Summary
Les astrocytes sont des cellules morphologiquement complexes, illustrées par leurs multiples processus et territoires touffus. Pour analyser leur morphologie élaborée, nous présentons un protocole fiable pour exécuter l'iontophoresis jaune intracellulaire de Lucifer dans le tissu légèrement fixé.
Abstract
Les astrocytes sont des composants essentiels des circuits neuronaux. Ils carirent l'ensemble du système nerveux central (SNC) et sont impliqués dans une variété de fonctions, qui comprennent le dégagement des neurotransmetteurs, la régulation des ions, la modulation synaptique, le soutien métabolique aux neurones, et la régulation du flux sanguin. Les astrocytes sont des cellules complexes qui ont un soma, plusieurs branches principales, et de nombreux processus fins qui contactent divers éléments cellulaires dans le neuropil. Afin d'évaluer la morphologie des astrocytes, il est nécessaire d'avoir une méthode fiable et reproductible pour visualiser leur structure. Nous rapportons un protocole fiable pour exécuter l'iontophoresis intracellulaire des astrocytes utilisant le colorant jaune fluorescent de Lucifer (LY) dans le tissu de cerveau légèrement fixé des souris adultes. Cette méthode a plusieurs caractéristiques qui sont utiles pour caractériser la morphologie des astrocytes. Il permet la reconstruction tridimensionnelle des astrocytes individuels, ce qui est utile pour effectuer des analyses morphologiques sur différents aspects de leur structure. L'immunohistochimie avec l'iontophoresis de LY peut également être employée pour comprendre l'interaction des astrocytes avec différents composants du système nerveux et pour évaluer l'expression des protéines dans les astrocytes étiquetés. Ce protocole peut être mis en œuvre dans une variété de modèles murins de troubles du SNC pour examiner rigoureusement la morphologie des astrocytes avec microscopie légère. LY iontophoresis fournit une approche expérimentale pour évaluer la structure des astrocytes, en particulier dans le contexte de blessures ou de maladies où ces cellules sont proposées pour subir des changements morphologiques importants.
Introduction
Les astrocytes sont les cellules gliales les plus abondantes du système nerveux central (SNC). Ils jouent des rôles dans l'homéostasie ionique, la régulation du flux sanguin, la formation de synapse ainsi que l'élimination, et l'élimination des neurotransmetteurs1. La large gamme de fonctions d'astrocyte se reflète dans leur structure morphologique complexe2,3. Les astrocytes contiennent plusieurs branches primaires et secondaires qui se divisent en milliers de branches et de folioles plus fines qui interagissent directement avec les synapses, les dendrites, les axones, les vaisseaux sanguins et d'autres cellules gliales. La morphologie des astrocytes varie selon les régions du cerveau, ce qui peut indiquer leur capacité à remplir leurs fonctions de façon différentielle dans les circuits neuronaux4. En outre, les astrocytes sont connus pour modifier leur morphologie au cours du développement, pendant les conditions physiologiques, et dans les états de maladie multiples3,5,6.
Une méthode cohérente et reproductible est nécessaire pour résoudre avec précision la complexité de la morphologie des astrocytes. Traditionnellement, l'immunohistochimie a été utilisée pour visualiser les astrocytes avec l'utilisation de marqueurs de protéines enrichis d'astrocytes ou d'astrocytes. Cependant, ces méthodes révèlent le modèle d'expression des protéines plutôt que la structure de l'astrocyte. Les marqueurs couramment utilisés, tels que la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et la protéine de liaison du calcium S100 (S100), ne s'expriment pas dans l'ensemble du volume cellulaire et ne résolvent donc pas la morphologie complète7. Les approches génétiques pour exprimer les protéines fluorescentes de façon omniprésente dans les astrocytes (injections virales ou lignes transgéniques de reporter de souris) peuvent identifier les branches plus fines et le territoire global. Cependant, il est difficile de différencier les astrocytes individuels, et les analyses peuvent être biaisées par la population d'astrocytes ciblée par le promoteur spécifique8. La microscopie électronique de section série a été employée pour indiquer une image détaillée des interactions des processus d'astrocyte avec des synapses. En raison des milliers de processus d'astrocyte s'entrelaçant des synapses, il n'est actuellement pas possible de reconstruire une cellule entière avec cette technique9, bien que cela devrait changer avec l'utilisation d'approches d'apprentissage automatique pour l'analyse des données.
Dans ce rapport, nous nous concentrons sur une procédure pour caractériser les astrocytes de souris utilisant l'iontophoresis intracellulaire avec le colorant jaune de Lucifer (LY), utilisant le radiatum de strate de CA1 comme exemple. La méthode est basée sur des travaux passés pionniers par Eric Bushong et Mark Ellisman10,11. Les astrocytes des tranches de cerveau légèrement fixes sont identifiés par leur forme distinctive de soma et remplis de LY. Les cellules sont ensuite représentées avec une microscopie confocale. Nous démontrons comment l'iontophoresis de LY peut être employé pour reconstruire les astrocytes individuels et effectuer des analyses morphologiques détaillées de leurs processus et territoire. En outre, cette méthode peut être appliquée en conjonction avec l'immunohistochimie pour identifier les relations spatiales et les interactions entre les astrocytes et les neurones, d'autres cellules gliales, et la vascularisation du cerveau. Nous considérons l'iontophoresis de LY comme un outil très approprié pour analyser la morphologie dans différentes régions du cerveau et modèles de souris des conditions saines ou de la maladie7,12,13.
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Protocol
Les expériences sur les animaux dans cette étude ont été effectuées conformément au National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et ont été approuvées par le Comité de recherche sur les animaux du chancelier à l'Université de Californie à Los Angeles. Des souris adultes (6 à 8 semaines) de sexe mixte ont été utilisées dans toutes les expériences.
1. Préparation de la solution
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Solution de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF)
- Préparer une solution ACSF fraîche (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 14,7 mM NaHCO3, 11 mM D-glucose, 1,25 mM Na2HPO4, et 2 mM CaCl2) avant chaque expérience. Ajouter MgCl2 et CaCl2 dans la dernière étape. Dissoudre les composants dans de l'eau déionisée de haute qualité.
- Incuber la solution ACSF à 35 oC dans un bain d'eau et une bulle avec 95 % o2/ 5 % de CO2 pendant au moins 30 minutes avant l'expérience.
- Ajouter 2 % d'hydrochlorure de lidocaïne pour atteindre une concentration finale de 0,02 % en ACSF (en 100 ml).
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Solution fixative
- Utilisez 10% de phosphate tamponné par formaline.
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Solution de teinture LY
- Préparer 1,5% LY solution de colorant en dissolvant LY CH sel de dilithium ou LY CH sel de dipotassium dans 5 mM KCl. Vortex à fond. Un volume de 1 ml est suffisant pour plusieurs expériences.
- Centrifugeuse pendant 10 min à 16 800 x g. Ensuite, filtrez le supernatant à l'emporte-sa vie avec un filtre à seringues de 0,2 m dans un nouveau tube. Les Aliquots peuvent être conservés à 4 oC jusqu'à 3 mois.
REMARQUE: Il est essentiel de centrifuger et de filtrer la solution de colorant pour empêcher l'agrégation des particules de colorant, qui peuvent obstruer l'électrode.
2. Perfusion transcarique de souris et dissection de cerveau
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Préparation de l'équipement et de la souris pour perfusion transcardique
REMARQUE: Les souris C57/BL6 de l'un ou l'autre sexe peuvent être utilisées. Il a été empiriquement observé que pour que la méthode fonctionne de manière fiable, il est important que les souris ne soient pas plus âgées que 3 mois (6 à 8 semaines est idéale). Le protocole de perfusion est décrit ci-dessous. Une référence supplémentaire est fournie pour plus de détails14.- Tubes de perfusion clairs avec la solution ACSF pour éliminer les bulles d'air dans la ligne. Mettre en place des outils chirurgicals par ordre d'utilisation (pinces, ciseaux courbés, émoussés, ciseaux à l'iris).
- Anesthésiez profondément la souris en la plaçant dans une chambre d'induction isoflurane, après avoir ajouté 2 à 3 ml d'isoflurane à la chambre. Laisser entrer en vigueur l'anesthésique d'une mi-temps. Assurez-vous que la respiration ne s'arrête pas.
- Test pour le réflexe de pincement des orteils. Procédez lorsque la souris ne réagit pas au stimulus de la douleur et que le réflexe est absent. Fixez l'animal en position de supine avec la tête placée dans le cône respiratoire avec un approvisionnement de 5% d'isoflurane en oxygène et les membres et la queue scotchés à l'intérieur d'une hotte de fumée chimique.
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Perfusion transcardique
- À l'aide d'une pince à épiler, soulever la peau sous la cage thoracique. Faire une incision de 5 à 6 cm avec les ciseaux courbés et émoussés à travers la peau pour exposer la cavité abdominale. Couper vers le haut à travers la paroi abdominale jusqu'à ce que le foie et le diaphragme soient visibles.
- Éloignez doucement le foie du diagramme. À l'aide de ciseaux à l'iris, faire une incision latérale de 3 à 4 cm dans le diaphragme.
- Couper à travers la cage thoracique le long des deux côtés du corps pour exposer la cavité thoracique. Veillez à ne pas endommager le cœur et éviter les poumons. Soulevez le sternum pour exposer le cœur.
- Une fois que le cœur est visible, injecter 0,05 ml de solution héparine de sodium (1 000 USP par mL) dans le ventricule gauche comme anticoagulant. Ensuite, insérez soigneusement l'aiguille de perfusion dans le ventricule gauche. Assurez-vous que l'aiguille reste dans le ventricule et ne perce pas à travers d'autres chambres cardiaques. Faire une petite incision dans l'atrium droit avec des ciseaux d'iris.
- Perfiliser avec la solution ACSF à un taux d'environ 10 ml/min jusqu'à ce que le liquide existant le corps soit dégagé du sang (1-2 min).
- Passez de la solution ACSF à la solution fixative sans introduire de bulles d'air. Perfuser d'une solution fixative pendant 10 min à 10 x 20 ml/min.
MISE EN GARDE: Veillez à ce qu'aucune solution fixative ne s'écoule du nez. Ceci indique que l'aiguille a atteint le ventricule droit et le fixatif se déplace aux poumons plutôt que par le circuit systémique au reste du corps.
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Dissection du cerveau
- Retirez la tête de la souris avec des ciseaux et disséquez soigneusement le cerveau de la souris du crâne. Placer dans une solution fixative pendant 1,5 h à température ambiante pendant une courte période de post-fixation.
REMARQUE: Une bonne perfusion est nécessaire pour réussir l'iontophoresis LY. Le cerveau doit être de couleur blanche et absent du sang dans la vascularisation du cerveau. Le corps et les membres doivent sembler raides.
- Retirez la tête de la souris avec des ciseaux et disséquez soigneusement le cerveau de la souris du crâne. Placer dans une solution fixative pendant 1,5 h à température ambiante pendant une courte période de post-fixation.
3. Préparation de tranche
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Préparation des tranches hippocampal
- Laver le cerveau avec 0,1 M de phosphate tamponné saline (PBS) à température ambiante pendant 5 min. Ensuite, séchez le cerveau avec du papier filtre et retirez l'ampoule olfactive et le cervelet avec une lame de rasoir pointue.
- Montez le cerveau sur le plateau de vibratome à l'aide de colle cyanoacrylate et remplissez le plateau avec PBS à température ambiante. Couper les sections coronales hippocampales d'une épaisseur de 110 m.
REMARQUE: Ajuster le réglage du vibratome pour s'assurer que les tranches ont la même épaisseur et même la surface. Pour cette expérience, un réglage de vitesse de 4,5 et un réglage de fréquence de 8 ont été utilisés, qui sont des paramètres arbitraires sur l'instrument (Tableau des matériaux). Les utilisateurs peuvent avoir besoin d'expérimenter avec les paramètres sur d'autres appareils. - Recueillir les sections du plateau et les placer dans un plat de PBS sur la glace.
4. Préparation à l'électrode
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Préparer une électrode pointue avec une résistance appropriée.
- Utilisez une électrode en verre borosilicate à baril unique avec filament (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm). Tirez une électrode sur un puller micropipette (Table of Materials). Les électrodes idéales remplies de 1,5 % de LY en 5 mM KCl doivent avoir une résistance de 200 M ' lorsqu'elles sont placées dans un bain de PBS.
REMARQUE: Le réglage du tireur varie en fonction de l'appareil (type de machine utilisée et filament du tire-lasseur). Un réglage de chaleur plus élevé donne généralement des conseils plus longs et plus fins. Pour le puller micropipette utilisé dans cette expérience, les réglages étaient : chaleur : 317, traction : 90, vitesse : 70, et retard : 70. Un filament de type creux a été utilisé. - Rangez les électrodes dans un contenant fermé pour empêcher la poussière d'entrer dans la pointe. Maintenez les électrodes élevées du bas de la boîte pour empêcher la pointe de se briser.
- Utilisez une électrode en verre borosilicate à baril unique avec filament (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm). Tirez une électrode sur un puller micropipette (Table of Materials). Les électrodes idéales remplies de 1,5 % de LY en 5 mM KCl doivent avoir une résistance de 200 M ' lorsqu'elles sont placées dans un bain de PBS.
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Remplissez l'électrode avec la solution de colorant LY.
- Placez une électrode en position verticale avec la pointe orientée vers le bas. Pipette 1/2 l de solution LY à l'arrière de l'électrode et attendre 5 à 10 min pour que la solution se déplace vers la pointe par action capillaire.
- Fixer doucement l'électrode remplie dans le support d'électrode relié à un manipulateur.
REMARQUE: Le fil argenté du porte-électrodes doit être en contact avec le LY à l'intérieur de l'électrode. Ajuster le volume de la solution LY si nécessaire, en fonction de la longueur du fil.
5. Remplissage des astrocytes avec iontophoresis
- Testez l'électrode.
- Placer délicatement une tranche de cerveau dans un plat en verre rempli de 0,1 M PBS à température ambiante. Maintenez la tranche en place avec une harpe en platine avec des cordes en nylon.
- Assurez-vous que l'électrode est connectée à une source de tension et placez l'électrode du sol dans le bain contenant la tranche de cerveau.
- Déplacer l'objectif vers la région du cerveau d'intérêt.
- Abaissez l'électrode dans la solution. Sous le champ lumineux, déplacez-le vers le centre du champ de vision et examinez-le attentivement avec la lentille d'immersion d'eau 40x pour s'assurer qu'il semble clair et sans débris ou bulles. S'il y a quelque chose obstruant la pointe de l'électrode, remplacez-la par une nouvelle.
REMARQUE: Le colmatage est une préoccupation pour l'électrode de 200 M. Avec la centrifugation et la filtration de la solution de colorant avant chaque expérience, cela ne devrait pas être un problème fréquent. Cependant, parce que la pointe de l'électrode est petite, le tissu peut parfois se coincer dans l'ouverture. Les auteurs n'ont pas trouvé un moyen d'empêcher cela, mais il peut être facilement traitée en utilisant simplement une nouvelle électrode. - Observez la pointe de l'électrode sous le microscope à balayage laser confocal avec le laser de 488 nm. Ensuite, testez l'éjection de colorant en allumant le stimulateur à 12 V. Notez un grand nuage de colorant fluorescent autour de la pointe de l'électrode pendant que le stimulateur est allumé. Si aucun colorant ou peu est éjecté lors de la stimulation de tension, remplacez l'électrode.
- Sous le champ lumineux, abaissez lentement l'électrode vers la tranche s'arrêtant juste au-dessus de la surface.
- Remplissez l'astrocyte d'iontophoresis.
- Identifiez les astrocytes à 40 à 50 m sous la surface de la tranche avec le contraste d'interférence différentiell infrarouge (IR-DIC). Recherchez des cellules avec des somatas allongés et ovales d'environ 10 m de diamètre. Une fois qu'un astrocyte est choisi, déplacez-le au centre du champ de vision.
REMARQUE: Une bonne cellule pour l'iontophoresis a des frontières claires et définies autour d'elle. Ne choisissez pas les cellules trop près de la surface de la tranche parce qu'elles ne peuvent pas être complètement remplies. Il faut un peu de pratique sur quelques jours pour être en mesure d'identifier systématiquement les astrocytes pour le remplissage des colorants. Selon la zone du cerveau utilisée pour l'expérience, le nombre d'astrocytes peut varier. Cela peut affecter le temps nécessaire pour identifier un astrocyte avant le remplissage. - Baissez lentement la pointe de l'électrode dans la tranche, naviguant à travers le tissu, jusqu'à ce qu'elle soit sur le même plan que le corps cellulaire.
REMARQUE: Déplacez l'électrode lentement pour éviter d'endommager le tissu. - Une fois que le corps cellulaire de l'astrocyte est clairement visible et décrit, avancez lentement et doucement l'électrode vers l'avant. Déplacer l'électrode jusqu'à ce que la pointe empale le soma de la cellule. Déplacez la mise au point de l'objectif lentement vers le haut et vers le bas pour noter si l'électrode est à l'intérieur du soma.
REMARQUE: La pointe de l'électrode doit être à l'intérieur du corps cellulaire, et une petite indentation sur le soma doit être observée. Ne déplacez pas l'électrode plus loin pour éviter la pointe qui traverse la cellule. - Une fois que la pointe de l'électrode est à l'intérieur de la cellule, allumez le stimulateur à 0,5 v et éjecterez continuellement le courant dans la cellule. À l'aide du microscope confocal, regardez le remplissage de la cellule. Augmentez le zoom numérique pour voir les détails de la cellule et assurez-vous que la pointe de l'électrode est visible à l'intérieur de la cellule.
REMARQUE: Abaissez la tension s'il semble que le colorant s'échappe de la cellule ou remplit d'autres cellules dans le voisinage. S'il semble que le colorant fuit encore hors de la cellule, tirez l'électrode lentement et trouvez une autre cellule. Il est important que le colorant ne fuit pas pour avoir un rapport signal/arrière élevé dans l'image finale. - Attendez environ 15 min jusqu'à ce que les branches et les processus plus fins semblent définis, éteignez la tension et retirez doucement la pointe de l'électrode de la cellule.
- Identifiez les astrocytes à 40 à 50 m sous la surface de la tranche avec le contraste d'interférence différentiell infrarouge (IR-DIC). Recherchez des cellules avec des somatas allongés et ovales d'environ 10 m de diamètre. Une fois qu'un astrocyte est choisi, déplacez-le au centre du champ de vision.
- Image de la cellule remplie.
REMARQUE : L'imagerie peut être réalisée immédiatement après le remplissage ou après la coloration avec immunohistochimie. Un objectif avec une ouverture numérique plus élevée (NA) se traduit par une meilleure résolution.- Attendez que la cellule revienne à la forme originale avant l'imagerie (15 à 20 min) avec objectif 40x. Pour imager la cellule, ajustez le réglage sur le confocal pour vous assurer que les branches et les processus plus fins semblent définis.
- Configurez une pile z d'une taille d'étape de 0,3 m. Pendant l'imagerie, déplacez l'objectif jusqu'à ce qu'il n'y ait pas de signal de la cellule et définir que le haut. Ensuite, déplacez l'objectif vers le bas (en se concentrant à travers la cellule) jusqu'à ce qu'il n'y ait pas de signal, définir que le fond.
- Une fois l'imagerie terminée, vérifiez l'éjection de l'électrode. Si un grand nuage de colorant apparaît, il peut être utilisé pour la tranche suivante. Sinon, remplacez-le par une nouvelle électrode.
REMARQUE: Le remplissage de teinture d'un seul astrocyte et l'imagerie prend environ 45 min à 1 h. Pour cette expérience spécifique, il a été possible d'obtenir environ 3 à 6 cellules par souris. Si nécessaire, plusieurs cellules peuvent être étiquetées sur la même tranche. Cependant, pour distinguer les astrocytes individuels, assurez-vous de garder une distance d'environ 200 m entre les cellules.
6. Staining with Immunohistochemistry (facultatif)
- Une fois l'imagerie terminée, placez immédiatement la tranche dans 10 % de formaline sur la glace pour préserver l'immunohistochimie. Gardez les tranches de cerveau dans l'obscurité et conservez-les toute la nuit à 4 oC.
- Laver les sections cérébrales 3x en 0,1 M PBS avec 0,5% de surfactant nonionic (c.-à-d., Triton X 100) pendant 5 min chacun. Ensuite, incuber dans une solution de blocage de 0,1 M PBS avec 0,5% de surfactant nonionique et 10% de sérum de chèvre normal (NGS) pendant 1 h à température ambiante avec une agitation douce.
- Incuber les sections avec de l'agitation dans les anticorps primaires dilués dans 0,1 M PBS avec 0,5% de surfactant nonionic et 5% NGS pendant 2 jours à 4 oC.
REMARQUE: En raison de l'épaisseur des tranches de cerveau, la période d'incubation des anticorps primaires doit être prolongée pour une meilleure pénétration et la concentration d'anticorps peut être augmentée. Dans cette expérience, une dilution de 1:500 a été employée pour l'anticorps anti GFAP et une dilution 1:500 a été employée pour l'anticorps anti aquaporin-4. - Laver les sections 3x en 0,1 M PBS avec 0,5% de surfactant nonionic pendant 10 min chacune, puis couver avec des anticorps secondaires dilués dans 0,1 M PBS avec 0,5% de surfactant nonionic et 10% NGS pour 6 h à température ambiante.
REMARQUE: Ne choisissez pas un anticorps secondaire excité par 488 nm, qui est la longueur d'onde utilisée pour visualiser le colorant LY. Dans cette expérience, une dilution de 1:1 000 a été utilisée pour Alexa Fluor 546 chèvre anti-poulet IgG (H-L) et Alexa Fluor 647 chèvre anti-lapin IgG (H-L). - Rincer les sections 3x en 0,1 M PBS pendant 10 min chacune. Ensuite, montez les sections sur des lames de microscope en verre dans des supports de montage adaptés à la fluorescence. Scellez les glissières. Cellules d'image à une taille d'étape de 0.3 'm.
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Representative Results
Les données rapportées dans cette étude proviennent de cellules de 7 à 12 cellules de 4 souris dans chaque expérience. Les données moyennes sont communiquées dans les panneaux de chiffres, le cas échéant.
Pour évaluer la morphologie des astrocytes, nous avons effectué une iontophoresis intracellulaire à l'aide de colorant LY pour remplir les astrocytes dans le radiatum de la strate CA1, qui est résumé à la figure 1. La figure 2 représente un astrocyte représentatif et sa structure morphologique élaborée. La cellule a été image de post-fixation avec la lentille d'immersion d'huile 60x sur un microscope à balayage laser confocal à l'aide de la ligne laser 488 nm (taille de l'étape de 0,3 m et 3,0 3,5x zoom numérique). Le tube photomultiplicateur (PMT), les fonctions de décalage et de gain du microscope confocal ont été ajustés pour créer un rapport signal/arrière élevé dans l'image finale. Dans la figure 2A, des images de plan optique unique à partir de différents z-steps (indiquées tous les 10 m, étiquetées dans l'ordre de 1 à 6) révèlent le soma central et plusieurs branches principales qui se sont divisées en un réseau dense de processus. En générant une projection d'intensité maximale (taille de la pile de 85 m), nous avons observé une vue détaillée de la structure de l'astrocyte et de son domaine (Figure 2B). Les principaux composants de la structure de l'astrocyte ont également été notés. Figure 2 C montre un zoom avant (x4) projection d'intensité maximale d'une branche majeure, plusieurs branches secondaires, et la distribution des branches et des dépliants environnants.
Des analyses morphologiques et des reconstructions d'astrocytes ont été effectuées avec le logiciel d'analyse Imaris(Tableau des matériaux) à l'aide des images post-fixation d'astrocytes remplis de LY (d'autres logiciels tels que ImageJ pourraient également être utilisés). Une fois la reconstruction de chaque astrocyte terminée, les volumes du soma, des branches principales, des processus et du territoire ont été quantifiés. Le soma a d'abord été créé avec un lissage de surface réglé à la limite de résolution du plan x-y (0,25 m). Le diamètre minimal de l'objet a été fixé à 3,0 m pour enlever d'autres objets non associés au corps cellulaire. Pour créer les branches principales, l'intensité du soma a été masquée, en raison de sa luminosité par rapport au reste de la cellule. Le lissage de la surface et le diamètre minimal de l'objet des branches principales ont été réglés à 0,3 m (taille de l'étape du plan Z). Pour créer les processus, l'intensité des principales branches a également été masquée. Le lissage de surface a été réglé à 0,18 m et le diamètre minimal de l'objet a été fixé à 0,3 m. Le territoire de l'astrocyte a été créé à l'aide d'un seuil d'intensité plus faible et d'un lissage de surface réglé à 0,75 m. La figure 3A montre l'image originale d'un astrocyte CA1. Le corps cellulaire, les principales branches, les processus et le volume du territoire clos par l'astrocyte sont reconstruits dans la figure 3B-E. Après la création des reconstructions des cellules, les volumes du soma, de la cellule entière et du territoire ont été quantifiés et le nombre de branches principales a été compté (tableau 1). Les astrocytes CA1 du radiatum de la strate avaient un volume moyen de soma de 488,91 m3, moyenne de 7 branches primaires, volume cellulaire moyen de 5,58 x 103 m3, et volume moyen du territoire de 2,94 x 104 m3.
Le marqueur astrocyte bien caractérisé, GFAP, est une protéine cytosquelettique qui étiquette les filaments intermédiaires d'un astrocyte8. Après que les astrocytes aient été remplis de colorant, nous avons exécuté l'immunostaining pour GFAP pour visualiser l'expression dans les astrocytes individuels (figure 4). Nous avons constaté que le GFAP était exprimé dans le soma cellulaire, les branches principales et certaines branches secondaires des astrocytes, mais pas dans les branches et les processus plus fins (figure 4A). Aucune différence significative n'a été constatée dans le nombre de branches primaires étiquetées par le GFAP et celles visualisées par LY (p - 0,1573; Figure 4 B). La surface cellulaire et le volume de l'astrocyte étiqueté par le GFAP étaient significativement plus petits que la zone et le volume visualisés avec LY (p 'lt; 0.0001; Figure 4 C,D). Cela démontre que le GFAP est un marqueur fiable pour l'étiquetage des principales branches, mais n'est pas utile pour déterminer la superficie globale ou le volume de la cellule.
Une caractéristique importante des astrocytes est leurs pieds-end, qui contactent les vaisseaux sanguins et sont proposés pour aider à réguler le flux sanguin dans le SNC. Pour mieux comprendre la relation spatiale entre les astrocytes et la vascularisation du cerveau, nous avons taché d'anticorps contre l'aquaporine-4 après le remplissage des colorants. Aquaporin-4 est une protéine de canal d'eau trouvée sur des astrocytes et des cellules éparymales, et est fortement exprimée dans les secteurs près des ventricules et des vaisseaux sanguins15. Nous avons constaté que l'aquaporine-4 est exprimée sur les pieds d'extrémité astrocytes à proximité de la vascularisation du cerveau (Figure 5A). L'image représente trois pieds d'extrémité d'astrocyte s'établissant en contact avec un vaisseau sanguin à différents endroits (indiqués par les flèches blanches). Dans le radiatum de la strate CA1, le nombre moyen de pieds d'extrémité par astrocyte était de 2(figure 5B). Fait intéressant, les branches contenant les pieds d'extrémité étaient significativement plus épaisses que les autres branches primaires de l'astrocyte, en utilisant les reconstructions principales de branche (p - 0,0038 ; Figure 5 C). Nous avons également mesuré la longueur des branches contenant des pieds d'extrémité du centre du soma au vaisseau sanguin et nous l'avons comparée au chemin le plus court et direct vers le vaisseau sanguin. La longueur réelle des branches du vaisseau sanguin était significativement plus grande que le chemin le plus court (p - 0,0333; Figure 5 D), ce qui suggère que ces branches ont tendance à prendre une route plus longue et détournée vers le vaisseau sanguin. Le film 1 dépeint un film d'une reconstruction d'un astrocyte rempli de LY et d'une coloration d'aquaporine-4. Les différentes composantes structurelles de l'astrocyte (soma, branches principales, processus et territoire) sont représentées en trois dimensions. L'astrocyte rempli de LY ainsi que la coloration de l'aquaporine-4 représentent les pieds d'extrémité d'astrocyte encerclant le vaisseau sanguin. De la reconstruction des branches principales et du vaisseau sanguin, les branches qui contiennent des pieds d'extrémité peuvent être visualisées s'étendant du soma au vaisseau.
Dans les sections précédentes, où les valeurs p sont déclarées, nous avons utilisé le test t d'un étudiant non apparié, avec une signification à p 'lt; 0.05.
Figure 1 : Diagramme du flux de travail dans l'iontophoresis DE LY. Représentation schématique du protocole mettant en évidence les étapes critiques. Après que la souris ait été perfused avec le fixatif, le cerveau a été disséqué. Après une courte période de post-fixation, des sections coronales ont été coupées avec un vibratome. L'électrode a été remblayée avec 1,5% de colorant LY. Des astrocytes ont été identifiés dans le radiatum de strate CA1 utilisant IR-DIC sur un microscope léger. Le soma de la cellule a été empalé par l'électrode, et le colorant a été injecté dans la cellule en appliquant 0.5-1 V jusqu'à ce que les processus plus fins aient été complètement remplis. La tranche a été imageavec la microscopie confocale utilisant une lentille d'immersion d'eau 40x et puis traitée pour l'immunohistochimie. D'autres images ont été complétées avec une lentille d'immersion d'huile de 60x pour effectuer la reconstruction cellulaire et l'analyse morphologique. Montré est un exemple de reconstruction des processus. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Astrocyte LY-rempli de radiatum de stratum CA1. (A) Images optiques d'un astrocyte d'un astrocyte montrées tous les 10 m (étiquetées 1 à 6). (B) Projection maximale de l'astrocyte, représentant la cellule soma, plusieurs branches principales, et de nombreux processus qui composent son territoire touffu. (C) Projection maximale (zoom x4) d'une branche principale (à partir de la section décrite en jaune), de deux branches secondaires, de plusieurs branches et de l'organisation des processus environnants. Barre d'échelle de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Reconstruction d'un astrocyte rempli de LY et de ses composants. (A) astrocyte CA1 rempli de LY. (B-E) Reconstruction tridimensionnelle du soma (B), soma et branches principales (C), processus (D), et territoire (E) à 0 et 45 degrés d'orientation. Barre d'échelle de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : immunostaining de GFAP dans les astrocytes LY-remplis. (A) Représentante z-projection de coloration LY (vert) et GFAP (magenta). Le GFAP est exprimé principalement dans les branches primaires et secondaires de l'astrocyte, mais n'a pas été trouvé dans l'ensemble du territoire d'astrocyte. Barre d'échelle de 10 m. (B) Graphique du nombre de branches primaires étiquetées par LY et GFAP. (C) Zone cellulaire dénotée par la coloration LY et GFAP. (D) Volume de cellules noté par ly et GFAP coloration. Les cercles ouverts sont des données brutes avec des carrés fermés indiquant la moyenne - SEM. Les données ont été recueillies à partir de 12 cellules de 4 souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Aquaporin-4 immunostaining dans les astrocytes LY-remplis. (A) Représentante z-projection de LY (vert) et aquaporine-4 coloration (magenta). L'aquaporine-4 s'exprime principalement dans les pieds fins de l'astrocyte. Les flèches blanches désignent les trois pieds-extrémités lorsqu'ils contactent un vaisseau sanguin à proximité. Barre d'échelle de 10 m. (B) Nombre de branches avec pieds finaux par astrocyte. (C) Épaisseur des branches avec les pieds finaux par rapport aux autres branches primaires des astrocytes. (D) Longueur des branches avec les pieds d'extrémité par rapport au chemin le plus court vers le vaisseau sanguin. Les cercles ouverts sont des données brutes avec des carrés fermés indiquant la moyenne - SEM. Les données ont été recueillies à partir de 7 cellules de 4 souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Film 1 : Reconstruction d'un astrocyte rempli de LY et d'une coloration aquaporine-4. Film représentatif d'un astrocyte CA1 à proximité d'un vaisseau sanguin. Le soma, les principales branches, les processus et le territoire ont été reconstruits pour analyser la morphologie de la cellule. La reconstruction des branches principales ainsi que l'aquaporine-4 représentent deux pieds-extrémités d'astrocyte s'entreautres directement avec le vaisseau sanguin. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
| Caractéristiques morphologiques | Moyenne et SEM |
| Volume de Soma (m3) | 489 à 30 ans |
| Nombre de branches primaires | 7,0 à 0,5 |
| Volume de cellules (m3) | 5580 à 425 |
| Volume du territoire (m3) | 29391 à 8150 |
| Nombre de cellules | 14 |
Tableau 1 : Analyse morphologique de la structure des astrocytes. Le volume de soma d'astrocyte, le nombre de branches primaires par astrocyte, le volume de cellules d'astrocyte, et le volume enfermé par le territoire d'astrocyte sont montrés. Les données ont été recueillies à partir de 14 cellules de 7 souris.
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Discussion
La méthode décrite dans cet article décrit une manière de visualiser la morphologie d'astrocyte utilisant l'iontophoresis intracellulaire du colorant de LY dans les tranches légèrement fixes de cerveau. Il y a plusieurs facteurs critiques mis en évidence dans ce protocole qui contribuent à l'iontophoresis réussi de LY et à la reconstruction morphologique des cellules. Un facteur est la qualité et la reproductibilité des images, qui est déterminée en grande partie par l'âge de la souris et le résultat de la perfusion. Dans cette étude, nous avons utilisé des souris C57/BL6N âgées de 6 à 8 semaines. Une perfusion réussie (fortement dépendante du placement approprié de l'aiguille perfusante et notée par un cerveau blanc-coloré et l'absence de sang dans la vascularisation de cerveau) est nécessaire pour les cellules les plus détaillées et clairement remplies. Après empalement par une électrode, la membrane cellulaire doit maintenir un joint serré autour de la pointe de l'électrode et empêcher le colorant de s'échapper. Malgré tous les efforts, de temps en temps d'autres structures à l'extérieur de la cellule seront remplies pendant que la pipette est avancée par le tissu cérébral : nous avons exclu ces cellules de l'analyse. La résistance des électrodes est un facteur clé supplémentaire. La haute résistance ne permet qu'une éjection régulière de colorant de la pointe de l'électrode lors de la stimulation de la tension. Plus techniquement, il est important de maintenir des mouvements doux et lents lors de l'empalisation du soma de la cellule avec l'électrode. La pénétration de l'électrode dans la cellule peut entraîner des fuites de colorant provenant du soma. Un empalement réussi suivi d'une application de tension devrait entraîner un remplissage presque immédiat du colorant du corps cellulaire et des processus (c.-à-d. en quelques secondes). Le temps nécessaire pour remplir complètement un astrocyte est lié au territoire qu'il englobe; cependant, attendez de vous assurer que les processus plus fins sont complètement remplis (au moins 15 min).
Nous avons trouvé ce protocole pour être un moyen le plus fidèle d'étudier la morphologie des astrocytes en détail, néanmoins, la méthode a ses limites. L'identification d'une cellule peut prendre du temps et être sujette aux erreurs. Sous IR-DIC, il faut identifier les caractéristiques distinctives qui marquent le type de cellule spécifique (forme et taille de soma). Alternativement, l'expression des journalistes fluorescents rouges spécifiquement dans les astrocytes, par injection virale ou une ligne transgénique de journaliste de souris, permet l'identification plus facile de ces cellules avant deremplir. En outre, LY est limité comme un colorant cytosolique parce qu'il ne peut pas être utilisé pour étiqueter la membrane astrocyte, par rapport à l'étiquetage avec un GFP membrané par membrane, comme Lck-GFP16. Lck-GFP donnerait une représentation plus précise de l'ensemble du territoire, comme LY iontophoresis révèle le volume interne d'un astrocyte. Cependant, selon la conception expérimentale, l'iontophoresis de LY est mieux adaptée pour résoudre le volume interne entier d'astrocyte, développer des reconstructions tridimensionnelles, et quantifier les composants anatomiques qui composent la structure d'un astrocyte6 . Enfin, comme avec toutes les formes de microscopie confocale, la résolution spatiale est limitée par la diffraction, noté que la fonction de propagation de point de l'optique de microscope17. La modification des composants du système d'imagerie, comme la diminution du diamètre du sténopé, aidera à améliorer les images, mais la véritable résolution est déterminée par la longueur d'onde de la lumière et l'ouverture numérique de la lentille objective. Dans notre cas, nous estimons que la meilleure résolution possible est probablement d'environ 300 nm, ce qui est susceptible d'être pire dans l'axe z.
LY iontophoresis offre plusieurs avantages par rapport à d'autres méthodes couramment utilisées pour étiqueter les astrocytes. Le protocole peut être appliqué dans n'importe quel modèle de souris établi, population cellulaire, ou région du cerveau18,19,20 car il n'est pas limité par un promoteur spécifique astrocyte ou une ligne de souris transgénique. Les approches génétiques pour exprimer les protéines fluorescentes omniprésentes dans les astrocytes par injections virales ou lignes transgéniques de journaliste de souris (c.-à-d., td-Tomato) exigent l'utilisation d'un promoteur d'astrocytes, qui, dans certaines régions, peut être exprimée dans d'autres types de cellules ou non comprennent tous les astrocytes21. L'iontophoresis DE LY est également efficace dans le temps, car les injections virales de protéines fluorescentes nécessitent une intervention chirurgicale et du temps pour exprimer le virus spécifique, et les lignées transgéniques de souris nécessitent une reproduction. Enfin, l'iontophoresis LY est une méthode utile pour distinguer les cellules individuelles, tandis que d'autres stratégies devraient également être combinées avec une méthode d'étiquetage clairsemé pour visualiser les territoires des astrocytes individuels22,23, 24. Cependant, aucune méthode n'est une panacée et dont le choix est utilisé doit être adapté à la question spécifique abordée.
Les études futures peuvent utiliser des manipulations expérimentales spécifiques et examiner différentes composantes de la structure des astrocytes (soma, branches, processus, territoire, etc.) pour répondre à des questions morphologiques. Cela pourrait fournir un aperçu et une direction dans la morphologie des astrocytes et ses implications fonctionnelles, qui pourraient être analysées plus loin par microscopie lumineuse à super résolution ou microscopie électronique4. Par exemple, l'iontophoresis LY fournit un moyen de visualiser les processus d'astrocytes fins, qui contactent des milliers de synapses et sont impliqués dans des fonctions synaptiques. Étudier comment la structure de ces processus change dans différentes conditions pathologiques pourrait aider à élucider les rôles des astrocytes dans la santé et la maladie. L'iontophoresis de LY est une technique importante pour visualiser la morphologie cellulaire détaillée et caractériser des propriétés d'astrocyte pour mieux comprendre leurs fonctions dans le système nerveux central.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Mme Soto, le Dr Yu et le Dr Octeau pour leurs conseils ainsi que leurs commentaires sur le texte. Ce travail est soutenu par NS060677.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
References
- Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
- Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
- Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
- Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
- Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
- Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
- Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
- Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
- Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
- Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
- Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
- Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
- Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
- Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
- Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
- Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).
