Summary
Los astrocitos son células morfológicamente complejas, ejemplificadas por sus múltiples procesos y territorios tupidos. Para analizar su elaborada morfología, presentamos un protocolo fiable para realizar la iontoforesis amarilla de Lucifer intracelular en tejido ligeramente fijo.
Abstract
Los astrocitos son componentes esenciales de los circuitos neuronales. Azulejon todo el sistema nervioso central (SNC) y están involucrados en una variedad de funciones, que incluyen aclaramiento de neurotransmisores, regulación iónica, modulación sináptica, apoyo metabólico a las neuronas, y regulación del flujo sanguíneo. Los astrocitos son células complejas que tienen un soma, varias ramas principales y numerosos procesos finos que contactan diversos elementos celulares dentro del neuropil. Para evaluar la morfología de los astrocitos, es necesario disponer de un método fiable y reproducible para visualizar su estructura. Reportamos un protocolo confiable para realizar la iontoforesis intracelular de astrocitos usando el tinte fluorescente amarillo Lucifer (LY) en tejido cerebral ligeramente fijo de ratones adultos. Este método tiene varias características que son útiles para caracterizar la morfología de los astrocitos. Permite la reconstrucción tridimensional de astrocitos individuales, lo que es útil para realizar análisis morfológicos sobre diferentes aspectos de su estructura. La inmunohistoquímica junto con la iontoforesis LY también se puede utilizar para entender la interacción de los astrocitos con diferentes componentes del sistema nervioso y para evaluar la expresión de proteínas dentro de los astrocitos etiquetados. Este protocolo se puede implementar en una variedad de modelos de ratón de trastornos del SNC para examinar rigurosamente la morfología de los astrocitos con microscopía ligera. La iontoforesis LY proporciona un enfoque experimental para evaluar la estructura de los astrocitos, especialmente en el contexto de lesiones o enfermedades en las que se propone que estas células se sometan a cambios morfológicos significativos.
Introduction
Los astrocitos son las células gliales más abundantes en el sistema nervioso central (SNC). Juegan papeles en la homeostasis iónial, regulación del flujo sanguíneo, formación de sinapsis, así como la eliminación, y la aceptación de neurotransmisores1. La amplia gama de funciones astrocitos se refleja en su compleja estructura morfológica2,3. Los astrocitos contienen varias ramas primarias y secundarias que se dividen en miles de ramitas y foliolos más finos que interactúan directamente con sinapsis, dendritas, axones, vasos sanguíneos y otras células gliales. La morfología de los astrocitos varía según las diferentes regiones cerebrales, lo que puede insinuar su capacidad para realizar sus funciones diferencialmente en los circuitos neuronales4. Además, se sabe que los astrocitos alteran su morfología durante el desarrollo, durante las condiciones fisiológicas, y en múltiples estados de enfermedad3,5,6.
Se necesita un método consistente y reproducible para resolver con precisión la complejidad de la morfología de los astrocitos. Tradicionalmente, la inmunohistoquímica se ha utilizado para visualizar astrocitos con el uso de marcadores de proteínas específicas de astrocitos o enriquecidos con astrocitos. Sin embargo, estos métodos revelan el patrón de expresión de proteínas en lugar de la estructura del astrocito. Los marcadores de uso común, como la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y la proteína de unión al calcio S100 (S100), no se expresan en todo el volumen celular y, por lo tanto, no resuelven la morfología completa7. Los enfoques genéticos para expresar las proteínas fluorescentes de forma omnipresente en los astrocitos (inyecciones virales o líneas de reporteros de ratones transgénicos) pueden identificar las ramas más finas y el territorio en general. Sin embargo, es difícil diferenciar los astrocitos individuales, y los análisis pueden ser sesgados por la población de astrocitos a los que apunta el promotor específico8. La microscopía electrónica de sección serial se ha utilizado para revelar una imagen detallada de las interacciones de los procesos de astrocitos con sinapsis. Debido a los miles de procesos de astrocitos que contactan con sinapsis, actualmente no es posible reconstruir una célula entera con esta técnica9,aunque se espera que esto cambie con el uso de enfoques de aprendizaje automático para el análisis de datos.
En este informe, nos centramos en un procedimiento para caracterizar los astrocitos de ratón utilizando la iontoforesis intracelular con el tinte amarillo Lucifer (LY), utilizando como ejemplo el radiatum de estrato CA1. El método se basa en trabajos pasados pioneros de Eric Bushong y Mark Ellisman10,11. Los astrocitos de las rebanadas cerebrales ligeramente fijas se identifican por su forma distintiva de soma y se llenan de LY. A continuación, las células se imagee con microscopía confocal. Demostramos cómo la iontoforesis LY se puede utilizar para reconstruir astrocitos individuales y realizar análisis morfológicos detallados de sus procesos y territorio. Además, este método se puede aplicar junto con la inmunohistoquímica para identificar las relaciones espaciales y las interacciones entre astrocitos y neuronas, otras células gliales y vasculatura cerebral. Consideramos QUE LA iontoforesis LY es una herramienta muy adecuada para analizar la morfología en diferentes regiones cerebrales y modelos de ratón de condiciones saludables o de enfermedad7,12,13.
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Protocol
Los experimentos con animales en este estudio se realizaron de acuerdo con la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal del Canciller en la Universidad de California, Los Angeles. En todos los experimentos se utilizaron ratones adultos (6 a 8 semanas de edad) de género mixto.
1. Preparación de la solución
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Solución de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF)
- Preparar una solución ACSF fresca (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 14,7 mM NaHCO3, 11 mM D-glucosa, 1,25 mM Na2HPO4y 2 mM De CaCl2) antes de cada experimento. Agregue MgCl2 y CaCl2 en el paso final. Disolver los componentes en agua desionizada de alta calidad.
- Incubar la solución ACSF a 35oC en un baño de agua y burbuja con 95% O2/ 5% CO2 durante al menos 30 min antes del experimento.
- Añadir 2% de clorhidrato de lidocaína para alcanzar una concentración final de 0,02% en ACSF (en 100 ml).
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Solución fija
- Utilice 10% de fosfato tamponado de formalina.
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Solución de tinte LY
- Prepare 1.5% LY solución de tinte disolviendo la sal de dilitio LY CH o LA sal de dipotásium LY CH en 5 mM KCl. Vortex a fondo. Un volumen de 1 ml es suficiente para varios experimentos.
- Centrífuga durante 10 min a 16.800 x g. A continuación, filtre el sobrenadante con un filtro de jeringa de 0,2 m en un tubo nuevo. Las aliquots se pueden mantener a 4oC durante un máximo de 3 meses.
NOTA: Es fundamental centrifugar y filtrar la solución de tinte para evitar la agregación de las partículas de tinte, que pueden obstruir el electrodo.
2. Perfusión transcardial del ratón y disección cerebral
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Preparación de equipos y ratón para perfusión transcardial
NOTA: Se pueden utilizar ratones C57/BL6 de ambos sexos. Se ha observado empíricamente que para que el método funcione de forma fiable, es importante que los ratones no sean mayores de 3 meses (6-8 semanas de edad es ideal). El protocolo de perfusión se describe a continuación. Se proporciona una referencia adicional para más detalles14.- Tubo de perfusión transparente con solución ACSF para eliminar cualquier burbuja de aire en la línea. Configurar herramientas de cirugía en orden de uso (pinzas, tijeras curvas, contundentes, tijeras de iris).
- Profundamente anestesiar el ratón poniéndolo en una cámara de inducción de isoflurano, después de añadir 2 x 3 ml de isoflurano a la cámara. Permita que el anestésico surta efecto de 1 a 2 minutos. Asegúrese de que la respiración no se detenga.
- Prueba de reflejo de pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo Proceda cuando el ratón no responde al estímulo del dolor y el reflejo está ausente. Asegure al animal en posición supina con la cabeza colocada en el cono respiratorio con un suministro de 5% de isoflurano en oxígeno y las extremidades y la cola pegadas dentro de una campana de humos químicos.
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Perfusión transcardial
- Con pinzas, levante la piel debajo de la caja torácica. Haga una incisión de 5 x 6 cm con las tijeras curvas y contundentes a través de la piel para exponer la cavidad abdominal. Corte hacia arriba a través de la pared abdominal hasta que el hígado y el diafragma sean visibles.
- Mueva suavemente el hígado lejos del diagrama. Con tijeras de iris, haga una incisión lateral de 3 x 4 cm en el diafragma.
- Cortar a través de la caja torácica a lo largo de ambos lados del cuerpo para exponer la cavidad torácica. Tenga cuidado de no dañar el corazón y evitar los pulmones. Levante el esternón para exponer el corazón.
- Una vez que el corazón esté visible, inyectar 0,05 ml de solución de heparina sódica (1.000 USP por ml) en el ventrículo izquierdo como anticoagulante. A continuación, inserte la aguja de perfusión cuidadosamente en el ventrículo izquierdo. Asegúrese de que la aguja permanezca en el ventrículo y no atraviese otras cavidades cardíacas. Haga una pequeña incisión en la aurícula derecha con tijeras de iris.
- Perfunde con solución ACSF a una velocidad de aproximadamente 10 ml/min hasta que el líquido existente el cuerpo se despeje de la sangre (1 x 2 min).
- Cambie de la solución ACSF a la solución fijativa sin introducir burbujas de aire. Perpeto con solución fijativa durante 10 min a 10 x 20 ml/min.
PRECAUCION: Tenga cuidado de que ninguna solución fijada esté drenando de la nariz. Esto indica que la aguja alcanzó el ventrículo derecho y el fijador está viajando a los pulmones en lugar de a través del circuito sistémico hasta el resto del cuerpo.
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Disección del cerebro
- Retire la cabeza del ratón con tijeras y diseccione cuidadosamente el cerebro del ratón del cráneo. Colocar en solución fijativa durante 1,5 h a temperatura ambiente durante un corto período de post-fijación.
NOTA: Una buena perfusión es necesaria para el éxito de la iontoforesis LY. El cerebro debe ser de color blanco y ausente de sangre en la vasculatura cerebral. El cuerpo y las extremidades deben aparecer rígidos.
- Retire la cabeza del ratón con tijeras y diseccione cuidadosamente el cerebro del ratón del cráneo. Colocar en solución fijativa durante 1,5 h a temperatura ambiente durante un corto período de post-fijación.
3. Preparación de rebanadas
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Preparación de rodajas de hipocampo
- Lavar el cerebro con 0,1 M de fosfato satina tamponada (PBS) a temperatura ambiente durante 5 min. Luego, seque el cerebro con papel de filtro y retire la bombilla olfativa y el cerebelo con una cuchilla de afeitar afilada.
- Monte el cerebro en la bandeja de vibratome con pegamento de cianoacrilato y llene la bandeja con PBS a temperatura ambiente. Corte las secciones coronales del hipocampo de 110 m de espesor.
NOTA: Ajuste el ajuste del vibratome para asegurarse de que las rodajas tengan el mismo grosor e incluso superficie. Para este experimento, se utilizó un ajuste de velocidad de 4,5 y un ajuste de frecuencia de 8, que son ajustes arbitrarios en el instrumento(Tabla de materiales). Es posible que los usuarios necesiten experimentar con la configuración de otros dispositivos. - Recoger las secciones de la bandeja y colocar en un plato de PBS en el hielo.
4. Preparación de electrodos
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Prepare un electrodo afilado con la resistencia adecuada.
- Utilice un electrodo de tubo de vidrio borosilicato con filamento (D.O. 1,0 mm, I.D. 0,58 mm). Tire de un electrodo en un tirador de micropipeta(Tabla de materiales). Los electrodos ideales llenos de 1,5% LY en 5 mM KCl deben tener una resistencia de 200 M cuando se colocan en un baño de PBS.
NOTA: El ajuste del tirador varía según el aparato (tipo de máquina utilizada y filamento del tirador). Un ajuste de calor más alto generalmente da puntas más largas y finas. Para el tirador de micropipetas utilizado en este experimento, los ajustes fueron: calor: 317, tirón: 90, velocidad: 70, y retardo: 70. Se utilizó un filamento tipo vaguada. - Almacene los electrodos en un recipiente cerrado para evitar que el polvo entre en la punta. Mantenga los electrodos elevados desde la parte inferior de la caja para evitar que la punta se rompa.
- Utilice un electrodo de tubo de vidrio borosilicato con filamento (D.O. 1,0 mm, I.D. 0,58 mm). Tire de un electrodo en un tirador de micropipeta(Tabla de materiales). Los electrodos ideales llenos de 1,5% LY en 5 mM KCl deben tener una resistencia de 200 M cuando se colocan en un baño de PBS.
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Llene el electrodo con solución de tinte LY.
- Coloque un electrodo en posición vertical con la punta hacia abajo. Pipetear 1 x 2 l de solución LY en la parte posterior del electrodo y esperar 5 x 10 minutos para que la solución se mueva a la punta a través de la acción capilar.
- Fije suavemente el electrodo lleno en el soporte del electrodo conectado a un manipulador.
NOTA: El cable de plata del soporte del electrodo debe estar en contacto con el LY dentro del electrodo. Ajuste el volumen de la solución LY si es necesario, dependiendo de la longitud del cable.
5. Llenar Astrocitos con Iontoforesis
- Pruebe el electrodo.
- Coloque una rebanada cerebral suavemente en un plato inferior de vidrio lleno de 0.1 M PBS a temperatura ambiente. Sostenga la rebanada en su lugar con un arpa de platino con cuerdas de nylon.
- Asegúrese de que el electrodo está conectado a una fuente de voltaje y coloque el electrodo de tierra en el baño que contiene la rebanada cerebral.
- Mueva el objetivo a la región cerebral de interés.
- Baje el electrodo en la solución. Debajo del campo brillante, muévalo al centro del campo de visión y examínelo cuidadosamente con la lente de inmersión en agua 40x para asegurarse de que parezca claro y sin residuos ni burbujas. Si hay algo que obstruya la punta del electrodo, reemplácela por una nueva.
NOTA: La obstrucción es una preocupación para el electrodo de 200 M. Con la centrifugación y filtración de la solución de tinte antes de cada experimento, esto no debería ser un problema frecuente. Sin embargo, debido a que la punta del electrodo es pequeña, el tejido a veces puede quedar atascado en la abertura. Los autores no han encontrado una manera de prevenir esto, pero se puede tratar fácilmente simplemente usando un nuevo electrodo. - Observe la punta del electrodo bajo el microscopio de exploración láser confocal con el láser de 488 nm. A continuación, pruebe la eyección del tinte encendiendo el estimulador a 12 V. Tenga en cuenta una gran nube de tinte fluorescente alrededor de la punta del electrodo mientras el estimulador está encendido. Si no se expulsa ningún tinte o poco al estimulación de voltaje, reemplace el electrodo.
- Debajo del campo brillante, baje lentamente el electrodo hacia la rebanada deteniéndose justo por encima de la superficie.
- Llena la astrocitosis con iontoforesis.
- Identifique los astrocitos 40 a 50 m por debajo de la superficie de la rebanada con el contraste de interferencia diferencial infrarroja (IR-DIC). Busque células con somatas alargados en forma ovalada de unos 10 m de diámetro. Una vez elegido un astrocito, muévalo al centro del campo de visión.
NOTA: Una buena célula para la iontoforesis tiene bordes claros y definidos a su alrededor. No elija celdas demasiado cerca de la superficie del sector porque no se pueden rellenar completamente. Se necesita un poco de práctica durante unos días para poder identificar rutinariamente astrocitos para el llenado de tintes. Dependiendo del área cerebral utilizada para el experimento, el número de astrocitos puede variar. Esto puede afectar el tiempo necesario para identificar un astrocito antes de llenarlo. - Baje lentamente la punta del electrodo en la rebanada, navegando a través del tejido, hasta que esté en el mismo plano que el cuerpo celular.
NOTA: Mueva el electrodo lentamente para evitar dañar el tejido. - Una vez que el cuerpo celular del astrocito es claramente visible y esbozado, avance lentamente y suavemente el electrodo hacia adelante. Mueva el electrodo hasta que la punta empale el soma de la célula. Mueva el foco del objetivo lentamente hacia arriba y hacia abajo para observar si el electrodo está dentro del soma.
NOTA: La punta del electrodo debe estar dentro del cuerpo celular, y se debe observar una pequeña sangría en el soma. No mueva el electrodo más para evitar que la punta pase por la célula. - Una vez que la punta del electrodo esté dentro de la célula, encienda el estimulador a 0,5 x 1 V y expulse continuamente la corriente a la célula. Con el microscopio confocal, observe el llenado de la célula. Aumente el zoom digital para ver los detalles de la celda y asegúrese de que la punta del electrodo sea visible dentro de la celda.
NOTA: Reduzca el voltaje si parece que el tinte se está filtrando fuera de la célula o llenando otras células en las cercanías. Si parece que el tinte todavía se está filtrando fuera de la célula, extraiga el electrodo lentamente y encuentre otra célula. Es importante que el tinte no se filtre para tener una alta relación señal/fondo en la imagen final. - Espere unos 15 minutos hasta que las ramas y los procesos más finos aparezcan definidos, apague el voltaje y retire suavemente la punta del electrodo de la célula.
- Identifique los astrocitos 40 a 50 m por debajo de la superficie de la rebanada con el contraste de interferencia diferencial infrarroja (IR-DIC). Busque células con somatas alargados en forma ovalada de unos 10 m de diámetro. Una vez elegido un astrocito, muévalo al centro del campo de visión.
- Imagen de la celda llena.
NOTA: Las imágenes se pueden realizar inmediatamente después del llenado o después de la tinción con inmunohistoquímica. Un objetivo con una apertura numérica más alta (NA) da como resultado una mejor resolución.- Espere hasta que la celda vuelva a la forma original antes de la toma de imágenes (15-20 min) con un objetivo de 40x. Para crear una imagen de la celda, ajuste la configuración en la confocala para asegurarse de que las ramas y los procesos más finos aparecen definidos.
- Configure una pila z con un tamaño de paso de 0,3 m. Durante la toma de imágenes, mueva el objetivo hasta que no haya señal de la célula y establezca eso como la parte superior. A continuación, mueva el objetivo hacia abajo (centrándose a través de la celda) hasta que no haya señal, establezca eso como la parte inferior.
- Una vez completada la toma de imágenes, compruebe si el electrodo está en busca de eyección del tinte. Si aparece una nube de tinte grande, se puede utilizar para la siguiente rebanada. De lo contrario, sustitúyalo por un electrodo nuevo.
NOTA: El llenado de un solo astrocito y la toma de imágenes tarda unos 45 minutos a 1 h. Para este experimento específico, fue posible obtener alrededor de 3 x 6 celdas por ratón. Si es necesario, se pueden etiquetar varias celdas en el mismo sector. Sin embargo, para distinguir los astrocitos individuales, asegúrese de mantener una distancia de aproximadamente 200 m entre las células.
6. Tinción con Inmunohistoquímica (Opcional)
- Una vez realizada la toma de imágenes, coloque inmediatamente la rebanada en un 10% de formalina sobre hielo para conservarla para inmunohistoquímica. Mantenga las rebanadas cerebrales en la oscuridad y guárdelas durante la noche a 4 oC.
- Lave las secciones cerebrales 3x en 0.1 M PBS con 0.5% tensioactivo no iónico (es decir, Tritón X 100) durante 5 min cada uno. A continuación, incubar en una solución de bloqueo de 0,1 M PBS con un tensioactivo no iónico al 0,5% y un 10% de suero normal de cabra (NGS) durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave.
- Incubar las secciones con agitación en anticuerpos primarios diluidos en 0,1 M PBS con un tensioactivo no iónico al 0,5% y un 5% de NGS durante 2 días a 4oC.
NOTA: Debido al grosor de las rodajas cerebrales, el período de incubación de los anticuerpos primarios debe extenderse para una mejor penetración y la concentración de anticuerpos puede aumentar. En este experimento, se utilizó una dilución 1:500 para anticuerpos anti GFAP y se utilizó una dilución 1:500 para anticuerpos antiaquaporina-4. - Lavar las secciones 3x en 0.1 M PBS con 0.5% tensioactivo no iónico durante 10 min cada una y luego incubar con anticuerpos secundarios diluidos en 0.1 M PBS con 0.5% tensioactivo no iónico y 10% NGS para 6 h a temperatura ambiente.
NOTA: No elija un anticuerpo secundario excitado por 488 nm, que es la longitud de onda utilizada para visualizar el tinte LY. En este experimento, se utilizó una dilución de 1:1,000 para Alexa Fluor 546 cabra anti-pollo IgG (H+L) y Alexa Fluor 647 cabra anticonejo IgG (H+L). - Enjuague las secciones 3x en 0.1 M PBS durante 10 min cada una. A continuación, monte las secciones en portaobjetos de microscopio de vidrio en soportes de montaje adecuados para la fluorescencia. Selle las diapositivas. Celdas de imagen con un tamaño de paso de 0,3 m.
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Representative Results
Los datos reportados en este estudio provienen de 7 a 12 células de 4 ratones en cada experimento. Los datos medios se indican en los paneles de figuras cuando proceda.
Para evaluar la morfología de los astrocitos, realizamos iontoforesis intracelular utilizando el tinte LY para rellenar los astrocitos en el estrato radiatón CA1, que se resume en la Figura 1. La Figura 2 representa un astrocito representativo y su elaborada estructura morfológica. La célula fue vista después de la fijación con la lente de inmersión en aceite 60x en un microscopio de escaneo láser confocal utilizando la línea láser de 488 nm (tamaño de paso de 0,3 m y zoom digital de 3,0 x 3,5 x). Las funciones de tubo fotomultiplicador (PMT), desplazamiento y ganancia del microscopio confocal se ajustaron para crear una alta relación señal/fondo en la imagen final. En la Figura 2A,las imágenes de un solo plano óptico de diferentes pasos z (que se muestran cada 10 m, etiquetados en orden de 1 a 6) revelan el soma central y varias ramas principales que se dividen en una densa red de procesos. Mediante la generación de una proyección de intensidad máxima (tamaño de pila de 85 m) observamos una vista detallada de la estructura del astrocito y su dominio(Figura 2B). También se han observado los principales componentes de la estructura del astrocito. Figura 2 C muestra una proyección de intensidad máxima de una rama principal , varias ramas secundarias y la distribución de las ramillas y foliolos circundantes.
Los análisis morfológicos y las reconstrucciones de astrocitos se realizaron con el software de análisis Imaris(Tabla de Materiales)utilizando las imágenes posteriores a la fijación de astrocitos rellenos de LY (también se podría utilizar otro software como ImageJ). Después de la reconstrucción de cada astrocito, se cuantificaron los volúmenes del soma, las principales ramas, procesos y territorio. El soma se creó primero con un suavizado de superficie ajustado al límite de resolución del plano x-y (0,25 m). El diámetro mínimo del objeto se estableció en 3,0 m para eliminar otros objetos no asociados con el cuerpo de la célula. Para crear las ramas principales, la intensidad del soma se enmascaró, debido a su brillo en relación con el resto de la célula. El suavizado de la superficie y el diámetro mínimo del objeto de las ramas principales se ha ajustado a 0,3 m (tamaño del paso del plano z). Para crear los procesos, también se enmascaró la intensidad de las principales ramas. El suavizado de la superficie se ha establecido en 0,18 m y el diámetro mínimo del objeto se estableció en 0,3 m. El territorio del astrocito fue creado usando un umbral de menor intensidad y suavizado de superficie establecido en 0.75 m. La Figura 3A muestra la imagen original de un astrocito CA1. El cuerpo celular, las ramas principales, los procesos y el volumen del territorio encerrado por el astrocito se reconstruyen en la Figura 3B-E. Después de que se crearon las reconstrucciones de las células, se cuantificaron los volúmenes del soma, la célula entera y el territorio y se contó el número de ramas principales (Tabla 1). Los astrocitos CA1 del estrato radiatum tenían un volumen medio de soma de 488,91 ám3,un promedio de 7 ramas primarias, un volumen celular medio de 5,58 x 103 m3y un volumen medio del territorio de 2,94 x 104 ám3.
El marcador de astrocito sazonado, GFAP, es una proteína citoesquelética que etiqueta los filamentos intermedios de un astrocito8. Después de que se llenaron los astrocitos, realizamos inmunostaining para GFAP para visualizar la expresión en astrocitos individuales(Figura 4). Encontramos que gfAP se expresaba en el soma celular, ramas principales y algunas ramas secundarias de astrocitos, pero no en las ramas y procesos más finos(Figura 4A). No se encontró ninguna diferencia significativa en el número de ramas primarias etiquetadas por GFAP y en las visualizadas por LY (p a 0,1573; Figura 4 B). El área celular y el volumen del astrocito etiquetado por GFAP fueron significativamente más pequeños que el área y el volumen visualizados con LY (p < 0.0001; Figura 4 C,D). Esto demuestra que GFAP es un marcador confiable para etiquetar ramas principales, pero no es útil para determinar el área o el volumen general de la celda.
Una característica importante de los astrocitos son sus pies finales, que se ajustan a los vasos sanguíneos y se proponen para ayudar a regular el flujo sanguíneo en el SNC. Para entender mejor la relación espacial entre los astrocitos y la vasculatura cerebral, nos tiñmos con anticuerpos contra la aquaporina-4 después del relleno del tinte. La aquaporina-4 es una proteína de canal de agua que se encuentra en astrocitos y células ependimales, y está muy expresada en áreas cercanas a ventrículos y vasos sanguíneos15. Encontramos que la aguaporina-4 se expresa en los pies de los pies de la astrocitos en las proximidades de la vasculatura cerebral(Figura 5A). La imagen representa tres pies de punta astrocitos en contacto con un vaso sanguíneo en diferentes lugares (indicado por las flechas blancas). En el estrato radiatum CA1, el número medio de pies finales por astrocito fue de 2 euros(Figura 5B). Curiosamente, las ramas que contienen los pies de los extremos eran significativamente más gruesas que las otras ramas primarias del astrocito, utilizando las reconstrucciones de las ramas principales (pág. 0,0038; Figura 5 C). También medimos la longitud de las ramas que contienen pies finales desde el centro del soma hasta el vaso sanguíneo y lo comparamos con el camino más corto y directo al vaso sanguíneo. La longitud real de las ramas hasta el vaso sanguíneo fue significativamente mayor que la trayectoria más corta (p a 0,0333; Figura 5 D), lo que sugiere que estas ramas tienden a tomar una ruta más larga y tortuosa al vaso sanguíneo. La película 1 muestra una película de una reconstrucción de un astrocito lleno de LY y una tinción de aquaporina-4. Los diferentes componentes estructurales del astrocito (soma, ramas principales, procesos y territorio) están representados en tres dimensiones. El astrocito lleno de LY junto con la tinción de aquaporina-4 representan los pies de los extremos de los astrocitos que rodean el vaso sanguíneo. A partir de la reconstrucción de las ramas principales y el vaso sanguíneo, las ramas que contienen pies de fondo se pueden visualizar extendiéndose desde el soma hasta el vaso.
En las secciones anteriores, donde se notifican los valores p, usamos una prueba t de Student no emparejada, con significación en p < 0.05.
Figura 1: Diagrama del flujo de trabajo en liontoforesis LY. Representación esquemática del protocolo que resalta los pasos críticos. Después de que el ratón fue perfundido con fijador, el cerebro fue diseccionado. Después de un corto período posterior a la fijación, las secciones coronales se cortaron con un vibratome. El electrodo se llenó con un 1,5% de tinte LY. Los astrocitos fueron identificados en el estrato radiato CA1 usando IR-DIC en un microscopio de luz. El soma de la célula fue empalado por el electrodo, y el tinte se inyectó en la célula mediante la aplicación de 0,5 x 1 V hasta que los procesos más finos se llenaron por completo. La rebanada fue imageificada con microscopía confocal usando una lente de inmersión en agua 40x y luego procesada para inmunohistoquímica. Se completaron más imágenes con una lente de inmersión en aceite de 60x para realizar la reconstrucción celular y el análisis morfológico. Se muestra un ejemplo de reconstrucción de los procesos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Astrocito relleno de LY de CA1 estrato radiatum. (A) Imágenes de plano óptico único de un astrocito que se muestracada cada 10 m (etiquetado s 1 a 6). (B) Proyección máxima del astrocito, que representa el soma celular, varias ramas principales, y numerosos procesos que conforman su territorio tupido. (C) Proyección máxima (zoom x4) de una rama principal (de la sección delineada en amarillo), dos ramas secundarias, varias ramquitas y la organización de los procesos circundantes. Barra de escala a 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Reconstrucción de un astrocito lleno de LY y sus componentes. (A) astrocito CA1 lleno de LY. (B-E) Reconstrucción tridimensional del soma (B), soma y ramas principales(C),procesos (D), y territorio (E) con orientación de 0o y 45o. Barra de escala a 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Inmunomanchación GFAP en astrocitos llenos de LY. (A) Proyección z representativa de la tinción LY (verde) y GFAP (magenta). GFAP se expresa principalmente en las ramas primarias y secundarias del astrocito, pero no se encontró dentro de todo el territorio astrocito. Barra de escala: 10 m. (B) Gráfico del número de ramas primarias etiquetadas por LY y GFAP. (C) Zona celular denotada por tinción LY y GFAP. (D) Volumen celular indicado por tinción LY y GFAP. Los círculos abiertos son datos sin procesar con cuadrados cerrados que indican la media de SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Inmunostaína Aquaporina-4 en astrocitos llenos de LY. (A) Proyección z representativa de la tinción LY (verde) y aquaporina-4 (magenta). La acuporina-4 se expresa principalmente en los pies finales del astrocito. Las flechas blancas denotan los tres pies finales cuando se ponen en contacto con un vaso sanguíneo cercano. Barra de escala a 10 m. (B) Número de ramas con pies de fondo por astrocito. (C) Espesor de las ramas con pies de fondo en comparación con las otras ramas primarias de los astrocitos. (D) Longitud de las ramas con patas de fondo en comparación con el camino más corto al vaso sanguíneo. Los círculos abiertos son datos sin procesar con cuadrados cerrados que indican la media de SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: Reconstrucción de un astrocito lleno de LY y tinción de aquaporina-4. Película representativa de un astrocito CA1 cerca de un vaso sanguíneo. El soma, las ramas principales, los procesos y el territorio fueron reconstruidos para analizar la morfología de la célula. La reconstrucción de las ramas principales junto con la aquaporina-4 representan dos pies de punta de astrocito sin contacto directo con el vaso sanguíneo. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
| Características morfológicas | Media: SEM |
| Volumen de Soma (m3) | 489 x 30 |
| Número de sucursales primarias | 7,0 a 0,5 |
| Volumen de celda (m3) | 5580 a 425 |
| Volumen del territorio (m3) | 29391 a 8150 |
| Número de células | 14 |
Tabla 1: Análisis morfológico de la estructura de los astrocitos. Se muestra nifique el volumen de soma de astrocitos, el número de ramas primarias por astrocito, el volumen de células astrocitos y el volumen encerrado por el territorio de los astrocitos. Se recopilaron datos de 14 células de 7 ratones.
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Discussion
El método descrito en este artículo describe una manera de visualizar la morfología de los astrocitos utilizando la iontoforesis intracelular del tinte LY en rebanadas cerebrales ligeramente fijas. Hay varios factores críticos destacados en este protocolo que contribuyen al éxito de la iontoforesis LY y la reconstrucción morfológica de las células. Un factor es la calidad y reproducibilidad de las imágenes, que se determina en gran medida por la edad del ratón y el resultado de la perfusión. En este estudio, usamos ratones C57/BL6N de 6 a 8 semanas de edad. Una perfusión exitosa (altamente dependiente de la colocación adecuada de la aguja peroperadora y observada por un cerebro de color blanco y ausencia de sangre en la vasculatura cerebral) es necesaria para las células más detalladas y claramente llenas. Después del empalamiento por un electrodo, la membrana celular debe mantener un sello apretado alrededor de la punta del electrodo y evitar que el tinte se escape. A pesar de los mejores esfuerzos, ocasionalmente se llenarán otras estructuras fuera de la célula a medida que la pipeta esté avanzada a través del tejido cerebral: excluimos estas células del análisis. La resistencia de los electrodos es un factor clave adicional. La alta resistencia sólo permite una eyección constante del tinte de la punta del electrodo tras la estimulación del voltaje. Más técnicamente, es importante mantener movimientos suaves y lentos al empalar el soma de la célula con el electrodo. La penetración de electrodos a través de la célula puede conducir a la fuga de tinte del soma. Un empalamiento exitoso seguido de una aplicación de voltaje debería dar lugar a un llenado casi inmediato del cuerpo y los procesos de la célula (es decir, en pocos segundos). El tiempo necesario para llenar completamente un astrocito está relacionado con el territorio que abarca; sin embargo, espere para asegurarse de que los procesos más finos están completamente llenos (al menos 15 min).
Encontramos que este protocolo es una forma más fiel de estudiar la morfología de los astrocitos en detalle, sin embargo, el método tiene sus limitaciones. Identificar una celda puede llevar mucho tiempo y ser propenso a errores. Bajo IR-DIC, uno debe identificar características distintivas que marquen el tipo de celda específico (forma y tamaño del soma). Alternativamente, la expresión de reporteros fluorescentes rojos específicamente en astrocitos, por inyección viral o una línea de reportero de ratón transgénico, permite una identificación más fácil de estas células antes derellenar. Además, LY es limitado como un tinte citosólico porque no se puede utilizar para etiquetar la membrana de astrocito, en comparación con el etiquetado con una GFP con membrana, como Lck-GFP16. Lck-GFP daría una representación más precisa de toda el área del territorio, ya que LY iontoforesis revela el volumen interno de un astrocito. Sin embargo, dependiendo del diseño experimental, la iontoforesis LY es más adecuada para resolver todo el volumen interno de los astrocitos, desarrollar reconstrucciones tridimensionales y cuantificar los componentes anatómicos que componen la estructura de un astrocito6 . Por último, al igual que con todas las formas de microscopía confocal, la resolución espacial está limitada por la difracción, señalada como la función de propagación puntual de la óptica del microscopio17. Alterar los componentes del sistema de imágenes, como la disminución del diámetro del agujero, ayudará a mejorar las imágenes, pero la verdadera resolución está determinada por la longitud de onda de la luz y la apertura numérica de la lente objetivo. En nuestro caso, estimamos que la mejor resolución posible es probablemente alrededor de 300 nm, que es probable que sea peor en el eje z.
LA iontoforesis LY ofrece varias ventajas sobre otros métodos comúnmente utilizados para etiquetar los astrocitos. El protocolo se puede aplicar en cualquier modelo de ratón establecido, población celular o región cerebral18,19,20 ya que no está limitado por un promotor específico de astrocitos o una línea de ratón transgénica. Los enfoques genéticos para expresar las proteínas fluorescentes ubicuamente en astrocitos mediante inyecciones virales o líneas de reporteros de ratones transgénicos (es decir, td-Tomate) requieren el uso de un promotor de astrocitos, que, en algunas regiones, puede expresarse en otros tipos de células o no incluyen todos los astrocitos21. La iontoforesis LY también es eficiente en el tiempo, ya que las inyecciones virales de proteínas fluorescentes requieren cirugía y tiempo para expresar el virus específico, y las líneas de ratón transgénicas requieren reproducción. Por último, la iontoforesis LY es un método útil para distinguir células individuales, mientras que otras estrategias también tendrían que combinarse con un método de etiquetado disperso para visualizar los territorios de los astrocitos individuales22,23, 24. Sin embargo, ningún método es una panacea y la elección de los cuales se utiliza debe adaptarse a la pregunta específica que se está abordando.
Los estudios futuros pueden emplear manipulaciones experimentales específicas y examinar diferentes componentes de la estructura de los astrocitos (soma, ramas, procesos, territorio, etc.) para responder preguntas morfológicas. Esto podría proporcionar información y dirección sobre la morfología de los astrocitos y sus implicaciones funcionales, que podrían analizarse más a fondo mediante microscopía de luz de superresolución o microscopía electrónica4. Por ejemplo, la iontoforesis LY proporciona un medio para visualizar procesos de astrocitos finos, que contactan con miles de sinapsis y están involucrados en funciones sinápticas. Estudiar cómo la estructura de estos procesos cambia en diferentes condiciones patológicas podría ayudar a dilucidar las funciones de los astrocitos en la salud y la enfermedad. La iontoforesis LY es una técnica importante para visualizar la morfología celular detallada y caracterizar las propiedades de los astrocitos para comprender mejor sus funciones en el sistema nervioso central.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a la Sra. Soto, al Dr. Yu y al Dr. Octeau por su orientación, así como por sus comentarios sobre el texto. Este trabajo es compatible con NS060677.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
References
- Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
- Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
- Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
- Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
- Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
- Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
- Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
- Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
- Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
- Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
- Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
- Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
- Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
- Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
- Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
- Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).
