Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

המחשה מורפולוגיה באמצעות לוציפר ביוטופזיס צהוב

Published: September 14, 2019 doi: 10.3791/60225
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

Summary

האסטרולוגים הם תאים מורכבים מורפולוגית, לידי ביטוי על ידי התהליכים המרובים שלהם בשטחים סבוך. כדי לנתח את המבנה המשוכלל שלהם, אנו מציגים פרוטוקול אמין כדי לבצע לוציפר תאיים ביוטופהורזיס צהוב בעדינות רקמה קבועה.

Abstract

אסטרוציטים הם מרכיבים חיוניים של מעגלים עצביים. הם לקלף את כל מערכת העצבים המרכזית (CN) והם מעורבים במגוון של פונקציות, אשר כוללות סיווג נוירוטרנסמיטר, רגולציה יון, אפנון סינפטית, תמיכה מטבולית לנוירונים, ובקרת זרימת הדם. Astrocytes הם תאים מורכבים בעלי סומה, כמה ענפים גדולים, ותהליכים משובחים רבים ליצור קשר עם אלמנטים סלולריים מגוונים בתוך נוירופיל. על מנת להעריך את המבנה של האסטרוציטים, יש צורך בשיטה אמינה ומועלת כדי להמחיש את המבנה שלהם. אנו מדווחים על פרוטוקול אמין לבצע iontophoresis של האסטרוציטים באמצעות פלורסנט לוציפר צהוב (LY) לצבוע בקלות רקמת מוח קבוע מעכברים למבוגרים. שיטה זו כוללת מספר תכונות שימושיות לאפיון מורפולוגיה אסטרוציט. זה מאפשר שחזור תלת מימדי של אסטרוציטים בודדים, אשר שימושי לבצע ניתוחים מורפולוגיים על היבטים שונים של המבנה שלהם. אימונוהיסטוכימיה יחד עם באופן LY יכול להיות מנוצל כדי להבין את האינטראקציה של אסטרוציטים עם רכיבים שונים של מערכת העצבים להעריך את הביטוי של חלבונים בתוך האסטרוציטים המסומנת. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם במגוון של מודלים העכבר של הפרעות מערכת העיכול כדי לבחון בקפדנות מורפולוגיה אסטרוציט עם מיקרוסקופ אור. מספק גישה ניסיונית להערכת מבנה אסטרוציט, במיוחד בהקשר של פציעה או מחלה שבה תאים אלה מוצעים לעבור שינויים מורפולוגיים משמעותיים.

Introduction

Astrocytes הם התאים הנפוצים ביותר גליה במערכת העצבים המרכזית (cn). הם משחקים תפקידים הומאוסטזיס יון, בקרת זרימת הדם, היווצרות סינפסה, כמו גם חיסול, ו הנוירוטרנסמיטור קליטת1. מגוון רחב של פונקציות אסטרוציט משתקף במבנה מורפולוגית המורכבת שלהם2,3. Astrocytes מכילים מספר ענפים עיקריים ומשניים אשר מתחלקים לאלפי ברשופטים עדין ועלונים כי אינטראקציה ישירה עם הסינפסות, דנדריטים, אקסונים, כלי דם, ותאים גליה אחרים. מורפולוגיה astrocyte משתנה בין אזורי מוח שונים, אשר עשוי לרמוז על יכולתם לבצע את תפקידם באופן מכריע במעגלים עצביים4. יתר על כן, האסטרוציטים ידועים לשנות את המבנה שלהם במהלך הפיתוח, במהלך התנאים הפיזיולוגיים, ובמדינות מחלות מרובות3,5,6.

שיטה עקבית ומדומה נחוצה כדי לפתור במדויק את המורכבות של המבנה האסטרוציט. באופן מסורתי, אימונוהיסטוכימיה נעשה שימוש כדי להמחיש אסטרוציטים עם שימוש ספציפי אסטרוציט מועשר חלבון סמנים. עם זאת, שיטות אלה לחשוף את התבנית של ביטוי חלבון ולא את המבנה של astrocyte. סמנים בשימוש נפוץ, כגון חלבון מסוג גליה fibrillary (gfap) ו S100 סידן כריכת חלבון β (S100β), לא לבטא את עוצמת הקול כולו, ובכך לא לפתור מורפולוגיה מלאה7. גישות גנטיות לבטא חלבונים פלואורסצנטי באופן מהיר ב אסטרוציטים (זריקות נגיפי או שורות כתב העכבר הטרנסגניים) יכול לזהות את הענפים עדין והשטח הכולל. עם זאת, קשה להבדיל אסטרוציטים בודדים, וניתוחים עשויים להיות מוטה על ידי אוכלוסיית אסטרוציט ממוקדות על ידי יזם מסוים8. מיקרוסקופ מקטע סדרתי משמש כדי לחשוף תמונה מפורטת של האינטראקציות של תהליכים אסטרוציט עם הסינפסות. בשל אלפי תהליכים אסטרוציט יצירת קשר עם הסינפסות, כרגע זה לא אפשרי לשחזר תא שלם עם טכניקה זו9, למרות זאת צפוי להשתנות עם השימוש בגישות למידה מחשב עבור ניתוח נתונים.

בדו ח זה, אנו מתמקדים בהליך לאפיין את האסטרוציטים העכבר באמצעות ביוטוהורזיס תאיים עם לוציפר צהוב (LY) צבע, באמצעות CA1 שכבה רדיואטום כדוגמה. השיטה מתבססת על עבודת העבר החלוצית של אריק בושונג ומארק אליסמן10,11. האסטרוציטים מפרוסות המוח קבוע בקלות מזוהים על ידי הצורה הייחודית שלהם וממולא LY. לאחר מכן התאים מתתמונות עם המיקרוסקופיה הקונפוקלית. אנו מדגימים כיצד משמש באופן LY iontophoresis לשחזר אסטרוציטים הפרט ולבצע ניתוחים מורפולוגיים מפורטים של התהליכים שלהם טריטוריה. גם, שיטה זו יכולה להיות מיושם בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה כדי לזהות יחסים מרחביים ואינטראקציות בין אסטרוציטים ונוירונים, תאים גליאל אחרים, והמוח המערכת. אנו מחשיבים באופן ככלי מתאים מאוד לניתוח מורפולוגיה באזורי מוח שונים ומודלים של עכברים בתנאים בריאים או מהמחלה7,12,13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים במחקר זה נערכו בהתאם למכון הלאומי למדריך בריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים מעבדה ואושרו על ידי ועדת המחקר בעלי חיים של הקנצלר באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס. עכברים מבוגרים (6 שבועות בני 8) של מין מעורב שימשו בכל הניסויים.

1. הכנה לפתרון

  1. נוזל שדרתי מלאכותי (ACSF) פתרון
    1. להכין פתרון ACSF טרי (135 mM היאl, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl2, 14.7 Mm נחקו3, 11 מ"מ D-גלוקוז, 1.25 mm Na2Hpo4, ו 2mm cacl2) לפני כל ניסוי. הוסף את MgCl2 ו-cacl2 בשלב הסופי. מפזר את הרכיבים במים באיכות גבוהה.
    2. מודטה את הפתרון ACSF ב 35 ° c באמבט מים בועה עם 95% O2/5% CO2 עבור לפחות 30 דקות לפני הניסוי.
    3. הוסף 2% לידוקאין הידרוכלוריד כדי להגיע לריכוז הסופי של 0.02% ב ACSF (ב 100 mL).
  2. פתרון מתקבע
    1. השתמש ב-10% שימוש במאגר פוספט.
  3. לצבוע את התמיסה
    1. להכין 1.5% ly פתרון לצבוע על ידי המסת ly ch מכרות דיליתיום יתיום מלח או ממלח ly ch מכרות דיליתיום ב 5 מ"מ kcl.. מערבולת ביסודיות נפח של 1 מ ל מספיק עבור ניסויים מספר.
    2. צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 16,800 x g. אז, לסנן את supernatant עם מסנן 0.2 יקרומטר מזרק לתוך צינור חדש. המלון יכול להישמר ב -4 ° c עד 3 חודשים.
      הערה: זה קריטי לצנטריפוגה ולסנן את פתרון הצבע כדי למנוע צבירה של חלקיקי הצבע, אשר עשוי לסתום את האלקטרודה.

2. העכבר הטרנס והפרזיה וניתוח המוח

  1. הכנת ציוד ועכבר עבור הפרזיה
    הערה:     ניתן להשתמש בעכברים C57/BL6 של שני סוגי המין. מדובר באופן אמפירי על כך שכדי שהשיטה תפעל בצורה מהימנה, חשוב שהעכברים לא יהיו בוגרים מ-3 חודשים (6 שבועות וחצי). פרוטוקול זלוף מתואר להלן. הפניה נוספת מסופקת לפרטים נוספים14.
    1. ברור אבובים זלוף עם פתרון acsf להסיר בועות אוויר בקו. כוונן כלי ניתוח לפי סדר השימוש (פינצטה, מספריים מעוקלים, בוטים, איריס מספריים).
    2. עכבר מורדם למדי על ידי הכנסתו לתוך חדר האינדוקציה isofלוריאן, לאחר הוספת 2 ל-3 מ ' של isofלפני החדר. הרשו 1 עד 2 דקות עבור הרדמה לפעול. . תוודא שהנשמה לא מפסיקה
    3. . מבחן רפלקס הבוהן המשך כאשר העכבר אינו מגיב לגירוי הכאב והרפלקס נעדר. לאבטח את החיה בתנוחה פרקדן עם הראש ממוקם קונוס הנשימה עם אספקה של 5% isofלוריאן בחמצן והגפיים והזנב מודבק בתוך כיסוי כימי.
  2. הרסקרדיאל פרזיה
    1. , משתמש בפינצטה. מרים את העור מתחת לצלעות הפוך לחתך של 5-6 ס מ עם מספריים מעוקלים וקהה דרך העור כדי לחשוף את חלל הבטן. חותכים כלפי מעלה דרך קיר הבטן עד הכבד והסרעפת גלויים.
    2. הזז בעדינות את הכבד הרחק מהדיאגרמה. עם איריס מספריים, לעשות חתך לרוחב 3-4 ס מ בסרעפת.
    3. חותכים את כלוב הצלעות לאורך שני צידי הגוף כדי לחשוף את חלל החזה. להיזהר לא לפגוע בלב ולהימנע הריאות. הרם את עצם החזה. כדי לחשוף את הלב
    4. לאחר הלב הוא נראה, להזריק 0.05 mL של תמיסת הפארין נתרן (1,000 USP לכל mL) לתוך החדר השמאלי כמו נוגד קרישה. לאחר מכן, הוסף מחט היתוך בזהירות לתוך החדר השמאלי. ודא כי המחט נשאר בחדר ואינו לחדור אל תאי לב אחרים. לעשות חתך קטן באטריום הימני עם מספריים איריס.
    5. מבשם עם פתרון ACSF בקצב של כ 10 מ"ל/min עד הנוזל הקיים הגוף מנוקה מדם (1-2 דקות).
    6. מעבר מפתרון acsf לפתרון קבע מבלי להציג בועות אוויר. מבשם עם פתרון מייצב עבור 10 דקות בשעה 10 עד 20 מ ל/דקה.
      זהירות: שמור על עצמך ללא פתרון הקבע מרוקן מהאף. הדבר מעיד על כך שהמחט הגיעה לחדר הימני והקיבעון נע אל הריאות ולא דרך מעגל מערכתי לשאר חלקי הגוף.
  3. חיתוך המוח
    1. להסיר את הראש של העכבר עם מספריים ולנתח בזהירות את המוח העכבר מהגולגולת. מקום בתמיסה הקבע עבור 1.5 h בטמפרטורת החדר לתקופה קצרה שלאחר הקיבוע.
      הערה: הפרזיה טובה היא הכרחית להצלחה מוצלחת של iontophoresis. המוח צריך להיות בצבע לבן ולהעדר דם בתוך המוח. הגוף והגפיים צריכים להיראות נוקשים.

3. הכנת פרוסה

  1. הכנת פרוסות היפוקמאל
    1. לשטוף את המוח עם 0.1 M פוספט באגירה מלוחים (PBS) בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. לאחר מכן, לייבש את המוח עם נייר סינון ולהסיר את נורת הריח ואת המוח המוחי עם להב תער חדה.
    2. הר את המוח על מגש הרטט באמצעות דבק ציאנואקרילי ולמלא את המגש עם PBS בטמפרטורת החדר. גזור סעיפים היפוקמאל ילתית של 110 יקרומטר עובי.
      הערה: התאימו את ההגדרה של הרטט כדי לוודא שפרוסות בעלות עובי זהה ואפילו משטח. עבור ניסוי זה, שימשו הגדרת מהירות של 4.5 והגדרת תדירות של 8, שהן הגדרות שרירותיות על המכשיר (טבלת חומרים). ייתכן שהמשתמשים יצטרכו להתנסות עם ההגדרות בהתקנים אחרים.
    3. לאסוף את הסעיפים מן המגש ומניחים בקערה של PBS על הקרח.

4. הכנה לאלקטרודה

  1. הכינו אלקטרודה חדה עם התנגדות מתאימה.
    1. השתמש בכלי זכוכית בורוסיליקט לחבית בודדת עם נימה (מנת יתר 1.0 מ"מ, זיהוי 0.58 מ"מ). משוך אלקטרודה על פולר מיקרופיפטה (טבלת חומרים). כימיקלים אידיאליים מלא 1.5% LY ב 5 מ"מ KCl צריך התנגדות של 200 MΩ כאשר ממוקם לתוך אמבטיה של PBS.
      הערה: ההגדרה פולר משתנה בהתאם למנגנון (סוג המכונה בשימוש, ולאחר הלהט הפולר). הגדרת חום גבוהה יותר מעניקה בדרך כלל עצות יותר ויותר. עבור הפולר מיקרופיפטה המשמש בניסוי זה, ההגדרות היו: חום: 317, למשוך: 90, מהירות: 70, ו עיכוב: 70. נעשה שימוש בנימה של סוג שוקת.
    2. אחסן אלקטרודות במיכל סגור כדי למנוע מאבק להיכנס לקצה. שמור על האלקטרודות הגבוהות מהחלק התחתון של התיבה כדי למנוע את שבירת הקצה.
  2. למלא את האלקטרודה עם פתרון לצבוע LY.
    1. הצב אלקטרודה במיקום אנכי כאשר הקצה פונה כלפי מטה. הפיפטה 1-2-3 μL של פתרון LY לתוך החלק האחורי של האלקטרודה ולחכות 5-10 דקות עבור הפתרון כדי לעבור את העצה באמצעות הפעולה נימי.
    2. אבטח בעדינות את האלקטרודה המלאה במחזיק האלקטרודות המחובר למניפולטור.
      הערה: חוט כסף של בעל האלקטרודה צריך להיות במגע עם LY בתוך האלקטרודה. כוונן את עוצמת הקול של הפתרון LY במידת הצורך, בהתאם לאורך הכבל.

5. מילוי אסטרוציטים עם יוטופהורזיס

  1. . תבדוק את האלקטרודות
    1. מניחים נתח מוח בעדינות לתוך הצלחת התחתונה זכוכית מלא 0.1 M PBS בטמפרטורת החדר. החזיקו את הפרוסה במקום עם נבל פלטינה עם מחרוזות ניילון.
    2. ודא כי האלקטרודה מחוברת למקור מתח ומניחים את הקרקע בתוך האמבט המכיל את פרוסת המוח.
    3. הזיזו את המטרה לאזור העניינים של המוח.
    4. הנמך את האלקטרודה לתוך הפתרון. תחת השדה הבהיר, להעביר אותו למרכז שדה התצוגה ולבחון אותו בזהירות עם העדשה 40 x טבילה המים כדי להבטיח כי הוא מופיע ברור וללא פסולת או בועות. אם יש משהו שסותם את. קצה האלקטרודה, החלף אותו באחד חדש
      הערה: סתימת הוא דאגה. לMΩ האלקטרודה ה200 עם צנטריפוגה וסינון של פתרון הצבע לפני כל ניסוי, זו לא צריכה להיות בעיה תכופה. עם זאת, בגלל קצה האלקטרודה הוא קטן, הרקמה עשויה לפעמים להיתקע בפתח. המחברים לא מצאו דרך למנוע זאת, אך ניתן לטפל בו בקלות על-ידי שימוש פשוט באלקטרודה חדשה.
    5. שימו לב לקצה האלקטרודה מתחת למיקרוסקופ סריקת לייזר ממוקד עם 488 ננומטר לייזר. לאחר מכן, בדיקת הפליטה של הצבע על-ידי הפעלת הגירוי ב-12 וולט הערה ענן של צבע פלורסנט גדול סביב קצה האלקטרודה בזמן שהגירוי מופעל. אם לא או צבע קטן נפלט על גירוי מתח, להחליף את האלקטרודה.
    6. תחת השדה הבהיר, הנמך באיטיות את האלקטרודה כלפי הפרוסה העוצרת מעל פני השטח.
  2. מילוי אסטרוציט עם יוטופהורזיס.
    1. זיהוי האסטרוציטים 40-50 יקרומטר מתחת למשטח הפרוסה בניגוד להתערבות הדיפרנציאלית באינפרא-אדום (IR-DIC). לחפש תאים עם מוארך, בצורת אליפסה, בקוטר של 10 יקרומטר. ברגע שנבחר אסטרוציט, הזז אותו למרכז שדה הראייה.
      הערה: לתא טוב ליוטופהורזיס יש. גבולות ברורים ומוגדרים סביבו אל תבחרו בתאים קרובים מדי למשטח הפרוסה מכיוון שהם לא יכולים להיות מלאים לחלוטין. זה לוקח קצת תרגול במשך כמה ימים כדי להיות מסוגל לזהות באופן שגרתי אסטרוציטים למילוי צבע. בהתאם לאזור המוח המשמש את הניסוי, מספר האסטרוציטים עשוי להשתנות. זה עשוי להשפיע על הזמן הדרוש כדי לזהות אסטרוציט לפני מילוי.
    2. הנמך באיטיות את קצה האלקטרודה לתוך הפרוסה, מנווט דרך הרקמה, עד שהוא נמצא על אותו מישור כמו גוף התא.
      הערה: להעביר את האלקטרודה לאט כדי למנוע פגיעה ברקמה.
    3. לאחר גוף התא של אסטרוציט הוא ברור לעין מחולקת, לאט ובעדינות לקדם את האלקטרודה קדימה. העבר את האלקטרודה עד שהקצה מחלק את הסומה של התא. להעביר את המוקד של אובייקטיבי לאט למעלה ולמטה כדי לציין אם האלקטרודה היא בתוך הסומה.
      הערה: העצה האלקטרודה חייבת להיות בתוך גוף התא, וכניסה קטנה על סומה צריך להיות נצפתה. אין להזיז את האלקטרודה יותר כדי למנוע את הקצה העובר בתא.
    4. לאחר שעצת האלקטרודות נמצאת בתוך התא, הפעל את מכשיר הגירוי ב-~ 0.5 עד 1 V והוצא את הזרם הנוכחי לתוך התא. , בעזרת מיקרוסקופ הקונמוקד. שים לב למילוי התא הגדל את הזום הדיגיטלי כדי לראות את פרטי התא וודא שקצה האלקטרודה גלוי בתוך התא.
      הערה: הנמך את המתח אם נראה כי הצבע דולף מהתא או ממלא תאים אחרים בסביבה. אם נראה כי הצבע עדיין דולף מתוך התא, למשוך אלקטרודה החוצה לאט ולמצוא תא אחר. חשוב כי הצבע אינו לדלוף יש יחס אות/רקע גבוה בתמונה הסופית.
    5. המתן כ-15 דקות עד שהענפים והתהליכים הטובים יותר יופיעו, כבו את המתח ומשוך בעדינות את קצה האלקטרודה מהתא.
  3. צלם את התא המלא.
    הערה:     ניתן לבצע הדמיה מיד לאחר מילוי או בעקבות הצביעת עם אימונוהיסטוכימיה. מטרה בעלת פתח מספרי גבוה יותר (NA) גורמת לרזולוציה טובה יותר.
    1. המתן עד שהתא יחזור לטופס המקורי לפני הדמיה (15 עד 20 דקות) עם מטרה 40x. כדי לדמות את התא, התאם את ההגדרה באמצעות החיבור כדי לוודא שהענפים והתהליכים הטובים יותר מופיעים כמשמעותם.
    2. הגדר מחסנית z עם גודל שלב של 0.3 μm. בזמן הדמיה, להעביר את המטרה עד שאין אות מתא ולהגדיר את זה כחלק העליון. לאחר מכן, הזז את המטרה למטה (התמקדות דרך התא) עד שאין אות, קבע כי כתחתית.
    3. לאחר השלמת ההדמיה, בדוק את האלקטרודה להוציא את הצבע. אם מופיע ענן צבע גדול, ניתן להשתמש בו לפרוסה הבאה. אחרת, החלף אותו באלקטרודה חדשה.
      הערה: מילוי צבע של אסטרוציט יחיד והדמיה לוקח כ 45 דקות עד 1 h. עבור ניסוי ספציפי זה, ניתן היה להשיג כ 3-6 תאים לכל עכבר. במידת הצורך, ניתן לתייג תאים מרובים באותה פרוסה. עם זאת, כדי להבדיל astrocytes בודדים, הקפד לשמור על מרחק של כ 200 יקרומטר בין התאים.

6. צביעת עם אימונוהיסטוכימיה (אופציונאלי)

  1. לאחר ההדמיה נעשה, מיד למקם את הפרוסה ב 10% פורמלין על הקרח כדי לשמר עבור אימונוהיסטוכימיה. שמרו על פרוסות מוחית בחשכה ואחסנו במשך הלילה ב -4 ° c.
  2. לשטוף את מקטעי המוח 3x ב 0.1 M PBS עם 0.5% nonionic החומרים (כלומר, טריטון X 100) עבור 5 דקות כל אחד. לאחר מכן מודדת בפתרון חוסם של 0.1 M PBS עם 0.5% nonionic החומרים ו 10% סרום עז רגיל (NGS) עבור 1 h בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדינה.
  3. מודלת את הסעיפים עם עצבנות בנוגדנים העיקריים מדולל 0.1 M PBS עם 0.5% nonionic החומרים ו 5% NGS עבור 2 ימים ב 4 ° c.
    הערה: בגלל העובי של פרוסות המוח, תקופת הדגירה של הנוגדנים העיקריים צריך להיות מורחב לחדירה טובה יותר ואת ריכוז הנוגדן יכול להיות גדל. בניסוי זה, מ1:500 דילול שימש לנוגדן אנטי GFAP ו-1:500 דילול שימש עבור אנטי אקופורוב 4 נוגדן.
  4. לשטוף את הסעיפים 3x ב 0.1 M PBS עם 0.5% nonionic הסורסטנט עבור 10 דקות כל אחד ולאחר מכן דגירה עם נוגדנים משניים מדולל ב 0.1 M PBS עם 0.5% nonionic החומרים ו 10% NGS עבור 6 h בטמפרטורת החדר.
    הערה: אין לבחור נוגדן משני נרגש על ידי 488 ננומטר, אשר הוא אורך הגל המשמש להמחיש את צבע LY. בניסוי זה, 1:1000 דילול שימש לאלקסה Fluor 546 עז נגד עוף IgG (H + L) ו אלקסה Fluor 647 עז אנטי ארנב IgG (H + L).
  5. לשטוף את הסעיפים 3x ב 0.1 M PBS עבור 10 דקות כל אחד. לאחר מכן הר את הסעיפים על מיקרוסקופ זכוכית מחליק במדיה הרכבה מתאים לזריחה. . לאטום שקופיות תאי תמונה בגודל שלב של 0.3 μm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הנתונים המדווחים במחקר זה הם מ 7-12 תאים מ 4 עכברים בכל ניסוי. נתונים ממוצעים מדווחים בלוחות האיור במידת הצורך.

כדי להעריך את מורפולוגיה אסטרוציט, הצלחנו לבצע בדיקת האסטרוציטים תאיים באמצעות לצבוע למלא אסטרוציטים ב CA1 שכבה רדיואטום, אשר מסוכם באיור 1. איור 2 מתאר את האסטרוציט הייצוגי ומבנה הורפולוגית המשוכלל. התא היה התמונה לאחר פיקסציה עם עדשת השמן 60x טבילה על מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד באמצעות קו הלייזר 488 ננומטר (גודל השלב של 0.3 יקרומטר ו 3.0-3.5 x זום דיגיטלי). הצינור הפוטוסולייר (PMT), היסט ופונקציות הרווח של המיקרוסקופ הקונטוייתי, הותאמו ליצירת יחס אות/רקע גבוה בתמונה הסופית. באיור 2A, מטוס אופטי יחיד תמונות מ-z שונים (מוצג כל 10 μm, מסומן לפי סדר מ 1-6) לחשוף את הסומה המרכזית ומספר ענפים עיקריים אשר מחולקים לרשת צפופה של תהליכים. על-ידי יצירת הקרנת אינטנסיביות מקסימלית (גודל מחסנית של 85 μm) הבחנו בתצוגה מפורטת של המבנה של האסטרוציט והתחום שלה (איור 2ב). גם המרכיבים העיקריים של המבנה של האסטרוציט צוינו. איור 2 ג מראה זום (x4) הקרנת עוצמה מקסימלית של ענף מרכזי אחד, מספר ענפים משניים, ואת התפלגות של הרשופונים ועלונים המקיפים.

ניתוחים מורפולוגיים ושחזורים של אסטרוציטים בוצעו עם imaris אריס ניתוח תוכנה (שולחן חומרים) באמצעות תמונות שלאחר קיבוע של LY מלא האסטרוציטים (תוכנות אחרות כגון imagej יכול לשמש גם). לאחר השלמת השחזור של כל אסטרוציטוט, הכרכים של הסומה, הענפים העיקריים, התהליכים והטריטוריה הושלו בכמויות. הסומה נוצרה תחילה עם החלקה על פני השטח המוגדר למגבלת רזולוציית המישור x-y (0.25 μm). קוטר האובייקט המינימלי הוגדר ב-3.0 יקרומטר כדי להסיר אובייקטים אחרים שאינם משויכים לגוף התא. כדי ליצור את הענפים העיקריים, את עוצמת הסומה היה רעולי פנים, בשל הבהירות שלה יחסית לשאר התא. ההחלקה על פני השטח וקוטר העצם המינימלי של הענפים העיקריים הוגדרה כ-0.3 יקרומטר (גודל מישור z). כדי ליצור את התהליכים, גם האינטנסיביות של הענפים העיקריים היה מוסווה. החלקה על פני השטח הוגדרה כ-0.18 יקרומטר וקוטר האובייקט המינימלי הוגדר ל 0.3 יקרומטר. הטריטוריה של אסטרוציט נוצר באמצעות סף בעצימות נמוכה יותר החלקה הקרקע להגדיר 0.75 μm. איור 3מראה את התמונה המקורית של CA1 אסטרוציט. גוף התא, הענפים העיקריים, התהליכים, ואת נפח השטח המוקף על ידי אסטרוציט משוחזרים באיור 3ב-E. לאחר שהשחזורים של התאים נוצרו, הכרכים של הסומה, התא כולו והטריטוריה הוקמו ומספר הענפים העיקריים נספר (טבלה 1). CA1 אסטרוציטים מן הרובד רדיואטום היה נפח סומה ממוצע של 488.91 יקרומטר3, ממוצע של ~ 7 הסניפים העיקריים, נפח התא הממוצע של 5.58 x 103 יקרומטר3, ואת נפח השטח הממוצע של 2.94 x 104 יקרומטר3.

סמן אסטרוציט מאופיין, gfap, הוא חלבון ציטושלד כי מתייג את חוטי ביניים של אסטרוציט8. לאחר האסטרוציטים היו לצבוע מילא, ביצעת כתמים חיסוני gfap להמחיש ביטוי אסטרוציטים בודדים (איור 4). מצאנו כי GFAP ביטא את הסומה התא, הענפים העיקריים, וכמה ענפים משניים של אסטרוציטים, אבל לא בענפים ותהליכים עדין (איור 4א). לא נמצא הבדל משמעותי במספר הענפים העיקריים המסומנים על ידי GFAP ואלה דמיינו על ידי LY (p = 0.1573; איור 4 ב). שטח התא ונפח של אסטרוציט המסומנים על ידי gfap היו קטנים באופן משמעותי מהשטח ונפח דמיינו עם LY (p < 0.0001; איור 4 C, D). זה מדגים כי GFAP הוא סמן אמין עבור תיוג ענפים גדולים, אבל הוא לא שימושי לקביעת השטח הכולל או נפח של התא.

תכונה חשובה של אסטרוציטים היא endfeet שלהם, אשר ליצור קשר כלי דם מוצעים כדי לסייע לווסת את זרימת הדם ב-cn. כדי להבין עוד את הקשר המרחבי בין האסטרוציטים לבין המוח, אנו מוכתמים בנוגדנים נגד אקואפוטין -4 לאחר מילוי הצבע. אקופורטל-4 הוא חלבון ערוץ מים נמצא על התאים אסטרוציטים ו ependymal, והוא מבוטא במידה רבה באזורים ליד החללים ובכלי הדם15. מצאנו כי aqu, ב-4 מתבטא על אסטרוציט endfeet בסמיכות למוח ובטלטורה (איור 5א). התמונה מתארת שלושה אסטרוציט endfeet יצירת קשר עם כלי דם במיקומים שונים (המצוין על ידי החיצים הלבנים). ב CA1 שכבה רדיואטום, המספר הממוצע של endfeet לכל אסטרוציט היה ~ 2 (איור 5ב). מעניין, הענפים המכילים endfeet היו עבים באופן משמעותי מאשר הענפים העיקריים האחרים של astrocyte, באמצעות שחזורים הענף העיקרי (p = 0.0038; איור 5 ג). אנו מדדו גם את אורך הענפים המכילים מרכז הסומה לכלי הדם והשוו את זה לדרך הקצרה, הישירה ביותר לכלי הדם. אורך בפועל של הענפים לכלי הדם היה גדול באופן משמעותי מהנתיב הקצר ביותר (p = 0.0333; איור 5 ד), המעיד על כך שענפים אלה נוטים לקחת דרך ארוכה ומתארכת לכלי הדם. סרט 1 מתאר סרט של שחזור של האסטרוציט באופן ממולא ואקומדיה-4 כתמים. המרכיבים המבבניים השונים של האסטרוציטוט (הסומה, הענפים העיקריים, התהליכים והטריטוריה) מיוצגים בשלושה מימדים. האסטרוציט המלא ביחד עם הצביעת aqu, 4 מתארים את האסטרוציט endfeet המקיף את כלי הדם. משיחזור הענפים הגדולים ומכלי הדם, ניתן לדמיין את הענפים המכילים את החלק הגדול מהסומה לכלי.

בסעיפים הקודמים, כאשר מדווחים על ערכי p, השתמשנו במבחן t של סטודנט שאינו משויך, בעלת חשיבות ב-p < 0.05.

Figure 1
איור 1: דיאגרמת זרימת עבודה ביוטופזיס LY. ייצוג סכמטי של פרוטוקול המדגיש את השלבים הקריטיים. לאחר שהעכבר הושם בתיקונים, המוח הועשה. בעקבות תקופה קצרה שלאחר הקיבעון, קטעים הקורונאליות נחתכו באמצעות רטט. אלקטרודה היתה מלאה בצבע 1.5% LY. האסטרוציטים זוהו ב CA1 שכבה רדיואטום באמצעות IR-DIC על מיקרוסקופ אור. הסומה של התא היה שופד על ידי האלקטרודה, והצבע הוזרק לתוך התא על ידי החלת 0.5 עד 1 V עד התהליכים הטובים יותר היו מלאים לחלוטין. הפרוסה הייתה בעלת תמונה עם מיקרוסקופ ממוקד באמצעות עדשת טבילה במים 40x ולאחר מכן מעובדת עבור אימונוהיסטוכימיה. הדמיה נוספת הושלמה עם עדשת טבילה 60x שמן לבצע שחזור התא ניתוח מורפולוגית. מוצג דוגמה שחזור של התהליכים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: האסטרוציט באופן מלא של CA1 שכבה רדיואטום. (A) מטוס אופטי יחיד תמונות מתוך אסטרוציט המוצג כל 10 יקרומטר (מתויג1-6). (ב) השלכה מקסימלית של האסטרוציט, המתארת את התא העיקרי, כמה ענפים עיקריים, ותהליכים רבים אשר מפצות על הטריטוריה סבוך שלה. (ג) הקרנה מרבית (זום x4) של סניף אחד (מתוך הסעיף המתואר בצהוב), שני ענפים משניים, מספר ברקיות וארגון התהליכים המקיפים. סרגל קנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שחזור של אסטרוציט מלא ומרכיביו. (א) CA1 אסטרוציטממולאב-LY. (ב-ה) שחזור תלת מימדי של הסומה (ב), סומה והענפים העיקריים (C), תהליכים (D) והטריטוריה (E) בכיוון 0 ° ו-45 °. סרגל קנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: חיסוני GFAP ב-LY ממולא אסטרוציטים. (A) נציג z-הטלה של LY (ירוק) ו GFAP (מגנטה) כתמים. Gfap מתבטאת בעיקר העיקרי וכמה ענפים משניים של אסטרוציט, אבל לא נמצא בתוך הטריטוריה אסטרוציט כולו. סרגל בקנה מידה = 10 μm. (ב) גרף של מספר הענפים העיקריים המסומנים באופן באילי ו GFAP. (ג) שטח התא מסומן על ידי כתמים LY ו GFAP. (ד) נפח תא שסומן באמצעות כתמים של LY ו-GFAP. עיגולים פתוחים הם נתונים גולמיים עם ריבועים סגורים המציינים ממוצע ± SEM. הנתונים נאספו מ-12 תאים מ-4 עכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: כתמים של אקומדיה-4 בעלי מילוי האסטרוציטים. (א) נציג z-הטלה של LY (ירוק) ו אקואפוב-4 כתמים (מגנטה). אקופורטל 4 מבוטא בעיקר בעומק האסטרוציט. חיצים לבנים מציינות את שלושת הרגליים כשהם מגעים עם כלי דם סמוך. סרגל בקנה מידה = 10 μm. (ב) מספר סניפים עם endfeet לכל astrocyte. (ג) עובי ענפים עם endfeet בהשוואה לענפים העיקריים האחרים של אסטרוציטים. (ד) אורך של סניפים עם endfeet בהשוואה לנתיב הקצר ביותר לכלי הדם. עיגולים פתוחים הם נתונים גולמיים עם ריבועים סגורים המציינים ממוצע ± SEM. נתונים נאספו מ 7 תאים מ 4 עכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Movie 1
סרט 1: שחזור של האסטרוציט ממולא באופן מלא וכתמים באקופורטל 4. סרט מייצג של CA1 אסטרוציט בסמיכות לכלי דם. הסומה, הענפים העיקריים, התהליכים והטריטוריה שוחזרו כדי לנתח את המבנה של התא. שחזור הסניפים העיקריים יחד עם אקופורטל-4 מתארים שתי אסטרוציטים ישירות ליצור קשר עם כלי הדם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

מאפיינים מורפולוגיים ממוצע ± SEM
מנפח סומה (μm3) 489 ± 30
מספר הסניפים הראשיים 7.0 ± 0.5
נפח תא (μm3) 5580 ± 425
נפח שטח (μm3) 29391 ± 8150
מספר התאים 14

טבלה 1: אנליזה מורפולוגית של מבנה אסטרוציטוט. את הכרך אסטרוציט, מספר הסניפים העיקריים לכל אסטרוציט, כמות התאים אסטרוציט, ונפח המוקף טריטוריה אסטרוציט מוצגים. הנתונים נאספו מ 14 תאים מ 7 עכברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארים במאמר זה מתארת דרך להמחיש מורפולוגיה אסטרוציט באמצעות ביוטוזיס תאיים של צבע LY בפרוסות מוחית בקלות. קיימים מספר גורמים קריטיים המסומנים בפרוטוקול זה, התורמים לשחזור מוצלח של התאים ולשיחזור מורפולוגי. גורם אחד הוא האיכות והתוכסות של התמונות, אשר נקבע במידה רבה על ידי גיל העכבר ואת התוצאה של perfusion. במחקר זה, השתמשנו C57/BL6N עכברים 6-8 שבועות בן. פרזיה מוצלחת (התלויה מאוד במיקום הנכון של המחט המושרת ומציינת על-ידי מוח בצבע לבן והעדר דם בתוך המוח) הכרחית לתאים מפורטים וברורים ביותר. לאחר החלוקה על ידי אלקטרודה, קרום התא צריך לשמור על חותם צר סביב קצה האלקטרודה ולמנוע לצבוע מתוך דולף החוצה. למרות המאמצים הטובים ביותר, מדי פעם מבנים אחרים מחוץ לתא יהיה מתמלא כמו הפיפטה מתקדם דרך רקמת המוח: שללנו את התאים האלה מהניתוח. התנגדות האלקטרודות היא גורם מפתח נוסף. עמידות גבוהה רק מאפשר הוצאה יציבה של צבע מן העצה האלקטרודה על גירוי מתח. יותר מבחינה טכנית, חשוב לשמור על תנועות עדינות, איטיות כאשר לשפד את הסומה של התא עם האלקטרודה. חדירה אלקטרודה דרך התא יכול להוביל דליפת צבע מן הסומה. השחתה מוצלחת ואחריו בקשת מתח צריך לגרום למילוי צבע כמעט מיידי של גוף התא ותהליכים (כלומר, בתוך כמה שניות). הזמן הנדרש כדי למלא אסטרוציט קשור לטריטוריה שהיא כוללת; עם זאת, המתן להבטיח שהתהליכים הטובים ביותר ימולאו לחלוטין (לפחות 15 דקות).

מצאנו את הפרוטוקול הזה להיות הדרך הנאמנה ביותר ללמוד מורפולוגיה אסטרוציט בפירוט, בכל זאת, לשיטה יש מגבלות. זיהוי תא עשוי לגזול זמן רב ומועדים לשגיאות. תחת IR-DIC, יש לזהות תכונות ייחודיות המזמידות את סוג התא הספציפי (צורה וגודל בסומה). לחילופין, הביטוי של כתבים פלורסנט אדום במיוחד ב astrocytes, על ידי הזרקה נגיפית או קו העכבר הטרנסגניים הכתב, מאפשר זיהוי קל יותר של תאים אלה לפני מילוי. גם, LY הוא מוגבל כמו לצבוע ציטוסולג כי זה לא יכול לשמש לתווית קרום אסטרוציט, בהשוואה לתיוג עם ממברנה קשור gfp, כגון lck-gfp16. Lck-GFP ייתן ייצוג מדויק יותר של השטח כולו, כמו iontophoresis למשל מגלה את הנפח הפנימי של astrocyte. עם זאת, בהתאם לעיצוב ניסיוני, LY iontophoresis מתאים יותר לפתור את הנפח הפנימי אסטרוציט כולו, לפתח שחזורים תלת ממדיים, ולכמת את הרכיבים האנטומיים המרכיבים את המבנה של אסטרוציט6 . לבסוף, כמו עם כל הצורות של מיקרוסקופ קונפוקלית הפתרון המרחבי מוגבל על ידי עקיפה, ציין את הפונקציה התפשטות הנקודה של המיקרוסקופ אופטיקה17. שינוי רכיבים של מערכת הדמיה, כגון קוטר חריר הפחתת, יעזור לשפר את התמונות, אבל הרזולוציה האמיתית נקבעת על ידי אורך הגל של האור ואת הצמצם המספרי של העדשה האובייקטיבית. במקרה שלנו, אנו מעריכים את הפתרון הטוב ביותר האפשרי הוא כנראה סביב 300 ננומטר, אשר עשוי להיות גרוע יותר בציר z.

באופן LY iontophoresis מציע מספר יתרונות על פני שיטות אחרות בשימוש נפוץ לתווית astrocytes. הפרוטוקול יכול להיות מיושם כל מודל העכבר הוקמה, האוכלוסייה תאים, או אזור המוח18,19,20 כפי שהוא אינו מוגבל על ידי מיזם ספציפי אסטרוציט או קו העכבר הטרנסגניים. גישות גנטיות לבטא חלבונים פלואורסצנטי באופן מפורש ב אסטרוציטים על ידי זריקות ויראלי או שורות כתב עכבר הטרנסגניים (כלומר, td-עגבניה) דורשים שימוש ביזם אסטרוציט, אשר, באזורים מסוימים, ניתן להתבטא בסוגי תאים אחרים או לא כוללים את כל האסטרוציטים21. LY iontophoresis הוא גם יעיל בזמן, כמו זריקות ויראלי של חלבונים פלורסנט דורשים ניתוח וזמן לבטא את הווירוס הספציפי, קווי העכבר הטרנסגניים דורשים הרבייה. בסופו של דבר, באופן בודד הוא שיטה שימושית כדי להבדיל בין תאים בודדים, בעוד אסטרטגיות אחרות גם צריך להיות משולב עם שיטה עבור תיוג דליל כדי להמחיש את הטריטוריות של האסטרוציטים בודדים22,23, . עשרים וארבע עם זאת, אף אחת מהשיטות היא תרופת פלא, והבחירה בה צריכה להיות מותאמת לשאלה הספציפית הנדונה.

מחקרים עתידיים יכולים להעסיק מניפולציות ניסיוני ספציפיים לבחון מרכיבים שונים של מבנה אסטרוציט (סומה, סניפים, תהליכים, טריטוריה, וכו ') כדי לענות על שאלות מורפולוגית. זה יכול לספק תובנה וכיוון לתוך מורפולוגיה אסטרוציט ואת ההשלכות הפונקציונליות שלה, אשר ניתן לנתח עוד יותר על ידי מיקרוסקופ אור סופר ברזולוציה או אלקטרון מיקרוסקופ4. לדוגמה, מספק לעצמי iontophoresis האמצעים להמחיש תהליכים אסטרוציט עדינים, אשר ליצור קשר עם אלפי סינפסות ומעורבים פונקציות סינפטית. לימוד כיצד המבנה של תהליכים אלה משתנה בתנאים פתולוגיים שונים יכול לעזור להבהיר את התפקידים של אסטרוציטים בריאות ומחלות. באופן LY iontophoresis היא טכניקה חשובה כדי להמחיש את מורפולוגיה התא מפורט ולאפיין את המאפיינים אסטרוציט כדי להבין טוב יותר את הפונקציות שלהם במערכת העצבים המרכזית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מודים לגב סוטו, ד ר יו וד ר אוקטו להדרכה, כמו גם הערות על הטקסט. עבודה זו נתמכת על-ידי NS060677.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Buffered Formalin Phosphate Fisher SF 100-20 An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane Pall 4692 An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet WPI EP2 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) Thermo Scientific A-11040 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Scientific A27040 A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody Novus Biologicals NBP1-87679 A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody Abcam ab4674 A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament World precision instruments 1B150F-4
C57BL/6NTac mice Taconic Stock B6 A similar alternative can be used
Calcium Chloride Sigma 21108 An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000MPE A similar alternative can be used
D-glucose Sigma G7528 An identical alternative can be used
Disodium Phosphate Sigma 255793 An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97 Sutter P-97 A similar alternative can be used
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) Sagent Pharmaceuticals 400-10 An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5) Bitplane Inc. A similar alternative can be used
Isofluorane Henry Schein Animal Health 29404 An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) Clipper 1050035 An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt Sigma L0144
Magnesium Chloride Sigma M8266 An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass Thermo Scientific 24X60-1 An identical alternative can be used
Microscope Slides Fisher 12-544-2 An identical alternative can be used
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000 An identical alternative can be used
Objective lens (40x) Olympus LUMPLFLN 40XW A similar alternative can be used
Objective lens (60x) Olympus PlanAPO 60X A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL VWR VWRVE404 An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200 Sutter MP-285 / ROE-200 / MPC-200 A similar alternative can be used
Potassium Chloride Sigma P3911 An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 An identical alternative can be used
Sodium Chloride Sigma S5886 An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010 World precision instruments Omnical 2010 A similar alternative can be used
Triton X 100 Sigma T8787 An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000 Pelco 100-S A similar alternative can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
  2. Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
  3. Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
  4. Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
  5. Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
  6. Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
  7. Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
  8. Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
  9. Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
  10. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  11. Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
  12. Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
  13. Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  15. Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
  16. Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
  17. Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
  18. Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
  19. Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
  20. Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
  21. Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
  22. Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
  23. Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
  24. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).

Tags

מדעי המוח סוגיה 151 לוציפר צהוב astrocyte מורפולוגיה מילוי צבע קצה כף הרגל aqu 3D שחזור היפוקמפוס
המחשה מורפולוגיה באמצעות לוציפר ביוטופזיס צהוב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moye, S. L., Diaz-Castro, B.,… More

Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter