Summary
Astrocyter är morfologiskt komplexa celler, exemplifieras av deras flera processer och buskiga territorier. För att analysera deras utarbetade morfologi presenterar vi ett tillförlitligt protokoll för att utföra intracellulära Lucifer gula Jontofores i lätt fixerad vävnad.
Abstract
Astrocyter är viktiga komponenter i neurala kretsar. De kakel hela centralanervsystemet (CNS) och är involverade i en mängd olika funktioner, som inkluderar signalsubstansen clearance, Jon reglering, synaptisk modulering, metabola stöd till nervceller, och blod flödesreglering. Astrocyter är komplexa celler som har en Soma, flera stora grenar, och många fina processer som kontaktar olika cellulära element inom neuropil. För att bedöma morfologin av astrocyter, är det nödvändigt att ha en tillförlitlig och reproducerbar metod för att visualisera deras struktur. Vi rapporterar ett tillförlitligt protokoll för att utföra intracellulär Jontofores av astrocyter med fluorescerande Lucifer gul (LY) färgämne i lätt fast hjärnvävnad från vuxna möss. Denna metod har flera funktioner som är användbara för att karakterisera astrocytmorfologi. Det möjliggör tredimensionell rekonstruktion av enskilda astrocyter, vilket är användbart för att utföra morfologiska analyser på olika aspekter av deras struktur. Immunohistokemi tillsammans med LY iontofores kan också utnyttjas för att förstå samspelet mellan astrocyter med olika komponenter i nervsystemet och för att utvärdera uttrycket av proteiner inom de märkta astrocyterna. Detta protokoll kan genomföras i en mängd olika musmodeller av CNS-störningar för att rigoröst undersöka astrocytmorfologi med ljus mikroskopi. LY iontofores ger en experimentell metod för att utvärdera astrocytstruktur, särskilt i samband med skada eller sjukdom där dessa celler föreslås genomgå betydande morfologiska förändringar.
Introduction
Astrocyter är de vanligast förekommande gliaccellerna i centralanervsystemet (CNS). De spelar roller i Ion homeostas, blod flödesreglering, synapsen bildas samt eliminering, och signalsubstansen upptag1. Det breda utbudet av astrocytfunktioner återspeglas i deras komplexa morfologiska struktur2,3. Astrocyter innehåller flera primära och sekundära grenar som delas in i tusentals finare grenarna och broschyrer som direkt interagerar med synapser, dendriter, axoner, blodkärl, och andra gliaceller. Astrocytmorfologi varierar mellan olika hjärnregioner, vilket kan antyda deras förmåga att utföra sina funktioner differentially i neuronala kretsar4. Dessutom, astrocyter är kända för att förändra sin morfologi under utveckling, under fysiologiska förhållanden, och i flera sjukdomstillstånd3,5,6.
En konsekvent, reproducerbar metod behövs för att korrekt lösa komplexiteten i astrocytmorfologin. Traditionellt, immunohistokemi har använts för att visualisera astrocyter med användning av astrocytspecifika eller astrocytberikade protein markörer. Emellertid, dessa metoder avslöjar mönstret av proteinuttryck snarare än strukturen av astrocyt. De vanligen använda markörer, såsom gliaceller hjärn sura protein (gfap) och S100 kalcium bindning protein β (S100β), inte uttrycker i hela cell volymen och därmed inte lösa fullständig morfologi7. Genetiska metoder för att uttrycka fluorescerande proteiner ubiquitously i astrocyter (virala injektioner eller transgena mus reporter linjer) kan identifiera de finare grenar och övergripande territorium. Det är dock svårt att skilja enskilda astrocyter, och analyser kan vara partiska av den astrocytpopulation som riktas mot den specifika promotorn8. Seriell sektion elektronmikroskopi har använts för att avslöja en detaljerad bild av samspelet mellan astrocytprocesserna med synapser. På grund av de tusentals astrocytprocesserna som kontaktar synapser är det för närvarande inte möjligt att rekonstruera en hel cell med denna teknik9, även om detta förväntas förändras med hjälp av maskininlärningsmetoder för dataanalys.
I denna rapport fokuserar vi på ett förfarande för att karakterisera mus astrocyter med hjälp av intracellulär Jontofores med Lucifer gult (LY) färgämne, med hjälp av CA1 stratum radiatum som ett exempel. Metoden bygger på banbrytande tidigare verk av Eric Bushong och mark Ellisman10,11. Astrocyter från lätt fasta hjärn skivor identifieras genom sin distinkta Soma form och fylls med LY. Cellerna är sedan avbildas med konfokalmikroskopi. Vi visar hur enkelt Jontofores kan användas för att rekonstruera enskilda astrocyter och utföra detaljerade morfologiska analyser av deras processer och territorium. Också, denna metod kan tillämpas i samband med immunohistokemi att identifiera rumsliga relationer och interaktioner mellan astrocyter och nervceller, andra gliaceller och hjärn vaskulatur. Vi anser ly Jontofores vara ett mycket lämpligt verktyg för att analysera morfologi i olika hjärnregioner och musmodeller av friska eller sjukdomstillstånd7,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsöken i denna studie utfördes i enlighet med National Institute of Health Guide för vård och användning av försöksdjur och godkändes av kanslerns djur forskningskommitté vid University of California, Los Angeles. Vuxna möss (6 − 8 veckor gamla) av blandat kön användes i alla experiment.
1. beredning av lösningen
-
Artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) lösning
- Förbered färsk ACSF lösning (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 14,7 mm NaHCO3, 11 mm D-glukos, 1,25 mm na2HPO4, och 2 mm CaCl2) före varje experiment. Lägg till MgCl2 och CaCl2 i det sista steget. Lös upp komponenterna i avjoniserat vatten av hög kvalitet.
- Inkubera ACSF-lösningen vid 35 ° c i ett vattenbad och bubbla med 95% O2/5% Co2 i minst 30 min före experimentet.
- Tillsätt 2% lidokain hydroklorid att nå en slutlig koncentration av 0,02% i ACSF (i 100 mL).
-
Fixativ lösning
- Använd 10% formalin buffrat fosfat.
-
LY Dye lösning
- Förbered 1,5% ly Dye lösning genom att lösa upp ly CH dilitium salt eller ly CH dikalium salt i 5 mm KCL. Vortex grundligt. En volym på 1 mL räcker till flera experiment.
- Centrifugera i 10 minuter vid 16 800 x g. Filtrera sedan supernatanten med ett 0,2 μm sprutfilter i ett nytt rör. Alikvoter kan förvaras vid 4 ° c i upp till 3 månader.
Anmärkning: Det är viktigt att Centrifugera och filtrera Dye lösning för att förhindra aggregering av färgämnen partiklar, som kan täppa till elektroden.
2. mus Transcardial perfusion och hjärn dissektion
-
Beredning av utrustning och mus för transcardial perfusion
Obs: C57/BL6 möss av endera kön kan användas. Det har empiriskt observerats att för att metoden ska fungera tillförlitligt är det viktigt att mössen inte är äldre än 3 månader (6 − 8 veckor gammal är idealisk). Perfusion-protokollet beskrivs nedan. En ytterligare referens ges för mer information14.- Rensa perfusion slang med ACSF lösning för att avlägsna eventuella luftbubblor i linjen. Ställ in kirurgiska verktyg i användningsordning (pincett, böjda, trubbig sax, Iris sax).
- Djupt söva mus genom att sätta den i en isofluran induktion kammare, efter tillsats av 2 − 3 ml isofluran till kammaren. Låt 1 − 2 min för bedövningsmedel träda i kraft. Se till att andningen inte slutar.
- Test för tå nypa reflex. Fortsätt när musen inte svarar på smärt stimulans och reflex är frånvarande. Säkra djuret i ryggläge med huvudet placerat i andnings kon med en tillförsel av 5% isofluran i syre och armar och ben och svans tejpade ner inuti en kemisk rök huva.
-
Transcardial perfusion
- Med pincett lyfter du upp huden under bröstkorgen. Gör en 5 − 6 cm snitt med böjda, trubbig sax genom huden för att exponera bukhålan. Skär uppåt genom bukväggen tills levern och membranet är synliga.
- Flytta försiktigt levern bort från diagrammet. Med Iris sax, gör en 3 − 4 cm lateral snitt i mellangärdet.
- Skär genom bröstkorgen längs båda sidor av kroppen för att exponera bröstet hålighet. Var noga med att inte skada hjärtat och undvika lungorna. Lyft bröstbenet upp för att exponera hjärtat.
- När hjärtat är synligt, injicera 0,05 mL heparin natrium lösning (1 000 USP per mL) i den vänstra ventrikeln som en antikoagulant. Sedan, sätt in perfusion nål försiktigt i vänster kammare. Se till att nålen stannar i ventrikeln och inte tränga igenom till andra hjärt kammare. Gör ett litet snitt i höger förmak med Iris sax.
- Parfymera med ACSF-lösning med en hastighet av cirka 10 mL/min tills vätskan som finns i kroppen rensas från blod (1 − 2 min).
- Byt från ACSF lösning till fixativ lösning utan att införa några luftbubblor. Parfymen med fixativ lösning för 10 min vid 10 − 20 mL/min.
Försiktighet: Var försiktig så att ingen fixativ lösning rinner från näsan. Detta indikerar att nålen nådde höger kammare och fixativ reser till lungorna snarare än genom den systemiska kretsen till resten av kroppen.
-
Dissektion av hjärnan
- Ta bort huvudet av musen med sax och försiktigt dissekera mushjärna från skallen. Placera i fixativ lösning för 1,5 h vid rumstemperatur under en kort efter bindningstid.
Anmärkning: En bra perfusion är nödvändigt för framgångsrik LY iontofores. Hjärnan bör vara vit-färgad och frånvarande av blod i hjärnans kärl. Kropp och armar och ben ska verka stela.
- Ta bort huvudet av musen med sax och försiktigt dissekera mushjärna från skallen. Placera i fixativ lösning för 1,5 h vid rumstemperatur under en kort efter bindningstid.
3. beredning av skiva
-
Beredning av hippocampus skivor
- Tvätta hjärnan med 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid rumstemperatur i 5 min. Torka sedan av hjärnan med filtrerpapper och ta bort luktbulben och lillhjärnan med ett vasst rakblad.
- Montera hjärnan på vibratome brickan med cyanoakrylatlim och fyll facket med PBS i rumstemperatur. Skära Hippocampus koronala sektioner av 110 μm tjocklek.
Anmärkning: Justera inställningen för vibratome för att se till att skivorna har samma tjocklek och jämn yta. För detta experiment användes en hastighetsinställning på 4,5 och en frekvensinställning på 8, som är godtyckliga inställningar på instrumentet (tabell över material). Användare kan behöva experimentera med inställningarna på andra enheter. - Samla in sektioner från facket och placera i en skål med PBS på is.
4. förberedelse av elektrod
-
Förbered en skarp elektrod med lämpligt motstånd.
- Använd en elektrod av borosilikatglas med ett enda fat med glödtråden (O.D. 1,0 mm, I.D. 0,58 mm). Dra en elektrod på en micropipettavdragare (tabell över material). Idealiska elektroder fyllda med 1,5% LY i 5 mM KCl bör ha ett motstånd på 200 MΩ när de placeras i ett bad av PBS.
Anmärkning: Avdragarinställningen varierar beroende på apparat (typ av maskin som används och avdragare glödtråden). En högre värme inställning ger oftast längre och finare tips. För micropipett avdragare som används i detta experiment var inställningarna: Heat: 317, pull: 90, Velocity: 70 och DELAY: 70. En tråg typ glödtråden användes. - Förvara elektroderna i en sluten behållare för att förhindra att damm tränger in i spetsen. Håll elektroder förhöjda från botten av lådan för att förhindra spetsen från att bryta.
- Använd en elektrod av borosilikatglas med ett enda fat med glödtråden (O.D. 1,0 mm, I.D. 0,58 mm). Dra en elektrod på en micropipettavdragare (tabell över material). Idealiska elektroder fyllda med 1,5% LY i 5 mM KCl bör ha ett motstånd på 200 MΩ när de placeras i ett bad av PBS.
-
Fyll elektroden med LY Dye lösning.
- Placera en elektrod i vertikalt läge med spetsen vänd nedåt. Pipettera över 1 − 2 μL av LY-lösningen i elektrodens bak och vänta i 5 − 10 min för att lösningen ska övergå till spetsen via kapillärverkan.
- Försiktigt säkra den fyllda elektroden i elektrodhållaren ansluten till en manipulator.
Anmärkning: Elektrod hållarens silvertråd måste vara i kontakt med insidan av elektroden. Justera volymen på den rätta lösningen om det behövs, beroende på tråd längden.
5. fyllning av astrocyter med Jontofores
- Testa elektroden.
- Placera en hjärn skiva försiktigt i en glasbotten skålen fylld med 0,1 M PBS vid rumstemperatur. Håll segmentet på plats med en platina-harpa med nylonsträngar.
- Se till att elektroden är ansluten till en spänningskälla och placera jordelektroden i badet som innehåller hjärn skiva.
- Flytta målet till hjärnregionen av intresse.
- Sänk elektroden i lösningen. Under det ljusa fältet, flytta den till mitten av synfält och undersöka det noggrant med 40x vatten nedsänkning lins för att se till att det verkar klart och utan skräp eller bubblor. Om det är något igensättning elektrod spetsen, ersätta den med en ny.
Anmärkning: Igensättning är ett bekymmer för 200 MΩ-elektroden. Med centrifugering och filtrering av färgämne lösningen före varje experiment, detta bör inte vara ett vanligt problem. Men eftersom spetsen på elektroden är liten, kan vävnad ibland fastna i öppningen. Författarna har inte hittat ett sätt att förhindra detta, men det kan lätt hanteras genom att helt enkelt använda en ny elektrod. - Observera spetsen av elektroden under det konfokala laser-scanning Mikroskop med 488 nm Laser. Sedan, test Dye ejektion genom att vrida på stimulatorn vid 12 V. notera en stor fluorescerande färg moln runt spetsen av elektroden medan stimulatorn är på. Om ingen eller liten färg matas ut vid spännings stimulering, Byt ut elektroden.
- Under det ljusa fältet, sakta sänka elektroden mot segmentet stannar precis ovanför ytan.
- Fyll astrocyt med Jontofores.
- Identifiera astrocyter 40 − 50 μm under segment ytan med infraröd differential störnings kontrast (IR-DIC). Leta efter celler med långsträckt, ovala Somata ca 10 μm i diameter. När en astrocyt väljs, flytta den till mitten av synfältet.
Anmärkning: En bra cell för Jontofores har tydliga, definierade gränser runt den. Välj inte celler för nära ytan på segmentet eftersom de inte kan fyllas helt. Det tar lite övning under några dagar för att rutinmässigt kunna identifiera astrocyter för färgfyllning. Beroende på hjärnan område som används för experimentet, antalet astrocyter kan variera. Detta kan påverka den tid som behövs för att identifiera en astrocyt före fyllning. - Sakta sänka elektrod spetsen i segmentet, navigera genom vävnaden, tills den är på samma plan som cellkroppen.
Anmärkning: Flytta elektroden långsamt för att undvika att skada vävnaden. - När cellkroppen av astrocyt är klart synlig och beskrivs, långsamt och försiktigt förskott elektroden framåt. Flytta elektrod tills spetsen impales Soma av cellen. Flytta fokus målet långsamt upp och ner för att notera om elektroden är inne i Soma.
Anmärkning: Elektrod spetsen måste vara inuti cellkroppen, och en liten inbuktning på Soma bör observeras. Flytta inte elektroden ytterligare för att undvika att spetsen går igenom cellen. - När elektrod spetsen är inne i cellen, slå på stimulatorn på ~ 0.5 − 1 V och kontinuerligt mata ut strömmen i cellen. Använd det konfokala mikroskopet och titta på cell fyllningen. Öka den digitala zoomen för att se detaljerna i cellen och kontrollera att spetsen på elektroden är synlig inuti cellen.
Anmärkning: Sänk spänningen om det verkar som om färgen läcker ut ur cellen eller fyller andra celler i närheten. Om det verkar som om färgen fortfarande läcker ut ur cellen, dra elektrod ut långsamt och hitta en annan cell. Det är viktigt att färgen inte läcker för att ha en hög signal/bakgrund förhållande i den slutliga bilden. - Vänta i ca 15 min tills de finare grenar och processer visas definierade, stänga av spänningen och försiktigt dra elektrod spetsen från cellen.
- Identifiera astrocyter 40 − 50 μm under segment ytan med infraröd differential störnings kontrast (IR-DIC). Leta efter celler med långsträckt, ovala Somata ca 10 μm i diameter. När en astrocyt väljs, flytta den till mitten av synfältet.
- Bild den fyllda cellen.
Anmärkning: avbildning kan utföras omedelbart efter fyllning eller efter färgning med immunohistokemi. Ett mål med en högre numerisk bländare (NA) resulterar i bättre upplösning.- Vänta tills cellen återgår till originalform före avbildning (15 − 20 min) med 40x-objektiv. Om du vill avbilda cellen, justera inställningen på den konfokalmikroskopi att se till att de finare grenar och processer visas definierade.
- Ställ in en z-stack med en steg storlek på 0,3 μm. Medan Imaging, flytta målet tills det inte finns någon signal från cellen och ange det som toppen. Flytta sedan målet nedåt (med fokus genom cellen) tills det inte finns någon signal, ange det som botten.
- När bilden är klar, kontrollera elektroden för färg utmatning. Om ett stort färg moln visas kan det användas för nästa segment. I annat fall, Byt ut den mot en ny elektrod.
Anmärkning: Dye fyllning av en enda astrocytmodell och avbildning tar ca 45 min till 1 h. För detta specifika experiment var det möjligt att få ca 3 − 6 celler per mus. Om det behövs kan flera celler märkas på samma segment. Men för att skilja enskilda astrocyter, se till att hålla ett avstånd på ca 200 μm mellan cellerna.
6. färgning med immunohistokemi (tillval)
- När bildbehandling är klar, omedelbart placera segmentet i 10% formalin på is för att bevara för immunohistokemi. Håll hjärn skivor i mörkret och förvara över natten vid 4 ° c.
- Tvätta hjärn sektioner 3x i 0,1 M PBS med 0,5% icke-jonaktivt tensid (dvs., Triton X 100) för 5 min vardera. Inkubera sedan i en blockerande lösning på 0,1 M PBS med 0,5% nonioniskt ytaktivt ämne och 10% normalt get serum (NGS) för 1 h vid rumstemperatur med mild agitation.
- Inkubera avsnitten med agitation i primära antikroppar utspädda i 0,1 M PBS med 0,5% icke-jonaktivt tensid och 5% ngs i 2 dagar vid 4 ° c.
Anmärkning: På grund av tjockleken på hjärn skivorna måste inkubationstiden för de primära antikropparna utökas för bättre penetration och antikroppskoncentrationen kan ökas. I detta experiment, en 1:500 utspädning användes för anti GFAP antikropp och en 1:500 utspädning användes för anti aquaporin-4 antikropp. - Tvätta sektionerna 3x i 0,1 M PBS med 0,5% nonioniskt ytaktivt ämne i 10 min vardera och inkubera sedan med sekundära antikroppar utspädda i 0,1 M PBS med 0,5% nonjontensid och 10% NGS för 6 h vid rumstemperatur.
Anmärkning: Välj inte en sekundär antikropp upphetsad av 488 nm, vilket är den våglängd som används för att visualisera den LY Dye. I detta experiment, en 1:1000 utspädning användes för Alexa fluor 546 Goat anti-kyckling IgG (H + L) och Alexa fluor 647 get anti-kanin IgG (H + L). - Skölj avsnitten 3x i 0,1 M PBS för 10 min vardera. Montera sedan sektionerna på glas Mikroskop diabilder i monteringsmaterial som lämpar sig för fluorescens. Tätnings glas. Bildceller med en steg storlek på 0,3 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De data som rapporteras i denna studie är från 7 − 12 celler från 4 möss i varje experiment. Genomsnittsdata rapporteras i figur panelerna där så är lämpligt.
För att bedöma astrocytmorfologi utförde vi intracellulära Jontofores med hjälp av LY Dye för att fylla astrocyter i CA1 stratum radiatum, som sammanfattas i figur 1. Figur 2 skildrar en representativ astrocyt och dess utarbetade morfologiska struktur. Cellen var avbildad efter fixering med 60x Oil Immersion lins på en konfokal laser-scanning Mikroskop med hjälp av 488 nm laserlinje (steg storlek på 0,3 μm och 3,0 − 3.5 x digital zoom). Den Fotomultiplikator Tube (PMT), offset, och få funktioner i konfokalmikroskopet justerades för att skapa en hög signal/bakgrund förhållande i den slutliga bilden. I figur 2Avisar enstaka optiska plan bilder från olika z-steg (visas var 10 μm, märkta i storleksordning från 1 − 6) den centrala Soma och flera stora grenar som delas in i ett tätt nätverk av processer. Genom att generera en maximal intensitet projektion (stackstorlek 85 μm) vi observerade en detaljerad bild av strukturen av astrocyt och dess domän (figur 2B). De viktigaste komponenterna i astrocyt struktur har också noterats. Figur 2 C visar en zoom in (x4) maximal intensitet projektion av en stor gren, flera sekundära grenar, och fördelningen av de omgivande grenarna och broschyrer.
Morfologiska analyser och rekonstruktioner av astrocyter utfördes med Imaris analysprogramvara (tabell över material) med hjälp av efter fixering bilder av ly-filled astrocyter (andra program som imagej kan också användas). Efter återuppbyggnaden av varje astrocytmodell slutfördes, volymerna av Soma, stora grenar, processer, och territorium kvantifierades. Soma skapades först med en ytutjämning inställd på x-y plan upplösning gräns (0,25 μm). Den minsta objekt diametern var satt till 3,0 μm för att ta bort andra objekt som inte är associerade med cellkroppen. För att skapa de stora grenarna var intensiteten i Soma maskerad, på grund av dess ljusstyrka i förhållande till resten av cellen. Ytan utjämning och minsta objekt diameter av de stora grenarna var inställd på 0,3 μm (z plan steg storlek). För att skapa processerna, var intensiteten i de stora grenarna också maskerad. Ytutjämning var satt till 0,18 μm och minsta objekt diameter var inställd på 0,3 μm. Territoriet av astrocyt skapades med hjälp av en lägre intensitet tröskel och ytutjämning inställd på 0,75 μm. figur 3a visar den ursprungliga bilden av en CA1 astrocytmodell. Cellen förkroppsligar, de huvudsakliga förgrena sig, bearbetar, och territorium volymen som omges av astrocyen, rekonstrueras i figurera 3B-E. Efter rekonstruktionerna av cellerna skapades, volymerna av Soma, hela cellen, och territorium kvantifierades och antalet större grenar räknades (tabell 1). CA1 astrocyter från stratum radiatum hade en genomsnittlig Soma volym på 488,91 μm3, genomsnitt av ~ 7 primära grenar, genomsnittlig cell volym på 5,58 x 103 μm3, och genomsnittliga territorium volym 2,94 x 104 μm3.
Den väl karaktäriserade astrocyt markör, GFAP, är ett cytoskeletärt protein som etiketter de mellanliggande glödtrådar av en astrocyt8. Efter att astrocyter var fyllt med färg, utförde vi immunofärgning för GFAP för att visualisera uttryck i enskilda astrocyter (figur 4). Vi fann att GFAP uttrycktes i cellen Soma, stora grenar, och några sekundära grenar av astrocyter, men inte i de finare grenar och processer (figur 4A). Ingen signifikant skillnad hittades i antalet primära grenar märkta med GFAP och de som visualiseras av LY (p = 0,1573; Figur 4 B). cellområdet och volymen av de astrocyt som är märkta med gfap var signifikant mindre än området och volymen VISUALISERADE med ly (p < 0,0001; Figur 4 C, D). Detta visar att GFAP är en tillförlitlig markör för att märka stora grenar, men är inte användbart för att bestämma den totala arean eller volymen av cellen.
Ett viktigt inslag i astrocyter är deras endfeet, som kontakt blodkärlen och föreslås för att hjälpa till att reglera blodflödet i CNS. För att ytterligare förstå den rumsliga relationen mellan astrocyter och hjärn vaskulatur, vi färgas med antikroppar mot aquaporin-4 efter färgning fyllning. Aquaporin-4 är ett vattenkanal protein som finns på astrocyter och ependymceller celler, och är starkt uttryckt i områden nära ventriklar och blodkärl15. Vi fann att aquaporin-4 uttrycks på astrocytändfötter i nära närhet till hjärn vaskulatur (figur 5A). Bilden visar tre astrocytpinnfötter som kontaktar ett blodkärl på olika platser (indikeras av de vita pilarna). I CA1 stratum radiatum var det genomsnittliga antalet endfeet per astrocytmodell ~ 2 (figur 5B). Intressant, grenarna som innehåller endfeet var betydligt tjockare än de andra primära grenarna av astrocyt, med hjälp av de stora grenen rekonstruktioner (p = 0,0038; Figur 5 C). Vi mätte också längden på grenarna som innehåller endfeet från mitten av Soma till blodkärlet och jämförde det med den kortaste, direkta vägen till blodkärlet. Den faktiska längden på grenarna till blodkärlet var signifikant större än den kortaste vägen (p = 0,0333; Figur 5 D), som antyder att dessa grenar tenderar att ta en längre, omväg till blodkärlet. Film 1 skildrar en film av en rekonstruktion av en ly-filled astrocytmodell och aquaporin-4 färgning. De olika strukturella komponenterna i astrocyt (Soma, stora grenar, processer, och territorium) är representerade i tre dimensioner. Den LY-fyllda astrocyt tillsammans med aquaporin-4 färgning skildrar astrocyt endfeet omger blodkärlet. Från återuppbyggnaden av de stora grenarna och blodkärlet, de grenar som innehåller endfeet kan visualiseras sträcker sig från Soma till fartyget.
I de föregående avsnitten, där p-värden rapporteras, använde vi en ej ihopparad Students t-test, med signifikans på p < 0,05.
Figur 1: diagram över arbetsflödet i ly iontofores. Schematisk representation av protokoll som belyser de kritiska stegen. Efter att musen var parfymera med fixativ, var hjärnan dissekeras. Efter en kort efter bindningstid, Koronal sektioner klipptes med en vibratome. Elektrod var återfyllt med 1,5% ly Dye. Astrocyter identifierades i CA1 stratum radiatum med IR-DIC på ett lätt Mikroskop. Soma av cellen var spetsad av elektroden, och färgämnet injicerades i cellen genom att tillämpa 0.5 − 1 V tills de finare processerna var helt fyllda. Segmentet var avbildad med konfokalmikroskopi med hjälp av en 40x vatten nedsänkning lins och sedan bearbetas för immunohistokemi. Ytterligare avbildning slutfördes med en 60x Oil Immersion lins för att utföra cell rekonstruktion och Morfologisk analys. Som visas är ett exempel på rekonstruktion av processerna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: ly fyllda astrocyt av CA1 stratum radiatum. A) enstaka optiska plan bilder från ett astrocyt som visas var 10: e μm (märkt 1 − 6). (B) maximal projektion av astrocyt, som skildrar cellen Soma, flera stora grenar, och många processer som utgör dess buskiga territorium. (C) maximal projektion (zoom x4) av en större gren (från avsnitt som beskrivs i gult), två sekundära grenar, flera förgreningar och organisationen av de omgivande processerna. Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: rekonstruktion av en ly-filled astrocyt och dess komponenter. (A) CA1 astrocyt fyllda med ly. (B-E) Tredimensionell rekonstruktion av Soma (B), Soma och större grenar (C), processer (D), och territorium (E) vid 0 ° och 45 ° orientering. Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: GFAP immunofärgning i ly-fyllda astrocyter. A) representativ z-projektion av ly (grön) och gfap (magenta) färgning. GFAP uttrycks främst i den primära och några sekundära grenar av astrocyt, men hittades inte inom hela astrocytterritoriet. Skalstapel = 10 μm. (B) diagram över antalet primära grenar märkta med ly och gfap. Ccell område BETECKNADE med ly-och gfap-färgning. Dcell volym som betecknas med ly-och gfap-färgning. Öppna cirklar är rådata med slutna rutor som indikerar medelvärdet ± SEM. data samlades in från 12 celler från 4 möss. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Aquaporin-4 immunofärgning i ly-fyllda astrocyter. A) representativ z-projektion av ly (grön) och aquaporin-4 färgning (magenta). Aquaporin-4 uttrycks främst i endfeet av astrocyt. Vita pilar betecknar de tre endfeet som de kontaktar en närliggande blodkärl. Scale bar = 10 μm. (B) antal grenar med endfeet per astrocyte. Ctjocklek av grenar med endfeet i jämförelse med de andra primära grenarna av astrocyter. Dlängd på grenar med endfeet i förhållande till den kortaste vägen till blodkärlet. Öppna cirklar är rådata med slutna rutor som indikerar medelvärdet ± SEM. data samlades in från 7 celler från 4 möss. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: rekonstruktion av en ly-filled astrocytmodell och aquaporin-4 färgning. Representativ film av en CA1 astrocyt i närheten av ett blodkärl. Soma, stora grenar, processer och territorium rekonstruerades för att analysera morfologin i cellen. Återuppbyggnaden av de stora grenarna tillsammans med aquaporin-4 skildra två astrocytändfötter direkt kontakt med blodkärlet. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
| Morfologiska egenskaper | Medelvärde ± SEM |
| Soma-volym (μm3) | 489 ± 30 |
| Antal huvudgrenar | 7,0 ± 0,5 |
| Cell volym (μm3) | 5580 ± 425 |
| Områdes volym (μm3) | 29391 ± 8150 |
| Antal celler | 14 |
Tabell 1: Morfologisk analys av astrocytstruktur. Den astrocyt Soma volym, antal primära grenar per astrocytmodell, astrocyt cell volym, och volym som omges av astrocyt territorium visas. Data samlades in från 14 celler från 7 möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs i detta dokument beskriver ett sätt att visualisera astrocytmorfologi med hjälp av intracellulära Jontofores av LY Dye i lätt fasta hjärn skivor. Det finns flera viktiga faktorer som lyfts fram i detta protokoll som bidrar till framgångsrik jonitofores och morfologisk rekonstruktion av cellerna. En faktor är kvaliteten och reproducerbarheten av bilderna, som bestäms till stor del av en ålder av musen och resultatet av perfusion. I denna studie använde vi C57/BL6N möss 6 − 8 veckor gamla. En lyckad perfusion (mycket beroende av korrekt placering av parfymen nål och noteras av en vit-färgad hjärna och frånvaro av blod i hjärnan kärl) är nödvändigt för de mest detaljerade och klart fyllda celler. Efter impalement av en elektrod, bör cellmembranet upprätthålla en tät tätning runt spetsen av elektroden och förhindra färg från att läcka ut. Trots bästa ansträngningar, ibland andra strukturer utanför cellen kommer att fyllas som pipetten är avancerad genom hjärnvävnad: vi exkluderade dessa celler från analysen. Resistensen hos elektroderna är ytterligare en nyckelfaktor. Det höga motståndet tillåter endast en stadig utmatning av färg från elektrod spetsen vid spännings stimulering. Mer tekniskt, det är viktigt att upprätthålla milda, långsamma rörelser när impaling Soma av cellen med elektroden. Elektrod inträngning genom cellen kan leda till Dye läckage från Soma. En lyckad impalement följt av spännings applicering bör resultera i nästan omedelbar färgfyllning av cellen kroppen och processer (dvs., inom några sekunder). Den tid som krävs för att helt fylla en astrocyt är relaterad till det område den omfattar; Men vänta med att se till att de finare processerna är helt fyllda (minst 15 min).
Vi fann detta protokoll vara ett troligast sätt att studera astrocytmorfologi i detalj, ändå har metoden sina begränsningar. Identifiera en cell kan vara tidskrävande och felbenägna. Under IR-DIC, bör man identifiera utmärkande egenskaper som markerar den specifika celltypen (Soma form och storlek). Alternativt, uttrycket av röda fluorescerande reportrar specifikt i astrocyter, genom viral injektion eller en transgen mus reporter linje, möjliggör enklare identifiering av dessa celler innan fyllning. Dessutom är LY begränsad som ett cytosoliskt färgämne eftersom det inte kan användas för att märka astrocytmembranet, i jämförelse med märkning med en membran-tjudrad GFP, såsom LCK-GFP16. LCK-GFP skulle ge en mer exakt representation av hela territoriet området, som LY Jontofores avslöjar den inre volymen av en astrocyt. Men beroende på experimentell design, är LY iontofores bättre lämpad att lösa hela astrocyt inre volym, utveckla tredimensionella rekonstruktioner, och kvantifiera de anatomiska komponenter som utgör en astrocyt struktur6 . Slutligen, som med alla former av konfokalmikroskopi, är rumslig upplösning begränsad av diffraktion, noteras som punkt sprids funktion av Mikroskop optik17. Ändra komponenter i avbildnings systemet, till exempel minska håldiameter, kommer att bidra till att förbättra bilderna, men den sanna upplösningen bestäms av våglängden av ljus och den numeriska bländaren av objektivlinsen. I vårt fall uppskattar vi den bästa upplösningen möjligt är förmodligen runt 300 nm, vilket sannolikt är värre i z-axeln.
LY Jontofores erbjuder flera fördelar jämfört med andra vanliga metoder för att märka astrocyter. Protokollet kan tillämpas i en etablerad musmodell, cellpopulation, eller hjärnregion18,19,20 eftersom det inte begränsas av en astrocytspecifik promotor eller en transgen mus linje. Genetiska metoder för att uttrycka fluorescerande proteiner ubiquitously i astrocyter genom viral injektioner eller transgena mus reporter linjer (dvs., TD-tomat) kräver användning av en astrocyt promotor, som i vissa regioner, kan uttryckas i andra celltyper eller inte inkludera alla astrocyter21. LY iontofores är också tidseffektiv, eftersom virala injektioner av fluorescerande proteiner kräver kirurgi och tid att uttrycka det specifika viruset, och transgena mus linjer kräver avel. Slutligen, ly Jontofores är en användbar metod för att skilja enskilda celler, medan andra strategier skulle också behöva kombineras med en metod för glesa märkning för att visualisera de territorier av enskilda astrocyter22,23, 24. Men ingen metod är en patentlösning och valet av som används måste anpassas till den specifika fråga som behandlas.
Framtida studier kan anställa specifika experimentella manipulationer och undersöka olika komponenter av astrocytstruktur (Soma, grenar, processer, territorium, etc.) för att besvara morfologiska frågor. Detta kan ge insikt och riktning i astrocytmorfologi och dess funktionella konsekvenser, som skulle kunna analyseras ytterligare genom super resolution ljus mikroskopi eller elektronmikroskopi4. Till exempel, LY Jontofores ger ett sätt att visualisera fina astrocytprocesser, som kontaktar tusentals synapser och är involverade i synaptiska funktioner. Studera hur strukturen i dessa processer förändringar i olika sjukdomstillstånd kan hjälpa belysa rollerna av astrocyter i hälsa och sjukdom. LY Jontofores är en viktig teknik för att visualisera detaljerad cellmorfologi och karakterisera astrocyt egenskaper för att bättre förstå deras funktioner i centralanervsystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar MS Soto, Dr Yu, och Dr Octeau för vägledning samt kommentarer till texten. Detta arbete stöds av NS060677.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
References
- Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
- Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
- Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
- Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
- Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
- Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
- Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
- Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
- Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
- Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
- Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
- Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
- Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
- Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
- Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
- Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).
