Summary
Mus prostata organoider utgör en lovande kontext för att utvärdera mekanismer som reglerar differentiering. Denna uppsats beskriver en förbättrad metod för att etablera prostata organoider, och introducerar metoder för att (1) samla in proteinlysat från organoider, och (2) Fix och fläcken organoider för hela konfokalmikroskopi.
Abstract
Prostatepitelet består huvudsakligen av basal och luminala celler. In vivo härstamnings spårning har utnyttjats för att definiera differentierings kapaciteten hos mus prostatas basal-och luminala celler under utveckling, vävnadsregenerering och Transformation. Men att utvärdera cell-inneboende och extrinsic regulatorer av prostata epitelial differentiering kapacitet med hjälp av en linje spårning strategi kräver ofta omfattande avel och kan vara kostnads-oöverkomliga. I prostatan Organoid assay, basal och luminala celler generera benign epitel ex vivo. Viktigare, primära epitelceller kan isoleras från möss av någon genetisk bakgrund eller möss som behandlats med valfritt antal små molekyler före, eller efter, plätering i tredimensionell (3D) kultur. Tillräckligt material för utvärdering av differentierings kapacitet genereras efter 7-10 dagar. Insamling av basal-härledda och Luminal-härledda organoider för (1) proteinanalys av Western blot och (2) immunohistokemisk analys av intakta organoider med hela konfokalmikroskopi gör det möjligt för forskare att utvärdera ex vivo-differentieringen kapacitet prostata epitelceller. När de används i kombination, ger dessa två metoder kompletterande information om differentierings kapaciteten hos prostatas basal-och luminala celler som svar på genetisk eller farmakologisk manipulation.
Introduction
Basal och luminala celler utgör majoriteten av prostatan epitel1. Härstamning studier har visat att dessa celltyper är övervägande självförsörjande av distinkta stamceller i vuxen mus2; emellertid, luminala differentiering från basal stamceller har observerats i flera sammanhang inklusive utveckling3,4, vävnadsregenerering5, inflammation6,7 och prostatacancer initiering2,8. Vidare stöder framväxande data förekomsten av multipotenta luminala progenitorer samt luminala-engagerade progenitorer9. Vid metastaserande prostatacancer, differentiering från en AR-beroende luminala härstamning till en AR-likgiltig härstamning med basal och neuroendokrina funktioner representerar en alltmer uppskattad mekanism för resistens mot androgen väg hämmare10,11,12. Därför, som differentiering är inblandad i normal fysiologi, cancer initiering och motståndskraft mot terapi, belysa viktiga molekylära regulatorer av prostata epitelial celldifferentiering är kritisk.
Musen prostata Organoid modell har uppstått som en elegant ex vivo sammanhang att studera prostata epitelial celldifferentiering9,13,14. I denna analys, enskilda epitelceller är pläterade i en 3D-matris där de genererar körtelstrukturer som innehåller både basal och luminala celler inom 1 vecka. Även befintliga metoder för plating celler i Organoid kultur kan användas för att effektivt generera organoider, dessa metoder kräver ytterligare optimering14. Anmärkningsvärda utmaningar i samband med odling av prostata organoider inkluderar (1) exklusive tvådimensionella (2D) kolonier som bildas under matrixen (Matrix gel) från analys, (2) bibehålla integriteten av Matrix gel under Media förändringar, och (3) räkna organoider korrekt. Detta papper beskriver en metod för att generera organoider från epitelceller isolerade från mus prostata. Den beskrivna metoden innebär beläggning plattor med poly (2-hydroxyethyl metakrylat) (poly-HEMA) för att förhindra uppkomsten av 2D-kolonier. Dessutom är celler pläterade i en matris gel ring, snarare än en matris gel skiva, vilket gör att ändra media och räkna organoider mindre utmanande. Dessa tekniker gör det möjligt för forskare att lättare undersöka hur genetiska förändringar eller små molekyler som introduceras före, eller under, Organoid formation förändrar viktiga processer som differentiering.
Skörd av prostata organoider för Western blot eller immunohistokemisk analys av hela Mount konfokalmikroskopi kan ge värdefull mekanistisk insikt i differentiering13, men väl etablerade protokoll för att förbereda organoider för sådana tekniker saknas. Detta manuskript beskriver metoder för att skörda organoider för (1) insamling av proteinlysat, eller (2) fixering och färgning för konfokalmikroskopi. Viktigt, den metod som beskrivs för fixering och färgning av prostata organoider är betydligt bättre i förhållande till befintliga metoder. Medan dessa förlitar sig på sektionering organoider15, den metod som beskrivs i detta manuskript använder intakt organoider, som hjälper till att skydda mot Organoid skador under provberedning. När den används i kombination, Western blot och konfokal mikroskopi kan ge värdefull insikt i molekylära regulatorer av differentiering. Alternativt kan dessa metoder användas för att modellera andra processer, till exempel utveckling och omvandling.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella Granskningsnämnden vid University of California, Los Angeles.
Anmärkning: En Schematisk illustration av de metoder som beskrivs i papperet finns i figur 1.
1. isolera mus basal och Luminal prostata epitelceller med Fluorescensaktiverad cell sortering (FACS)-TIMING: 30 min
Anmärkning: Utför steg 1.3-1.5 i mörkret.
- Efter separerande celler från total mus prostata som beskrivs i Lawson et al.16, överföra cellerna till FACS rör och Omsuspendera 0,1-5 x 106 celler i 100 μl dissociation media (tabell 1).
- Tillsätt lämplig volym av följande direkt konjugerade primära antikroppar: CD45, CD31, ter-119, EpCAM och CD49f.
- Inkubera på isen, skyddad från ljus, i 20 min.
Anmärkning: Det rekommenderas att använda 10% av den totala separerade celler för obefläckade och enfärgade kontroller. Dessa kontroller är nödvändiga för att ställa in rätt kompensation och spänning för sortering. - Quench antikropp cocktail genom att tillsätta 1 mL dissociation media till varje prov. Pelleten cellerna genom centrifugering vid 800 x g i 5 min vid rumstemperatur (RT) och ta bort supernatanten genom aspirerande.
- Omsuspendera cellerna i lämplig volym (250 μL per 1 x 106 celler) dissociationsmedia innehållande 1 μg/ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Fortsätt till FACS. Flödescytometri tomter som visar isolering av mus basal och luminala prostata epitelceller illustreras i figur 2.
2. plätering sorteras prostata epitelceller i primär mus Organoid kultur-TIMING: 2-3 H (exklusive Poly-HEMA-belagd platta beredning)
Anmärkning: Plattorna är belagda med poly-HEMA för att förhindra 2D kolonibildning på ytan av brunnen under Matrix gel. Förbered Poly-HEMA-belagda plattor 1 dag före plätering sorteras basal eller luminala prostata epitelceller i mus Organoid kultur. Thaw 1 mL alikvoter av reducerad tillväxtfaktor Matrix gel, hädanefter kallad Matrix gel, på is 2 h före steg 2,1. Y-27632 (ROCK inhibitor) bör läggas till mus Organoid Media omedelbart före steg 2,1. Utför steg 2.1-2.8 på is.
- Pelleten cellerna i 5 mL rund-botten rören genom centrifugering vid 800 x g i 5 min vid 4 ° c och Aspirera supernatanten.
- Tvätta cellpelleten i 500 μL av mus Organoid media (tabell 2)14.
- Pelleten cellerna genom centrifugering vid 800 x g i 5 min vid 4 ° c och aspirera på supernatanten.
- Omsuspendera i mus Organoid media vid en celltäthet av 1 000 celler/μL.
- För att förbereda Master mixar, blanda epitelceller suspenderade i mus Organoid media med Matrix gel för att generera en slutlig blandning som innehåller 25% celler/media och 75% Matrix gel. Basala celler är typiskt pläterade vid en koncentration av 100-2000 celler/80 μL, medan luminala celler typiskt är klädd i en koncentration av 2000-10000 celler/80 μL. Tätheten av celler pläterade varierar beroende på dagen för förväntad materialinsamling, och önskad nedströms ansökan.
Anmärkning: Chill lämplig storlek Tube (s) för förväntad Master Mix volym 5 min före Master Mix beredning. För att säkerställa att Matrix gel inte hårdnar vid hantering är det viktigt att kyla pipettspetsen genom att Pipettera Matrix-gelen 3-4 gånger innan den överförs till ett nytt rör. - Tillsätt 80 μL av matrisen gel/cell blandning per brunn av en 24-brunn tallrik. Pipettera en droppe på den nedre halvan av väggen i brunnen, samtidigt som man undviker direkt kontakt med poly-HEMA beläggning rekommenderas. Efter tillsats av Matrix gel, snurra plattan så att Matrix gel/cell blandningen att bilda en ring runt kanten av brunnen.
- Placera 24-brunnen plattan i en 37 ° c 5% CO2 inkubator höger sida upp för 10 min för att tillåta Matrix gel att delvis stelna.
Anmärkning: Börja uppvärmningen mus Organoid media vid 37 ° c omedelbart efter att placera 24-brunnen plattan i inkubatorn. - Efter Inkubera i 10 min, vänd den 24-väl plattan upp och ner och inkubera för ytterligare 50 min så att Matrix gel att helt härda.
- Tillsätt 350 μl av pre-warmed mus Organoid Media droppvis till mitten av varje brunn.
Anmärkning: För att bibehålla matrixgelens integritet är det viktigt att undvika Matrix gel ring när du lägger till media. - Efter tillsats av media, returnera 24-brunnen plattan till 37 ° c 5% CO2 inkubator.
3. påfyllning mus Organoid Media-TIMING: 10-15 min per 24-brunn tallrik
Anmärkning: Befintliga medier bör ersättas med färska medier varje 48 h. Före varje media förändring, pre-Warm mus Organoid media. Det är inte nödvändigt att lägga till ROCK inhibitor till media som används för påfyllning.
- Luta 24-brunnen plattan i en 45 ° vinkel och försiktigt bort befintliga medier från mitten av varje brunn med hjälp av en P1000 pipett, samtidigt som man undviker Matrix gel ringen.
- Tillsätt 350 μL förvärmda mus Organoid media som i steg 2,9. Det rekommenderas att lägga till en större volym av media (upp till 1 mL) till organoider odlade längre än 5 dagar för att förhindra snabb utarmning av viktiga näringsämnen och tillväxtfaktorer.
4. utvinna Proteinlysat från prostata Organoider för Western blot-analys-TIMING: 2.5-4 H
Anmärkning: Före insamling organoider för protein lysate extraktion, förbereda och pre-Warm dispase-innehållande media (tabell 1).
- Ta bort mediet från varje brunn som i steg 3,1.
- För att samla in organoider, Tryck upprepade gånger på Matrix-gelen genom att Pipettera 1 mL av de dispase-innehållande medierna direkt på Matrix gel ring tills hela ringen är nedsläckt och överför till ett 1,5 mL microcentrifugerör.
Anmärkning: Det är viktigt att undvika direkt kontakt med poly-HEMA-belagda brunnar. Direkt kontakt kan orsaka kontaminering av det insamlade materialet med poly-HEMA, vilket kan inverka negativt på cellernas överlevnad. - Placera 1,5 mL mikrocentrifug röret (s) i en 37 ° c 5% CO2 inkubator för 30 min till 1 h för att möjliggöra fullständig nedbrytning av Matrix gel genom dispase.
- Pelletorganoider genom centrifugering vid 800 x g i 5 min vid RT och ta bort supernatanten med hjälp av en mikropipett.
- Tillsätt fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till den Organoid pelleten och Omsuspendera genom att försiktigt snärta.
Anmärkning: Underlåtenhet att tillräckligt Omsuspendera den Organoid pelleten kan resultera i förorening av Organoid material med resterande dispas eller Matrix gel. - Pelleten organoider genom centrifugering vid 800 x g i 5 min vid RT och ta bort supernatanten med hjälp av en micropipett.
- Snabbfrysa Organoid pellets genom att placera varje rör i en lösning som innehåller torris och metanol. Förvara röret (s) till framtida användning vid-80 ° c. Alternativt, extrahera proteinlysat omedelbart efter steg 4,6.
- Omsuspendera de organoida pelletarna i 100 μL proteinlyseringsbuffert (tabell 1) per 10 μl packad cell volym. Svep för att Omsuspendera.
Anmärkning: Vid återupptagning efter snabbfrysning, se till att proteinlysbufferten tinas upp innan proverna tas bort från-80 ° c, eftersom lyseringsbufferten måste läggas till proverna omedelbart för att förhindra fosfatas och proteasaktivitet. - Inkubera proverna i proteinlysbuffert på is under minst 45 min.
Anmärkning: Det rekommenderas att Sonikera före inkubering på is för att öka effektiviteten i kärn protein återhämtning; emellertid, ultraljudsbehandling krävs inte. Om ultraljudsbehandling inte utförs, gå vidare till steg 4,10.- Att Sonikera, dränera rör i våt is och försiktigt tillämpa spetsen på Sonic dismembrator till utsidan av microcentrifug röret. Sonikera för 40 s vid 20 kHz.
- Fortsätt till Western blot enligt fastställda protokoll.
5. fixering och färgning av prostata Organoider för immunohistokemisk analys av konfokalmikroskopi i hela monteringen
-
Samla in prostata organoider från 24-well tallrikar-timing: 45-60 min
Anmärkning: Vid insamling av prostata organoider att bearbeta för konfokalmikroskopi, är det viktigt att hantera dem med omsorg för att bibehålla sin struktur. Insamlings protokollet nedan är utformat för att minska störningen av Organoid struktur under isoleringen.- Ta bort mediet från varje brunn som i steg 3,1.
- Smält Matrix-gelen genom att inkuberas med 500 μL av dispase-innehållande media (tabell 1) i 30 minuter i en 37 ° c 5% Co2 inkubator.
- Samla in smält Organoid suspension i ett microcentrifug rör och pellet organoider genom centrifugering på 800 x g för 3 min vid RT. ta bort supernatanten.
-
Hel-Mount Immunofluorescerande färgning av prostata organoider – timing: 3-4 dagar (1-5 h/dag)
- Tillsätt 500 μL 4% PARAFORMALDEHYD i PBS och inkubera i 2 timmar vid RT med skonsam skakning.
- Pellets organoider genom centrifugering vid 800 x g för 3 min vid RT, ta bort supernatanten, och tvätta pelleten med 1 ml PBS för 15 min med mild skakning.
- Tvätta pelleten som i steg 5.2.2 för ytterligare två gånger.
- Pellets organoider genom centrifugering vid 800 x g för 3 min vid RT och ta bort supernatanten. Tillsätt 1 μg/mL DAPI i blockeringslösning (tabell 1). Inkubera i 2 timmar vid RT eller alternativt över natten vid 4 ° c med skonsam skakning.
- Pellets organoider genom centrifugering vid 800 x g för 3 min vid RT och ta bort supernatanten. Tillsätt primär antikropp (kanin anti-p63, Mouse anti-cytokeratin 8) i blockerande lösning och inkubera över natten vid 4 ° c med skonsam skakning.
- Pellets organoider genom centrifugering vid 800 x g för 3 min vid RT och ta bort supernatanten. Tvätta pelleten med 1 mL PBS i 15 minuter med skonsam skakning.
- Tvätta pelleten som i steg 5.2.6 för ytterligare två gånger.
- Pellets organoider genom centrifugering vid 800 x g för 3 min vid RT och ta bort supernatanten. Tillsätt sekundär antikropp (get anti-kanin IgG-Alexa fluor 594, get anti-Mouse IgG-Alexa fluor 488) i blockerande lösning och inkubera över natten vid 4 ° c med skonsam skakning.
- Pellets organoider genom centrifugering vid 800 x g för 3 min vid RT, ta bort supernatanten, och tvätta pelleten med 1 ml PBS för 15 min med mild skakning.
- Tvätta pelleten som i steg 5.2.9 för ytterligare två gånger.
6. vävnads clearing och montering av den färgade prostata Organoider för hela Mount konfokalmikroskopi-TIMING: 7 H
- Pellets organoider genom centrifugering vid 800 x g för 3 min vid RT och ta bort supernatanten.
- Tillsätt 1 mL 30% sackaros i PBS med 1% Triton X-100 och inkubera i 2 timmar vid RT med skonsam skakning.
- Pellets organoider genom centrifugering vid 800 x g för 3 min vid RT och ta bort supernatanten.
- Tillsätt 1 mL 45% sackaros i PBS med 1% Triton X-100 och inkubera i 2 timmar vid RT med skonsam skakning.
- Pellets organoider genom centrifugering vid 800 x g för 3 min vid RT och ta bort supernatanten.
- Tillsätt 1 mL 60% sackaros i PBS med 1% Triton X-100 och inkubera i 2 timmar vid RT med skonsam skakning.
- Pellets organoider genom centrifugering vid 800 x g för 3 min vid RT och ta bort 95% av supernatanten.
Anmärkning: Pelleten blir lösare då koncentrationen av sackaros blir högre. Observation av DAPI-färgade organoider under UV-ljus för att bekräfta att de inte försvann under avlägsnande av supernatanten rekommenderas. - Överför en 10-20 μL droppe av den återstående suspensionen till en kamrad täckslip och fortsätt till konfokalmikroskopi.
Anmärkning: Täckglasfragment kan placeras på ömse sidor om dropparna som ska användas som distansen (figur 4c). Dessa hindrar organoider från att kollapsa när en täckslip placeras över droplet.
Representative Results
Prostata epitelceller är pläterade i mus Organoid kultur där de bildar organoider, som skördas före beredning för nedströms analys (figur 1).
Basala och luminala epitelceller isoleras med FACS. Efter att ha exkluderat DAPI+ -celler och nedbrytande lin+ celler (CD45, CD31, Ter119) särskiljs basal-och luminala celler baserat på differential uttryck av EpCAM och CD49f (figur 2). Den metod som beskrivs för att plattan prostata basal och luminala celler i Organoid kultur innebär: (1) plating celler i Matrix gel ringar, och (2) beläggning brunnar med poly-HEMA. Plätering i ringar har tidigare beskrivits i Agarwal et al9. Använda denna metod (figur 3A) gör det möjligt för forskare att lättare undvika Matrix gel medan påfyllning av media (steg 3), och lättare räkna organoider genom att följa omkretsen av brunnen. Beläggning brunnar med poly-HEMA har visat sig förhindra 2D kolonibildning i retinal organoider17; emellertid, denna metod har inte utnyttjats i prostata Organoid modellen. Viktigt är att beläggnings brunnar med poly-HEMA (tabell 3) eliminerar förekomsten av 2D-kolonier utan att störa Organoid formation (figur 3B). Dessa modifieringar utökar kapaciteten hos prostata Organoid-analysen.
Basal-och luminala celler bildar organoider med distinkta morfologier (figur 4A). Medan de flesta basal-derived organoider är liknande i storlek (100-300 μm diameter) efter 7 dagar i kulturen, Luminal-härledda organoider uppvisar betydande heterogenitet (30-450 μm diameter). Dessutom, de flesta basal-derived organoider innehåller lumen omgiven av flerskiktade epitel (figur 4a, topp), medan Luminal-härledda organoider intervall i morfologi från ihåliga, med enskiktade epitel till fast, med flera lager sladdar av celler som inte canalize (figur 4a, botten). De metoder som beskrivs ovan för att framställa organoider för analys i senare led (steg 4,5) användes för att undersöka om dessa fenotypiska skillnader avspeglar skillnader i uttrycket för härstamning. Western blot-analys avslöjade att basal och luminala-härledda organoider behåller funktioner förknippade med basala och luminala primära celler. Basal-derived organoider uttrycker högre nivåer av basal markör cytokeratin 5 (K5), medan luminala-härledda organoider uttrycker högre nivåer av luminala markör cytokeratin 8 (K8) (figur 4B). Både basal och luminala markörer upptäcktes i basal och luminala-härledda organoider i bulk population, kanske tyder på differentiering (figur 4B).
Vi försökte karakterisera Lineage markör uttryck i basal-härledda organoider och avgöra om morfologiskt distinkta Luminal-härledda organoider uppvisar skillnader i markör uttryck genom färgning intakt organoider och utför konfokalmikroskopi (figur 4D). Basal-derived organoider innehöll flera lager epitel med yttre skikt uttrycker höga halter av basal markör p63 och måttliga nivåer av luminala markör K8 (p63Hi, K8Mid), och inre skikt utan detekterbara nivåer av p63 och höga nivåer av K8 (p63Lo, K8Hi) (figur 4D, topp). Medan alla celler i enskiktade Luminal-härledda organoider färgade positivt för K8, endast utvalda celler innehöll Nuclear p63 (figur 4D, botten). Dessa data validera metoder för att skörda och förbereda organoider för analys av Western blot eller konfokala mikroskopi och därmed utöka förmågan hos Organoid analysen för att studera viktiga cellulära processer, inklusive differentiering.
Figur 1: schematiskt illustrerande arbetsflöde för att generera prostata organoider för insamling och analys. Total mus prostata separeras och basal och luminala prostata epitelceller isoleras genom fluorescensaktiverad cell sortering via etablerade protokoll18,19. Basal eller luminala celler suspenderade i en blandning av mus Organoid media och Matrix gel är pläterade i Matrix gel ringar. Efter 5 till 7 dagar av kultur, organoider skördas för analys av Western blot eller konfokal mikroskopi. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: isolering av mus basal och luminala prostata epitelceller med fluorescensaktiverad cell sortering (FACS). Separerade celler från mus prostata färgas med DAPI, att skilja levande från döda celler, och ytanti kroppar, att skilja basal från luminala celler, före FACS. Left = gated på DAPI-Cells. FSC-A = framåt-scatter. Center = gated på lin- celler (CD45Lo, CD31Lo, Ter119Lo). SSC-A = sido scatter. Höger = basala celler (bas) (EpCAMHi, CD49fHi), Luminal celler (Lum) (EpCAMHi, CD49fMid). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: inrättande av mus prostata organoider. (A) schematiskt illustrerande tillvägagångssätt för att generera en matris gel ring i en brunn av en 24-brunn tallrik. (B) representativa faskontrast bilder av Organoider (3D-tillväxtplan) och tvådimensionella kolonier (2D tillväxtplan) bildade 7 dagar efter plätering prostata epitelceller i un-belagda (poly-Hema (-)), eller belagda (poly-Hema (+)) 24-well tallrikar. Inramade regioner inom 2D-tillväxtplanet förstoras till höger. Skalstreck = 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: analys av härstamnings märke uttryck i prostata organoider av Western blot och Whole-Mount konfokalmikroskopi. (A) representativa faskontrast bilder av basal-derived (topp), och Luminal-härledda (botten) organoider efter 7 dagar av kultur. Skalstapel = 100 μm.B) analys av västerländska blot-analyser av basal-derived (bas) och Luminal-härledda (Lum) organoider efter 5 dagars kultur. Färgning för basal markör, cytokeratin 5 (K5), och luminala markör, cytokeratin 8 (K8), och en lastning kontroll, Histon H3 (HH3). (C) schematiskt illustrerar kamrar täckslip med distaner. D) representativa differential interferenskontraster (DIC) och Immunofluorescerande bilder av basal-härledda (topp) och Luminal-härledda (botten) organoider efter 7 dagars kultur. Färgning för p63 (röd), K8 (grön) och DAPI (blå) individuellt och sammanslagna. Skalstreck = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Recept | |
| Media som innehåller dispase | 1 mg/ml dispas + 10 μm rock inhibitor i Advanced DMEM F12. Filtrera sterilisera med 0,22 μm filter. |
| Dissociation Media | 10% FBS + 1x penicillin-streptomycin i RPMI 1640. Filtrera sterilisera med 0,22 μm filter. |
| Proteinlyseringsbuffert | RIPA buffert + fosfatashämmare + proteashämmare |
| Blockerande lösning | 10% FBS i PBS med 0,2% Triton X-100 |
Tabell 1: anvisningar för beredning av nyckellösningar.
| Komponent | Koncentration |
| B-27 | 1x (späd från 50x koncentrat) |
| GlutaMAX | 1x (späd från 100x koncentrat) |
| N-acetyl-L-cystein | 1,25 mM |
| Normocin | 50 μg/mL |
| Rekombinant human EGF, djurfri | 50 ng/mL |
| Rekombinant humant noggin | 100 ng/mL |
| R-spondin 1-conditioned Media | 10% konditionerade medier |
| A83-01 | 200 nM |
| Dht | 1 nM |
| Y-27632 dihydroklorid (berg hämmare) | 10 μM |
| Avancerad DMEM/F-12 | Basmedia |
| R-spondin 1-conditioned Media genereras som beskrivs i Drost, et al.13. Efter tillsats av alla komponenter, filter sterilisera mus Organoid media med 0,22 μm filter. ROCK inhibitor tillsätts endast under etableringen av kultur och passaging av organoids. | |
Tabell 2: instruktioner för beredning av mus Organoid media.
| Protokoll för beredning av poly-HEMA-belagda plattor | |
| 1 | Tillsätt 0,25 g Poly-HEMA till 50 mL 98% EtOH. Lös upp Poly-HEMA vid 37 ° c i en shaker. Denna process tar minst 4 h. |
| 2 | Filter sterilisera Poly-HEMA med 0,22 μm filter. |
| 3 | Tillsätt 200 μl Poly-HEMA-lösning per brunn på en 24-brunn-platta (s). |
| 4 | Ta bort locket (s) från 24-brunn plattan (s) efter tillsats av poly-HEMA och låt lösningen avdunstar över natten. |
| 5 | Tvätta varje brunn två gånger med PBS och säkerställ att brunnarna är helt torra före förvaring efter slutlig tvätt. Obs: störa Poly-HEMA beläggning under tvättning kan bidra till 2-dimensionell tillväxt på plätering epitelceller i Organoid kultur. För att förhindra skador på Poly-HEMA-belagda brunnar, Undvik direkt kontakt med pipettspetsen under tvättning. Integriteten hos de Poly-HEMA-belagda brunnarna kommer att förbli intakt om inte Poly-HEMA skrapas bort av pipettspetsen. |
| 6 | Poly-HEMA-belagda plattor kan förvaras vid 4 ° c i upp till två veckor. Anmärkning: Inplastnings plåtar i parafilm före förvaring minskar risken för kontaminering. |
Tabell 3: protokoll för beredning av poly-HEMA-belagda plattor.
Discussion
Prostata epitelial celldifferentiering har varit inblandad i både normal prostata bio Logi2,3,4,5,6,7 och sjukdoms bio Logi8,10,11,12; dock förblir befälhavaren regulatorer av denna process odefinierad. Identifiera nyckel regulatorer av prostata epitelcell differentiering har varit svårt delvis på grund av avsaknaden av väletablerade sammanhang för att modellera den. Medan 2D enskiktslager kultur kan användas för att modellera differentiering11,12, detta sammanhang misslyckas med att recapitulate den komplexa prostata mikromiljö. Dessutom lämpar sig in vivo-sammanhang för modell differentiering inte för mekanistiska studier, eftersom de är utmanande att manipulera. Därför är identifieringen av en lätt att manipulera, men fysiologiskt relevant sammanhang, att studera differentiering kritisk.
Prostatan Organoid modellen representerar en elegant ex vivo sammanhang där basal till luminala differentiering rapporteras inträffa. Metoder för att etablera prostata organoider är väl etablerade14; ytterligare optimering av dessa metoder är dock nödvändigt. Dessutom är metoder för att skörda och förbereda prostata organoider för analys inte tydligt beskrivna. Denna uppsats beskriver ett förhållningssätt till plattan prostata epitelceller isolerade från mus prostata i Organoid kultur. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för forskare att (1) förhindra uppkomsten av 2D-kolonier under Organoid formation, (2) minska risken för störningar i Matrix gelen under Media påfyllning, och (3) räkna organoider mer effektivt. Dessutom beskriver detta manuskript metoder för att skörda organoider för förberedelse för Western blot-analys, eller hela konfokalmikroskopi. Viktigt, den metod som används för att förbereda organoider för konfokalmikroskopi upprätthåller intakt struktur organoider genom dess varaktighet, vilket minskar Organoid skador före bild förvärv. Sammantaget de metoder som beskrivs utöka funktionerna i prostata Organoid analysen.
I synnerhet kan Organoid-formnings förmågan hos basala och luminala celler ändras både av metoder som används för att isolera respektive populationer och av odlingsförhållanden. De Organoid odlingsförhållanden som används i denna analys beskrevs först av Karthaus et al.13. Karthaus et al. har rapporterat att basala celler har en högre Organoid formnings kapacitet (15%) än luminala celler (1%)13, Chua et al., med hjälp av distinkta isoleringsmetoder och odlingsförhållanden, har rapporterat att luminala celler (0,2-0,3%) har en högre Organoid-formnings kapacitet än basala celler (0,03%)20. Sammantaget leder metoder som beskrivs av Karthaus et al. till högre Organoid-formnings hastigheter för både basal-och luminala celler, vilket sannolikt återspeglar skillnader i den metod som används för att isolera basal-och luminala celler13, i motsats till odlingsförhållanden som bias mot Organoid-bildning från luminala celler. Det är fortfarande oklart om det protokoll som beskrivs i detta manuskript gynnar luminala Organoid formation från multipotenta luminala progenitorer, eller engagerade-luminala progenitorer9. Även i tid och kostnads oöverkomliga, in vivo härstamning studier kan användas för att validera progenitorceller funktioner i samband med distinkta prostata epitelial linjer klarlagd i Organoid analysen.
Processer som utveckling, differentiering och Transformation är inte bara relevanta för prostata bio logi, utan också relevanta för biologi av andra vävnader, inklusive hjärna, lungor, tarm, bukspottkörtel och lever. De beskrivna metoderna underlättar utnyttjandet av Organoid-modellen för att studera dessa processer i inte bara prostata, utan också ett brett spektrum av vävnader.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
PDC och JMG stöds av Ruth L. Kirschstein National Research Service Award GM007185. JAD stöds av det nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper av National Institutes of Health (R25GM055052) tilldelas T. Hasson och Saul Martinez stipendium. ASG stöds av Spitzer Family Foundation fonden och Gill begåvning. Detta arbete stöddes av American Cancer Society (RSG-17-068-01-TBG), Department of Defense (W81XWH-13-1-0470), Margaret E. Tidig medicinsk forskning Trust, NIH/NCI (P50CA092131/UCLA SPORE i prostatacancer), Rose Hills Foundation, och stöd från UCLA ' s Jonsson Comprehensive Cancer Center, brett Stamcellsforsknings centrum, klinisk och Translational Science Institute, och Institute of Urologic Oncology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Dish 35 mm, high | ibidi | 81156 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 μg | BioLegend | 118218 | |
| B-27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11836145001 | |
| (DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one) | Sigma | A-8380 | |
| Dispase II, Powder | Thermo Fisher Scientific | 17-105-041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F8667 | |
| FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) | BioLegend | 102405 | |
| FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) | BioLegend | 103107 | |
| FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) | BioLegend | 116205 | |
| Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | |
| Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Halt Phosphatase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78428 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230C | |
| Mouse anti-cytokeratin 8 | BioLegend | 904804 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | |
| Normocin | Thermo Fisher Scientific | ant-nr-1 | |
| PE anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313612 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) | Sigma | P3932-25G | |
| Rabbit anti-p63 | BioLegend | 619002 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | PI89901 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10) | Thermo Fisher Scientific | 22400105 | |
| Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific | FB120 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-5ML | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Selleck Chemical | S1049-50MG |
References
- Kwon, O. J., Xin, L. Prostate epithelial stem and progenitor cells. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 2 (3), 209-218 (2014).
- Choi, N., Zhang, B., Zhang, L., Ittmann, M., Xin, L. Adult Murine Prostate Basal and Luminal Cells Are Self-Sustained Lineages that Can Both Serve as Targets for Prostate Cancer Initiation. Cancer Cell. 21 (2), 253-265 (2012).
- Ousset, M., Van Keymeulen, A., et al. Multipotent and unipotent progenitors contribute to prostate postnatal development. Nature Cell Biology. 14 (11), 1131-1138 (2012).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 1-13 (2014).
- Wang, Z. A., Mitrofanova, A., et al. Lineage analysis of basal epithelial cells reveals their unexpected plasticity and supports a cell-of-origin model for prostate cancer heterogeneity. Nature Cell Biology. 15 (3), 274-283 (2013).
- Kwon, O. J., Zhang, B., Zhang, L., Xin, L. High fat diet promotes prostatic basal-to-luminal differentiation and accelerates initiation of prostate epithelial hyperplasia originated from basal cells. Stem Cell Research. 16 (3), 682-691 (2016).
- Kwon, O. J., Zhang, L., Ittmann, M. M., Xin, L. Prostatic inflammation enhances basal-to-luminal differentiation and accelerates initiation of prostate cancer with a basal cell origin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 192 (3), 997-999 (2014).
- Stoyanova, T., et al. Prostate cancer originating in basal cells progresses to adenocarcinoma propagated by luminal-like cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (50), 20111-20116 (2013).
- Agarwal, S., Hynes, P. G., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
- Bishop, J. L., et al. The Master Neural Transcription Factor BRN2 Is an Androgen Receptor-Suppressed Driver of Neuroendocrine Differentiation in Prostate Cancer. Cancer Discovery. 7 (1), 54-71 (2016).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Drost, J., Karthaus, W. R., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), e59051 (2019).
- Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 181-186 (2007).
- Chen, H. Y., Kaya, K. D., Dong, L., Swaroop, A. Three-dimensional retinal organoids from mouse pluripotent stem cells mimic in vivo development with enhanced stratification and rod photoreceptor differentiation. Molecular vision. 22, 1077-1094 (2016).
- Liu, X., et al. Low CD38 Identifies Progenitor-like Inflammation-Associated Luminal Cells that Can Initiate Human Prostate Cancer and Predict Poor Outcome. Cell Reports. 17 (10), 2596-2606 (2016).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
- Chua, C. W., Shibata, M., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
