Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Visualisering af Astrocyt morfologi ved hjælp af Lucifer Yellow iontophoresis

Published: September 14, 2019 doi: 10.3791/60225
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

Summary

Astrocytter er morfologisk komplekse celler, eksemplificeret ved deres mange processer og Bushy territorier. For at analysere deres udførlige morfologi præsenterer vi en pålidelig protokol til at udføre intracellulær Lucifer gul iontophorese i let fast væv.

Abstract

Astrocytter er essentielle komponenter i neurale kredsløb. De flise hele centralnervesystemet (CNS) og er involveret i en række forskellige funktioner, som omfatter neurotransmitter clearance, ionregulering, synaptisk modulation, metaboliske støtte til neuroner, og blodgennemstrømning regulering. Astrocytter er komplekse celler, der har en Soma, flere store filialer, og talrige fine processer, der kontakter forskellige cellulære elementer i neuropil. For at vurdere morfologien af astrocytter, er det nødvendigt at have en pålidelig og reproducerbar metode til at visualisere deres struktur. Vi rapporterer en pålidelig protokol til at udføre intracellulær iontophorese af astrocytter ved hjælp af fluorescerende Lucifer gul (LY) farvestof i let fast hjernevæv fra voksne mus. Denne metode har flere funktioner, der er nyttige til at karakterisere astrocyt morfologi. Det giver mulighed for tredimensionel rekonstruktion af individuelle astrocytter, hvilket er nyttigt at udføre morfologiske analyser på forskellige aspekter af deres struktur. Immun histokemi sammen med ly iontoforese kan også udnyttes til at forstå samspillet mellem astrocytter med forskellige komponenter i nervesystemet og til at evaluere ekspression af proteiner inden for de mærkede astrocytter. Denne protokol kan implementeres i en række musemodeller af CNS lidelser til nøje at undersøge astrocyt morfologi med lys mikroskopi. LY iontoforese giver en eksperimentel tilgang til at evaluere astrocyt struktur, især i forbindelse med skade eller sygdom, hvor disse celler er foreslået at gennemgå betydelige morfologiske ændringer.

Introduction

Astrocytter er de mest rigelige gliale celler i centralnervesystemet (CNS). De spiller roller i ion homøostase, blodgennemstrømning regulering, synapse dannelse samt elimination, og neurotransmitter optagelse1. Den brede vifte af astrocyt funktioner afspejles i deres komplekse morfologiske struktur2,3. Astrocytter indeholder flere primære og sekundære grene, som opdeles i tusindvis af finere branchlets og foldere, der direkte interagerer med synapser, dendritter, axoner, blodkar og andre gliale celler. Astrocyte morfologi varierer på tværs af forskellige hjerneområder, som kan antyde deres evne til at udføre deres funktioner differentielt i neuronal kredsløb4. Desuden, astrocytter er kendt for at ændre deres morfologi under udvikling, under fysiologiske forhold, og i flere sygdomstilstande3,5,6.

En konsistent, reproducerbar metode er nødvendig for præcist at løse kompleksiteten af astrocyt morfologi. Traditionelt har immun histokemi været brugt til at visualisere astrocytter med brug af astrocyt specifikke eller astrocyt beriget protein markører. Men disse metoder afslører mønsteret af protein udtryk i stedet for strukturen af astrocyt. De almindeligt anvendte markører, såsom gliaceller fibrillært syreholdigt protein (GFAP) og S100 calcium bindende protein β (S100β), udtrykker ikke i hele cellens volumen og løser derfor ikke fuldstændig morfologi7. Genetiske tilgange til at udtrykke fluorescerende proteiner allestedsnærværende i astrocytter (virale injektioner eller transgene muse reporter linjer) kan identificere de finere grene og samlede territorium. Men det er svært at skelne individuelle astrocytter, og analyser kan være partisk af astrocyt populationen målrettet af den specifikke promotor8. Seriel sektion elektronmikroskopi er blevet brugt til at afsløre et detaljeret billede af samspillet mellem astrocyt processer med synapser. På grund af de tusindvis af astrocyt processer, der kontakter synapser, er det i øjeblikket ikke muligt at rekonstruere en hel celle med denne teknik9, selv om dette forventes at ændre sig med brugen af Machine Learning tilgange til dataanalyse.

I denne rapport fokuserer vi på en procedure til at karakterisere mus astrocytter ved hjælp af intracellulær iontophorese med Lucifer Yellow (LY) farvestof, ved hjælp af Carnot stratum radiatum som et eksempel. Metoden er baseret på banebrydende tidligere arbejde af Eric Bushong og Mark Ellisman10,11. Astrocytter fra let fast hjerne skiver er identificeret ved deres karakteristiske Soma form og fyldt med LY. Cellerne er derefter afbildet med confokal mikroskopi. Vi demonstrerer, hvordan LY iontophorese kan bruges til at rekonstruere individuelle astrocytter og udføre detaljerede morfologiske analyser af deres processer og territorium. Denne metode kan også anvendes sammen med immun histokemi til at identificere rumlige relationer og interaktioner mellem astrocytter og neuroner, andre gliale celler og hjernens vaskulatur. Vi betragter ly iontoforese at være et meget velegnet værktøj til at analysere morfologi i forskellige hjerneområder og musemodeller af sunde eller sygdomstilstande7,12,13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøgene i denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med National Institute of Health guide til pleje og brug af forsøgsdyr og blev godkendt af kanslerens dyre forskningsudvalg ved University of California, Los Angeles. Voksne mus (6 − 8 uger gamle) af blandet køn blev anvendt i alle forsøg.

1. klargøring af opløsningen

  1. Kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) opløsning
    1. Forbered frisk ACSF opløsning (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 14,7 mm NaHCO3, 11 mm D-glucose, 1,25 mm na2HPO4og 2 mm CaCl2) før hvert eksperiment. Tilsæt MgCl2 og CaCl2 i det sidste trin. Komponenterne opløses i deioniseret vand af høj kvalitet.
    2. ACSF-opløsningen inkubates ved 35 °C i et vandbad og boble med 95% O2/5% Co2 i mindst 30 minutter før forsøget.
    3. Tilsæt 2% lidocain hydrochlorid for at nå en endelig koncentration på 0,02% i ACSF (i 100 mL).
  2. Fikativ opløsning
    1. Brug 10% formalin Buffered fosfat.
  3. LY farvestof opløsning
    1. Forbered 1,5% LY farveopløsning ved at opløse LY CH dilithium salt eller LY CH dikalium salt i 5 mM KCl. vortex grundigt. En volumen på 1 mL er tilstrækkelig til flere eksperimenter.
    2. Centrifuger i 10 min. ved 16.800 x g. Derefter filtreres supernatanten med et 0,2 μm sprøjte filter i et nyt rør. Aliquoter kan opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder.
      Bemærk: Det er afgørende at centrifuge og filtrere farveopløsningen for at forhindre aggregering af de farve partikler, som kan tilstoppe elektroden.

2. mus Transcardial perfusion og hjernen Dissection

  1. Klargøring af udstyr og mus til transcardial perfusion
    Bemærk:     C57/BL6 mus af begge køn kan bruges. Det har været empirisk observeret, at for metoden til at arbejde pålideligt, er det vigtigt, at musene ikke er ældre end 3 måneder (6 − 8 uger gammel er ideel). Perfusions protokollen er beskrevet nedenfor. Der findes en yderligere henvisning til flere oplysninger14.
    1. Ryd perfusions slange med ACSF-opløsning for at fjerne eventuelle luftbobler i linjen. Oprette kirurgi værktøjer i rækkefølge (pincet, buet, stump saks, iris saks).
    2. Dybt anæstetize mus ved at sætte det ind i en isofluran induktions kammer, efter tilsætning af 2 − 3 ml isofluran til kammeret. Lad 1 − 2 min for anæstetika træde i kraft. Sørg for, at vejrtrækningen ikke stopper.
    3. Test for tå knivspids refleks. Fortsæt, når musen er afvisende over for smerte stimulus og refleks er fraværende. Fastgør dyret i liggende stilling med hovedet anbragt i åndedræts keglen med en tilførsel på 5% isofluran i ilt og lemmer og hale, der er nedhængt i en kemisk stinkhætte.
  2. Transcardial perfusion
    1. Brug pincet, løft huden under rib Cage. Lav en 5 − 6 cm indsnit med den buede, stump saks gennem huden for at udsætte bughulen. Skær opad gennem bugvæggen, indtil leveren og mellem gulvet er synlige.
    2. Flyt forsigtigt leveren væk fra diagrammet. Med iris saks, lav en 3 − 4 cm lateral indsnit i membranen.
    3. Skær gennem ribburet langs begge sider af kroppen for at udsætte brysthulen. Pas på ikke at beskadige hjertet og undgå lungerne. Løft brystbenet op for at afsløre hjertet.
    4. Når hjertet er synligt, indsprøjtes 0,05 mL heparin natrium opløsning (1.000 USP pr. mL) i venstre ventrikel som en antikoagulans. Indsæt derefter perfusions nålen forsigtigt i venstre ventrikel. Sørg for, at nålen forbliver i ventriklen og ikke gennembore til andre hjertekamre. Lav et lille snit i det højre atrium med iris saks.
    5. Perfuse med ACSF opløsning med en hastighed på ca. 10 mL/min indtil væsken eksisterende kroppen er ryddet af blod (1 − 2 min).
    6. Skift fra ACSF-løsning til fixativ opløsning uden at indføre luftbobler. Perfuse med fiktionativ opløsning i 10 minutter ved 10 − 20 mL/min.
      Forsigtig: Pas på, at ingen fixativ opløsning dræne fra næsen. Dette indikerer, at nålen nåede højre ventrikel og fiksativ er at rejse til lungerne i stedet for gennem den systemiske kredsløb til resten af kroppen.
  3. Dissektion af hjernen
    1. Fjern hovedet af musen med en saks og forsigtigt dissekere muse hjernen fra kraniet. Placer i fikserings opløsning til 1,5 h ved stuetemperatur i en kort periode efter fiksering.
      Bemærk: En god perfusion er nødvendig for vellykket LY iontophoresis. Hjernen skal være hvid-farvet og fraværende af blod i hjernen vasculature. Krop og lemmer skal fremstå stive.

3. klargøring af skive

  1. Fremstilling af hippocampale skiver
    1. Hjernen vaskes med 0,1 M fosfat bufferet saltvand (PBS) ved stuetemperatur i 5 minutter. Derefter tørre hjernen med filtrerpapir og fjerne olfaktoriske pære og cerebellum med en skarp barberkniv.
    2. Monter hjernen på vibratome bakken ved hjælp af cyanoacrylatlim og fyld bakken med PBS ved stuetemperatur. Skær hippocampus-koronale sektioner af 110 μm tykkelse.
      Bemærk: Juster indstillingen af vibratome for at sikre, at skiver har samme tykkelse og jævn overflade. Til dette eksperiment blev der anvendt en hastighedsindstilling på 4,5 og en frekvensindstilling på 8, som er vilkårlige indstillinger på instrumentet (tabel over materialer). Brugere kan være nødt til at eksperimentere med indstillingerne på andre enheder.
    3. Saml afsnittene fra bakken og sted i en skål af PBS på is.

4. fremstilling af elektrode

  1. Forbered en skarp elektrode med passende modstand.
    1. Brug en enkelt cylinder elektrode med borosilikat glas med glødetråd (OD 1,0 mm, id 0,58 mm). Træk en elektrode på en mikropipette aftrækker (tabel over materialer). Ideelle elektroder fyldt med 1,5% LY i 5 mM KCl skal have en modstand på 200 MΩ, når de placeres i et bad af PBS.
      Bemærk: Pullerindstilling varierer afhængigt af apparatet (maskintype og pullergløde tråd). En højere varme indstilling giver normalt længere og finere tips. For den mikropipette aftrækker, der blev anvendt i dette eksperiment, var indstillingerne: varme: 317, træk: 90, hastighed: 70 og forsinkelse: 70. Der blev anvendt en glødetråd af dal-typen.
    2. Opbevar elektroder i en lukket beholder for at forhindre støv i at trænge ind i spidsen. Hold elektroderne forhøjede fra bunden af kassen for at forhindre spidsen i at bryde.
  2. Fyld elektroden med LY-farveopløsning.
    1. Placer en elektrode i lodret position med spidsen vendt nedad. Afpipettér 1 − 2 μL LY-opløsning på bagsiden af elektroden, og vent 5 − 10 minutter, så opløsningen flyttes til spidsen via kapillar handling.
    2. Fastgør forsigtigt den fyldte elektrode i Elektrodeholderen, der er tilsluttet en manipulator.
      Bemærk: Elektrode ledningens sølvfarvede ledning skal være i kontakt med den LY, der er inde i elektroden. Juster lydstyrken for LY-opløsningen, hvis det er nødvendigt, afhængigt af trådlængden.

5. fyldning af astrocytter med iontophoresis

  1. Test elektroden.
    1. Placer en hjerne skive forsigtigt i en glasbund skål fyldt med 0,1 M PBS ved stuetemperatur. Hold skiven på plads med en platin Harpe med nylon strenge.
    2. Sørg for, at elektroden er forbundet til en spændingskilde, og Placer jordelektroden i badet, der indeholder hjerne skiven.
    3. Flyt målet til hjernen region af interesse.
    4. Sænk elektroden ind i opløsningen. Under det lyse felt, flytte det til midten af synsfeltet og undersøge det omhyggeligt med 40x vand nedsænkning linse for at sikre, at det synes klart og uden snavs eller bobler. Hvis der er noget tilstopning elektrodespidsen, Udskift den med en ny.
      Bemærk: Tilstopning er en bekymring for 200 MΩ elektroden. Med centrifugering og filtrering af farveopløsningen før hvert eksperiment, bør dette ikke være et hyppigt problem. Men fordi spidsen af elektroden er lille, kan væv nogle gange blive stukket i åbningen. Forfatterne har ikke fundet en måde at forhindre dette, men det kan let håndteres ved blot at bruge en ny elektrode.
    5. Overhold spidsen af elektroden under det konfokale laser scannings mikroskop med 488 nm-laseren. Derefter, test Dye udslyngning ved at tænde stimulatoren på 12 V. Bemærk en stor fluorescerende farvestof Sky omkring spidsen af elektroden, mens stimulatoren er på. Hvis der ikke er nogen eller kun lidt farve, der skubbes ud ved spændings stimulering, skal elektroden udskiftes.
    6. Under det lyse felt, langsomt sænke elektroden mod udsnittet stopper lige over overfladen.
  2. Fyld astrocyt med iontophoresis.
    1. Identificer astrocytter 40 − 50 μm under udsnitsfladen med den infrarøde differens interferens kontrast (IR-DIC). Kig efter celler med aflange, ovale somata omkring 10 μm i diameter. Når en astrocyt er valgt, flytte den til midten af synsfeltet.
      Bemærk: En god celle til iontophorese har klare, definerede grænser omkring den. Undlad at vælge celler for tæt på udsnittets overflade, da de ikke kan fyldes helt. Det tager nogle praksis over et par dage at være i stand til rutinemæssigt at identificere astrocytter for farvestof påfyldning. Afhængigt af det hjerne område, der anvendes til eksperimentet, kan antallet af astrocytter variere. Dette kan påvirke den tid, der er nødvendig for at identificere en astrocyt før påfyldning.
    2. Sænk langsomt elektrodespidsen ind i skiven, Naviger gennem vævet, indtil det er på samme plan som celle legemet.
      Bemærk: Bevæg elektroden langsomt for at undgå beskadigelse af vævet.
    3. Når celle kroppen af astrocytten er klart synlig og skitseret, langsomt og forsigtigt forhånd elektroden fremad. Flyt elektroden, indtil spidsen mig Soma af cellen. Flyt fokus for mål langsomt op og ned for at bemærke, hvis elektroden er inde i Soma.
      Bemærk: Elektrodespidsen skal være inde i celle legemet, og en lille indrykning på Soma skal observeres. Bevæg ikke elektroden yderligere for at undgå, at spidsen går gennem cellen.
    4. Når elektrodespidsen er inde i cellen, skal du tænde stimulatoren på ~ 0.5 − 1 V og kontinuerligt skubbe strømmen ind i cellen. Brug af Konfokal mikroskop, se celle fyldet. Forøg den digitale zoom for at se detaljerne i cellen og sørg for, at spidsen af elektroden er synlig inde i cellen.
      Bemærk: Sænk spændingen, hvis det viser sig, at farvestoffet lækker ud af cellen eller fylder andre celler i nærheden. Hvis det viser sig, at farvestoffet stadig lækker ud af cellen, skal du trække elektroden ud langsomt og finde en anden celle. Det er vigtigt, at farvestoffet ikke lække til at have et højt signal/baggrundsforhold i det endelige billede.
    5. Vent ca. 15 minutter, indtil de finere grene og processer er defineret, sluk for spændingen, og træk forsigtigt elektrodespidsen ud af cellen.
  3. Afbilde den udfyldte celle.
    Bemærk:     billeddannelse kan udføres umiddelbart efter påfyldning eller efter farvning med immun histokemi. Et mål med en højere numerisk blænde (NA) resulterer i bedre opløsning.
    1. Vent, indtil cellen vender tilbage til oprindelig form før billeddannelse (15 − 20 minutter) med 40x objektiv. Hvis du vil afbilde cellen, skal du justere indstillingen på Konfokal for at sikre, at de finere grene og processer vises defineret.
    2. Konfigurer en z-stak med en trin størrelse på 0,3 μm. Under billedbehandling skal du flytte målet, indtil der ikke er noget signal fra cellen, og indstille det som toppen. Flyt derefter målet nedad (med fokus gennem cellen), indtil der ikke er noget signal, sæt det som bunden.
    3. Når billedbehandlingsprogrammet er færdigt, kontrolleres elektroden for farve udslyngning. Hvis der vises en stor farve på skyen, kan den bruges til det næste udsnit. Ellers skal du udskifte den med en ny elektrode.
      Bemærk: Farvning påfyldning af en enkelt astrocyt og Imaging tager omkring 45 min til 1 time. Til dette specifikke eksperiment var det muligt at opnå ca. 3 − 6 celler pr. mus. Hvis det er nødvendigt, kan flere celler mærkes på det samme udsnit. Men for at skelne individuelle astrocytter, skal du sørge for at holde en afstand på omkring 200 μm mellem cellerne.

6. farvning med immun histokemi (valgfrit)

  1. Når billeddannelse er færdig, skal du straks placere skiven i 10% formalin på is for at bevare for immun histokemi. Hold hjerne skiver i mørket og opbevar natten over ved 4 °C.
  2. Vask hjernen sektioner 3x i 0,1 M PBS med 0,5% nonioniske overfladeaktive (dvs., Triton X 100) for 5 min hver. Derefter inkubates i en blokerende opløsning på 0,1 M PBS med 0,5% nonionisk overfladeaktivt stof og 10% normalt gede serum (NGS) i 1 time ved stuetemperatur med blid agitation.
  3. Inkubaterne med agitation i primære antistoffer fortyndet i 0,1 M PBS med 0,5% nonionisk overfladeaktivt stof og 5% NGS i 2 dage ved 4 °C.
    Bemærk: På grund af tykkelsen af hjernen skiver, inkubationsperioden for de primære antistoffer skal forlænges for bedre penetration og antistofkoncentrationen kan øges. I dette eksperiment blev en 1:500 fortynding anvendt til anti-GFAP-antistof, og en 1:500 fortynding blev anvendt til anti-aquaporin-4-antistoffer.
  4. Afsnittene 3x i 0,1 M PBS vaskes med 0,5% nonionisk overfladeaktivt stof i 10 min. hver og derefter inkubates med sekundære antistoffer fortyndet i 0,1 M PBS med 0,5% nonionisk overfladeaktivt stof og 10% NGS i 6 timer ved stuetemperatur.
    Bemærk: Du må ikke vælge et sekundært antistof ophidset af 488 nm, som er den bølgelængde, der anvendes til at visualisere den LY farve. I dette eksperiment, en 1:1000 fortynding blev brugt til Alexa fluor 546 ged anti-kylling IgG (H + L) og Alexa fluor 647 ged anti-kanin IgG (H + L).
  5. Skyl afsnittene 3x i 0,1 M PBS i 10 min. hver. Monter derefter afsnittene på glasmikroskop glider i monterings medier, som egner sig til fluorescens. Forsegl slides. Billed celler i en trin størrelse på 0,3 μm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De data, der rapporteres i dette studie, er fra 7 − 12 celler fra 4 mus i hvert eksperiment. Gennemsnitlige data rapporteres i figur panelerne, hvor det er relevant.

For at vurdere astrocyt morfologi udførte vi intracellulær iontophorese ved hjælp af LY Dye til at fylde astrocytter i kkstratum radiatum, som er opsummeret i figur 1. Figur 2 skildrer en repræsentativ astrocyt og dens udførlige morfologiske struktur. Cellen blev afbildet efter fiksering med 60x olie fordybnings linsen på et confokal laser scannings-mikroskop ved hjælp af 488 nm-laserlinjen (trin størrelse på 0,3 μm og 3,0 − 3.5 x digital zoom). Den Photomultiplier Tube (PMT), offset, og Gain funktioner af confokale mikroskop blev justeret for at skabe et højt signal/baggrundsforhold i det endelige billede. I figur 2A afslører etenkelt optisk plan billede fra forskellige z-trin (vist hver 10 μm, mærket i rækkefølge fra 1 − 6) den centrale Soma og flere store grene, som opdeles i et tæt netværk af processer. Ved at generere en maksimal intensitet projektion (stakstørrelse på 85 μm) Vi observerede en detaljeret visning af strukturen af astrocyt og dens domæne (figur 2B). De vigtigste komponenter i astrocyte struktur er også blevet bemærket. Figur 2 C viser en zoom ind (X4) maksimal intensitet projektion af en større gren, flere sekundære grene, og fordelingen af de omgivende branchlets og foldere.

Morfologiske analyser og rekonstruktioner af astrocytter blev udført med Imaris Analysis software (tabel over materialer) ved hjælp af post-fiksering billeder af ly-fyldte astrocytter (anden software som ImageJ kunne også bruges). Efter genopbygningen af hver astrocyt blev afsluttet, blev mængderne af Soma, store grene, processer og territorium kvantificeret. Soma blev først oprettet med en overflade udjævning indstillet til x-y-plan opløsnings grænsen (0,25 μm). Den mindste objekt diameter blev sat til 3,0 μm for at fjerne andre objekter, der ikke er forbundet med celle legemet. For at skabe de store grene, var intensiteten af Soma maskeret, på grund af dens lysstyrke i forhold til resten af cellen. Overflade udjævning og mindste objekt diameter for de store grene blev sat til 0,3 μm (z plane trin størrelse). For at skabe processerne, var intensiteten af de store grene også maskeret. Overflade udjævning blev indstillet til 0,18 μm, og den mindste objekt diameter blev indstillet til 0,3 μm. Det område af astrocyt blev oprettet ved hjælp af en lavere intensitet tærskel og overflade udjævning sat til 0,75 μm. figur 3a viser det oprindelige billede af en caratastrocyt. Cellen krop, de store grene, processerne, og territoriet volumen omsluttet af astrocyt er rekonstrueret i figur 3B-E. Efter at rekonstruktioner af cellerne blev oprettet, blev mængden af Soma, hele cellen og territoriet kvantificeret, og antallet af større filialer blev talt (tabel 1). I en gennemsnitlig Soma-mængde på 488,91 μm3, gennemsnit af ~ 7 primære grene, gennemsnitlig celle volumen på 5,58 x 103 μm3og gennemsnitlig område volumen på 2,94 x 104 μm3.

Den velkarakteriserede astrocyt markør, GFAP, er et cytoskelet protein, der mærker de mellemliggende filamenter af en astrocyt8. Efter at astrocytter var farve fyldt, udførte vi immun farvning for GFAP for at visualisere udtryk i individuelle astrocytter (figur 4). Vi fandt, at GFAP blev udtrykt i cellen Soma, store filialer, og nogle sekundære grene af astrocytter, men ikke i de finere grene og processer (figur 4A). Der blev ikke fundet nogen signifikant forskel i antallet af primære grene mærket af GFAP og dem, der blev visualiseret af LY (p = 0,1573; Figur 4 B). celleområdet og mængden af astrocyt mærket af GFAP var betydeligt mindre end arealet og volumenet visualiseret med ly (p < 0,0001; Figur 4 C, D). Dette viser, at GFAP er en pålidelig markør for mærkning store filialer, men er ikke nyttigt til bestemmelse af det samlede areal eller volumen af cellen.

Et vigtigt træk ved astrocytter er deres endfeet, som kontakter blodkarrene og foreslås for at hjælpe med at regulere blodgennemstrømningen i CNS. For yderligere at forstå det rumlige forhold mellem astrocytter og hjernens vaskulatur, farves vi med antistoffer mod aquaporin-4 efter farve påfyldning. Aquaporin-4 er en vandkanal protein, der findes på astrocytter og ependymale celler, og er stærkt udtrykt i områder nær ventrikler og blodkar15. Vi fandt, at aquaporin-4 er udtrykt på astrocyt endfeet i umiddelbar nærhed af hjernens vaskulatur (figur 5A). Billedet skildrer tre astrocyt endfeet kontakte et blodkar på forskellige steder (indikeret af de hvide pile). I det gennemsnitlige antal endfeet pr. astrocyt var ~ 2 (figur 5B). Interessant, de grene, der indeholder endfeet var betydeligt tykkere end de andre primære grene af astrocyt, ved hjælp af de store gren rekonstruktioner (p = 0,0038; Figur 5 C). vi har også målt længden af de grene, der indeholder endfeet fra midten af Soma til blodkar og sammenlignet med den korteste, direkte vej til blodkar. Den faktiske længde af grenene til blodkar var signifikant større end den korteste vej (p = 0,0333; Figur 5 D), som antyder, at disse filialer har tendens til at tage en længere, kredsløb vej til blodkar. Film 1 skildrer en film af en rekonstruktion af en ly-fyldt astrocyt og aquaporin-4 farvning. De forskellige strukturelle komponenter i astrocytten (Soma, store grene, processer og territorium) er repræsenteret i tre dimensioner. Den LY-fyldte astrocyt sammen med aquaporin-4 farvning skildrer astrocyt endfeet omkranser blodkar. Fra genopbygningen af de store grene og blodkar, kan de grene, der indeholder endfeet visualiseres strækker sig fra Soma til fartøjet.

I de foregående afsnit, hvor p-værdier rapporteres, brugte vi en ikke-parret elevs t-test med betydning på p < 0,05.

Figure 1
Figur 1: diagram over arbejdsgange i ly iontoforese. Skematisk gengivelse af protokol, som fremhæver de kritiske trin. Efter at musen var perfekteret med fikativ, blev hjernen dissekeret. Efter en kort efter fikserings periode blev de koronale sektioner skåret med en vibratome. Elektroden var tilbage fyldt med 1,5% LY farvestof. Astrocytter blev identificeret i den CARGO'S stratum radiatum ved hjælp af IR-DIC på et let mikroskop. Den Soma af cellen blev Impaled af elektroden, og farvestof blev injiceret i cellen ved at anvende 0.5 − 1 V, indtil de finere processer var helt fyldt. Skiven blev afbildet med Konfokal mikroskopi ved hjælp af en 40x vand fordybning linse og derefter forarbejdet til immun histokemi. Yderligere billeddannelse blev afsluttet med en 60x olie fordybning linse til at udføre celle rekonstruktion og morfologiske analyse. Vist er et eksempel rekonstruktion af processerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: ly-fyldt astrocyt af Carnot stratum radiatum. (A) enkelt optisk plan billeder fra en astrocyt vist hver 10 μm (mærket 1 − 6). (B) maksimal projektion af astrocytten, skildrer cellen Soma, flere store grene, og talrige processer, der udgør sin Bushy territorium. (C) maksimal projektion (zoom X4) af en større gren (fra sektion skitseret i gul), to sekundære grene, flere forgreninger, og organiseringen af de omkringliggende processer. Scale bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: genopbygning af en sand fyldt astrocyt og dens komponenter. (A) Carnot astrocyt fyldt med ly. (B-E) Tredimensionel rekonstruktion af Soma (B), Soma og store grene (C), processer (D) og territorium (E) ved 0 ° og 45 ° orientering. Scale bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: GFAP immunofarvning i ly-fyldte astrocytter. A) repræsentativ z-projektion af ly (grøn) og GFAP (magenta) farvning. GFAP udtrykkes primært i den primære og nogle sekundære grene af astrocyt, men blev ikke fundet inden for hele astrocyt territorium. Scale bar = 10 μm. (B) graf over antallet af primære grene mærket af ly og GFAP. C) celleområde, som er angivet ved ly og GFAP-farvning. D) celle volumen angivet ved ly og GFAP-farvning. Åbne cirkler er rå data med lukkede firkanter, der indikerer Mean ± SEM. data blev indsamlet fra 12 celler fra 4 mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Aquaporin-4 immunofarvning i ly-fyldte astrocytter. A) repræsentativ z-projektion af ly (grøn) og aquaporin-4 farvning (magenta). Aquaporin-4 udtrykkes hovedsageligt i endfødderne af astrocytten. Hvide pile betegner de tre endfeet, når de kontakter et blodkar i nærheden. Skala bar = 10 μm. (B) antal grene med endfeet pr. astrocyt. (C) tykkelse af grene med endfeet i forhold til de andre primære grene af astrocytter. (D) længden af grene med endfeet i forhold til den korteste vej til blodkar. Åbne cirkler er rå data med lukkede firkanter, der indikerer Mean ± SEM. data blev indsamlet fra 7 celler fra 4 mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Movie 1
Film 1: rekonstruktion af en ly-fyldt astrocyt og aquaporin-4 farvning. Repræsentativ film af en Carnot astrocyt i nærheden af et blodkar. Soma, store grene, processer og territorium blev genopbygget for at analysere morfologien af cellen. Genopbygningen af de store grene sammen med aquaporin-4 skildrer to astrocyt-endfeet, som direkte kontakter blodkar. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Morfologiske egenskaber Gennemsnit ± SEM
Soma-volumen (μm3) 489 ± 30
Antal primære grene 7,0 ± 0,5
Celle volumen (μm3) 5580 ± 425
Territory Volume (μm3) 29391 ± 8150
Antal celler 14

Tabel 1: morfologisk analyse af astrocyt struktur. Astrocyt Soma volumen, antallet af primære grene pr astrocyt, astrocyt celle volumen, og volumen omsluttet af astrocyt territorium er vist. Data blev indsamlet fra 14 celler fra 7 mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den metode, der er skitseret i dette papir beskriver en måde at visualisere astrocyt morfologi ved hjælp af intracellulær iontophorese af LY farvestof i let fast hjernen skiver. Der er flere kritiske faktorer fremhævet i denne protokol, der bidrager til vellykket ly iontoforese og morfologiske rekonstruktion af cellerne. En faktor er kvaliteten og reproducerbarhed af billederne, som er bestemt i høj grad af alder af musen og resultatet af perfusion. I denne undersøgelse brugte vi C57/BL6N mus 6 − 8 uger gamle. En vellykket perfusion (meget afhængig af korrekt placering af perfusing nål og noteret af en hvid-farvet hjerne og fravær af blod i hjernen vasculature) er nødvendig for de mest detaljerede og klart fyldte celler. Efter Spidning på pæl af en elektrode, bør cellemembranen opretholde en stram forsegling omkring spidsen af elektroden og forhindre farvestof i at lække ud. På trods af den bedste indsats, vil lejlighedsvis andre strukturer uden for cellen blive udfyldt, da pipetten er fremskreden gennem hjernevæv: vi udelukkede disse celler fra analysen. Modstanden af elektroderne er en yderligere nøglefaktor. Den høje modstand tillader kun en stabil udslyngning af farvestof fra elektrodespidsen ved spændings stimulering. Mere teknisk, er det vigtigt at opretholde blide, langsomme bevægelser, når spiddet Soma af cellen med elektroden. Elektrode indtrængning gennem cellen kan føre til farve lækage fra Soma. En vellykket Spidning på pæl efterfulgt af spænding ansøgning bør resultere i næsten øjeblikkelig farvning fyldning af cellen krop og processer (dvs., inden for et par sekunder). Den tid, det kræver at fylde en astrocyt helt, er relateret til det område, den omfatter; Men, vente med at sikre de finere processer er helt fyldt (mindst 15 min).

Vi fandt denne protokol til at være en mest trofast måde at studere astrocyt morfologi i detaljer, ikke desto mindre, metoden har sine begrænsninger. Identifikation af en celle kan være tidskrævende og fejlbehæftet. Under IR-DIC, bør man identificere karakteristiske træk, der markerer den specifikke celletype (Soma form og størrelse). Alternativt, ekspression af rødt fluorescerende journalister specifikt i astrocytter, ved viral injektion eller en Transgene mus reporter linje, giver mulighed for lettere identifikation af disse celler før påfyldning. Også, ly er begrænset som en cytosolisk farvestof, fordi det ikke kan bruges til at mærke astrocyt membran, i forhold til mærkning med en membran-bundet gfp, såsom lck-gfp16. Lck-gfp ville give en mere nøjagtig repræsentation af hele territoriet område, som ly iontoforese afslører den interne volumen af en astrocyt. Men, afhængigt af det eksperimentelle design, ly iontoforese er bedre egnet til at løse hele astrocyt indre volumen, udvikle tredimensionelle rekonstruktioner, og kvantificere de anatomiske komponenter, der udgør en astrocyt struktur6 . Endelig, som med alle former for Konfokal mikroskopi, rumlig opløsning er begrænset af diffraktion, noteret som punkt Spread funktion af mikroskopet optik17. Ændring af komponenter i billedbehandlings systemet, såsom faldende pinhole diameter, vil hjælpe med at forbedre billederne, men den sande opløsning bestemmes af lysets bølgelængde og den numeriske blænde af objektivlinsen. I vores tilfælde anslår vi den bedste opløsning muligt er formentlig omkring 300 Nm, som sandsynligvis vil være værre i z-aksen.

LY iontoforese tilbyder flere fordele i forhold til andre almindeligt anvendte metoder til at mærke astrocytter. Protokollen kan anvendes i enhver etableret musemodel, cellepopulation, eller hjernen region18,19,20 da det ikke er begrænset af en astrocyt specifik promotor eller en transgene muse linje. Genetiske tilgange til at udtrykke fluorescerende proteiner allestedsnærværende i astrocytter ved virale injektioner eller Transgene mus reporter linjer (dvs., TD-tomat) kræver brug af en astrocyt promotor, som i nogle regioner, kan udtrykkes i andre celletyper eller ikke Medtag alle astrocytter21. LY iontoforese er også tidsbesparende, som virale injektioner af fluorescerende proteiner kræver kirurgi og tid til at udtrykke den specifikke virus, og transgene muse linjer kræver avl. Endelig, ly iontoforese er en nyttig metode til at skelne individuelle celler, mens andre strategier også skal kombineres med en metode til sparsomme mærkning for at visualisere de enkelte astrocytter22,23, 24. Men ingen metode er en universalløsning, og valget af, hvad der anvendes, skal skræddersys til det specifikke spørgsmål, der behandles.

Fremtidige undersøgelser kan ansætte specifikke eksperimentelle manipulationer og undersøge forskellige komponenter i astrocyt struktur (Soma, grene, processer, territorium, etc.) til at besvare morfologiske spørgsmål. Dette kunne give indsigt og retning i astrocyt morfologi og dens funktionelle konsekvenser, som kunne analyseres yderligere ved super opløsning lys mikroskopi eller elektronmikroskopi4. For eksempel, ly iontoforese giver et middel til at visualisere fine astrocyt processer, som kontakt tusindvis af synapser og er involveret i synaptisk funktioner. At studere, hvordan strukturen af disse processer ændrer sig i forskellige patologiske tilstande, kan hjælpe med at belyse astrocyternes roller i sundhed og sygdom. LY iontoforese er en vigtig teknik til at visualisere detaljerede celle morfologi og karakterisere astrocyt egenskaber for bedre at forstå deres funktioner i centralnervesystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker fru Soto, Dr. Yu, og Dr. Octeau for vejledning samt kommentarer til teksten. Dette arbejde understøttes af NS060677.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Buffered Formalin Phosphate Fisher SF 100-20 An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane Pall 4692 An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet WPI EP2 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) Thermo Scientific A-11040 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Scientific A27040 A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody Novus Biologicals NBP1-87679 A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody Abcam ab4674 A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament World precision instruments 1B150F-4
C57BL/6NTac mice Taconic Stock B6 A similar alternative can be used
Calcium Chloride Sigma 21108 An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000MPE A similar alternative can be used
D-glucose Sigma G7528 An identical alternative can be used
Disodium Phosphate Sigma 255793 An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97 Sutter P-97 A similar alternative can be used
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) Sagent Pharmaceuticals 400-10 An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5) Bitplane Inc. A similar alternative can be used
Isofluorane Henry Schein Animal Health 29404 An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) Clipper 1050035 An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt Sigma L0144
Magnesium Chloride Sigma M8266 An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass Thermo Scientific 24X60-1 An identical alternative can be used
Microscope Slides Fisher 12-544-2 An identical alternative can be used
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000 An identical alternative can be used
Objective lens (40x) Olympus LUMPLFLN 40XW A similar alternative can be used
Objective lens (60x) Olympus PlanAPO 60X A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL VWR VWRVE404 An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200 Sutter MP-285 / ROE-200 / MPC-200 A similar alternative can be used
Potassium Chloride Sigma P3911 An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 An identical alternative can be used
Sodium Chloride Sigma S5886 An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010 World precision instruments Omnical 2010 A similar alternative can be used
Triton X 100 Sigma T8787 An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000 Pelco 100-S A similar alternative can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
  2. Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
  3. Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
  4. Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
  5. Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
  6. Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
  7. Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
  8. Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
  9. Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
  10. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  11. Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
  12. Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
  13. Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  15. Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
  16. Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
  17. Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
  18. Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
  19. Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
  20. Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
  21. Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
  22. Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
  23. Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
  24. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).

Tags

Neurovidenskab Lucifer Yellow astrocyt morfologi Dye fyldning end-feet aquaporin-4 3D rekonstruktion hippocampus
Visualisering af Astrocyt morfologi ved hjælp af Lucifer Yellow iontophoresis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moye, S. L., Diaz-Castro, B.,… More

Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter