer Cell. 21 (2), 253-265 (2012).
- Ousset, M., Van Keymeulen, A., et al. Multipotent and unipotent progenitors contribute to prostate postnatal development. Nature Cell Biology. 14 (11), 1131-1138 (2012).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 1-13 (2014).
- Wang, Z. A., Mitrofanova, A., et al. Lineage analysis of basal epithelial cells reveals their unexpected plasticity and supports a cell-of-origin model for prostate cancer heterogeneity. Nature Cell Biology. 15 (3), 274-283 (2013).
- Kwon, O. J., Zhang, B., Zhang, L., Xin, L. High fat diet promotes prostatic basal-to-luminal differentiation and accelerates initiation of prostate epithelial hyperplasia originated from basal cells. Stem Cell Research. 16 (3), 682-691 (2016).
- Kwon, O. J., Zhang, L., Ittmann, M. M., Xin, L. Prostatic inflammation enhances basal-to-luminal differentiation and accelerates initiation of prostate cancer with a basal cell origin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 192 (3), 997-999 (2014).
- Stoyanova, T., et al. Prostate cancer originating in basal cells progresses to adenocarcinoma propagated by luminal-like cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (50), 20111-20116 (2013).
- Agarwal, S., Hynes, P. G., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
- Bishop, J. L., et al. The Master Neural Transcription Factor BRN2 Is an Androgen Receptor-Suppressed Driver of Neuroendocrine Differentiation in Prostate Cancer. Cancer Discovery. 7 (1), 54-71 (2016).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Drost, J., Karthaus, W. R., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), e59051 (2019).
- Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 181-186 (2007).
- Chen, H. Y., Kaya, K. D., Dong, L., Swaroop, A. Three-dimensional retinal organoids from mouse pluripotent stem cells mimic in vivo development with enhanced stratification and rod photoreceptor differentiation. Molecular vision. 22, 1077-1094 (2016).
- Liu, X., et al. Low CD38 Identifies Progenitor-like Inflammation-Associated Luminal Cells that Can Initiate Human Prostate Cancer and Predict Poor Outcome. Cell Reports. 17 (10), 2596-2606 (2016).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
- Chua, C. W., Shibata, M., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
