Summary
Астроциты являются морфологически сложными клетками, о чем свидетельствует их многочисленные процессы и густые территории. Для анализа их сложной морфологии мы представляем надежный протокол для выполнения внутриклеточного люцифера желтого ионтофореза в слегка фиксированной ткани.
Abstract
Астроциты являются важнейшими компонентами нейронных цепей. Они плитки всей центральной нервной системы (ЦНС) и участвуют в различных функций, которые включают нейромедиатор зазор, ионная регуляция, синаптической модуляции, метаболической поддержки нейронов, и регулирование кровотока. Астроциты являются сложными клетками, которые имеют сома, несколько крупных ветвей, и многочисленные тонкие процессы, которые контактируют с различными клеточными элементами в нейропиле. Для того, чтобы оценить морфологию астроцитов, необходимо иметь надежный и воспроизводимый метод визуализации их структуры. Мы сообщаем о надежном протоколе для выполнения внутриклеточного ионтофореза астроцитов с использованием флуоресцентного желтого (LY) красителя Люцифера в слегка фиксированной ткани мозга от взрослых мышей. Этот метод имеет несколько особенностей, которые полезны для характеристики морфологии астроцитов. Это позволяет трехмерную реконструкцию отдельных астроцитов, что полезно для проведения морфологического анализа по различным аспектам их структуры. Иммуногистохимия вместе с ионтофорусом LY также может быть использована для понимания взаимодействия астроцитов с различными компонентами нервной системы и для оценки экспрессии белков в обозначенных астроцитах. Этот протокол может быть реализован в различных моделях мыши расстройств ЦНС для тщательного изучения морфологии астроцитов с помощью световой микроскопии. Ионтофорез LY обеспечивает экспериментальный подход к оценке структуры астроцитов, особенно в контексте травмы или болезни, где эти клетки предлагается претерпеть значительные морфологические изменения.
Introduction
Астроциты являются наиболее распространенными глиальными клетками в центральной нервной системе (ЦНС). Они играют роль в ионного гомеостаза, регуляции кровотока, формирования синапсов, а также ликвидации, и поглощение нейромедиатора1. Широкий спектр функций астроцитов отражается в их сложной морфологической структуре2,3. Астроциты содержат несколько первичных и вторичных ветвей, которые делятся на тысячи тонких ветвей и листовок, которые непосредственно взаимодействуют с синапсами, дендритами, аксонами, кровеносными сосудами и другими глиальными клетками. Морфология астроцитов варьируется в разных областях мозга, что может намекать на их способность выполнять свои функции дифференцированным в нейронных цепях4. Кроме того, астроциты, как известно, изменить свою морфологию во время развития, во время физиологических условий, и в нескольких состояниях болезни3,5,6.
Для точного решения сложности морфологии астроцитов необходим последовательный, воспроизводимый метод. Традиционно, иммуногистохимия была использована для визуализации астроцитов с использованием астроцитов конкретных или астроцитов обогащенных маркеров белка. Тем не менее, эти методы показывают структуру экспрессии белка, а не структуру астроцитов. Широко используемые маркеры, такие как глиальный фибриллюкислый кислотный белок (GFAP) и S100 кальций связывающий белок (S100), не выражаются во всем объеме клеток и, таким образом, не разрешают полную морфологию7. Генетические подходы к экспрессу флуоресцентных белков повсеместно в астроцитах (вирусные инъекции или трансгенные линии репортера мыши) могут определить более тонкие ветви и общую территорию. Тем не менее, трудно дифференцировать отдельные астроциты, и анализы могут быть предвзятыми по популяции астроцитов, мишенью для конкретногопромоутера 8. Для выявления детальной картины взаимодействия астроцитных процессов с синапсами используется серийная электронная микроскопия. Из-за тысяч астроцитов процессов контакта синапсов, в настоящее время не представляется возможным реконструировать всю ячейку с этой техникой9, хотя это, как ожидается, изменится с использованием машинного обучения подходов для анализа данных.
В этом отчете мы сосредоточиваемся на процедуре характеристики астроцитов мыши с использованием внутриклеточного ионтофорасиса с желтым (LY) красителем Люцифера, используя радиат слоя CA1 в качестве примера. Метод основан на новаторской прошлой работе Эрикbus и Марк Эллисман10,11. Астроциты из слегка фиксированных ломтиков мозга идентифицируются по их отличительной форме сомы и заполнены LY. Клетки затем изображены с конфокальной микроскопией. Мы демонстрируем, как ионтофорес LY может быть использован для реконструкции отдельных астроцитов и проведения детального морфологического анализа их процессов и территории. Кроме того, этот метод может быть применен в сочетании с иммуногистохимии для выявления пространственных связей и взаимодействий между астроцитами и нейронами, другими глиальными клетками и сосудами мозга. Мы считаем, LY ионтофорез, чтобы быть очень подходящим инструментом для анализа морфологии в различных областях мозга и мыши модели здоровых или заболеваний условия7,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных в этом исследовании были проведены в соответствии с Национальным институтом здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по исследованиям животных канцлера в Университете Калифорнии, Лос-Анджелес. Взрослые мыши (от 6 до 8 недель) смешанного пола использовались во всех экспериментах.
1. Подготовка решения
-
Искусственный спинномозговой жидкости (ACSF) решение
- Приготовьте свежий раствор ACSF (135 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 14,7 мМ NaHCO3, 11 мМ D-глюкоза, 1,25 мМ Na2HPO4, и 2 мМ CaCl2) перед каждым экспериментом. Добавьте MgCl2 и CaCl2 на заключительном этапе. Растворите компоненты в высококачественной деионизированной воде.
- Инкубировать раствор ACSF при 35 градусах Цельсия в водяной бане и пузырь с 95% O2/ 5% CO2, по крайней мере 30 минут до эксперимента.
- Добавьте 2% гидрохлорид лидокаина, чтобы достичь конечной концентрации 0,02% в ACSF (в 100 мл).
-
Исправление решения
- Используйте 10% формалина буферизированного фосфата.
-
LY раствор красителя
- Приготовьте 1,5% LY растворить растворительную соль дилития LY CH или соль диполотия LY CH в 5 мМ KCl. Vortex тщательно. Объем 1 мл достаточен для нескольких экспериментов.
- Центрифуга в течение 10 мин при 16800 х г. Затем отфильтруйте супернатант фильтром шприца 0,2 мкм в новую трубку. Aliquots может храниться при 4 градусах по Цельсию в течение 3 месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно центрифуги и фильтровать раствор красителя для предотвращения агрегации частиц красителя, которые могут засорить электрод.
2. Мышь Транскардиальной перфузии и рассечения мозга
-
Подготовка оборудования и мыши для перфузии транскардиала
ПРИМЕЧАНИЕ: C57/BL6 мышей любого пола могут быть использованы. Было эмпирически отмечено, что для метода, чтобы работать надежно, важно, чтобы мыши не старше 3 месяцев (6-8 недель является идеальным). Протокол перфузии описан ниже. Дополнительная ссылка предоставляется для более подробной информации14.- Очистить перфузионные трубки с раствором ACSF, чтобы удалить любые пузырьки воздуха в линии. Настройка хирургических инструментов в порядке использования (пинцет, изогнутые, тупые ножницы, ножницы радужной оболочки глаза).
- Глубоко обезопаживайте мышь, поместив ее в изофлуранскую индукционную камеру, после добавления в камеру 2,3 мл изофлюрани. Разрешить 1'2 мин для анестезии, чтобы ввести в действие. Убедитесь, что дыхание не прекращается.
- Тест для ногой щепотку рефлекс. Продолжить, когда мышь не реагирует на боль стимул и рефлекс отсутствует. Безопасные животных в положении на спине с головой помещены в дыхательный конус с поставкой 5% изофруран в кислороде и конечностей и хвоста лентой вниз внутри химического дыма капот.
-
Транскардиейная перфузия
- Используя пинцет, поднимите кожу под грудную клетку. Сделайте разрез на 5–6 см с помощью изогнутых, тупых ножниц через кожу, чтобы разоблачить брюшную полость. Вырезать вверх через брюшную стенку, пока печень и диафрагма видны.
- Аккуратно отодвинете печень от диаграммы. С ножницами радужной оболочки, сделать 3'4 см боковой разрез в диафрагме.
- Вырезать через грудную клетку вдоль обеих сторон тела, чтобы разоблачить грудной полости. Будьте осторожны, чтобы не повредить сердце и избежать легких. Поднимите грудину, чтобы разоблачить сердце.
- Как только сердце видно, вводят 0,05 мл раствора натрия гепарина (1000 USP на мл) в левый желудочек в качестве антикоагулянта. Затем вставьте перфузионную иглу тщательно в левый желудочек. Убедитесь, что игла остается в желудочке и не прокалывается в другие камеры сердца. Сделайте небольшой разрез в правом предсердии ножницами радужной оболочки.
- Пронизываете раствор ACSF со скоростью около 10 мл/мин до тех пор, пока существующая жидкость не очищается от крови (1–2 мин).
- Переход от решения ACSF к фиксаторному решению без введения пузырьков воздуха. Perfuse с фиксаторным решением в течение 10 мин на 10'20 мл/ мин.
ПРЕДЕКТО: Позаботьтесь о том, чтобы ни одно фиксаторное решение не вытекает из носа. Это указывает на то, что игла достигла правого желудочка и фиксатор едет в легкие, а не через системную цепь к остальной части тела.
-
Рассечение мозга
- Снимите голову мыши ножницами и тщательно вскрывайте мозг мыши из черепа. Поместите в фиксаторный раствор на 1,5 ч при комнатной температуре в течение короткого периода после фиксации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая перфузия необходима для успешного ионтофореза. Мозг должен быть белого цвета и отсутствие крови в сосуды мозга. Тело и конечности должны казаться жесткими.
- Снимите голову мыши ножницами и тщательно вскрывайте мозг мыши из черепа. Поместите в фиксаторный раствор на 1,5 ч при комнатной температуре в течение короткого периода после фиксации.
3. Подготовка фрагмента
-
Приготовление гиппокампа ломтиками
- Вымойте мозг с 0,1 М фосфат буферного солима (PBS) при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем высушите мозг фильтровальной бумагой и удалите обонятельную луковицу и мозжечок острым лезвием бритвы.
- Установите мозг на подносе вибратома с помощью клея цианоакрилат а также заполните лоток PBS при комнатной температуре. Вырезать гиппокампа корональных секций толщиной 110 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте настройки вибратом, чтобы убедиться, что ломтики имеют такую же толщину и даже поверхность. Для этого эксперимента были использованы настройка скорости 4,5 и частота 8, которые являются произвольными настройками на инструменте(Таблица материалов). Пользователям может потребоваться поэкспериментировать с настройками на других устройствах. - Соберите секции из лотка и поместите в блюдо PBS на льду.
4. Подготовка электрода
-
Приготовьте острый электрод с соответствующим сопротивлением.
- Используйте боросиликатное стекло одноствольного электрода с нитью (O.D. 1.0 мм, I.D. 0.58 мм). Потяните электрод на выдвижной микропайпет(Таблица материалов). Идеальные электроды, заполненные 1,5% LY в 5 мМ KCl должны иметь сопротивление 200 МЗ при попадании в ванну PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка пуля варьируется в зависимости от используемого аппарата (тип используемой машины и нити шкива). Более высокая настройка тепла обычно дает больше и тоньше советы. Для микропипов, используемых в этом эксперименте, настройки были: тепло: 317, тянуть: 90, скорость: 70, и задержка: 70. Использовалась нить типа корыта. - Храните электроды в закрытом контейнере, чтобы предотвратить попадание пыли на кончик. Держите электроды поднятые из нижней части коробки, чтобы предотвратить кончик от разрушения.
- Используйте боросиликатное стекло одноствольного электрода с нитью (O.D. 1.0 мм, I.D. 0.58 мм). Потяните электрод на выдвижной микропайпет(Таблица материалов). Идеальные электроды, заполненные 1,5% LY в 5 мМ KCl должны иметь сопротивление 200 МЗ при попадании в ванну PBS.
-
Заполните электрод раствором LY красителя.
- Поместите электрод в вертикальное положение с кончиком, обращенным вниз. Pipette 1'2 л РАСТВОРа LY в заднюю часть электрода и ждать 5-10 минут для решения, чтобы перейти к кончику через капиллярное действие.
- Аккуратно закрепите заполненный электрод в держателе электрода, подключенном к манипулятору.
ПРИМЕЧАНИЕ: Серебряный провод держателя электрода должен быть в контакте с LY внутри электрода. При необходимости отрегулируйте громкость решения LY в зависимости от длины провода.
5. Заполнение астроцитов ионтофорезом
- Проверьте электрод.
- Поместите ломтик мозга осторожно в стеклянную нижнюю тарелку, наполненную 0,1 М ПБС при комнатной температуре. Держите ломтик на месте с платиновой арфой с нейлоновыми струнами.
- Убедитесь, что электрод подключен к источнику напряжения и поместите молотый электрод в ванну, содержащую срез мозга.
- Переместите цель в область мозга, интересуемую.
- Опустите электрод в раствор. Под ярким полем, переместить его в центр поля зрения и тщательно изучить его с 40-x объектив погружения воды, чтобы убедиться, что он появляется ясно и без мусора или пузырьков. Если есть что-то засорение наконечник электрода, замените его на новый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Засорение является проблемой для 200 МЗ электрод. При центрифугации и фильтрации раствора красителя перед каждым экспериментом, это не должно быть частой проблемой. Однако, поскольку кончик электрода небольшой, ткани иногда могут застрять в открытии. Авторы не нашли способ предотвратить это, но это можно легко решить, просто используя новый электрод. - Наблюдайте за кончиком электрода под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом с помощью лазера 488 нм. Затем, тест красителя выброса, включив стимулятор на 12 V. Обратите внимание на большой флуоресцентный краситель облако вокруг кончика электрода в то время как стимулятор на. Если нет или мало красителя выбрасывается на стимуляцию напряжения, заменить электрод.
- Под ярким полем медленно опустите электрод к срезу, останавливаясь чуть выше поверхности.
- Заполните астроцит ионтофорусом.
- Определите астроциты на 40–50 мкм ниже поверхности среза с контрастом инфракрасного дифференциального интерференции (IR-DIC). Ищите клетки с удлиненные, овальной формы соматы около 10 мкм в диаметре. Как только астроцит выбран, переместите его в центр поля зрения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая ячейка для ионтофорасиса имеет четкие, определенные границы вокруг него. Не выбирайте ячейки слишком близко к поверхности среза, потому что они не могут быть полностью заполнены. Это занимает некоторую практику в течение нескольких дней, чтобы иметь возможность регулярно определить астроцитов для заполнения красителя. В зависимости от области мозга, используемой для эксперимента, количество астроцитов может варьироваться. Это может повлиять на время, необходимое для идентификации астроцитов перед заполнением. - Медленно опустите наконечник электрода в срез, перемещаясь по ткани, пока он не находится на той же плоскости, что и тело клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перемещение электрода медленно, чтобы избежать повреждения ткани. - После того, как тело клетки астроцита хорошо видно и очерчены, медленно и осторожно продвигайте электрод вперед. Перемещение электрода до кончика пронзает сомы клетки. Перемещение фокус аминь медленно вверх и вниз, чтобы отметить, если электрод находится внутри сомы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечник электрода должен находиться внутри клеточного тела, и следует наблюдать небольшой отступ на соме. Не двигайте электрод дальше, чтобы избежать кончика, проходящего через клетку. - Как только наконечник электрода находится внутри клетки, включите стимулятор при 0,5-1 В и непрерывно выбрасываем ток в клетку. Используя конфокальный микроскоп, наблюдайте, как клетка заполняет. Увеличьте цифровой зум, чтобы увидеть детали ячейки и убедитесь, что кончик электрода виден внутри клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нижняя напряжение, если кажется, что краситель просачивается из клетки или заполнения других клеток в непосредственной близости. Если окажется, что краситель все еще вытекает из клетки, вытащите электрод медленно и найдите другую клетку. Важно, чтобы краситель не протекал, чтобы иметь высокое соотношение сигнала/фона на конечном изображении. - Подождите около 15 минут, пока не определятся более тонкие ветви и процессы, выключите напряжение и аккуратно выдвините наконечник электрода из клетки.
- Определите астроциты на 40–50 мкм ниже поверхности среза с контрастом инфракрасного дифференциального интерференции (IR-DIC). Ищите клетки с удлиненные, овальной формы соматы около 10 мкм в диаметре. Как только астроцит выбран, переместите его в центр поля зрения.
- Изображение заполненной ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация может быть выполнена сразу после заполнения или после окрашивания с иммуногистохимией. Цель с более высокой численной диафрагмой (NA) приводит к лучшему разрешению.- Подождите, пока ячейка вернется в исходную форму, прежде чем изображение (15–20 мин) с 40-x целью. Чтобы изображение ячейки, настроить настройки на confocal, чтобы убедиться, что тонкие ветви и процессы появляются определены.
- Навлажь z-стек с размером шага 0,3 мкм. Во время визуализации, переместить цель, пока нет сигнала от клетки и установить, что в качестве верхней. Затем переместите цель вниз (фокусировка через ячейку) до тех пор, пока не будет сигнала, установите это как дно.
- После завершения изображения проверьте электрод на выброс красителя. Если появляется большое облако красителя, его можно использовать для следующего среза. В противном случае замените его новым электродом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Краска заполнения одного астроцита и изображения занимает около 45 мин до 1 ч. Для этого конкретного эксперимента, можно было получить около 3'6 ячеек на мышь. При необходимости несколько ячеек могут быть помечены на одном и том же срезе. Однако, чтобы отличить отдельные астроциты, не забудьте держать расстояние около 200 мкм между клетками.
6. Окрашивание иммуногистохимией (необязательно)
- Как только изображение сделано, немедленно поместите ломтик в 10% формалин на льду, чтобы сохранить для иммуногистохимии. Держите ломтики мозга в темноте и хранить на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Вымойте мозг разделы 3x в 0,1 M PBS с 0,5% неионический сурфактант (т.е., Тритон X 100) в течение 5 мин каждый. Затем инкубировать в блокирующий раствор 0,1 М PBS с 0,5% неионическим сурфактантом и 10% нормальной козьей сывороткой (NGS) на 1 ч при комнатной температуре с нежным возбуждением.
- Инкубировать секции с возбуждением первичных антител, разбавленных в 0,1 М ПБС с 0,5% неионическим сурфактантом и 5% NGS в течение 2 дней при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за толщины ломтиков мозга, инкубационный период первичных антител необходимо расширить для лучшего проникновения и концентрация антител может быть увеличена. В этом эксперименте, 1:500 разбавления был использован для антиGFAP антитела и 1:500 разбавления был использован для антитела антиквопорин-4. - Вымойте разделы 3x в 0,1 M PBS с 0,5% неионический сурфактант на 10 мин каждый, а затем инкубировать вторичными антителами, разбавленными в 0,1 М PBS с 0,5% неионический сурфактант и 10% NGS для 6 ч при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не выбирайте вторичное антитело возбужденных 488 нм, который длина волны используется для визуализации LY красителя. В этом эксперименте, 1:1,000 разбавления был использован для Alexa Fluor 546 коза анти-курица IgG (H'L) и Alexa Fluor 647 коза анти-кролик IgG (H'L). - Промыть секции 3x в 0,1 М PBS за 10 минут каждый. Затем смонтировать разделы на стеклянных слайдах микроскопа в монтажных носителях, подходящих для флуоресценции. Уплотнить слайды. Ячейки изображения размером 0,3 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Данные, представленные в этом исследовании, от 7 до 12 клеток от 4 мышей в каждом эксперименте. Средние данные регистрируются в группах цифр, где это уместно.
Для оценки морфологии астроцитов мы провели внутриклеточный ионтофорус с помощью LY красителя для заполнения астроцитов в радиате цеха попроси, который обобщен на рисунке 1. На рисунке 2 изображен репрезентативный астроцит и его сложная морфологическая структура. Ячейка была изображена после фиксации с 60x масляным объективом погружения на конфокальном лазерно-сканирующем микроскопе с помощью лазерной линии 488 нм (размер шага 0,3 мкм и 3,0-3,5 х цифрового зума). Фотомультипликатор трубки (PMT), смещения, и получить функции конфокального микроскопа были скорректированы для создания высокого сигнала / фонового соотношения в конечном изображении. На рисунке 2A, однооптические изображения плоскости из различных z-шагов (показано каждые 10 мкм, помеченные в порядке от 1'6) показывают центральную сому и несколько крупных ветвей, которые делятся на плотную сеть процессов. Создавая максимальную интенсивность проекции (размер стека 85 мкм), мы наблюдали детальное представление о структуре астроцита и его домене(рисунок 2B). Также были отмечены основные компоненты структуры астроцита. Рисунок 2 C показывает увеличенную (x4) максимальную интенсивность проекции одной крупной ветви, нескольких вторичных ветвей, а также распределение окружающих ветвей и листовок.
Морфологические анализы и реконструкции астроцитов были проведены с помощью программного обеспечения анализа Imaris(Таблица материалов) с использованием пост-фиксации изображения LY заполненных астроцитов (другое программное обеспечение, такое как ImageJ также может быть использован). После завершения реконструкции каждого астроцита были количественно определены объемы сомы, крупных ветвей, процессов и территории. Сома была создана сначала с поверхностным сглаживающим набором до предела разрешения плоскости x-y (0,25 мкм). Минимальный диаметр объекта был установлен на уровне 3,0 мкм для удаления других объектов, не связанных с телом клетки. Для создания основных ветвей, интенсивность сома была замаскирована, из-за его яркости по отношению к остальной части клетки. Поверхностное сглаживание и минимальный диаметр объекта основных ветвей были установлены до 0,3 мкм (размер шага плоскости). Для создания процессов была также замаскирована интенсивность основных ветвей. Сглаживание поверхности было установлено до 0,18 мкм, а минимальный диаметр объекта - 0,3 мкм. Территория астроцита была создана с использованием более низкого порога интенсивности и сглаживания поверхности, установленного до 0,75 мкм. На рисунке 3А показано исходное изображение астроцита CA1. Тело клетки, основные ветви, процессы и объем территории, огороженный астроцитами, реконструируются на рисунке 3B-E. После реконструкции клеток были созданы, объемы сомы, всей клетки и территории были количественно оценены и количество основных ветвей было подсчитано(таблица 1). CA1 астроцитов из радиата слоя был средний объем сомы 488,91 мкм3, в среднем 7 первичных ветвей, средний объем клеток 5,58 х 10мкм 3, и средний объем территории 2,94 х 104 мкм3.
Хорошо характерный маркер астроцитов, GFAP, является цитоскелетным белком, который маркирует промежуточные нити астроцита8. После астроцитов были заполнены красителя, мы выполнили иммуностоинга для GFAP визуализировать выражение в отдельных астроцитов(Рисунок 4). Мы обнаружили, что GFAP был выражен в клеточной соме, основных ветвей и некоторых вторичных ветвей астроцитов, но не в более тонких ветвях и процессах(рисунок 4A). Не было обнаружено существенной разницы в количестве первичных ветвей, помеченных GFAP, и филиалах, визуализированных LY (p 0.1573; Рисунок 4 B). Область клеток и объем астроцитов, обозначенных GFAP, были значительно меньше площади и объема, визуализированного с помощью LY (p zlt; 0.0001; Рисунок 4 C,D). Это свидетельствует о том, что GFAP является надежным маркером для маркировки основных ветвей, но не полезен для определения общей площади или объема ячейки.
Важной особенностью астроцитов является их endfeet, которые контактируют кровеносные сосуды и предлагается, чтобы помочь регулировать кровоток в ЦНС. Для дальнейшего понимания пространственной взаимосвязи между астроцитами и сосудами мозга, мы окрашены антителами против аквапорина-4 после заполнения красителя. Aquaporin-4 является водоканал белка, найденного на астроцитов и эпендимальных клеток, и высоко выражается в районах вблизи желудочков и кровеносных сосудов15. Мы обнаружили, что аквапорин-4 выражается на астроцитов endfeet в непосредственной близости от сосуды мозга (Рисунок 5A). На рисунке изображены три астроцитовых конца, контактирующих с кровеносным сосудом в разных местах (указанные белыми стрелками). В радиате слоя CA1 среднее количество конечных ног на астроцит составило 2 евро(рисунок 5B). Интересно, что ветви, содержащие endfeet были значительно толще, чем другие первичные ветви астроцитов, используя основные реконструкции ветви (р 0,0038; Рисунок 5 C). Мы также измерили длину ветвей, содержащих эндфут ы от центра сомы к кровеносным сосудам и сравнили это с кратчайшим, прямым путем к кровеносным сосудам. Фактическая длина ветвей к кровеносным сосудам была значительно больше, чем кратчайший путь (р 0,0333; Рисунок 5 D), что свидетельствует о том, что эти ветви, как правило, принимают более длительный, обходной путь к кровеносным сосудам. Фильм 1 изображает фильм о реконструкции LY заполненные астроцитов и аквапорина-4 окрашивания. Различные структурные компоненты астроцита (сома, основные ветви, процессы и территория) представлены в трех измерениях. LY заполненные астроцитов вместе с аквапорином-4 пятно изображают астроцитов endfeet окружающих кровеносный сосуд. От реконструкции основных ветвей и кровеносных сосудов, ветви, которые содержат endfeet могут быть визуализированы простираясь от сомы к сосуду.
В предыдущих разделах, где, как сообщается, значения p, мы использовали тест t неспаренного студента, со значением на p qlt; 0.05.
Рисунок 1: Диаграмма рабочего процесса в ионтофореза LY. Схематическое представление протокола, подчеркивающего критические шаги. После того, как мышь была пропитана фиксатором, мозг был рассечен. После короткого периода после фиксации корональные секции были вырезаны с помощью вибратом. Электрод был заполнен обратно с 1,5% LY красителя. Астроциты были идентифицированы в радиате слоя CA1 с помощью ИК-DIC на легком микроскопе. Сома клетки была пронзана электродом, и краситель вводился в клетку, применяя 0,5-1 В до тех пор, пока более тонкие процессы не были полностью заполнены. Кусочек был изображен с конфокальной микроскопией с помощью 40-x объектива погружения воды, а затем обработан для иммуногистохимии. Дальнейшее изображение было завершено с 60x масляным объективом погружения для выполнения реконструкции клеток и морфологического анализа. Показан пример реконструкции процессов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: LY-заполненный астроцит радиата слоя CA1. (A) Однооптические изображения плоскости из астроцита, показанные каждые 10 мкм (помечены 1'6). (B) Максимальная проекция астроцита, изображающий клеточной сомы, несколько крупных ветвей, и многочисленные процессы, которые составляют его густую территорию. (C) Максимальная проекция (зум x4) одной крупной ветви (из раздела, очерченного желтым цветом), двух вторичных ветвей, нескольких ветвей и организации окружающих процессов. Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Реконструкция заполненного LY астроцита и его компонентов. (A) Астроцит CA1 заполнен LY. (B-E) Трехмерная реконструкция сомы(B),сома и основных ветвей (C), процессы (D, и территории (E) на 0 "и 45" ориентации. Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: GFAP иммуно-сточки в LY заполненные астроциты. (A) Представитель z-проекции LY (зеленый) и GFAP (magenta) окрашивание. GFAP выражается в основном в первичных и некоторых вторичных ветвях астроцитов, но не был найден на всей территории астроцитов. Шкала бар No 10 мкм. (B) График числа первичных ветвей помечены LY и GFAP. (C)Область клетки, обозначаемые LY и GFAP окрашивая. (D) Объем ячейки, обозначаемый LY и GFAP окрашивания. Открытые круги представляют необработанные данные с закрытыми квадратами, указывающими на среднее значение SEM. Данные были собраны из 12 ячеек от 4 мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Aquaporin-4 иммуно-пятно в LY заполненных астроцитов. (A) Представитель z-проекции LY (зеленый) и аквапорин-4 окрашивания (magenta). Aquaporin-4 выражается в основном в конце ноги астроцитов. Белые стрелки обозначают три конца, когда они контактируют с соседним кровеносным сосудом. Шкала бар No 10 мкм. (B) Количество ветвей с endfeet на астроцитов. (C) Толщина ветвей с endfeet по сравнению с другими первичными ветвями астроцитов. (D) Длина ветвей с endfeet по сравнению с кратчайшим путь к кровеносным сосудам. Открытые круги представляют необработанные данные с закрытыми квадратами, указывающими на среднее значение SEM. Данные были собраны из 7 ячеек от 4 мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Фильм 1: Реконструкция LY-заполненные астроцитов и аквапорина-4 окрашивания. Представитель фильма CA1 астроцитов в непосредственной близости от кровеносных сосудов. Сома, основные ветви, процессы и территория были реконструированы для анализа морфологии клетки. Реконструкция основных ветвей вместе с аквапорином-4 изображает два астроцитовых конца, непосредственно контактирующих с кровеносным сосудом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
| Морфологические характеристики | Среднее - SEM |
| Объем сомы (мкм3) | 489 х 30 |
| Количество первичных ветвей | 7,0 и 0,5 |
| Объем ячейки (мкм3) | 5580 и 425 |
| Объем территории (мкм3) | 29391 й 8150 |
| Количество ячеек | 14 |
Таблица 1: Морфологический анализ структуры астроцитов. Показаны объем астроцитовой сомы, количество первичных ветвей на астроцитов, объем астроцитных клеток и объем, огороженный территорией астроцитов. Данные были собраны из 14 клеток 7 мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, изложенный в настоящей статье, описывает способ визуализации морфологии астроцитов с помощью внутриклеточного ионтофореза ЛАЙ-красителя в слегка фиксированных ломтиках мозга. Есть несколько критических факторов, отмеченных в этом протоколе, которые способствуют успешной ионтофорез И морфологической реконструкции клеток. Одним из факторов является качество и воспроизводимость изображений, которая во многом определяется возрастом мыши и результатом перфузии. В этом исследовании мы использовали мышей C57/BL6N от 6 до 8 недель. Успешная перфузия (сильно зависящая от правильного размещения перфузной иглы и отмеченная белым мозгом и отсутствием крови в сосудистой клетке мозга) необходима для самых подробных и четко заполненных клеток. После прокола электродом, клеточная мембрана должна поддерживать плотную печать вокруг кончика электрода и предотвратить утечку красителя. Несмотря на все усилия, иногда другие структуры за пределами клетки будут заполнены, как пипетка продвинулась через ткани мозга: мы исключили эти клетки из анализа. Сопротивление электродов является дополнительным ключевым фактором. Высокая устойчивость только позволяет устойчивый выброс красителя из электрода наконечник анатизм на стимуляции напряжения. Более технически, важно поддерживать нежные, медленные движения при пронзании сомы клетки с электродом. Проникновение электрода через клетку может привести к утечке красителя из сомы. Успешное impalement последовано за применением напряжения должно привести к в почти немедленно заполнять красителя тела клетки и процессов (т.е., в пределах немного секунд). Время, необходимое для полного заполнения астроцита, связано с территорией, охватывающей его территорию; однако, подождите, чтобы обеспечить более тонкие процессы полностью заполнены (по крайней мере 15 минут).
Мы обнаружили, что этот протокол является наиболее верным способом изучения морфологии астроцитов в деталях, тем не менее, метод имеет свои ограничения. Определение ячейки может занять много времени и подвержено ошибкам. В соответствии с ИК-DIC, следует определить отличительные особенности, которые отмечают конкретный тип клетки (форма и размер сомы). Кроме того, выражение красных флуоресцентных репортеров конкретно в астроцитах, вирусной инъекцией или трансгенной линией репортера мыши, позволяет легче идентифицировать эти клетки перед заполнением. Кроме того, LY ограничен как цитосолико, потому что он не может быть использован для обозначения мембраны астроцитов, по сравнению с маркировкой с мембранной привязанной GFP, таких как Lck-GFP16. Lck-GFP даст более точное представление всей территории, как LY ионтофорез показывает внутренний объем астроцитов. Однако, в зависимости от экспериментального дизайна, LY ионтофорез лучше подходит для решения всего внутреннего объема астроцитов, разработки трехмерных реконструкций и количественной оценки анатомических компонентов, составляющих структуру астроцита6 . Наконец, как и во всех формах конфокальной микроскопии, пространственное разрешение ограничено дифракцией, отмеченной как точечная функция распространения микроскопа оптики17. Изменение компонентов системы визуализации, таких как уменьшение диаметра пинхола, поможет улучшить изображения, но истинное разрешение определяется длиной волны света и численной диафрагмой объективного объектива. В нашем случае, по нашим оценкам, наилучшее разрешение возможно, вероятно, около 300 нм, что, вероятно, будет хуже в z-оси.
Ионтофорез LY предлагает ряд преимуществ по сравнению с другими широко используемыми методами для обозначения астроцитов. Протокол может быть применен в любой установленной модели мыши, популяции клеток, или области мозга18,19,20, поскольку он не ограничивается астроцитов конкретных промоутер или трансгенной линии мыши. Генетические подходы к экспрессу флуоресцентных белков повсеместно в астроцитах вирусными инъекциями или трансгенными линиями репортера мыши (т.е. td-Tomato) требуют использования астроцита, который в некоторых регионах может быть выражен в других типах клеток или нет включают в себя все астроциты21. Ионтофорез LY также является эффективным по времени, так как вирусные инъекции флуоресцентных белков требуют хирургического вмешательства и времени, чтобы выразить специфический вирус, а трансгенные линии мыши требуют размножения. Наконец, LY ионтофорез является полезным методом для различения отдельных клеток, в то время как другие стратегии также должны быть объединены с методом для разреженной маркировки, чтобы визуализировать территории отдельных астроцитов22,23, 24. Однако ни один метод не является панацеей, и выбор которого используется, должен быть адаптирован к конкретному рассматриваемому вопросу.
Будущие исследования могут использовать конкретные экспериментальные манипуляции и изучить различные компоненты структуры астроцитов (сома, ветви, процессы, территория и т.д.) для ответа на морфологические вопросы. Это может обеспечить понимание и направление в морфологии астроцитов и ее функциональные последствия, которые могут быть проанализированы далее с помощью супер разрешения световой микроскопии или электронной микроскопии4. Например, ионтофорез LY предоставляет средства для визуализации тонких процессов астроцитов, которые контактируют с тысячами синапсов и участвуют в синапических функциях. Изучение того, как структура этих процессов изменяется в различных патологических условиях, может помочь выяснить роль астроцитов в здоровье и заболеваниях. LY ионтофорез является важным методом для визуализации подробной морфологии клеток и характеризуют свойства астроцитов, чтобы лучше понять их функции в центральной нервной системе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят г-жу Сото, д-ра Yu и д-ра Октко за рекомендации, а также за комментарии к тексту. Эта работа поддерживается NS060677.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
References
- Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
- Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
- Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
- Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
- Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
- Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
- Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
- Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
- Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
- Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
- Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
- Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
- Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
- Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
- Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
- Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).
