Summary
Astrocyten zijn morfologisch complexe cellen, geïllustreerd door hun meerdere processen en bossige gebieden. Om hun uitgebreide morfologie te analyseren, presenteren wij een betrouwbaar protocol voor het uitvoeren van intracellulaire Lucifer gele Iontoforese in licht vast weefsel.
Abstract
Astrocyten zijn essentiële componenten van neurale circuits. Ze tegel het gehele centrale zenuwstelsel (CNS) en zijn betrokken bij een verscheidenheid van functies, waaronder de klaring van de neurotransmitter, Ion regulatie, synaptische modulatie, metabole ondersteuning voor neuronen, en de regulering van de bloedstroom. Astrocyten zijn complexe cellen met een Soma, verschillende belangrijke takken en tal van fijne processen die verschillende cellulaire elementen in de neuro pil contacteren. Om de morfologie van astrocyten te beoordelen, is het noodzakelijk om een betrouwbare en reproduceerbaar methode te hebben om hun structuur te visualiseren. We rapporteren een betrouwbaar protocol voor het uitvoeren van intracellulaire Iontoforese van astrocyten met behulp van fluorescerende Lucifer geel (LY) kleurstof in licht vaste hersenweefsel van volwassen muizen. Deze methode heeft verschillende functies die nuttig zijn om de morfologie van astrocyten te karakteriseren. Het maakt de driedimensionale reconstructie van individuele astrocyten mogelijk, wat nuttig is om morfologische analyses uit te voeren op verschillende aspecten van hun structuur. Immunohistochemie samen met LY iontforesis kan ook worden gebruikt om de interactie van astrocyten met verschillende componenten van het zenuwstelsel te begrijpen en om de expressie van eiwitten binnen de gelabelde astrocyten te evalueren. Dit protocol kan worden geïmplementeerd in een verscheidenheid van Muismodellen van CZS-aandoeningen om de morfologie van astrocyten grondig te onderzoeken met lichte microscopie. LY Iontoforese biedt een experimentele benadering om de astrocyten structuur te evalueren, vooral in de context van letsel of ziekte, waarbij deze cellen worden voorgesteld om significante morfologische veranderingen te ondergaan.
Introduction
Astrocyten zijn de meest voorkomende gliacellen in het centrale zenuwstelsel (CNS). Ze spelen rollen in ion homeostase, bloedstroom regulatie, Synapse vorming evenals eliminatie, en neurotransmitter opname1. Het brede scala aan astrocyten functies wordt weerspiegeld in hun complexe morfologische structuur2,3. Astrocyten bevatten verschillende primaire en secundaire takken die verdelen in duizenden fijnere vertakkingen en folders die rechtstreeks interageren met synapsen, dendrites, axonen, bloedvaten en andere gliacellen. De morfologie van de astrocyten varieert in verschillende hersengebieden, wat kan hint naar hun vermogen om hun functies differentieel te vervullen in neuronale circuits4. Bovendien is bekend dat astrocyten hun morfologie veranderen tijdens de ontwikkeling, tijdens fysiologische omstandigheden, en in meerdere ziektetoestanden3,5,6.
Een consistente, reproduceerbare methode is nodig om de complexiteit van de morfologie van de astrocyten nauwkeurig op te lossen. Van oudsher wordt immunohistochemie gebruikt om astrocyten te visualiseren met het gebruik van specifieke astrocyten of verrijkte eiwit markers. Echter, deze methoden onthullen het patroon van eiwit expressie in plaats van de structuur van de astrocyten. De veelgebruikte markers, zoals gliacellen fibrillair zuur eiwit (GFAP) en S100 calcium bindende proteïne β (S100β), drukken niet in het gehele celvolume uit en lossen dus geen volledige morfologie7op. Genetische benaderingen om fluorescerende eiwitten te uiten die alomtegenwoordig zijn in astrocyten (virale injecties of transgene muis reporter lijnen) kunnen de fijnere takken en het gehele grondgebied identificeren. Het is echter moeilijk om individuele astrocyten te differentiëren en analyses kunnen bevooroordeeld zijn door de astrocyten populatie die de specifieke promotor8target. Seriële sectie elektronenmicroscopie is gebruikt om een gedetailleerd beeld te onthullen van de interacties van astrocyten processen met synapsen. Vanwege de duizenden astrocyten processen die contact opnemen met synapsen, is het momenteel niet mogelijk om een hele cel te reconstrueren met deze techniek9, hoewel dit naar verwachting verandert met het gebruik van machine learning-benaderingen voor gegevensanalyse.
In dit rapport richten we ons op een procedure voor het karakteriseren van muis astrocyten met behulp van intracellulaire Iontoforese met Lucifer geel (LY) Dye, met behulp van de CA1 stratum radiatum als voorbeeld. De methode is gebaseerd op baanbrekend werk van Eric Bushong en Mark Ellisman10,11. Astrocyten van licht vaste hersen sneden worden geïdentificeerd door hun kenmerkende Soma-vorm en gevuld met LY. De cellen worden vervolgens met een confocale microscopie afgebeeld. We laten zien hoe sterk Iontoforese kan worden gebruikt om individuele astrocyten te reconstrueren en gedetailleerde morfologische analyses van hun processen en territorium uit te voeren. Ook kan deze methode worden toegepast in combinatie met immunohistochemie om ruimtelijke relaties en interacties tussen astrocyten en neuronen, andere gliacellen en hersen vasculatuur te identificeren. We beschouwen ly iontopforesis als een zeer geschikt hulpmiddel om de morfologie in verschillende hersengebieden en Muismodellen van gezonde of ziekte aandoeningen7,12,13te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dier experimenten in deze studie werden uitgevoerd in overeenstemming met het National Institute of Health Guide voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de kanselier van de Dierenonderzoekscommissie van de Universiteit van Californië, Los Angeles. Bij alle experimenten werden volwassen muizen (6 − 8 weken oud) van gemengd geslacht gebruikt.
1. voorbereiding van de oplossing
-
Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) oplossing
- Bereid verse ACSF-oplossing (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 14,7 mm NaHCO3, 11 mm D-glucose, 1,25 mm na2HPO4en 2 mm CACL2) voor elk experiment. Voeg in de laatste stap MgCl2 en CACL2 toe. Los de componenten op in hoogwaardig gedeïoniseerd water.
- Incuberen de ACSF-oplossing bij 35 °C in een waterbad en bel met 95% O2/5% Co2 gedurende ten minste 30 minuten voor het experiment.
- Voeg 2% lidocaïne waterstofchloride te bereiken van een uiteindelijke concentratie van 0,02% in ACSF (in 100 mL).
-
Fixatieve oplossing
- Gebruik 10% formaline gebufferd fosfaat.
-
LY kleurstof oplossing
- Bereid 1,5% LY kleurstof oplossing door het oplossen van LY CH dilithium zout of LY CH dikalium zout in 5 mM KCl. Vortex grondig. Een volume van 1 mL volstaat voor verschillende experimenten.
- Centrifugeer 10 min bij 16.800 x g. Filtreer vervolgens de supernatant met een spuit filter van 0,2 μm in een nieuwe buis. Aliquots kunnen maximaal 3 maanden bij 4 °C worden bewaard.
Opmerking: Het is van cruciaal belang om de kleurstofoplossing te centrifugeren en te filteren om aggregatie van de kleurstof deeltjes te voorkomen, die de elektrode kunnen verstoppen.
2. muis Transcardial perfusie en hersen dissectie
-
Voorbereiding van apparatuur en muis voor transcardial perfusie
Opmerking: C57/BL6 muizen van beide seks kunnen worden gebruikt. Het is empirisch waargenomen dat voor de methode om betrouwbaar te werken, het belangrijk is dat de muizen niet ouder zijn dan 3 maanden (6 − 8 weken oud is ideaal). Het perfusie-protocol wordt hieronder beschreven. Er wordt een aanvullende referentie gegeven voor meer informatie14.- Heldere perfusie slang met ACSF oplossing om eventuele luchtbellen in de lijn te verwijderen. Instellen van chirurgie tools in volgorde van gebruik (pincet, gebogen, Blunt schaar, Iris schaar).
- Diep anesthetiseer muis door het in een Isofluraan inductie kamer, na het toevoegen van 2 − 3 ml Isofluraan aan de kamer. Laat 1 − 2 min voor verdoving in werking nemen. Zorg ervoor dat de ademhaling niet stopt.
- Test voor teen pinch reflex. Ga verder wanneer de muis niet reageert op pijn stimulus en de reflex afwezig is. Bevestig het dier in de rugligging met het hoofd in de adem kegel met een toevoer van 5% Isofluraan in zuurstof en de ledematen en staart in een chemische rook afzuigkap afgetand.
-
Transcardial perfusie
- Gebruik pincet en til de huid onder de ribbenkast op. Maak een 5 − 6 cm incisie met de gebogen, stompe schaar door de huid om de buikholte bloot te leggen. Snijd door de buikwand tot de lever en het diafragma zichtbaar zijn.
- Beweeg de lever voorzichtig uit de buurt van het diagram. Met Iris schaar, maak een 3 − 4 cm laterale incisie in het diafragma.
- Snijd door de ribbenkast langs de beide zijden van het lichaam om de borstholte bloot te leggen. Wees voorzichtig om het hart niet te beschadigen en de longen te vermijden. Til het borstbeen omhoog om het hart bloot te leggen.
- Zodra het hart zichtbaar is, injecteert u 0,05 mL heparine natrium oplossing (1.000 USP per mL) in de linker ventrikel als een antistollingsmiddel. Plaats vervolgens perfusie naald voorzichtig in de linker ventrikel. Zorg ervoor dat de naald in de ventrikel blijft en niet doorboren naar andere hartkamers. Maak een kleine incisie in het rechter atrium met Iris schaar.
- Parfuseren met ACSF-oplossing met een snelheid van ongeveer 10 mL/min totdat de vloeistof bestaande het lichaam wordt gewist van bloed (1 − 2 min).
- Overschakelen van de ACSF-oplossing naar de fixatieve oplossing zonder luchtbellen te introduceren. Parfumerend met fixatieve oplossing gedurende 10 min bij 10 − 20 mL/min.
Let op: Zorg dat er geen fixatieve oplossing uit de neus wordt verwijderd. Dit geeft aan dat de naald de rechter ventrikel bereikt en de fixatief is reizen naar de longen in plaats van via het systemische circuit naar de rest van het lichaam.
-
Dissectie van de hersenen
- Verwijder de kop van de muis met een schaar en ontleden voorzichtig de muis hersenen van de schedel. Plaats in fixatieve oplossing voor 1,5 uur bij kamertemperatuur voor een korte periode na fixatie.
Opmerking: Een goede perfusie is noodzakelijk voor een succesvolle LY iontforesis. Hersenen moeten wit-gekleurd en afwezig van bloed in de hersenen vasculatuur. Lichaam en ledematen moeten stijf lijken.
- Verwijder de kop van de muis met een schaar en ontleden voorzichtig de muis hersenen van de schedel. Plaats in fixatieve oplossing voor 1,5 uur bij kamertemperatuur voor een korte periode na fixatie.
3. voorbereiding van segmenten
-
Bereiding van hippocampal plakjes
- Was de hersenen met 0,1 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Droog vervolgens de hersenen af met filtreerpapier en verwijder de olfactorische bol en het cerebellum met een scherp scheermesje.
- Monteer de hersenen op de vibratome tray met behulp van Cyanoacrylaat lijm en vul de lade met PBS bij kamertemperatuur. Gesneden hippocampal coronale secties van 110 μm dikte.
Opmerking: Pas de instelling van de vibratome aan om ervoor te zorgen dat de segmenten dezelfde dikte en zelfs een oppervlak hebben. Voor dit experiment, een snelheidsinstelling van 4,5 en een frequentie-instelling van 8 werden gebruikt, die willekeurige instellingen op het instrument (tabel van de materialen). Gebruikers moeten mogelijk experimenteren met de instellingen op andere apparaten. - Verzamel de secties van de lade en plaats ze in een schotel van PBS op ijs.
4. voorbereiding van de elektrode
-
Bereid een scherpe elektrode met de juiste weerstand.
- Gebruik een enkele vat-elektrode van borosilicaatglas met gloeidraad (O.D. 1,0 mm, I.D. 0,58 mm). Trek een elektrode aan op een micro pipet-trekker (tabel met materialen). Ideale elektroden gevuld met 1,5% LY in 5 mM KCl moet een weerstand van 200 MΩ hebben wanneer ze in een bad van PBS worden geplaatst.
Opmerking: De trekker-instelling varieert afhankelijk van het apparaat (typemachine gebruikt en trekker filament). Een hogere warmte-instelling geeft meestal langere en fijnere tips. Voor de pipet-trekker die in dit experiment wordt gebruikt, waren de instellingen: Heat: 317, pull: 90, Velocity: 70 en delay: 70. Er werd een trog type filament gebruikt. - Bewaar de elektroden in een gesloten recipiënt om te voorkomen dat er stof in de punt terechtkomt. Houd de elektroden verhoogd vanaf de onderkant van de doos om te voorkomen dat de tip breekt.
- Gebruik een enkele vat-elektrode van borosilicaatglas met gloeidraad (O.D. 1,0 mm, I.D. 0,58 mm). Trek een elektrode aan op een micro pipet-trekker (tabel met materialen). Ideale elektroden gevuld met 1,5% LY in 5 mM KCl moet een weerstand van 200 MΩ hebben wanneer ze in een bad van PBS worden geplaatst.
-
Vul de elektrode met LY Dye oplossing.
- Plaats een elektrode in verticale positie met de punt naar beneden gericht. Pipetteer 1 − 2 μL van de oplossing in de achterkant van de elektrode en wacht 5 − 10 minuten tot de uitkomst via capillaire werking naar de punt gaat.
- Bevestig de gevulde elektrode voorzichtig in de elektrodehouder die is aangesloten op een manipulator.
Opmerking: De zilver draad van de elektrodehouder moet in contact zijn met de LY in de elektrode. Pas indien nodig het volume van de LY-oplossing aan, afhankelijk van de draadlengte.
5. het vullen van astrocyten met Iontoforese
- Test de elektrode.
- Plaats een hersen segment zachtjes in een glazen bodem schotel gevuld met 0,1 M PBS bij kamertemperatuur. Houd het segment op zijn plaats met een platina harp met nylon snaren.
- Zorg ervoor dat de elektrode is aangesloten op een spanningsbron en plaats de aardelektrode in het bad met de hersen slice.
- Verplaats de doelstelling naar het hersengebied van belang.
- Verlaag de elektrode in de oplossing. Onder het heldere veld, verplaats het naar het midden van het gezichtsveld en Bekijk het zorgvuldig met de 40x water onderdompeling lens om ervoor te zorgen dat het duidelijk en zonder puin of bubbels lijkt. Als er iets is verstopping van de elektrode tip, vervang deze door een nieuwe.
Opmerking: Verstopping is een zorg voor de 200 MΩ-elektrode. Met centrifugeren en filtreren van de kleurstofoplossing voor elk experiment, moet dit geen frequent probleem zijn. Echter, omdat de punt van de elektrode klein is, kan weefsel soms vast komen te zitten in de opening. De auteurs hebben geen manier gevonden om dit te voorkomen, maar het kan gemakkelijk worden aangepakt door simpelweg een nieuwe elektrode te gebruiken. - Observeer de punt van de elektrode onder de confocale laser scanning-microscoop met de 488 nm-laser. Test vervolgens de kleurstof ejectie door de stimulator bij 12 V in te schakelen. Let op een grote fluorescerende kleurstof wolk rond de punt van de elektrode terwijl de stimulator is ingeschakeld. Als er geen of weinig kleurstof wordt uitgeworpen bij spannings stimulatie, vervangt u de elektrode.
- Onder het heldere veld verlaagt u langzaam de elektrode naar het segment dat net boven het oppervlak stopt.
- Vul de astrocyten met iontoforese.
- Identificeer astrocyten 40 − 50 μm onder het segment oppervlak met het infrarood differentieel interferentie contrast (IR-DIC). Zoek naar cellen met langwerpige, ovaal vormige somata met een diameter van 10 μm. Als een astrocyten is gekozen, verplaats deze dan naar het midden van het gezichtsveld.
Opmerking: Een goede cel voor Iontoforese heeft duidelijke, gedefinieerde randen eromheen. Kies geen cellen te dicht bij het oppervlak van het segment omdat ze niet volledig kunnen worden gevuld. Het duurt een paar dagen om routinematig astrocyten te kunnen identificeren voor het vullen van kleurstoffen. Afhankelijk van het hersengebied dat voor het experiment wordt gebruikt, kan het aantal astrocyten variëren. Dit kan van invloed zijn op de tijd die nodig is om een astrocyten te identificeren voor het vullen. - Verlaag langzaam de elektrode punt in het segment, navigeer door het weefsel, totdat het zich op hetzelfde vlak bevindt als het cellichaam.
Opmerking: Verplaats de elektrode langzaam om beschadiging van het weefsel te voorkomen. - Zodra het cellichaam van de astrocyten duidelijk zichtbaar en geschetst is, gaat de elektrode langzaam en voorzichtig naar voren. Verplaats de elektrode totdat de punt het SOMA van de cel vertrotst. Beweeg de focus van de doelstelling langzaam omhoog en omlaag om te noteren of de elektrode zich in het SOMA bevindt.
Opmerking: De elektrode punt moet in het cellichaam zitten en er moet een kleine inkeping op het SOMA worden waargenomen. Verplaats de elektrode niet verder om te voorkomen dat de punt door de cel gaat. - Zodra de elektrodentip zich in de cel bevindt, schakelt u de stimulator in op ~ 0,5 − 1 V en verwijdert u de stroom continu in de cel. Bekijk de celvulling met behulp van de confocale Microscoop. Verhoog de digitale zoom om de details van de cel te zien en zorg ervoor dat de punt van de elektrode zichtbaar is in de cel.
Opmerking: Verlaag de spanning als blijkt dat de kleurstof uit de cel lekt of andere cellen in de omgeving vult. Als blijkt dat de kleurstof nog steeds uit de cel lekt, trek de elektrode dan langzaam uit en zoek een andere cel. Het is belangrijk dat de kleurstof niet lekt om een hoge signaal/achtergrond verhouding in het uiteindelijke beeld te hebben. - Wacht ongeveer 15 minuten totdat de fijnere takken en processen zijn gedefinieerd, schakel de spanning uit en trek de elektrode punt voorzichtig uit de cel.
- Identificeer astrocyten 40 − 50 μm onder het segment oppervlak met het infrarood differentieel interferentie contrast (IR-DIC). Zoek naar cellen met langwerpige, ovaal vormige somata met een diameter van 10 μm. Als een astrocyten is gekozen, verplaats deze dan naar het midden van het gezichtsveld.
- Afbeelding van de gevulde cel.
Opmerking: Imaging kan onmiddellijk worden uitgevoerd na het vullen of na kleuring met immunohistochemie. Een doel met een hoger numeriek diafragma (NA) resulteert in een betere resolutie.- Wacht tot de cel terugkeert naar de oorspronkelijke vorm voordat Imaging (15 − 20 min) met 40x doelstelling. Als u de cel wilt afbeelselen, past u de instelling op het confocale aan om ervoor te zorgen dat de fijnere vertakkingen en processen worden gedefinieerd.
- Stel een z-stack in met een stapgrootte van 0,3 μm. Verplaats de doelstelling tijdens Imaging, totdat er geen signaal van de cel is en stel deze in als de bovenkant. Verplaats de doelstelling vervolgens naar beneden (scherpstellen via de cel) totdat er geen signaal is, stel dat in als de onderkant.
- Nadat de Imaging is voltooid, controleert u de elektrode voor het uitwerpen van de kleurstof. Als een grote kleurstof wolk wordt weergegeven, kan deze worden gebruikt voor het volgende segment. Anders, vervang het door een nieuwe elektrode.
Opmerking: Kleurstof vulling van een enkele astrocyten en beeldvorming duurt ongeveer 45 min tot 1 uur. Voor dit specifieke experiment was het mogelijk om ongeveer 3 − 6 cellen per muis te verkrijgen. Indien nodig kunnen meerdere cellen op hetzelfde segment worden gelabeld. Om echter individuele astrocyten te onderscheiden, moet u een afstand van ongeveer 200 μm tussen cellen behouden.
6. kleuring met immunohistochemie (optioneel)
- Zodra de beeldvorming is voltooid, plaatst u het segment onmiddellijk in 10% formaline op ijs om te behouden voor immunohistochemie. Houd hersen schijfjes in het donker en bewaar 's nachts bij 4 °C.
- Was hersen secties 3x in 0,1 M PBS met 0,5% nonionische oppervlakteactieve stof (d.w.z. Triton X 100) gedurende 5 min elk. Inbroed vervolgens in een blokkerende oplossing van 0,1 M PBS met 0,5% nietionogene oppervlakteactieve stof en 10% normaal geiten serum (NGS) voor 1 uur bij kamertemperatuur met zachte opwinding.
- Inbroed de secties met agitatie in primaire antilichamen verdund in 0,1 M PBS met 0,5% nietionogene oppervlakteactieve stof en 5% ngs gedurende 2 dagen bij 4 °c.
Opmerking: Vanwege de dikte van de hersen schijfjes moet de incubatieperiode van de primaire antilichamen worden verlengd voor een betere penetratie en kan de antilichaam concentratie worden verhoogd. In dit experiment werd een 1:500-verdunning gebruikt voor anti-GFAP-antilichaam en een 1:500 verdunning werd gebruikt voor anti aquaporin-4-antilichamen. - Was de secties 3x in 0,1 m PBS met 0,5% nietionogene oppervlakteactieve stof gedurende 10 min elk en vervolgens inbroed met secundaire antilichamen verdund in 0,1 m PBS met 0,5% nonionische oppervlakteactieve stof en 10% ngs voor 6 uur bij kamertemperatuur.
Opmerking: Kies niet voor een secundair antilichaam opgewonden door 488 nm, wat de golflengte is die wordt gebruikt om de LY-kleurstof te visualiseren. In dit experiment, een 1:1000 verdunning werd gebruikt voor Alexa Fluor 546 geit anti-kip IgG (H + L) en Alexa Fluor 647 geit anti-konijn IgG (H + L). - Spoel de secties 3x in 0,1 M PBS gedurende 10 min elk. Monteer vervolgens de secties op glazen Microscoop-dia's in montage media die geschikt zijn voor fluorescentie. Afdichting dia's. Beeld cellen bij een stapgrootte van 0,3 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De in deze studie gerapporteerde gegevens zijn van 7 − 12 cellen van 4 muizen in elk experiment. De gemiddelde gegevens worden in de deelvensters waar nodig gerapporteerd.
Om de morfologie van astrocyten te beoordelen, voerden we intracellulaire Iontoforese uit met behulp van LY Dye om astrocyten te vullen in het CA1 stratum radiatum, dat wordt samengevat in Figuur 1. Figuur 2 toont een representatieve astrocyten en de uitgebreide morfologische structuur. De cel werd na fixatie met de 60x olie Dompel lens op een confocale laser scanning microscoop met behulp van de 488 nm Laser lijn (stapgrootte van 0,3 μm en 3,0 − 3.5 x digitale zoom) afgebeeld. De fotomultiplicator buis (PMT), offset, en Gain functies van de confocale Microscoop werden aangepast om een hoge signaal/achtergrond verhouding in het uiteindelijke beeld te creëren. In Figuur 2Atonen enkele optische vlak beelden uit verschillende z-stappen (afgebeeld op elke 10 μm, gelabeld in volgorde van 1 − 6) het centrale Soma en een aantal belangrijke takken die in een dicht netwerk van processen zijn onderverdeeld. Door het genereren van een projectie met maximale intensiteit (stackgrootte van 85 μm) hebben we een gedetailleerd beeld gezien van de structuur van de Astrocyt en zijn domein (Figuur 2B). Ook de belangrijkste componenten van de structuur van de astrocyten zijn genoteerd. Figuur 2 C toont een zoom in (X4) maximale intensiteit projectie van een belangrijke tak, verschillende secundaire takken, en de verdeling van de omringende vertakkingen en folders.
Morfologische analyses en reconstructies van astrocyten werden uitgevoerd met Imaris analyse software (tabel van de materialen) met behulp van de post-fixatie beelden van ly-filled astrocyten (andere software zoals imagej kan ook worden gebruikt). Nadat de reconstructie van elke astrocyten voltooid was, werden de volumes van het SOMA, grote takken, processen en territorium gekwantificeerd. Het SOMA werd eerst gemaakt met een oppervlak smoothing ingesteld op de x-y vlak resolutie limiet (0,25 μm). De minimale object diameter werd ingesteld op 3,0 μm om andere objecten te verwijderen die niet geassocieerd zijn met het cellichaam. Om de belangrijkste takken te creëren, werd de intensiteit van het SOMA gemaskeerd, vanwege de helderheid ten opzichte van de rest van de cel. De oppervlakte vloeiendheid en de minimale object diameter van de grote takken werden ingesteld op 0,3 μm (z-vlak stapgrootte). Om de processen te creëren werd ook de intensiteit van de grote takken gemaskeerd. De oppervlakte vloeiendheid werd ingesteld op 0,18 μm en de minimale object diameter was ingesteld op 0,3 μm. Het grondgebied van de astrocyten werd gecreëerd met een lagere intensiteits drempel en een oppervlakte verzachting ingesteld op 0,75 μm. Figuur 3a toont het originele beeld van een Ca1-astrocyten. Het cellichaam, de belangrijkste takken, de processen en het territorium volume dat door de astrocyten wordt omsloten, worden gereconstrueerd in Figuur 3B-E. Nadat de reconstructies van de cellen werden gecreëerd, werden de volumes van het SOMA, de gehele cel en het territorium gekwantificeerd en werd het aantal grote takken geteld (tabel 1). CA1 astrocyten uit het stratum radiatum hadden een gemiddeld Soma-volume van 488,91 μm3, gemiddelde van ~ 7 primaire takken, gemiddelde celvolume van 5,58 x10 3 μm3en gemiddeld gebied volume van 2,94 x 104 μm3.
De goed gekenmerkte astrocyten marker, GFAP, is een cytoskelet-eiwit dat de tussenliggende filamenten van een astrociet8etiquette. Nadat astrocyten kleurstof gevuld waren, voerden we immunokleuring voor GFAP uit om expressie in individuele astrocyten te visualiseren (Figuur 4). We constateerden dat GFAP werd uitgedrukt in de cel Soma, belangrijke takken en enkele secundaire takken van astrocyten, maar niet in de fijnere takken en processen (Figuur 4A). Er werd geen significant verschil gevonden in het aantal primaire takken gelabeld door GFAP en die door LY gevisualiseerd (p = 0,1573; Figuur 4 B). het celgebied en het volume van de door GFAP gelabelde astrocyten waren significant kleiner dan het gebied en het volume dat met ly werd gevisualiseerd (p < 0,0001; Figuur 4 C, D). Dit toont aan dat GFAP een betrouwbare marker is voor het labelen van belangrijke takken, maar is niet nuttig voor het bepalen van het totale gebied of volume van de cel.
Een belangrijk kenmerk van astrocyten is hun endfeet, die contact met de bloedvaten en worden voorgesteld om te helpen reguleren van de bloedtoevoer in het CZS. Om de ruimtelijke relatie tussen astrocyten en hersen vasculatuur verder te begrijpen, bevlekt we met antilichamen tegen aquaporin-4 volgende kleurstof vulling. Aquaporin-4 is een waterkanaal eiwit gevonden op astrocyten en Ependymale cellen, en wordt sterk uitgedrukt in gebieden in de buurt van ventrikels en bloedvaten15. We ontdekten dat aquaporin-4 wordt uitgedrukt op astrocyten endfeet in de nabijheid van hersen vasculatuur (Figuur 5A). De afbeelding toont drie astrociet endfeet die contact opnemen met een bloedvat op verschillende locaties (aangegeven door de witte pijlen). In de CA1 stratum radiatum was het gemiddelde aantal eind voeten per astrocyten ~ 2 (Figuur 5B). Belangwekkend, de takken met endfeet waren aanzienlijk dikker dan de andere primaire takken van de astrocyten, met behulp van de belangrijkste tak reconstructies (p = 0,0038; Figuur 5 C). we gemeten ook de lengte van de takken met endfeet van het centrum van het SOMA naar het bloedvat en vergeleken dat met het kortste, directe pad naar het bloedvat. De werkelijke lengte van de takken aan het bloedvat was significant groter dan het kortste pad (p = 0,0333; Figuur 5 D), wat suggereert dat deze takken de neiging hebben om een langere, gesloten route naar het bloedvat te nemen. Film 1 toont een film van een reconstructie van een ly-filled astrociet en aquaporin-4 kleuring. De verschillende structurele componenten van de astrocyten (SOMA, grote takken, processen en grondgebied) zijn in drie dimensies vertegenwoordigd. De ly-filled astrociet samen met de aquaporin-4 kleuring verbeelden de uiteinden van de astrocyten die het bloedvat omcirkelen. Van de reconstructie van de belangrijkste takken en het bloedvat, kunnen de takken die endfeet bevatten worden gevisualiseerd van het SOMA naar het vat.
In de voorgaande secties, waar p-waarden worden gerapporteerd, gebruikten we een ongepaarde student t-toets, met betekenis bij p < 0,05.
Figuur 1: diagram van de workflow in ly iontforesis. Schematische weergave van het protocol waarin de kritieke stappen worden gemarkeerd. Nadat de muis geperfectionteerd werd met fixatief, werd de hersenen ontleed. Na een korte post-fixatie periode werden coronale secties met een vibratome gesneden. Elektrode werd aangevuld met 1,5% LY kleurstof. Astrocyten werden geïdentificeerd in de CA1 stratum radiatum met behulp van IR-DIC op een lichte Microscoop. Het SOMA van de cel werd door de elektrode gespietst en de kleurstof werd in de cel geïnjecteerd door 0,5 − 1 V toe te passen totdat de fijnere processen volledig waren gevuld. Het segment werd afgebeeld met confocale microscopie met behulp van een 40x water onderdompeling lens en vervolgens verwerkt voor immunohistochemie. Verdere beeldvorming werd voltooid met een 60x olie Dompel lens om celreconstructie en morfologische analyse uit te voeren. Weergegeven is een voorbeeld reconstructie van de processen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: ly-gevulde astrocyten van Ca1 stratum radiatum. A) enkele optische vlak beelden van een astrocyten die elke 10 μm worden weergegeven (gelabeld 1 − 6). B) maximale projectie van de astrocyten, met de cel Soma, een aantal belangrijke takken, en talrijke processen waaruit het bossige gebied bestaat. (C) maximale projectie (zoom X4) van één belangrijke tak (van de in geel omlijnde sectie), twee secundaire takken, verschillende branchets en de organisatie van de omringende processen. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: reconstructie van een duidelijk gevulde astrocyten en de componenten ervan. A) Ca1-Astrocyt gevuld met ly. (B-E) Driedimensionale reconstructie van de Soma (B), Soma en belangrijke takken (C), processen (D) en grondgebied (E) bij 0 ° en 45 ° oriëntatie. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: GFAP-immunokleuring in ly-gevulde astrocyten. A) representatieve z-projectie van ly (Green) en GFAP (magenta) kleuring. GFAP wordt voornamelijk uitgedrukt in de primaire en sommige secundaire takken van de astrocyten, maar werd niet gevonden binnen het gehele astrocyten gebied. Schaalbalk = 10 μm.B) grafiek van het aantal primaire takken met het label ly en GFAP. C) het celgebied dat wordt aangeduid met ly en GFAP-kleuring. D) celvolume aangeduid met ly en GFAP-kleuring. Open cirkels zijn onbewerkte gegevens met gesloten vierkantjes die duiden op gemiddelde ± SEM. gegevens werden verzameld uit 12 cellen van 4 muizen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: aquaporin-4-immunokleuring in ly-gevulde astrocyten. A) representatieve z-projectie van ly-(groene) en aquaporin-4-kleuring (magenta). Aquaporin-4 wordt voornamelijk uitgedrukt in de eind voeten van de astrocyten. Witte pijlen duiden de drie eind voeten aan als ze contact opnemen met een nabijgelegen bloedvat. Schaal staaf = 10 μm.B) aantal takken met eind voeten per astrocyten. C) de dikte van de takken met eind voeten in vergelijking met de andere primaire takken van astrocyten. D) lengte van takken met eind voeten in vergelijking met de kortste weg naar het bloedvat. Open cirkels zijn onbewerkte gegevens met gesloten vierkantjes die duiden op gemiddelde ± SEM. gegevens werden verzameld uit 7 cellen van 4 muizen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Film 1: reconstructie van een ly-filled astrociet en aquaporin-4 kleuring. Representatieve film van een CA1 astrocyten in de nabijheid van een bloedvat. De Soma, grote takken, processen en grondgebied werden gereconstrueerd om de morfologie van de cel te analyseren. De reconstructie van de belangrijkste takken samen met aquaporin-4 verbeelden twee astrociet endfeet direct contact op met het bloedvat. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
| Morfologische kenmerken | Gemiddelde ± SEM |
| SOMA-volume (μm3) | 489 ± 30 |
| Aantal primaire vertakkingen | 7,0 ± 0,5 |
| Celvolume (μm3) | 5580 ± 425 |
| Gebied volume (μm3) | 29391 ± 8150 |
| Aantal cellen | 14 |
Tabel 1: morfologische analyse van de astrocyten structuur. Het astrocyten Soma-volume, het aantal primaire takken per astrocyten, het celvolume van de astrocyten en het door het gebied van de astrocyten ingesloten volume worden weergegeven. Gegevens werden verzameld uit 14 cellen van 7 muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in dit artikel beschreven methode beschrijft een manier om de morfologie van astrocyten te visualiseren met behulp van intracellulaire iontforese van LY Dye in licht vaste hersen sneden. Er zijn verschillende kritische factoren die in dit protocol worden benadrukt en die bijdragen aan een succesvolle, zeer Iontoforese en morfologische reconstructie van de cellen. Een factor is de kwaliteit en reproduceerbaarheid van de beelden, die grotendeels wordt bepaald door de leeftijd van de muis en de uitkomst van de perfusie. In deze studie gebruikten we C57/BL6N muizen 6 − 8 weken oud. Een succesvolle perfusie (sterk afhankelijk van de juiste plaatsing van de perfusing naald en opgemerkt door een wit-gekleurd brein en afwezigheid van bloed in de hersen-vasculatuur) is nodig voor de meest gedetailleerde en duidelijk gevulde cellen. Na impalement door een elektrode, moet het celmembraan een strakke afdichting rond de punt van de elektrode houden en voorkomen dat de kleurstof uit lekt. Ondanks de beste inspanningen zullen soms andere structuren buiten de cel worden gevuld terwijl de pipet door hersenweefsel wordt gevorderd: we hebben deze cellen uit de analyse uitgesloten. De weerstand van de elektroden is een extra belangrijke factor. De hoge weerstand maakt alleen een gestage uitwerpen van de kleurstof van de elektrode Tip bij spannings stimulatie mogelijk. Technisch gezien is het belangrijk om zachte, langzame bewegingen te handhaven wanneer het SOMA van de cel met de elektrode wordt gespietst. Elektrode penetratie door de cel kan leiden tot kleurstof lekkage uit het SOMA. Een geslaagde impalement gevolgd door een spannings toepassing moet resulteren in bijna onmiddellijke vulling van het cellichaam en de processen (d.w.z. binnen enkele seconden). De tijd die nodig is om een astrocyten volledig te vullen, is gerelateerd aan het gebied dat het omvat; echter, wachten om ervoor te zorgen dat de fijnere processen zijn volledig gevuld (ten minste 15 min).
We vonden dit protocol een meest getrouwe manier om de morfologie van astrocyten in detail te bestuderen, niettemin heeft de methode zijn beperkingen. Het identificeren van een cel kan tijdrovend en foutgevoelig zijn. Onder IR-DIC moet men onderscheidende kenmerken identificeren die het specifieke celtype (SOMA-vorm en-grootte) markeren. Als alternatief, de uitdrukking van rode fluorescerende verslaggevers specifiek in astrocyten, door virale injectie of een transgene muis reporter lijn, maakt het mogelijk om deze cellen gemakkelijker te identificeren voordat ze worden gevuld. Ook is LY beperkt als een cytosolische kleurstof omdat het niet kan worden gebruikt voor het labelen van het membraan van de astrocyten, in vergelijking met labels met een membraan-tethered GFP, zoals lck-GFP16. Lck-GFP zou een nauwkeurigere representatie van het gehele grondgebied geven, aangezien ly Iontoforese het inwendige volume van een astrocyten onthult. Echter, afhankelijk van het experimentele ontwerp, is ly Iontoforese beter geschikt om het gehele interne astrocyten volume op te lossen, driedimensionale reconstructies te ontwikkelen en de anatomische componenten van een astrocyten structuur te kwantificeren6 . Tot slot, zoals bij alle vormen van confocale microscopie, ruimtelijke resolutie wordt beperkt door diffractie, genoteerd als de punt spread functie van de Microscoop optiek17. Het wijzigen van componenten van het beeldvormings systeem, zoals het verkleinen van de pinhole diameter, zal de beelden helpen verbeteren, maar de echte resolutie wordt bepaald door de golflengte van het licht en het numerieke diafragma van de objectief lens. In ons geval schatten we de best mogelijke resolutie waarschijnlijk rond 300 nm, wat waarschijnlijk slechter zal zijn in de z-as.
LY Iontoforese biedt verschillende voordelen ten opzichte van andere veelgebruikte methoden om astrocyten te labelen. Het protocol kan worden toegepast in elk vastgesteld muismodel, celpopulatie of hersenregio18,19,20 omdat het niet wordt beperkt door een specifieke promotor van de astrocyten of een transgene muis lijn. Genetische benaderingen voor het uitdrukken van fluorescerende eiwitten die alomtegenwoordig zijn in astrocyten door virale injecties of transgene muis reporter lijnen (d.w.z. TD-tomaat) vereisen het gebruik van een astrocyten promotor, die in sommige regio's kan worden uitgedrukt in andere celtypen of niet Neem alle astrocyten21op. LY iontforesis is ook tijd-efficiënt, als virale injecties van fluorescerende eiwitten vereisen chirurgie en tijd om het specifieke virus uit te drukken, en transgene muis lijnen vereisen fokken. Ten slotte is ly-Iontoforese een nuttige methode om afzonderlijke cellen te onderscheiden, terwijl andere strategieën ook moeten worden gecombineerd met een methode voor verspreide labeling om de gebieden van individuele astrocyten te visualiseren22,23, 24. Geen enkele methode is echter een wondermiddel en de keuze die gebruikt wordt, moet worden afgestemd op de specifieke vraag die wordt behandeld.
Toekomstige studies kunnen specifieke experimentele manipulaties gebruiken en verschillende componenten van de astrocyten structuur (SOMA, takken, processen, territorium, enz.) onderzoeken om morfologische vragen te beantwoorden. Dit zou inzicht en richting kunnen geven in de morfologie van de astrocyten en de functionele implicaties ervan, die verder geanalyseerd kunnen worden door super resolution Lichtmicroscopie of elektronenmicroscopie4. Bijvoorbeeld, LY iontforesis biedt een middel om te visualiseren van fijne astrocyten processen, die contact maken met duizenden synapsen en zijn betrokken bij synaptische functies. Bestuderen hoe de structuur van deze processen verandert in verschillende pathologische omstandigheden kan helpen om de rollen van astrocyten in gezondheid en ziekte te verhelderende. LY Iontoforese is een belangrijke techniek om gedetailleerde celmorfologie te visualiseren en eigenschappen van astrocyten te karakteriseren om hun functies in het centrale zenuwstelsel beter te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken MS. Soto, Dr. Yu, en Dr. Octeau voor begeleiding, evenals opmerkingen over de tekst. Dit werk wordt ondersteund door NS060677.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
References
- Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
- Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
- Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
- Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
- Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
- Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
- Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
- Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
- Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
- Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
- Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
- Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
- Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
- Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
- Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
- Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).
