Summary
Os astrócitos são células morfologicamente complexas, exemplificadas por seus múltiplos processos e territórios Bushy. Para analisar sua morfologia elaborada, apresentamos um protocolo confiável para a realização de iontoforese intracelular de Lúcifer amarelo em tecido levemente fixo.
Abstract
Os astrócitos são componentes essenciais dos circuitos neurais. Eles telha todo o sistema nervoso central (CNS) e estão envolvidos em uma variedade de funções, que incluem o afastamento do neurotransmissor, regulação de íons, modulação sináptica, suporte metabólico para neurônios, e regulação do fluxo sanguíneo. Os astrócitos são células complexas que têm um soma, vários ramos principais, e inúmeros processos finos que contatam diversos elementos celulares dentro do neuropil. A fim de avaliar a morfologia dos astrócitos, é necessário ter um método confiável e reprodutível para visualizar sua estrutura. Nós relatamos um protocolo de confiança para executar o iontoforese intracelular dos astrócitos usando a tintura fluorescente do amarelo de Lúcifer (ly) no tecido levemente fixo do cérebro dos ratos adultos. Este método tem diversas características que são úteis caracterizar a morfologia do astrocyte. Permite a reconstrução tridimensional de astrócitos individuais, o que é útil para realizar análises morfológicas em diferentes aspectos de sua estrutura. Immunohistochemistry junto com o iontoforese de ly pode igualmente ser utilizado para compreender a interação dos astrócitos com componentes diferentes do sistema nervoso e para avaliar a expressão das proteínas dentro dos astrócitos etiquetados. Este protocolo pode ser executado em uma variedade de modelos do rato de desordens do CNS para examinar rigorosa a morfologia do astrocyte com microscopia de luz. A iontoforese de LY fornece uma aproximação experimental para avaliar a estrutura do astrocyte, especial no contexto da lesão ou da doença onde estas pilhas são propor para submeter-se a mudanças morfológicas significativas.
Introduction
Os astrócitos são as células gliais mais abundantes no sistema nervoso central (SNC). Jogam papéis na homeostase do íon, na regulação do fluxo sanguíneo, na formação do sinapse assim como na eliminação, e na captação1do neurotransmissor. A vasta gama de funções do astrocyte é refletida em sua estrutura morfológica complexa2,3. Os astrócitos contêm vários ramos primários e secundários que se dividem em milhares de branchlets e folhetos mais finos que interagem diretamente com sinapses, dendritos, axônios, vasos sanguíneos e outras células gliais. A morfologia do astrocyte varia em diferentes regiões cerebrais, o que pode sugerir sua capacidade de desempenhar suas funções diferencialmente em circuitos neuronais4. Além disso, os astrócitos são conhecidos por alterarem sua morfologia durante o desenvolvimento, durante as condições fisiológicas, e em múltiplos estados de doença3,5,6.
Um método consistente, reprodutível é necessário para resolver com precisão a complexidade da morfologia do astrocyte. Tradicionalmente, a imunohistoquímica tem sido usada para visualizar os astrócitos com o uso de marcadores de proteínas enriquecidos astrocícitos ou astrocícitos. No entanto, esses métodos revelam o padrão de expressão protéica em vez da estrutura do astrocícito. Os marcadores comumente usados, como a proteína ácida fibrilhante glial (GFAP) e a proteína de ligação de cálcio S100 β (S100β), não expressam em todo o volume celular e, portanto, não resolvem a morfologia completa7. Abordagens genéticas para expressar proteínas fluorescentes onipresente em astrócitos (injeções virais ou linhas de repórter transgênica do mouse) podem identificar os ramos mais finos e o território geral. No entanto, é difícil diferenciar os astrócitos individuais, e as análises podem ser tendenciosas pela população de astrocícitos direcionada pelo promotor específico8. A microscopia de elétron da seção de série foi usada para revelar um retrato detalhado das interações de processos do astrocyte com sinapses. Devido aos milhares de processos de astrocyte em contato com sinapses, atualmente não é possível reconstruir uma célula inteira com essa técnica9, embora isso seja esperado para mudar com o uso de abordagens de aprendizado de máquina para análise de dados.
Neste relato, focamos em um procedimento para caracterizar astrócitos de camundongo usando iontoforese intracelular com corante amarelo de Lúcifer (LY), usando o radiatum de estrato CA1 como exemplo. O método é baseado no trabalho pioneiro passado por Eric Bushong e Mark Ellisman10,11. Os astrocytes de fatias levemente fixas do cérebro são identificados por sua forma distintiva do soma e enchido com o LY. As células são então imaged com microscopia confocal. Nós demonstramos como a iontoforese de ly pode ser usada para reconstruir astrócitos individuais e para executar análises morfológicas detalhadas de seus processos e território. Também, este método pode ser aplicado conjuntamente com immunohistochemistry para identificar relações espaciais e interações entre astrócitos e neurônios, outras pilhas glial, e vasculature do cérebro. Consideramos que a iontoforese é uma ferramenta muito adequada para analisar a morfologia em diferentes regiões cerebrais e modelos de camundongo de condições saudáveis ou de doença7,12,13.
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Protocol
Os experimentos com animais neste estudo foram realizados de acordo com o guia do Instituto Nacional de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê de pesquisa animal do Chanceler da Universidade da Califórnia, Los Angeles. Camundongos adultos (6 − 8 semanas de idade) de gênero misto foram utilizados em todos os experimentos.
1. preparação da solução
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Solução de fluido cefalorraquidiano artificial (ACSF)
- Prepare uma solução ACSF fresca (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 14,7 mm NaHCO3, 11 mm D-glucose, 1,25 mm na2HPO4e 2 mm CAcl2) antes de cada experimento. Adicione MgCl2 e CAcl2 na etapa final. Dissolva os componentes em água deionizada de alta qualidade.
- Incubar a solução de ACSF em 35 ° c em um banho de água e em uma bolha com 95% O2/5% co2 para pelo menos 30 minutos antes do experimento.
- Adicione 2% de cloridrato de lidocaína para atingir uma concentração final de 0, 2% em ACSF (em 100 mL).
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Solução fixativa
- Use 10% de fosfato de formalina tamponada.
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Solução de corante LY
- Prepare 1,5% LY corante solução dissolvendo LY CH dilithium sal ou LY CH sal dipotássico em 5 mM KCl. Vortex completamente. Um volume de 1 mL é suficiente para vários experimentos.
- Centrifugador por 10 min a 16.800 x g. Em seguida, filtre o sobrenadante com um filtro de seringa de 0,2 μm em um novo tubo. As alíquotas podem ser mantidas a 4 ° c por até 3 meses.
Nota: É fundamental para centrifugar e filtrar a solução corante para evitar a agregação das partículas de corante, que pode entupir o eletrodo.
2. perfusão do rato Transcardial e dissecção cerebral
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Preparação de equipamentos e mouse para perfusão perfusão
Nota: C57/BL6 camundongos de qualquer sexo pode ser usado. Tem sido empiricamente observado que para o método para trabalhar de forma confiável, é importante que os camundongos não são mais velhos do que 3 meses (6 − 8 semanas de idade é ideal). O protocolo de perfusão é descrito abaixo. Uma referência adicional é fornecida para mais detalhes14.- Limpe a tubulação da perfusão com a solução de ACSF para remover todas as bolhas de ar na linha. Configurar ferramentas de cirurgia em ordem de uso (pinças, curvas, tesoura sem corte, tesouras da íris).
- Anestesie profundamente o rato colocando-o em uma câmara da indução do isoflurano, após ter adicionado 2 − 3 ml do isoflurano à câmara. Permita 1 − 2 minutos para que o anestésico tome o efeito. Assegure-se de que a respiração não pare.
- Teste para o reflexo da pitada do dedo do pé. Proceder quando o mouse não responde ao estímulo da dor e o reflexo está ausente. Fixe o animal na posição supina com a cabeça colocada no cone respiratório com um suprimento de isoflurano a 5% em oxigênio e os membros e a cauda gravados dentro de uma capa de fumaça química.
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Perfusão transcardial
- Usando pinças, levante a pele abaixo da caixa torácica. Faça uma incisão de 5 − 6 cm com a tesoura curvada, sem corte através da pele para expor a cavidade abdominal. Corte para cima através da parede abdominal até que o fígado e o diafragma estejam visíveis.
- Mova suavemente o fígado para longe do diagrama. Com tesouras da íris, faça uma incisão lateral de 3 − 4 cm no diafragma.
- Cortar através da caixa torácica ao longo dos dois lados do corpo para expor a cavidade torácica. Tenha cuidado para não danificar o coração e evitar os pulmões. Levante o esterno para expor o coração.
- Uma vez que o coração é visível, injete 0, 5 mL de solução de sódio de heparina (1.000 USP por mL) no ventrículo esquerdo como um anticoagulante. Em seguida, insira a agulha de perfusão cuidadosamente no ventrículo esquerdo. Certifique-se de que a agulha permaneça no ventrículo e não perfure através de outras câmaras cardíacas. Faça uma pequena incisão no átrio direito com tesouras de íris.
- Perfuse com solução de ACSF em uma taxa de aproximadamente 10 mL/min até que o líquido existente o corpo esteja cancelado do sangue (1 − 2 minutos).
- Mude da solução de ACSF à solução fixador sem introduzir nenhumas bolhas de ar. Perfuse com solução fixativa por 10 min a 10 − 20 mL/min.
Atenção: Tome cuidado para que nenhuma solução fixativa esteja drenando do nariz. Isso indica que a agulha atingiu o ventrículo direito e o fixador está viajando para os pulmões, em vez de através do circuito sistêmico para o resto do corpo.
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Dissecção do cérebro
- Retire a cabeça do rato com uma tesoura e cuidadosamente dissecar o cérebro do rato do crânio. Coloc na solução fixador para 1,5 h na temperatura ambiente para um período curto da borne-fixação.
Nota: Uma boa perfusão é necessária para A iontoforese bem sucedida de LY. O cérebro deve ser de cor branca e ausente de sangue na vasculatura cerebral. Corpo e membros devem aparecer duros.
- Retire a cabeça do rato com uma tesoura e cuidadosamente dissecar o cérebro do rato do crânio. Coloc na solução fixador para 1,5 h na temperatura ambiente para um período curto da borne-fixação.
3. preparação da fatia
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Preparação de fatias do hippocampal
- Lave o cérebro com 0,1 M de fosfato salina tamponada (PBS) à temperatura ambiente por 5 min. Em seguida, seque o cérebro com papel de filtro e retire o bulbo olfatório e cerebelo com uma lâmina afiada.
- Monte o cérebro na bandeja do usando cola de cianoacrilato e encha a bandeja com PBS à temperatura ambiente. Corte as secções coronais hipocampais de 110 μm de espessura.
Nota: Ajuste o ajuste do do para certificar-se de que as fatias têm a mesma espessura e mesmo superfície. Para este experimento, utilizou-se um ajuste de velocidade de 4,5 e um ajuste de frequência de 8, que são configurações arbitrárias no instrumento (tabela de materiais). Os usuários podem precisar experimentar as configurações em outros dispositivos. - Colete as seções da bandeja e coloque em um prato de PBS no gelo.
4. preparação do eletrodo
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Prepare um eletrodo afiado com resistência adequada.
- Use um vidro de borosilicato único eletrodo de barril com filamento (O.D. 1,0 mm, identificação 0,58 mm). Puxe um eletrodo em um extrator de micropipeta (tabela de materiais). Os eletrodos ideais preenchidos com 1,5% LY em KCl de 5 mM devem ter uma resistência de 200 MΩ quando colocados em um banho de PBS.
Nota: O ajuste do extrator varia dependendo do aparelho (tipo de máquina usada e filamento do extrator). Um ajuste mais elevado do calor dá geralmente umas pontas mais longas e mais finas. Para o extrator de micropipeta usado neste experimento, as configurações foram: calor: 317, puxar: 90, velocidade: 70, e atraso: 70. Utilizou-se um filamento tipo calha. - Armazene os eletrodos em um recipiente fechado para evitar que a poeira entre na ponta. Mantenha os eletrodos elevados da parte inferior da caixa para evitar que a ponta se quebra.
- Use um vidro de borosilicato único eletrodo de barril com filamento (O.D. 1,0 mm, identificação 0,58 mm). Puxe um eletrodo em um extrator de micropipeta (tabela de materiais). Os eletrodos ideais preenchidos com 1,5% LY em KCl de 5 mM devem ter uma resistência de 200 MΩ quando colocados em um banho de PBS.
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Encha o eletrodo com a solução de corante LY.
- Coloque um eletrodo na posição vertical com a ponta virada para baixo. Pipete 1 − 2 μL de solução LY na parte de trás do eléctrodo e aguarde 5 − 10 min para que a solução se desloque para a ponta através de uma acção capilar.
- Fixe delicadamente o elétrodo enchido no suporte do elétrodo conectado a um manipulador.
Nota: O fio de prata do suporte do elétrodo precisa de estar no contato com o LY dentro do elétrodo. Ajuste o volume da solução LY, se necessário, dependendo do comprimento do fio.
5. enchimento de astrócitos com iontoforese
- Teste o eletrodo.
- Coloc uma fatia do cérebro delicadamente em um prato inferior de vidro enchido com o PBS de 0,1 M na temperatura ambiente. Segure a fatia no lugar com uma harpa de platina com cordas de nylon.
- Assegure-se de que o elétrodo esteja conectado a uma fonte da tensão e coloc o elétrodo à terra no banho que contem a fatia do cérebro.
- Mova o objetivo para a região cerebral de interesse.
- Abaixe o eletrodo na solução. o campo brilhante, movê-lo para o centro do campo de visão e examiná-lo cuidadosamente com a lente de imersão 40x água para garantir que ele parece claro e sem detritos ou bolhas. Se houver algo entupimento da ponta do eletrodo, substitua-o por um novo.
Nota: Entupimento é uma preocupação para o 200 MΩ eletrodo. Com a centrifugação e filtração da solução corante antes de cada experimento, este não deve ser um problema frequente. Entretanto, porque a ponta do elétrodo é pequena, o tecido pode às vezes ficar furado na abertura. Os autores não encontraram uma maneira de evitar isso, mas pode ser facilmente tratada por simplesmente usando um novo eletrodo. - Observe a ponta do eletrodo o microscópio de varredura de laser confocal com o laser de 488 nm. Então, teste a ejeção da tintura girando sobre o estimulador em 12 V. Anote uma grande nuvem fluorescente da tintura em torno da ponta do elétrodo quando o estimulador estiver sobre. Se nenhum ou pouco corante é ejetado em cima da estimulação da tensão, substitua o elétrodo.
- o campo luminoso, abaixe lentamente o eletrodo em direção à fatia parando logo acima da superfície.
- Encha o astrocyte com iontoforese.
- Identifique os astrócitos 40 − 50 μm abaixo da superfície da fatia com o contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC). Procure células com SOMATA alongada, oval em forma de cerca de 10 μm de diâmetro. Uma vez que um astrocyte é escolhido, movê-lo para o centro do campo de visão.
Nota: Uma boa célula para iontoforese tem bordas claras e definidas em torno dele. Não escolha células muito próximas à superfície da fatia porque elas não podem ser completamente preenchidas. Toma alguma prática sobre alguns dias para poder identificar rotineiramente astrócitos para o enchimento da tintura. Dependendo da área cerebral usada para o experimento, o número de astrócitos pode variar. Isto pode afetar o tempo necessário para identificar um astrocyte antes de encher. - Abaixe lentamente a ponta do elétrodo na fatia, navegando através do tecido, até que esteja no mesmo plano que o corpo da pilha.
Nota: Mova o eletrodo lentamente para evitar danificar o tecido. - Uma vez que o corpo da célula do astrocyte é claramente visível e delineado, lentamente e gentilmente avançar o eletrodo para a frente. Mova o elétrodo até que a ponta empales o soma da pilha. Mova o foco do objetivo lentamente para cima e para baixo para notar se o eletrodo está dentro do soma.
Nota: A ponta do eletrodo deve estar dentro do corpo da célula, e um pequeno recuo no soma deve ser observado. Não mova o elétrodo mais adicional para evitar a ponta que atravessa a pilha. - Uma vez que a ponta do elétrodo está dentro da pilha, gire sobre o estimulador em ~ 0.5 − 1 V e ejetar continuamente a corrente na pilha. Usando o microscópio confocal, observe o preenchimento da célula. Aumente o zoom digital para ver os detalhes da célula e certifique-se de que a ponta do eletrodo é visível dentro da célula.
Nota: Abaixe a tensão se parece que o corante está vazando para fora da célula ou enchendo outras células na vizinhança. Se parece que a tintura ainda está vazando para fora da célula, puxe o eletrodo para fora lentamente e encontrar outra célula. É importante que o corante não vaze para ter uma alta relação sinal/fundo na imagem final. - Aguarde cerca de 15 min até que as ramificações e os processos mais finos apareçam definidos, desligue a voltagem e retire suavemente a ponta do eletrodo da célula.
- Identifique os astrócitos 40 − 50 μm abaixo da superfície da fatia com o contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC). Procure células com SOMATA alongada, oval em forma de cerca de 10 μm de diâmetro. Uma vez que um astrocyte é escolhido, movê-lo para o centro do campo de visão.
- Imagem da célula preenchida.
Nota: a imagem latente pode ser executada imediatamente depois de encher ou de seguir manchar com immunohistochemistry. Um objetivo com maior abertura numérica (NA) resulta em melhor resolução.- Aguarde até que a célula retorne ao formulário original antes da imagem (15 − 20 min) com o objetivo de 40x. Para fazer a imagem da célula, ajuste a configuração no confocal para certificar-se de que as ramificações e os processos mais finos apareçam definidos.
- Configure uma pilha z com um tamanho de passo de 0,3 μm. Quando a imagem latente, mova o objetivo até que não haja nenhum sinal da pilha e o ajuste que como a parte superior. Então, mova o objetivo para baixo (focalizando através da pilha) até que não haja nenhum sinal, ajuste isso como a parte inferior.
- Depois que a imagem latente é completa, verific o elétrodo para a ejeção da tintura. Se uma grande nuvem de corante aparecer, ela pode ser usada para a próxima fatia. Caso contrário, substitua-o por um novo eletrodo.
Nota: O enchimento da tintura de um único astrocyte e de imagem toma aproximadamente 45 minutos a 1 h. Para este experimento específico, foi possível obter cerca de 3 − 6 células por mouse. Se necessário, várias células podem ser rotuladas na mesma fatia. No entanto, para distinguir astrócitos individuais, certifique-se de manter uma distância de cerca de 200 μm entre as células.
6. coloração com immunohistochemistry (opcional)
- Uma vez que a imagem é feita, imediatamente coloque a fatia em formalina 10% no gelo para preservar para immunohistochemistry. Mantenha as fatias cerebrais no escuro e armazene durante a noite a 4 ° c.
- Lave as secções do cérebro 3x em 0,1 M PBS com 0,5% de surfactante não iônico (i.e., Triton X 100) durante 5 min cada. Em seguida, incubar em uma solução de bloqueio de 0,1 M PBS com 0,5% surfactante não iônico e 10% de soro de cabra normal (NGS) por 1 h à temperatura ambiente com agitação suave.
- Incubar as seções com agitação em anticorpos primários diluídos em PBS 0,1 M com surfactante 0,5% não iônico e 5% NGS por 2 dias a 4 ° c.
Nota: Por causa da espessura das fatias do cérebro, o período de incubação dos anticorpos preliminares precisa de ser prolongado para a melhor penetração e a concentração do anticorpo pode ser aumentada. Neste experimento, foi utilizada uma diluição de 1:500 para o anticorpo anti GFAP e foi utilizada uma diluição de 1:500 para o anticorpo anti aquaporina-4. - Lave as secções 3x em 0,1 M PBS com 0,5% de surfactante não iônico durante 10 min cada e, em seguida, incubar com anticorpos secundários diluídos em 0,1 M PBS com um surfactante não iônico de 0,5% e 10% de NGS para 6 h à temperatura ambiente.
Nota: Não escolha um anticorpo secundário excitado por 488 nm, que é o comprimento de onda usado para visualizar o corante LY. Neste experimento, foi utilizada uma diluição de 1:1000 para Alexa fluor 546 goat anti-frango IgG (H + L) e Alexa fluor 647 goat anti-Rabbit IgG (H + L). - Enxague as secções 3x em 0,1 M PBS durante 10 min cada. Em seguida, monte as secções em lâminas de microscópio de vidro em suportes de montagem adequados para fluorescência. Slides de vedação. Células de imagem em um tamanho de etapa de 0,3 μm.
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Representative Results
Os dados relatados neste estudo são de 7 − 12 células de 4 camundongos em cada experimento. Os dados médios são relatados nos painéis de figura, quando apropriado.
Para avaliar a morfologia do astrocite, realizou-se iontoforese intracelular com corante LY para preenchimento de astrócitos no estrato de CA1 radiatum, que está resumido na Figura 1. A Figura 2 retrata um astrocite representativo e sua elaborada estrutura morfológica. A célula foi imaged pós-fixação com a lente de imersão de óleo 60x em um microscópio de varredura de laser confocal usando a linha de laser de 488 nm (tamanho do passo de 0,3 μm e zoom digital de 3,0 − 3,5 x). As funções de tubo fotomultiplicador (PMT), offset e ganho do microscópio confocal foram ajustadas para criar uma alta relação sinal/fundo na imagem final. Na Figura 2a, imagens de plano óptico único de diferentes passos z (mostrados a cada 10 μm, rotulados em ordem de 1 − 6) revelam o soma central e vários ramos principais que se dividiram em uma densa rede de processos. Ao gerar uma projeção de intensidade máxima (tamanho da pilha de 85 μm) observamos uma visão detalhada da estrutura do astrocite e seu domínio (Figura 2B). Os componentes principais da estrutura do astrocyte foram anotados igualmente. Figura 2 C mostra uma projeção de intensidade máxima de zoom (X4) de uma filial principal, várias ramificações secundárias e a distribuição dos branchlets e folhetos circundantes.
Análises morfológicas e reconstruções de astrócitos foram realizadas com o software de análise Imaris (tabela de materiais) utilizando as imagens pós-fixação de astrócitos com ly-filled (outros softwares como o ImageJ também poderiam ser usados). Depois que a reconstrução de cada astrocyte foi terminada, os volumes do soma, das filiais principais, dos processos, e do território foram quantificados. O soma foi criado primeiro com um conjunto de suavização de superfície para o limite de resolução de plano x-y (0,25 μm). O diâmetro mínimo do objeto foi fixado em 3,0 μm para remover outros objetos não associados ao corpo da célula. Para criar os principais ramos, a intensidade do soma foi mascarada, devido ao seu brilho em relação ao resto da célula. A suavização de superfície e o diâmetro mínimo do objeto das ramificações principais foram definidos como 0,3 μm (tamanho do degrau plano z). Para criar os processos, a intensidade dos ramos principais também foi mascarada. A suavização de superfície foi ajustada para 0,18 μm e o diâmetro mínimo do objeto foi ajustado para 0,3 μm. O território do astrocyte foi criado usando um limiar de intensidade inferior e alisamento de superfície definido para 0,75 μm. Figura 3a mostra a imagem original de um astrocyte CA1. O corpo celular, os principais ramos, os processos e o volume do território delimitados pelo astrocite são reconstruídos na Figura 3B-E. Após a criação das reconstruções das células, foram quantificados os volumes de soma, célula inteira e território, e o número de ramos principais foi contado (tabela 1). Os astrócitos CA1 do estrato radiatum apresentaram um volume médio de soma de 488,91 μm3, média de ~ 7 ramos primários, volume celular médio de 5,58 x10 3 μm3e volume médio de território de 2,94 x 104 μm3.
O marcador bem caracterizado do astrocyte, GFAP, é uma proteína cytoesquelética que rotula os filamentos intermediários de um astrocyte8. Após os astrócitos estarem cheios de corante, realizamos imunocoloração para GFAP para visualizar a expressão em astrócitos individuais (Figura 4). Verificou-se que a GFAP foi expressa na soma celular, ramos principais e alguns ramos secundários dos astrócitos, mas não nos ramos e processos mais finos (Figura 4A). Não foi encontrada diferença significativa no número de ramos primários rotulados pelo GFAP e aqueles visualizados por LY (p = 0,1573; Figura 4 B). a área celular e o volume do astrocite rotulado por GFAP foram significativamente menores do que a área e o volume visualizados com ly (p < 0, 1; Figura 4 C, D). Isso demonstra que o GFAP é um marcador confiável para a rotulagem de ramificações principais, mas não é útil para determinar a área geral ou o volume da célula.
Uma característica importante dos astrócitos é a sua endfeet, que contatam os vasos sanguíneos e são propostos para ajudar a regular o fluxo sanguíneo no SNC. Para compreender mais a relação espacial entre astrócitos e vasculatura cerebral, coramos com anticorpos contra aquaporina-4 após o enchimento da tintura. Aquaporin-4 é uma proteína de canal de água encontrada em astrócitos e células ependymal, e é altamente expressa em áreas próximas a ventrículos e vasos sanguíneos15. Nós encontramos que Aquaporin-4 é expressado em endfeet do astrocyte na proximidade próxima à vasculatura do cérebro (Figura 5a). A imagem retrata três endfeet do astrocyte que contactam um vaso sanguíneo em posições diferentes (indicadas pelas setas brancas). No radiatum do estrato CA1, o número médio de endfeet por astrocyte foi de ~ 2 (Figura 5B). Curiosamente, os ramos que continham endfeet foram significativamente mais grossos que os demais ramos primários do astrocite, utilizando-se as principais reconstruções de ramo (p = 0, 38; Figura 5 C). nós igualmente medimos o comprimento dos ramos que contêm endfeet do centro do soma ao vaso sanguíneo e comparado aquele ao trajeto mais curto, direto ao vaso sanguíneo. O comprimento real dos ramos para o vaso sanguíneo foi significativamente maior do que o trajeto mais curto (p = 0, 333; Figura 5 D), o que sugere que esses ramos tendem a tomar uma rota mais longa e circuitosa para o vaso sanguíneo. O filme 1 retrata um filme de uma reconstrução de um astrocyte ly-filled e de um Aquaporin-4 que mancham. Os diferentes componentes estruturais do astrocite (soma, ramos principais, processos e território) são representados em três dimensões. O astrocyte LY-filled junto com a coloração de Aquaporin-4 retratam os endfeet do astrocyte que cercam o vaso sanguíneo. A partir da reconstrução dos principais ramos e do vaso sanguíneo, os galhos que contêm endfeet podem ser visualizados estendendo-se do soma para o vaso.
Nas seções anteriores, onde os valores de p são relatados, utilizou-se o teste t de Student não pareado, com significância de p < 0, 5.
Figura 1: diagrama de fluxo de trabalho em iontoforese ly. Representação esquemática do protocolo destacando as etapas críticas. Depois que o rato foi perfundidos com fixative, o cérebro foi dissecado. Após um curto período pós-fixação, cortes coronais foram cortados com um vibratoma. Eletrodo foi preenchido com 1,5% LY corante. Os astrocytes foram identificados no radiatum do estrato CA1 usando o IR-DIC em um microscópio claro. O soma da célula foi empalado pelo eletrodo, e a tintura foi injetada na célula aplicando 0,5 − 1 V até que os processos mais finos estivessem completamente preenchidos. A fatia foi imaged com microscopia confocal usando uma lente da imersão da água 40x e processada então para immunohistochemistry. A imagem latente mais adicional foi terminada com uma lente da imersão do óleo 60x para executar a reconstrução da pilha e a análise morfológica. Mostrado é um exemplo de reconstrução dos processos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: astrocite ly-filled do radiatum do estrato de CA1. (A) imagens de plano óptico único de um astrocite mostrados a cada 10 μm (rotulados como 1 − 6). (B) projeção máxima do astrocite, representando a soma celular, vários ramos principais, e inúmeros processos que compõem seu território espesso. (C) projeção máxima (zoom X4) de uma filial principal (da seção esboçada em amarelo), dois ramos secundários, vários branchets, e a organização dos processos circunvizinhos. Barra de escala = 10 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: reconstrução de um astrocite com ly-filled e seus componentes. (A) CA1 astrocyte preenchido com ly. (B-E) Reconstrução tridimensional do soma (B), soma e ramos principais (C), processos (D) e território (e) a0 ° e orientação de 45 °. Barra de escala = 10 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: imunocoloração de GFAP em astrócitos preenchidos com ly. (A) projeção z representativa de coloração ly (verde) e GFAP (magenta). GFAP é expressado primeiramente no preliminar e em algumas filiais secundárias do astrocyte, mas não foi encontrado dentro do território inteiro do astrocyte. Barra de escala = 10 μm. (B) gráfico do número de ramos primários rotulados por ly e GFAP. (C) área celular denotada por ly e GFAP coloração. (D) volume celular denotado pela coloração de ly e GFAP. Os círculos abertos são dados brutos com quadrados fechados indicando média ± SEM. os dados foram coletados de 12 células de 4 camundongos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: imunocoloração aquaporina-4 em astrócitos preenchidos com ly. (A) projeção z representativa de coloração de ly (verde) e aquaporina-4 (magenta). Aquaporin-4 é expressado principalmente nos endfeet do astrocyte. As setas brancas denotam os três pés finais como eles contatam um vaso sanguíneo nas proximidades. Barra de escala = 10 μm. (B) número de filiais com endfeet por astrocyte. (C) espessura de ramos com endfeet em comparação com os outros ramos primários dos astrócitos. (D) comprimento de ramos com endfeet em comparação com o caminho mais curto para o vaso sanguíneo. Os círculos abertos são dados brutos com quadrados fechados indicando média ± SEM. os dados foram coletados de 7 células de 4 camundongos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: reconstrução de um astrocyte ly-filled e de um Aquaporin-4 que mancham. Filme representativo de um astrocyte CA1 na proximidade de um vaso sanguíneo. O soma, os principais ramos, processos e território foram reconstruídos para analisar a morfologia da célula. A reconstrução das filiais principais junto com Aquaporin-4 descreve dois endfeet do astrocyte que contacta diretamente o vaso sanguíneo. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
| Características morfológicas | Média ± SEM |
| Volume soma (μm3) | 489 ± 30 |
| Número de filiais primárias | 7,0 ± 0,5 |
| Volume celular (μm3) | 5580 ± 425 |
| Volume do território (μm3) | 29391 ± 8150 |
| Número de células | 14 |
Tabela 1: análise morfológica da estrutura do astrocite. O volume do astrocyte soma, o número de filiais preliminares por astrocyte, o volume da pilha do astrocyte, e o volume incluidos pelo território do astrocyte são mostrados. Os dados foram coletados de 14 células de 7 camundongos.
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Discussion
O método esboçado neste papel descreve uma maneira de visualizar a morfologia do astrocyte usando o iontoforese intracelular do corante de ly em fatias levemente fixas do cérebro. Existem vários fatores críticos destacados neste protocolo que contribuem para a bem sucedida iontoforese e reconstrução morfológica das células. Um fator é a qualidade e reprodutibilidade das imagens, que é determinada em grande parte pela idade do rato e o resultado da perfusão. Neste estudo, foram utilizados camundongos C57/BL6N de 6 a 8 semanas de idade. Uma perfusão bem sucedida (altamente dependente da colocação apropriada da agulha perfusing e anotada por um cérebro de cor branca e pela ausência de sangue no vasculature do cérebro) é necessária para as pilhas as mais detalhadas e claramente enchidas. Após o empalamento por um elétrodo, a membrana de pilha deve manter um selo apertado em torno da ponta do elétrodo e impedir que o corante escape para fora. Apesar dos melhores esforços, ocasionalmente outras estruturas fora da célula serão preenchidas à medida que a pipeta é avançada através do tecido cerebral: excluímos essas células da análise. A resistência dos eletrodos é um fator chave adicional. A resistência elevada permite somente uma ejeção constante da tintura da ponta do elétrodo em cima da estimulação da tensão. Mais tecnicamente, é importante manter movimentos suaves e lentos ao empalar o soma da célula com o eletrodo. A penetração do eletrodo através da célula pode levar ao vazamento de corante do soma. Um empalamento bem sucedido seguido pela aplicação da tensão deve conduzir ao enchimento quase imediato da tintura do corpo e dos processos da pilha (isto é, dentro de alguns segundos). O tempo necessário para encher completamente um astrocyte está relacionado ao território que engloba; no entanto, aguarde para garantir que os processos mais finos estão completamente preenchidos (pelo menos 15 min).
Encontramos este protocolo para ser uma forma mais fiel de estudar a morfologia dos astrocícitos em detalhes, no entanto, o método tem suas limitações. A identificação de uma célula pode ser demorada e sujeita a erros. IR-DIC, um deve identificar características distintivas que marcam o tipo específico da pilha (forma e tamanho do soma). Alternativamente, a expressão de repórteres fluorescentes vermelhos especificamente em astrocytes, por injeção viral ou uma linha de repórter transgênica do rato, permite a identificação mais fácil destas pilhas antes de encher. Também, o ly é limitado como um corante citosólico porque não pode ser usado para etiquetar a membrana do astrocyte, em comparação a etiquetar com um GFP membrana-tethered, tal como o lck-GFP16. Lck-GFP daria uma representação mais precisa de toda a área do território, como a iontoforese de LY revela o volume interno de um astrocyte. No entanto, dependendo do experimento experimental, a iontoforese de LY é mais adequada para resolver todo o volume interno do astrocite, desenvolver reconstruções tridimensionais e quantificar os componentes anatômicos que compõem a estrutura de um Astrócito6 . Finalmente, como em todas as formas de microscopia confocal, a resolução espacial é limitada por difração, anotada como a função de spread pontual do microscópio óptico17. Alterando os componentes do sistema de imagem, como diminuir o diâmetro do furo de pino, ajudará a melhorar as imagens, mas a verdadeira resolução é determinada pelo comprimento de onda da luz e a abertura numérica da lente objetiva. No nosso caso, estimamos a melhor resolução possível é provavelmente em torno de 300 nm, que é susceptível de ser pior no eixo z.
A iontoforese de LY oferece diversas vantagens sobre outros métodos geralmente usados para etiquetar astrocytes. O protocolo pode ser aplicado em qualquer modelo de mouse estabelecido, população celular, ou região cerebral18,19,20 como não é limitado por um promotor específico astrocyte ou uma linha de mouse transgênico. Abordagens genéticas para expressar as proteínas fluorescentes onipresente em astrócitos por injeções virais ou linhas de repórter transgênica do rato (ou seja, TD-tomate) requerem o uso de um promotor astrocícito, que, em algumas regiões, pode ser expresso em outros tipos de células ou não incluir todos os astrócitos21. A iontoforese de ly é igualmente tempo-eficiente, porque as injeções virais de proteínas fluorescentes exigem a cirurgia e o tempo para expressar o vírus específico, e as linhas transgênicas do rato exigem a criação de animais. Finalmente, a iontoforese é um método útil para distinguir as células individuais, enquanto outras estratégias também precisam ser combinadas com um método de rotulagem esparsa para visualizar os territórios de astrócitos individuais22,23, a 24. No entanto, nenhum método é uma panaceia e a escolha do que é usado precisa ser adaptada à questão específica que está sendo abordada.
Os estudos futuros podem empregar manipulações experimentais específicas e examinar componentes diferentes da estrutura do astrocyte (soma, filiais, processos, território, etc.) para responder a perguntas morfológicas. Isto poderia fornecer a introspecção e o sentido na morfologia do astrocyte e em suas implicações funcionais, que poderiam ser analisadas mais pela fotomicroscopia de luz super da definição ou pela microscopia de elétron4. Por exemplo, a iontoforese de ly fornece um meio para visualizar os processos finos do astrocyte, que contatam milhares de sinapses e são involvidos em funções sináptica. Estudar como a estrutura desses processos muda em diferentes condições patológicas poderia ajudar a elucidar os papéis dos astrócitos na saúde e na doença. A iontoforese de LY é uma técnica importante para visualizar a morfologia detalhada da pilha e para caracterizar Propriedades do astrocyte para compreender melhor suas funções no sistema nervoso central.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Sra. Soto, o Dr. Yu, e o Dr. Octeau por orientação, bem como comentários sobre o texto. Este trabalho é apoiado por NS060677.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
References
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