Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

تصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الأيونتوبهوريس الأصفر لوسيفر

doi: 10.3791/60225 Published: September 14, 2019

Summary

الخلايا النجمية هي خلايا معقدة من الناحية الشكلية، وتتمثل في عملياتها المتعددة وأراضيها الكثيفة. لتحليل مورفولوجيا تفصيلا، ونحن نقدم بروتوكول موثوق بها لأداء الأيونتوبهوريس الأصفر داخل الخلايا في الأنسجة الثابتة طفيفة.

Abstract

الخلايا النجمية هي مكونات أساسية للدوائر العصبية. أنها البلاط الجهاز العصبي المركزي بأكمله (CNS) وتشارك في مجموعة متنوعة من الوظائف, التي تشمل إزالة الناقل العصبي, تنظيم أيون, تعديل متشابك, دعم التمثيل الغذائي للخلايا العصبية, وتنظيم تدفق الدم. الخلايا النجمية هي خلايا معقدة تحتوي على سوما، والعديد من الفروع الرئيسية، والعديد من العمليات الدقيقة التي تتصل بالعناصر الخلوية المتنوعة داخل neuropil. من أجل تقييم مورفولوجيا الخلايا النجمية ، من الضروري أن يكون لديك طريقة موثوقة واستنساخ لتصور بنيتها. نحن الإبلاغ عن بروتوكول موثوق به لأداء الأيونتوبهوريس داخل الخلايا من الخلايا النجمية باستخدام الفلورسنت لوسيفر الأصفر (LY) صبغ في أنسجة الدماغ ثابتة طفيفة من الفئران الكبار. هذه الطريقة لديها العديد من الميزات التي هي مفيدة لوصف مورفولوجيا الخلايا النجمية. وهو يسمح بإعادة بناء الخلايا النجمية الفردية ثلاثية الأبعاد، وهو أمر مفيد لإجراء تحليلات مورفولوجية على جوانب مختلفة من هيكلها. الكيمياء المناعية جنبا إلى جنب مع الأيونتوبهوريسيسي LY يمكن أيضا أن تستخدم لفهم تفاعل الخلايا النجمية مع مكونات مختلفة من الجهاز العصبي وتقييم التعبير عن البروتينات داخل الخلايا النجمية المسمى. ويمكن تنفيذ هذا البروتوكول في مجموعة متنوعة من نماذج الماوس من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي لفحص دقيق مورفولوجيا الخلايا النجمية مع الفحص المجهري الخفيف. يوفر داء الأيونتوبهوريس لي نهجا تجريبيا لتقييم بنية الخلايا النجمية، وخاصة في سياق الإصابة أو المرض حيث يقترح أن تخضع هذه الخلايا لتغيرات مورفولوجية كبيرة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الخلايا النجمية هي الخلايا الغليفية الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS). أنها تلعب أدوارا في التوازن أيون, تنظيم تدفق الدم, تشكيل متشابك، فضلا عن القضاء, والناقل العصبي التناول1. وينعكس مجموعة واسعة من وظائف الخلايا النجمية في بنيتها المورفولوجية المعقدة2،3. تحتوي الخلايا النجمية على العديد من الفروع الأولية والثانوية التي تنقسم إلى الآلاف من الفروع الدقيقة والمنشورات التي تتفاعل مباشرة مع نقاط الاشتباك العصبي، dendrites، المحاور، الأوعية الدموية، وغيرها من الخلايا الدبقية. يختلف مورفولوجيا الخلايا النجمية عبر مناطق الدماغ المختلفة، والتي قد تلمح إلى قدرتها على أداء وظائفها بشكل تفاضلي في الدوائر العصبية4. وعلاوة على ذلك، من المعروف أن الخلايا النجمية لتغيير مورفولوجيا أثناء التنمية، وخلال الظروف الفسيولوجية، وفي حالات المرض متعددة6.

هناك حاجة إلى طريقة متسقة، قابلة للاستنساخ لحل بدقة تعقيد مورفولوجيا الخلايا النجمية. تقليديا، وقد استخدمت الكيمياء المناعية لتصور الخلايا النجمية مع استخدام علامات البروتين الغنية بالخلايا النجمية أو astrocyte محددة. ومع ذلك، تكشف هذه الطرق عن نمط التعبير البروتين بدلاً من بنية الخلايا النجمية. علامات شائعة الاستخدام، مثل البروتين الحمضي الفيبريلي الغليفي (GFAP) وS100 بروتين الكالسيوم ملزمة β (S100β)، لا تعبر في حجم الخلية بأكمله، وبالتالي لا تحل مورفولوجيا كاملة7. يمكن للنهج الوراثية للتعبير عن البروتينات الفلورية في كل مكان في الخلايا النجمية (الحقن الفيروسية أو خطوط مراسل الماوس المعدلة وراثيا) تحديد الفروع الدقيقة والأراضي عموما. ومع ذلك، فمن الصعب التمييز بين الخلايا النجمية الفردية، والتحليلات قد تكون متحيزة من قبل السكان astrocyte المستهدفة من قبل المروج محددة8. وقد استخدم المقطع التسلسلي مجهري الإلكترون للكشف عن صورة مفصلة للتفاعلات من عمليات الخلايا النجمية مع نقاط الاشتباك العصبي. بسبب الآلاف من عمليات الخلايا النجمية الاتصال نقاط الاشتباك العصبي، فإنه من غير الممكن حاليا لإعادة بناء خلية كاملة مع هذه التقنية9، على الرغم من أن هذا من المتوقع أن تتغير مع استخدام نهج التعلم الآلي لتحليل البيانات.

في هذا التقرير، نركز على إجراء لتوصيف الخلايا النجمية للماوس باستخدام أيونتوبهوريس داخل الخلايا مع صبغة لوسيفر الصفراء (LY)، وذلك باستخدام أشعة الطبقة CA1 كمثال. ويستند الأسلوب على العمل السابق الرائد من قبل اريك Bushong ومارك Ellisman10،11. يتم تحديد الخلايا النجمية من شرائح الدماغ ثابتة بخفة من خلال شكل هاسيما مميزة ومليئة LY. ثم يتم تصوير الخلايا مع الفحص المجهري البؤري. نبين كيف يمكن استخدام الأيونوفوريسيس LY لإعادة بناء الخلايا النجمية الفردية وإجراء تحليلات مورفولوجية مفصلة لعملياتها وأراضيها. أيضا، يمكن تطبيق هذه الطريقة جنبا إلى جنب مع الكيمياء المناعية لتحديد العلاقات المكانية والتفاعلات بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية، والخلايا الدبقية الأخرى، والأوعية الدموية في الدماغ. ونحن نعتبر LY iontophoresis لتكون أداة مناسبة جدا لتحليل مورفولوجيا في مناطق الدماغ المختلفة ونماذج الماوس من الظروف الصحية أو المرض7،12،13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أجريت التجارب الحيوانية في هذه الدراسة وفقا للمعهد الوطني للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ووافقت عليها لجنة البحوث الحيوانية المستشار في جامعة كاليفورنيا، لوس انجليس. استخدمت الفئران البالغة (6-8 أسابيع) من الجنس المختلط في جميع التجارب.

1. إعداد الحلول

  1. حل السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (ACSF)
    1. إعداد حل جديد ACSF (135 M NaCl، 5 M M KCl، 1 M MgCl14.7 m NaHCO11 mM D-الجلوكوز، 1.25 mM Na2HPOو 2 MM CaCl2)قبل كل تجربة. إضافة MgCl2 و CaCl2 في الخطوة الأخيرة. إذابة المكونات في المياه منزوعة الأيونات عالية الجودة.
    2. احتضان حل ACSF في 35 درجة مئوية في حمام مائي وفقاعة مع 95٪ س2/ 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التجربة.
    3. إضافة 2٪ هيدروكلوريد ليدوكائين للوصول إلى تركيز نهائي من 0.02٪ في ACSF (في 100 مل).
  2. الحل المصلح
    1. استخدام 10٪ رسميافين الفوسفات المخزنة مؤقتا.
  3. LY صبغ الحل
    1. إعداد 1.5٪ LY حل صبغ عن طريق حل لي CH ديالليثيوم الملح أو لي CH ديبوتاسيوم الملح في 5 M KCl. دوامة تماما. حجم 1 مل يكفي لعدة تجارب.
    2. الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 16800 × ز. ثم، قم بتصفية supernatant مع مرشح حقنة 0.2 م في أنبوب جديد. يمكن الاحتفاظ Aliquots عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
      ملاحظة: من المهم أن تطرد الطرد المركزي وتصفية محلول الصبغة لمنع تجميع جزيئات الصبغة، والتي قد تسد القطب الكهربائي.

2. الماوس عبر التسريب وتشريح الدماغ

  1. إعداد المعدات والفأرة للتسريب عبر العضلة
    ملاحظة:
    يمكن استخدام الفئران C57/BL6 من أي من الجنسين. وقد لوحظ تجريبيا أن الطريقة للعمل بشكل موثوق، من المهم أن الفئران ليست أقدم من 3 أشهر (6-8 أسابيع من العمر مثالية). ويرد أدناه وصف لبروتوكول التسريب. ويرد مرجع إضافي لمزيد من التفاصيل14.
    1. واضح أنابيب التسريب مع حل ACSF لإزالة أي فقاعات الهواء في الخط. إعداد أدوات الجراحة حسب ترتيب الاستخدام (ملاقط، منحنية، مقص حادة، مقص قزحية).
    2. التخدير العميق للفأر من خلال وضعه في غرفة تحريض isoflurane، بعد إضافة 2-3 مل من isoflurane إلى الغرفة. السماح بدقيقة واحدة أو دقيقتين للمخدر ليدخل حيز التنفيذ. تأكد من عدم توقف التنفس.
    3. اختبار لقرصة اصبع القدم منعكس. المضي قدما عندما يكون الماوس لا يستجيب لتحفيز الألم وردود الفعل غائبة. تأمين الحيوان في موقف supine مع وضع الرأس في مخروط التنفس مع إمدادات من 5٪ isoflurane في الأكسجين والأطراف والذيل مسجلة أسفل داخل غطاء الدخان الكيميائية.
  2. التسريب عبر الكارديل
    1. باستخدام ملاقط، رفع الجلد تحت القفص الصدري. قم بعمل شق 5-6 سم مع المقص المنحني غير الحاد عبر الجلد لفضح تجويف البطن. قطع صعودا من خلال جدار البطن حتى الكبد والحجاب الحاجز مرئية.
    2. نقل الكبد بلطف بعيدا عن الرسم التخطيطي. مع مقص قزحية العين، قم بعمل شق جانبي 3-4 سم في الحجاب الحاجز.
    3. قطع من خلال القفص الصدري على طول جانبي الجسم لفضح تجويف الصدر. يجب الحرص على عدم تلف القلب وتجنب الرئتين. رفع القص حتى لفضح القلب.
    4. بمجرد ظهور القلب، حقن 0.05 مل من محلول الصوديوم الهيبارين (1000 USP لكل مل) في البطين الأيسر كمضاد للتخثر. ثم، أدخل إبرة التسريب بعناية في البطين الأيسر. تأكد من أن الإبرة تبقى في البطين ولا تخترق غرف القلب الأخرى. قم بعمل شق صغير في الأذين الأيمن مع مقص قزحية العين.
    5. يُملّق مع محلول ACSF بمعدل 10 مل/دقيقة تقريبًا حتى يتم تطهير السائل الموجود في الجسم من الدم (1-2 دقيقة).
    6. التبديل من حل ACSF إلى الحل المثبت دون إدخال أي فقاعات الهواء. مع محلول تثبيتي لمدة 10 دقائق عند 10-20 مل/دقيقة.
      تحذير: الحرص على أن أي حل إصلاحي هو استنزاف من الأنف. وهذا يشير إلى أن الإبرة وصلت إلى البطين الأيمن والمثبت يسافر إلى الرئتين بدلا من خلال الدائرة الجهازية إلى بقية الجسم.
  3. تشريح الدماغ
    1. إزالة رأس الماوس مع مقص وتشريح بعناية من الدماغ الماوس من الجمجمة. ضعها في محلول تثبيتي لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة لفترة قصيرة بعد التثبيت.
      ملاحظة: التسريب الجيد ضروري لنجاح ILY الأيونهوريس. يجب أن يكون الدماغ أبيض اللون وغائب من الدم في الأوعية الدموية في الدماغ. يجب أن يظهر الجسم والأطراف قاسية.

3. إعداد شريحة

  1. إعداد شرائح فرس النهر
    1. غسل الدماغ مع 0.1 M الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم، تجف الدماغ مع ورقة مرشح وإزالة لمبة الشم والمخيخ مع شفرة حلاقة حادة.
    2. جبل الدماغ على علبة الاهتزاز باستخدام الغراء cyanoacrylate وملء علبة مع PBS في درجة حرارة الغرفة. قطع أقسام الإكليل فرس النهر من سمك 110 درجة مئوية.
      ملاحظة: ضبط إعداد الاهتزاز للتأكد من أن شرائح لها نفس سمك وحتى السطح. لهذه التجربة، تم استخدام إعداد السرعة من 4.5 وإعداد تردد من 8، والتي هي إعدادات تعسفية على الصك(جدول المواد). قد يحتاج المستخدمون إلى تجربة الإعدادات على الأجهزة الأخرى.
    3. جمع المقاطع من علبة ووضعها في طبق من PBS على الجليد.

4. إعداد القطب الكهربائي

  1. إعداد قطب حاد مع المقاومة المناسبة.
    1. استخدام زجاج البورسليكات قطب برميل واحد مع خيوط (O.D. 1.0 مم، I.D. 0.58 مم). سحب قطب كهربائي على سحب micropipette(جدول المواد). الأقطاب الكهربائية المثالية مليئة 1.5٪ LY في 5 MM KCl يجب أن يكون لها مقاومة من 200 MΩ عند وضعها في حمام من PBS.
      ملاحظة: يختلف إعداد الساحبة اعتمادا على الجهاز (نوع من آلة المستخدمة وخيوط puller). عادة ما يعطي إعداد الحرارة العالي نصائح أطول وأدق. لبكرة micropipette المستخدمة في هذه التجربة، وكانت الإعدادات: الحرارة: 317، وسحب: 90، والسرعة: 70، والتأخير: 70. تم استخدام خيوط من نوع الحوض الصغير.
    2. تخزين الأقطاب الكهربائية في حاوية مغلقة لمنع الغبار من دخول طرف. الحفاظ على الأقطاب الكهربائية مرتفعة من الجزء السفلي من المربع لمنع طرف من كسر.
  2. ملء القطب الكهربائي مع LY صبغ الحل.
    1. ضع قطب كهربائي في وضع عمودي مع طرف تواجه إلى أسفل. ماصة 1-2 درجة مئوية من محلول LY في الجزء الخلفي من القطب والانتظار لمدة 5-10 دقائق للحل للانتقال إلى طرف عن طريق العمل الشعرية.
    2. قم بتأمين القطب المملوء بلطف في حامل القطب الكهربائي المتصل بالمتلاعب.
      ملاحظة: الأسلاك الفضية لحامل القطب الكهربائي يجب أن تكون على اتصال مع LY داخل القطب الكهربائي. ضبط حجم الحل LY إذا لزم الأمر، اعتمادا على طول السلك.

5. ملء الخلايا النجمية مع الأيونة

  1. اختبار القطب الكهربائي.
    1. ضع شريحة الدماغ برفق في طبق سفلي زجاجي مملوء بـ 0.1 مليون دولار في درجة حرارة الغرفة. عقد شريحة في مكان مع القيثارة البلاتين مع سلاسل النايلون.
    2. تأكد من توصيل القطب الكهربائي بمصدر الجهد ووضع القطب الأرضي في الحمام الذي يحتوي على شريحة الدماغ.
    3. نقل الهدف إلى منطقة الدماغ من الفائدة.
    4. خفض القطب الكهربائي في الحل. تحت الحقل الساطع، نقله إلى مركز مجال الرؤية وفحصه بعناية مع عدسة غمر المياه 40X للتأكد من أنه يبدو واضحا وبدون حطام أو فقاعات. إذا كان هناك أي شيء انسداد طرف القطب الكهربائي، واستبداله ابد.
      ملاحظة: انسداد هو مصدر قلق للقطب 200 MΩ. مع الطرد المركزي والترشيح من حل صبغ قبل كل تجربة، وهذا لا ينبغي أن يكون مشكلة متكررة. ومع ذلك، لأن طرف القطب هو صغير، قد تصبح الأنسجة عالقة في بعض الأحيان في الافتتاح. لم يجد المؤلفون طريقة لمنع ذلك، ولكن يمكن التعامل معها بسهولة ببساطة باستخدام قطب كهربائي جديد.
    5. مراقبة غيض من القطب تحت المجهر الليزر المسح الضوئي مع الليزر 488 نانومتر. ثم، اختبار طرد صبغ عن طريق تشغيل محفز في 12 V. لاحظ سحابة صبغ الفلورسنت كبيرة حول غيض من القطب في حين أن محفز هو على. إذا لم يتم إخراج أي صبغة أو القليل عند تحفيز الجهد، استبدل القطب الكهربائي.
    6. تحت الحقل الساطع، خفض ببطء القطب نحو شريحة وقف فقط فوق السطح.
  2. ملء الخلايا النجمية مع الأيونة.
    1. تحديد الخلايا النجمية 40-50 ميكرومتر تحت سطح الشريحة مع تباين التداخل التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء (IR-DIC). ابحث عن الخلايا ذات السوماتا على شكل بيضاوي حوالي 10 ميكرومتر في القطر. بمجرد اختيار الخلايا النجمية، نقله إلى مركز مجال الرؤية.
      ملاحظة: خلية جيدة لiontophoresis لديها حدود واضحة ومحددة من حوله. لا تختار الخلايا القريبة جدا من سطح الشريحة لأنه لا يمكن تعبئتها تماما. يستغرق بعض الممارسة على مدى بضعة أيام لتكون قادرة على تحديد الخلايا النجمية بشكل روتيني لملء الصبغة. اعتمادا على منطقة الدماغ المستخدمة في التجربة، قد يختلف عدد الخلايا النجمية. قد يؤثر هذا على الوقت اللازم لتحديد الخلايا النجمية قبل الملء.
    2. قم بتقليل طرف القطب الكهربائي ببطء في الشريحة، والتنقل عبر الأنسجة، حتى يكون على نفس المستوى مثل جسم الخلية.
      ملاحظة: تحريك القطب ببطء لتجنب إتلاف الأنسجة.
    3. مرة واحدة في الجسم الخلية من الخلايا النجمية مرئية بوضوح والمبينة، ببطء وبلطف تقدم القطب إلى الأمام. نقل القطب الكهربائي حتى طرف يصطدم سوما من الخلية. نقل التركيز على الهدف ببطء صعودا وهبوطا لملاحظة ما إذا كان القطب هو داخل سوما.
      ملاحظة: يجب أن يكون طرف القطب الكهربائي داخل جسم الخلية، وينبغي ملاحظة مسافة بادئة صغيرة على السوما. لا تحرك القطب أي أبعد من ذلك لتجنب تلميح يمر عبر الخلية.
    4. بمجرد أن يكون طرف القطب الكهربائي داخل الخلية، قم بتشغيل المحفز عند حوالي 0.5−1 فولت وطرد التيار باستمرار إلى الخلية. باستخدام المجهر البؤري، ومشاهدة ملء الخلية. قم بزيادة التكبير/التصغير الرقمي لمعرفة تفاصيل الخلية وتأكد من أن طرف القطب الكهربائي مرئي داخل الخلية.
      ملاحظة: خفض الجهد إذا كان يبدو أن صبغ يتسرب من الخلية أو ملء خلايا أخرى في المنطقة المجاورة. إذا كان يبدو أن الصبغة لا تزال تتسرب من الخلية، وسحب القطب ببطء والعثور على خلية أخرى. من المهم أن الصبغة لا تسرب أن يكون إشارة عالية / نسبة الخلفية في الصورة النهائية.
    5. انتظر حوالي 15 دقيقة حتى تظهر أدق الفروع والعمليات محددة، وإيقاف الجهد وسحب بلطف طرف القطب الكهربائي من الخلية.
  3. صورة الخلية المعبأة.
    ملاحظة:
    يمكن إجراء التصوير مباشرة بعد ملء أو بعد تلطيخ مع الكيمياء المناعية. يؤدي الهدف ذو الفتحة الرقمية الأعلى (NA) إلى دقة أفضل.
    1. انتظر حتى تعود الخلية إلى النموذج الأصلي قبل التصوير (15-20 دقيقة) بهدف 40 x. لتصوير الخلية، اضبط الإعداد على البؤرة للتأكد من أن الفروع والعمليات الدقيقة تظهر معرّفة.
    2. إعداد مكدس z بحجم خطوة 0.3 ميكرومتر. أثناء التصوير، حرك الهدف حتى لا يكون هناك إشارة من الخلية وتعيين ذلك كأعلى. ثم، نقل الهدف إلى أسفل (التركيز من خلال الخلية) حتى لا يكون هناك إشارة، تعيين ذلك كما أسفل.
    3. بعد اكتمال التصوير، تحقق من القطب الكهربائي لطرد الصبغة. إذا ظهرت سحابة صبغ كبيرة، يمكن استخدامها للشريحة التالية. وإلا، استبدله بقطب كهربائي جديد.
      ملاحظة: صبغ ملء astrocyte واحد والتصوير يستغرق حوالي 45 دقيقة إلى 1 ساعة. لهذه التجربة المحددة، كان من الممكن الحصول على حوالي 3-6 خلايا لكل ماوس. إذا لزم الأمر، يمكن تسمية خلايا متعددة على نفس الشريحة. ومع ذلك، للتمييز بين الخلايا النجمية الفردية، تأكد من الحفاظ على مسافة حوالي 200 ميكرومتر بين الخلايا.

6. تلطيخ مع الكيمياء المناعية (اختياري)

  1. بمجرد الانتهاء من التصوير، على الفور وضع شريحة في 10٪ رسمي على الجليد للحفاظ على الكيمياء المناعية. الحفاظ على شرائح الدماغ في الظلام وتخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  2. غسل أقسام الدماغ 3X في 0.1 M PBS مع 0.5٪ السطحي غير الأيونية (أي، تريتون X 100) لمدة 5 دقائق لكل منهما. ثم احتضان في حل حجب من 0.1 M PBS مع 0.5٪ السطحي غير الأيونية و 10٪ مصل الماعز العادي (NGS) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع التحريض لطيف.
  3. حضانة الأقسام مع التحريض في الأجسام المضادة الأولية المخففة في 0.1 M PBS مع 0.5٪ السطحي غير الأيونية و 5٪ NGS لمدة 2 أيام في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: بسبب سمك شرائح الدماغ ، تحتاج فترة حضانة الأجسام المضادة الأولية إلى تمديدها لتحسين الاختراق ويمكن زيادة تركيز الأجسام المضادة. في هذه التجربة، تم استخدام تخفيف 1:500 لمكافحة GFAP الأجسام المضادة وتم استخدام تخفيف 1:500 لمكافحة aquaporin-4 الأجسام المضادة.
  4. غسل الأقسام 3X في 0.1 M PBS مع 0.5٪ السطحي غير الأيونية لمدة 10 دقيقة لكل منهما ومن ثم حضانة مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 0.1 M PBS مع 0.5٪ السطحي غير الأيونية و 10٪ NGS لمدة 6 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: لا تختار الأجسام المضادة الثانوية متحمس من قبل 488 نانومتر، وهو الطول الموجي المستخدمة لتصور صبغLY. في هذه التجربة، تم استخدام تخفيف 1:1000 لاليكسا فلور 546 الماعز المضادة للدجاج IgG (H + L) واليكسا فلور 647 الماعز المضادة للأرنب IgG (H + L).
  5. شطف المقاطع 3X في 0.1 M PBS لمدة 10 دقيقة لكل منهما. ثم جبل المقاطع على الشرائح المجهر الزجاجي في تصاعد وسائل الإعلام المناسبة للفلورة. ختم الشرائح. خلايا الصورة في حجم خطوة من 0.3 ميكرومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

البيانات الواردة في هذه الدراسة هي من 7-12 خلية من 4 فئران في كل تجربة. ويُبلَّغ عن متوسط البيانات في أفرقة الأرقام حسب الاقتضاء.

لتقييم مورفولوجيا الخلايا النجمية، قمنا بإجراء تيونات الخلايا باستخدام صبغLY لملء الخلايا النجمية في الطبقة CA1 رادياتوم، والتي يتم تلخيصها في الشكل 1. يصور الشكل 2 الخلايا النجمية التمثيلية وبنيتها المورفولوجية المعقدة. تم تصوير الخلية بعد التثبيت مع عدسة الغمر بالزيت 60x على مجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري باستخدام خط الليزر 488 نانومتر (حجم الخطوة 0.3 ميكرومتر و3.0−3.5x التكبير الرقمي). تم تعديل أنبوب المضاعف الضوئي (PMT)، وتعويض، ووظائف الربح من المجهر البؤري لخلق نسبة إشارة / خلفية عالية في الصورة النهائية. في الشكل 2تكشف صور طائرة بصرية واحدة من خطوات z مختلفة (تظهر كل 10 ميكرومتر، وتوصف بالترتيب من 1-6) عن السوما المركزية والعديد من الفروع الرئيسية التي تنقسم إلى شبكة كثيفة من العمليات. من خلال توليد الإسقاط كثافة قصوى (حجم المكدس من 85 درجة مئوية) لاحظنا وجهة نظر مفصلة من هيكل الخلايا النجمية ومجالها(الشكل 2B). كما لوحظت المكونات الرئيسية لهيكل الخلايا النجمية. الشكل 2 C يظهر التكبير في (x4) الإسقاط كثافة قصوى من فرع رئيسي واحد، والعديد من الفروع الثانوية، وتوزيع الفروع المحيطة والمنشورات.

وقد أجريت التحليلات المورفولوجية وإعادة بناء الخلايا النجمية مع برنامج تحليل إيماريس(جدول المواد)باستخدام صور ما بعد التثبيت من الخلايا النجمية المليئة LY (يمكن أيضا استخدام برامج أخرى مثل ImageJ). بعد الانتهاء من إعادة بناء كل الخلايا النجمية، تم تحديد كميات من سوما، والفروع الرئيسية، والعمليات، والأراضي. تم إنشاء سوما أولاً مع تعيين تنعيم السطح إلى حد دقة الطائرة x-y (0.25 درجة مئوية). تم تعيين الحد الأدنى لقطر الكائن عند 3.0 ميكرومتر لإزالة كائنات أخرى غير مقترنة بجسم الخلية. لإنشاء الفروع الرئيسية، تم إخفاء شدة سوما، وذلك بسبب سطوعها بالنسبة لبقية الخلية. تم تعيين تنعيم السطح والحد الأدنى لقطر الكائن من الفروع الرئيسية إلى 0.3 ميكرومتر (z حجم خطوة الطائرة). ولإنشاء هذه العمليات، كانت كثافة الفروع الرئيسية مقنعة أيضا. تم تعيين تنعيم السطح إلى 0.18 ميكرومتر وتم تعيين الحد الأدنى لقطر الكائن إلى 0.3 ميكرومتر. تم إنشاء أراضي الخلايا النجمية باستخدام عتبة كثافة أقل وتمهيد السطح تعيين إلى 0.75 م. الشكل 3يظهر الصورة الأصلية للكريات النجمية CA1. يتم إعادة بناء جسم الخلية، والفروع الرئيسية، والعمليات، وحجم الأراضي المغلقة من قبل الخلايا النجمية في الشكل 3B-E. بعد إنشاء إعادة بناء الخلايا، تم تحديد كميات من سوما، والخلية بأكملها، والأراضي وعدد الفروع الرئيسية تم حسابها(الجدول 1). كان متوسط حجم الخلايا النجمية CA1 من الطبقة الإشعاعية 488.91 ميكرومتر3، ومتوسط ~ 7 فروع أولية ، ومتوسط حجم الخلايا من 5.58 × 103 ميكرومتر3، ومتوسط حجم الأراضي من 2.94 × 104 ميكرومتر3.

علامة الخلايا النجمية ذات الخصائص الجيدة، GFAP، هو بروتين الخلايا الهيكلية الذي يصف خيوط وسيطة من الخلايا النجمية8. بعد ملء الخلايا النجمية صبغ، قمنا بتلطيخ المناعة لGFAP لتصور التعبير في الخلايا النجمية الفردية(الشكل 4). وجدنا أن GFAP تم التعبير عنها في سوما الخلية، والفروع الرئيسية، وبعض الفروع الثانوية من الخلايا النجمية، ولكن ليس في أدق الفروع والعمليات(الشكل 4A). ولم يُوجد أي فرق كبير في عدد الفروع الأولية التي تحمل اسم GFAP وتلك التي تصورها LY (p = 0.1573; الشكل 4 B).كانت منطقة الخلية وحجم الخلايا النجمية التي تحملها GFAP أصغر بكثير من المنطقة وحجم تصور مع LY (p < 0.0001; الشكل 4 C، D). وهذا يدل على أن GFAP هو علامة موثوق بها لوضع العلامات على الفروع الرئيسية، ولكن ليس مفيدا لتحديد المساحة الإجمالية أو حجم الخلية.

ومن السمات الهامة للخلايا النجمية هي أقدامها، التي تتصل بالأوعية الدموية ويقترح للمساعدة في تنظيم تدفق الدم في الجهاز العصبي الوطني. لمزيد من الفهم للعلاقة المكانية بين الخلايا النجمية والأوعية الدموية في الدماغ، ونحن ملطخة الأجسام المضادة ضد aquaporin-4 بعد ملء صبغ. Aquaporin-4 هو بروتين قناة المياه الموجودة على الخلايا النجمية والخلايا اللاإبيدية، ويتم التعبير عنها بشكل كبير في المناطق القريبة من البطينين والأوعية الدموية15. وجدنا أن aquaporin-4 يتم التعبير عنها على endfeet astrocyte على مقربة من الأوعية الدموية الدماغ(الشكل 5A). تُصوّر الصورة ثلاثة أقدام من الخلايا النجمية تتصل بوعاء دموي في مواقع مختلفة (تشير إليه الأسهم البيضاء). في الطبقة CA1 رادياتوم، كان متوسط عدد الأقدام النهائية لكل الخلايا النجمية ~ 2(الشكل 5B). ومن المثير للاهتمام أن الفروع التي تحتوي على الأقدام النهائية كانت أكثر سمكا بكثير من الفروع الأولية الأخرى للكريات النجمية، وذلك باستخدام عمليات إعادة بناء الفروع الرئيسية (p = 0.0038; الشكل 5 ج).كما قمنا بقياس طول الفروع التي تحتوي على المنتصف من مركز السوما إلى الأوعية الدموية وقارننا ذلك بأقصر مسار مباشر إلى الأوعية الدموية. وكان الطول الفعلي للفروع إلى الأوعية الدموية أكبر بكثير من أقصر مسار (ص = 0.0333; الشكل 5 D)،مما يشير إلى أن هذه الفروع تميل إلى اتخاذ أطول، طريق دائري إلى الأوعية الدموية. يصور الفيلم 1 فيلماً عن إعادة بناء الخلايا النجمية المليئة بـ LY وتلطيخ aquaporin-4. يتم تمثيل المكونات الهيكلية المختلفة للالخلايا النجمية (سوما، الفروع الرئيسية، والعمليات، والأراضي) في ثلاثة أبعاد. تُصوّر الخلايا النجمية المملوءة بـ LY مع تلطيخ aquaporin-4 الأقدام النجمية التي تحيط بالأوعية الدموية. من إعادة بناء الفروع الرئيسية والأوعية الدموية، يمكن تصور الفروع التي تحتوي على أقدام النهاية تمتد من سوما إلى الوعاء.

في الأقسام السابقة، حيث يتم الإبلاغ عن قيم p استخدمنا اختبار t الطالب غير المقترن، مع أهمية في p < 0.05.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لسير العمل في I iontophoresis. تمثيل تخطيطي للبروتوكول يسلط الضوء على الخطوات الهامة. بعد أن تم غرس الماوس مع المثبت، تم تشريح الدماغ. بعد فترة قصيرة بعد التثبيت، تم قطع المقاطع الإكليلية مع الاهتزاز. وقد امتلأ القطب مع 1.5٪ صبغ LY. تم التعرف على الخلايا النجمية في الطبقة CA1 رادياتوم باستخدام الأشعة تحت الحمراء-DIC على المجهر الضوئي. تم اختراق ورم الخلية بواسطة القطب الكهربائي، وتم حقن الصبغة في الخلية بتطبيق 0.5−1 V حتى تم ملء العمليات الدقيقة بالكامل. تم تصوير الشريحة مع الفحص المجهري البؤري باستخدام عدسة غمر المياه 40X ومن ثم معالجتها لالكيمياء المناعية. تم الانتهاء من مزيد من التصوير مع عدسة الغمر النفط 60X لإجراء إعادة بناء الخلايا والتحليل المورفولوجي. يظهر مثال إعادة بناء العمليات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الخلايا النجمية المملوءة LY من الطبقة CA1 رادياتوم. (أ)صور طائرة بصرية واحدة من الخلايا النجمية تظهر كل 10 ميكرومتر (تحت عنوان 1-6). (ب)الحد الأقصى من الإسقاط من الخلايا النجمية، تصور سوما الخلية، والعديد من الفروع الرئيسية، والعديد من العمليات التي تشكل أراضيها بوشي. (C)الحد الأقصى للإسقاط (التكبير x4) من فرع رئيسي واحد (من القسم المبين باللون الأصفر)، فرعين ثانويين، عدة فروع، وتنظيم العمليات المحيطة. شريط مقياس = 10 درجة.

Figure 3
الشكل 3: إعادة بناء الخلايا النجمية المملوءة LY ومكوناتها. (أ)CA1 astrocyte مليئة LY. (B-E) إعادة بناء ثلاثية الأبعاد من سوما(ب)،سوما والفروع الرئيسية(C)،والعمليات(D)،والأراضي(E)في اتجاه 0 درجة و 45 درجة. شريط مقياس = 10 درجة.

Figure 4
الشكل 4: تلطيخ المناعة GFAP في الخلايا النجمية المملوءة LY. (أ)ممثل z-إسقاط LY (الأخضر) وGFAP (أرجواني) تلطيخ. يتم التعبير عن GFAP في المقام الأول في الفروع الأولية وبعض الثانوية من الخلايا النجمية، ولكن لم يتم العثور عليها داخل كامل الأراضي النجمية. شريط مقياس = 10 درجة مئوية(B)الرسم البياني لعدد الفروع الأولية التي تحمل اسم LY و GFAP. (C)منطقة الخلية تدل عليها LY وGFAP تلطيخ. (D)حجم الخلية تدل عليها LY وGFAP تلطيخ. الدوائر المفتوحة هي بيانات خام مع مربعات مغلقة تشير إلى متوسط ± SEM. تم جمع البيانات من 12 خلية من 4 فئران. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: Aquaporin-4 تلطيخ المناعة في الخلايا النجمية المملوءة LY. (أ)ممثل z-إسقاط LY (الأخضر) وaquaporin-4 تلطيخ (أرجواني). يتم التعبير عن Aquaporin-4 أساسا في نهاية القدمين من الخلايا النجمية. تشير السهام البيضاء إلى الأقدام الثلاثة أثناء اتصالها بوعاء دموي قريب. شريط مقياس = 10 ميكرومتر (ب) عدد الفروع ذات الأقدام النهائية لكل الخلايا النجمية. (ج)سمك الفروع ذات الأنفيت بالمقارنة مع الفروع الأولية الأخرى من الخلايا النجمية. (د)طول الفروع مع endfeet بالمقارنة مع أقصر مسار إلى الأوعية الدموية. الدوائر المفتوحة هي بيانات خام مع مربعات مغلقة تشير إلى متوسط ± SEM. تم جمع البيانات من 7 خلايا من 4 فئران. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Movie 1
فيلم 1: إعادة بناء الخلايا النجمية المليئة LY وaquaporin-4 تلطيخ. فيلم تمثيلي للكريات النجمية CA1 على مقربة من الأوعية الدموية. تم إعادة بناء سوما، والفروع الرئيسية، والعمليات، والأراضي لتحليل مورفولوجيا الخلية. إعادة بناء الفروع الرئيسية جنبا إلى جنب مع aquaporin-4 تصور اثنين من endfeet الخلايا النجمية الاتصال مباشرة الأوعية الدموية. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

الخصائص المورفولوجية يعني ± SEM
سوما حجم (ميكرومتر3) 489 ± 30
عدد الفروع الأولية 7.0 ± 0.5
حجم الخلية (ميكرومتر3) 5580 ± 425
حجم الإقليم (ميكرومتر3) 29391 ± 8150
عدد الخلايا 14

الجدول 1: التحليل المورفولوجي لبنية الخلايا النجمية. يتم عرض حجم سوما الخلايا النجمية، وعدد الفروع الأولية لكل الخلايا النجمية، وحجم الخلايا النجمية، وحجم محاط بأراضي الخلايا النجمية. تم جمع البيانات من 14 خلية من 7 فئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الطريقة المبينة في هذه الورقة تصف طريقة لتصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الأيونتوبهوريس داخل الخلايا من صبغ LY في شرائح الدماغ ثابتة قليلا. هناك العديد من العوامل الحاسمة التي تم تسليط الضوء عليها في هذا البروتوكول التي تسهم في نجاح LY الأيونتوبهوريسوإعادحي المورفولوجية للخلايا. أحد العوامل هو نوعية واستنساخ الصور، والتي يتم تحديدها إلى حد كبير من قبل عمر الماوس ونتيجة التسريب. في هذه الدراسة، استخدمنا الفئران C57/BL6N 6-8 أسابيع من العمر. التسريب الناجح (يعتمد إلى حد كبير على التنسيب السليم للإبرة المندمجة ولاحظ من قبل الدماغ الأبيض اللون وعدم وجود الدم في الأوعية الدموية في الدماغ) ضروري للخلايا الأكثر تفصيلا ومليئة بوضوح. بعد الانفعال بواسطة قطب كهربائي، يجب أن يحافظ غشاء الخلية على ختم محكم حول طرف القطب الكهربائي ويمنع الصبغة من التسرب. على الرغم من أفضل الجهود، في بعض الأحيان سيتم ملء هياكل أخرى خارج الخلية كما يتم متقدمة ماصة من خلال أنسجة الدماغ: استبعدنا هذه الخلايا من التحليل. مقاومة الأقطاب الكهربائية هي عامل رئيسي إضافي. المقاومة العالية تسمح فقط طرد ثابت من صبغ من طرف القطب الكهربائي على تحفيز الجهد. أكثر من الناحية الفنية، من المهم الحفاظ على حركات لطيفة وبطيئة عند اختراق سوما الخلية مع القطب الكهربائي. اختراق القطب الكهربائي من خلال الخلية يمكن أن يؤدي إلى تسرب صبغ من سوما. وينبغي أن يؤدي الانفمنت الناجح الذي يتبعه تطبيق الجهد إلى ملء صبغ فوري تقريبا من جسم الخلية والعمليات (أي في غضون بضع ثوان). ويتصل الوقت اللازم لملء الخلايا النجمية تماما بالأراضي التي تشملها؛ ومع ذلك، انتظر للتأكد من أن العمليات الدقيقة مليئة بالكامل (15 دقيقة على الأقل).

وجدنا هذا البروتوكول ليكون وسيلة أكثر إخلاصا لدراسة مورفولوجيا الخلايا النجمية بالتفصيل، ومع ذلك، فإن الطريقة لها حدودها. يمكن أن يكون تحديد الخلية يستغرق وقتاً طويلاً وعرضة للخطأ. تحت IR-DIC، يجب تحديد الميزات المميزة التي تميز نوع الخلية المحددة (شكل وحجم سوما). بدلا من ذلك، فإن التعبير عن الصحفيين الفلورسنت الأحمر على وجه التحديد في الخلايا النجمية، عن طريق الحقن الفيروسي أو خط مراسل الماوس المعدلة وراثيا، يسمح لتحديد أسهل من هذه الخلايا قبل ملء. أيضا، LY محدودة كصبغة دوريلأنه لا يمكن استخدامها لتسمية غشاء الخلايا النجمية، بالمقارنة مع وضع العلامات مع GFP الغشاء المربوطة، مثل LCK-GFP16. Lck-GFP من شأنه أن يعطي تمثيلا أكثر دقة من منطقة الأراضي بأكملها، كما LY iontophoresis يكشف عن الحجم الداخلي للخلايا النجمية. ومع ذلك، اعتمادا على التصميم التجريبي، LY iontophoresis هو الأنسب لحل كامل حجم الخلايا النجمية الداخلية، وتطوير عمليات إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد، وتحديد المكونات التشريحية التي تشكل بنية الخلايا النجمية6 . وأخيرا، كما هو الحال مع جميع أشكال الفحص المجهري البؤري، ويقتصر القرار المكاني عن طريق الانعراج، وأشار إلى وظيفة انتشار نقطة من البصريات المجهر17. تغيير مكونات نظام التصوير، مثل انخفاض قطر الثقب، سيساعد على تحسين الصور، ولكن يتم تحديد القرار الحقيقي من قبل الطول الموجي للضوء والفتحة العددية للعدسة الموضوعية. في حالتنا، ونحن نقدر أفضل قرار ممكن هو على الأرجح حوالي 300 نانومتر، والتي من المرجح أن تكون أسوأ في محور z.

LY iontophoresis يقدم العديد من المزايا على غيرها من الطرق الشائعة الاستخدام لتسمية الخلايا النجمية. يمكن تطبيق البروتوكول في أي نموذج الماوس المنشأة، والسكان الخلية، أو منطقة الدماغ18،19،20 كما أنها ليست محدودة من قبل المروج astrocyte محددة أو خط الماوس المعدلة وراثيا. تتطلب النُهج الوراثية للتعبير عن بروتينات الفلورسنت في كل مكان في الخلايا النجمية عن طريق الحقن الفيروسية أو خطوط مراسل الفئران المعدلة وراثياً (أي td-Tomato) استخدام مروج للخلايا النجمية، والتي يمكن التعبير عنها في بعض المناطق في أنواع خلايا أخرى أم لا تشمل جميع الخلايا النجمية21. LY iontophoresis هو أيضا كفاءة الوقت، والحقن الفيروسية من البروتينات الفلورية تتطلب عملية جراحية والوقت للتعبير عن فيروس معين، وخطوط الماوس المعدلة وراثيا تتطلب تربية. وأخيرا، LY iontophoresis هو وسيلة مفيدة للتمييز بين الخلايا الفردية، في حين أن استراتيجيات أخرى تحتاج أيضا إلى الجمع بين طريقة لوضع العلامات متفرقة لتصور أراضي الخلايا النجمية الفردية22،23، 24. ومع ذلك، لا توجد طريقة واحدة هي علاج شاف، وينبغي أن يكون اختيارها مُصمماً وفقاً للمسألة المحددة التي يجري تناولها.

يمكن للدراسات المستقبلية استخدام التلاعب التجريبي ة محددة ودراسة مكونات مختلفة من بنية الخلايا النجمية (سوما، الفروع، العمليات، الأراضي، الخ) للإجابة على الأسئلة المورفولوجية. وهذا يمكن أن يوفر البصيرة والاتجاه في مورفولوجيا الخلايا النجمية وآثارها الوظيفية، والتي يمكن تحليلها كذلك عن طريق الفحص المجهري ضوء فائقة القرار أو المجهر الإلكتروني4. على سبيل المثال، يوفر داء الأيونتوبهوريس لي وسيلة لتصور عمليات الخلايا النجمية الدقيقة، التي تتصل بالآلاف من نقاط الاشتباك العصبي وتشارك في وظائف متشابكة. دراسة كيفية تغير هيكل هذه العمليات في مختلف الظروف المرضية يمكن أن تساعد في توضيح أدوار الخلايا النجمية في الصحة والمرض. LY iontophoresis هو تقنية هامة لتصور مورفولوجيا الخلية مفصلة وتميز خصائص الخلايا النجمية لفهم وظائفها بشكل أفضل في الجهاز العصبي المركزي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ويشكر أصحاب البلاغ السيدة سوتو والدكتور يو والدكتور أوكتو على التوجيه وكذلك على التعليقات على النص. هذا العمل معتمد من قبل NS060677.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Buffered Formalin Phosphate Fisher SF 100-20 An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane Pall 4692 An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet WPI EP2 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) Thermo Scientific A-11040 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Scientific A27040 A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody Novus Biologicals NBP1-87679 A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody Abcam ab4674 A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament World precision instruments 1B150F-4
C57BL/6NTac mice Taconic Stock B6 A similar alternative can be used
Calcium Chloride Sigma 21108 An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000MPE A similar alternative can be used
D-glucose Sigma G7528 An identical alternative can be used
Disodium Phosphate Sigma 255793 An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97 Sutter P-97 A similar alternative can be used
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) Sagent Pharmaceuticals 400-10 An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5) Bitplane Inc. A similar alternative can be used
Isofluorane Henry Schein Animal Health 29404 An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) Clipper 1050035 An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt Sigma L0144
Magnesium Chloride Sigma M8266 An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass Thermo Scientific 24X60-1 An identical alternative can be used
Microscope Slides Fisher 12-544-2 An identical alternative can be used
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000 An identical alternative can be used
Objective lens (40x) Olympus LUMPLFLN 40XW A similar alternative can be used
Objective lens (60x) Olympus PlanAPO 60X A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL VWR VWRVE404 An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200 Sutter MP-285 / ROE-200 / MPC-200 A similar alternative can be used
Potassium Chloride Sigma P3911 An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 An identical alternative can be used
Sodium Chloride Sigma S5886 An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010 World precision instruments Omnical 2010 A similar alternative can be used
Triton X 100 Sigma T8787 An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000 Pelco 100-S A similar alternative can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18, (7), 942-952 (2015).
  2. Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18, (1), 31-41 (2017).
  3. Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
  4. Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95, (3), 531-549 (2017).
  5. Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18, (6), 567-588 (2012).
  6. Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6, (1), (2019).
  7. Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516, (1), 1-19 (2009).
  8. Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8, (7), 69143 (2013).
  9. Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22, (1), 77-88 (2015).
  10. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22, (1), 183-192 (2002).
  11. Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (46), 17513-17518 (2006).
  12. Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71, (4), 640-655 (2011).
  13. Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113, (1), 221-233 (2002).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  15. Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7, (5), (2015).
  16. Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141, (1), 41-53 (2005).
  17. Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10, (3), 0121096 (2015).
  18. Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
  19. Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98, (1), 49-66 (2018).
  20. Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34, (6), 2285-2298 (2014).
  21. Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27, (6), 508-525 (2018).
  22. Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38, (25), 5710-5726 (2018).
  23. Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22, (1), 101-110 (2012).
  24. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9, (1), 1623 (2018).
تصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الأيونتوبهوريس الأصفر لوسيفر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).More

Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter