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Neuroscience

Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Luzifer gelben Iontophorese

doi: 10.3791/60225 Published: September 14, 2019

Summary

Astrozyten sind morphologisch komplexe Zellen, die durch ihre vielfältigen Prozesse und buschigen Territorien veranschaulicht werden. Um ihre aufwendige Morphologie zu analysieren, präsentieren wir ein zuverlässiges Protokoll, um intrazelluläre Luzifer gelbe Iontophorese in leicht fixiertem Gewebe durchzuführen.

Abstract

Astrozyten sind wesentliche Bestandteile neuronaler Schaltkreise. Sie kacheln das gesamte zentrale Nervensystem (ZNS) und sind an einer Vielzahl von Funktionen beteiligt, die Neurotransmitter Clearance, Ionenregulierung, synaptische Modulation, metabolische Unterstützung für Neuronen, und Blutflussregulierung gehören. Astrozyten sind komplexe Zellen, die ein Soma, mehrere Hauptzweige und zahlreiche feine Prozesse haben, die verschiedene zelluläre Elemente innerhalb des Neuropils kontaktieren. Um die Morphologie von Astrozyten zu beurteilen, ist es notwendig, eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zu haben, um ihre Struktur zu visualisieren. Wir berichten über ein zuverlässiges Protokoll zur intrazellulären Iontophorese von Astrozyten mit fluoreszierendem Luzifergelb (LY) Farbstoff in leicht fixiertem Hirngewebe von erwachsenen Mäusen. Diese Methode hat mehrere Funktionen, die nützlich sind, um Astrozytenmorphologie zu charakterisieren. Es ermöglicht eine dreidimensionale Rekonstruktion einzelner Astrozyten, die nützlich ist, um morphologische Analysen zu verschiedenen Aspekten ihrer Struktur durchzuführen. Die Immunhistochemie kann zusammen mit der LY-Iontophorese auch genutzt werden, um die Wechselwirkung von Astrozyten mit verschiedenen Komponenten des Nervensystems zu verstehen und die Expression von Proteinen innerhalb der markierten Astrozyten zu bewerten. Dieses Protokoll kann in einer Vielzahl von Mausmodellen von ZNS-Störungen implementiert werden, um die Astrozytenmorphologie mit Lichtmikroskopie streng zu untersuchen. Die LY-Iontophorese bietet einen experimentellen Ansatz zur Bewertung der Astrozytenstruktur, insbesondere im Zusammenhang mit Verletzungen oder Krankheiten, bei denen diese Zellen signifikante morphologische Veränderungen erfahren sollen.

Introduction

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Astrozyten sind die am häufigsten vorkommenden Gliazellen im Zentralnervensystem (ZNS). Sie spielen Rollen in Ionenhomöostase, Blutflussregulation, Synapse-Bildung sowie Elimination, und Neurotransmitter Aufnahme1. Das breite Spektrum der Astrozytenfunktionen spiegelt sich in ihrer komplexen morphologischen Struktur2,3wider. Astrozyten enthalten mehrere primäre und sekundäre Zweige, die sich in Tausende von feineren Zweigen und Flugblättern teilen, die direkt mit Synapsen, Dendriten, Axonen, Blutgefäßen und anderen Gliazellen interagieren. Astrozytenmorphologie variiert zwischen verschiedenen Hirnregionen, was auf ihre Fähigkeit hindeuten kann, ihre Funktionen differenziell in neuronalen Schaltkreisen auszuführen4. Darüber hinaus sind Astrozyten dafür bekannt, ihre Morphologie während der Entwicklung, während physiologischer Bedingungen und in mehreren Krankheitszuständen3,5,6zu verändern.

Eine konsistente, reproduzierbare Methode ist erforderlich, um die Komplexität der Astrozytenmorphologie genau aufzulösen. Traditionell wurde die Immunhistochemie verwendet, um Astrozyten mit der Verwendung von astrozytenspezifischen oder astrozytenangereicherten Proteinmarkern zu visualisieren. Diese Methoden zeigen jedoch eher das Muster der Proteinexpression als die Struktur der Astrozyten. Die häufig verwendeten Marker, wie z.B. glialfibrilläres saures Protein (GFAP) und S100 Calciumbindungsprotein (S100), drücken nicht im gesamten Zellvolumen aus und lösen somit keine vollständige Morphologie7. Genetische Ansätze zur Expressfluoreszenzproteine in Astrozyten (virale Injektionen oder transgene Mausreporterlinien) können die feineren Zweige und das gesamte Territorium identifizieren. Es ist jedoch schwierig, einzelne Astrozyten zu unterscheiden, und Analysen können durch die Astrozytenpopulation verzerrt werden, die vom spezifischen Promotor angestrebt wird8. Serial section electron microscopy wurde verwendet, um ein detailliertes Bild der Wechselwirkungen von Astrozytenprozessen mit Synapsen zu enthüllen. Aufgrund der Tausenden von Astrozytenprozessen, die synapses kontaktieren, ist es derzeit nicht möglich, eine ganze Zelle mit dieser Technik9zu rekonstruieren, obwohl dies sich mit dem Einsatz von Machine Learning-Ansätzen für die Datenanalyse ändern dürfte.

In diesem Bericht konzentrieren wir uns auf ein Verfahren zur Charakterisierung von Mausastrozyten mit intrazellulärer Iontophorese mit Luzifergelb (LY) Farbstoff, am Beispiel des CA1-Stratum-Radiatums. Die Methode basiert auf bahnbrechenden Arbeiten von Eric Bushong und Mark Ellisman10,11. Astrozyten aus leicht fixierten Hirnscheiben werden durch ihre unverwechselbare Soma-Form identifiziert und mit LY gefüllt. Die Zellen werden dann mit konfokaler Mikroskopie abgebildet. Wir zeigen, wie LY-Iontophorese verwendet werden kann, um einzelne Astrozyten zu rekonstruieren und detaillierte morphologische Analysen ihrer Prozesse und gebiete durchzuführen. Auch kann diese Methode in Verbindung mit der Immunhistochemie angewendet werden, um räumliche Beziehungen und Wechselwirkungen zwischen Astrozyten und Neuronen, anderen Gliazellen und Gehirnvaskulatur zu identifizieren. Wir betrachten LY Iontophorese als ein sehr geeignetes Werkzeug, um Morphologie in verschiedenen Hirnregionen und Mausmodelle von gesunden oder Krankheitszuständen7,12,13zu analysieren.

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Protocol

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Die Tierversuche in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit dem National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt und vom Animal Research Committee der Kanzlerin an der University of California, Los Angeles, genehmigt. Erwachsene Mäuse (6-8 Wochen alt) mit gemischtem Geschlecht wurden in allen Experimenten verwendet.

1. Lösungsvorbereitung

  1. Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) Lösung
    1. Bereiten Sie frische ACSF-Lösung (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 14,7 mM NaHCO3, 11 mM D-Glucose, 1,25 mM Na2HPO4und 2 mM CaCl2) vor jedem Experiment vor. Fügen Sie im letzten Schritt MgCl2 und CaCl2 hinzu. Lösen Sie die Komponenten in hochwertigem entionisiertem Wasser auf.
    2. Inkubieren Sie die ACSF-Lösung bei 35 °C in einem Wasserbad und Blasen mit 95%O2/ 5%CO2 für mindestens 30 min vor dem Experiment.
    3. Fügen Sie 2% Lidocainhydrochlorid hinzu, um eine Endkonzentration von 0,02% in ACSF (in 100 ml) zu erreichen.
  2. Fixative Lösung
    1. Verwenden Sie 10% formalin gepuffertes Phosphat.
  3. LY Farbstofflösung
    1. 1,5% LY-Farbstofflösung vorbereiten, indem Sie LY CH Dilithiumsalz oder LY CH Dikaliumsalz in 5 mM KCl. Vortex gründlich auflösen. Für mehrere Experimente reicht ein Volumen von 1 ml aus.
    2. Zentrifuge für 10 min bei 16.800 x g. Filtern Sie dann den Überstand mit einem 0,2-m-Spritzenfilter in ein neues Rohr. Aliquots können bis zu 3 Monate bei 4 °C aufbewahrt werden.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Farbstofflösung zentrifugieren und filtern, um eine Aggregation der Farbstoffpartikel zu verhindern, die die Elektrode verstopfen können.

2. Maus transkardiale Perfusion und Gehirndissektion

  1. Vorbereitung von Geräten und Maus für die transkardiale Perfusion
    HINWEIS:
    C57/BL6-Mäuse beiderlei Geschlechts können verwendet werden. Es wurde empirisch beobachtet, dass es für eine zuverlässige Arbeit der Methode wichtig ist, dass die Mäuse nicht älter als 3 Monate sind (6-8 Wochen alt ist ideal). Das Perfusionsprotokoll wird unten beschrieben. Eine zusätzliche Referenz ist für weitere Details14angegeben.
    1. Klare Perfusionsschläuche mit ACSF-Lösung, um Luftblasen in der Leitung zu entfernen. Einrichten von Operationswerkzeugen in der Reihenfolge der Anwendung (Pinzette, gekrümmte, stumpfe Schere, Irisschere).
    2. Die Maus tief anästhesieren, indem sie sie in eine Isofluran-Induktionskammer legt, nachdem man der Kammer 2 x 3 ml Isofluran hinzugefügt hat. Lassen Sie 1 x 2 min für anästhetische Wirkung wirksam werden. Stellen Sie sicher, dass die Atmung nicht aufhört.
    3. Testen Sie auf Zehenkneifreflex. Fahren Sie fort, wenn die Maus nicht auf Schmerzreize reagiert und der Reflex fehlt. Sichern Sie das Tier in der Rückenlage mit dem Kopf in den Atemkegel mit einer Zufuhr von 5% Isofluran in Sauerstoff und die Gliedmaßen und Schwanz in einer chemischen Rauchhaube verklebt.
  2. Transkardiale Perfusion
    1. Mit einer Pinzette die Haut unter dem Rippenkäfig heben. Machen Sie einen 5 x 6 cm Schnitt mit der gekrümmten, stumpfen Schere durch die Haut, um die Bauchhöhle freizulegen. Schneiden Sie nach oben durch die Bauchwand, bis Leber und Zwerchfell sichtbar sind.
    2. Bewegen Sie die Leber vorsichtig vom Diagramm weg. Mit einer Irisschere einen seitlichen Einschnitt in der Membran von 3 x 4 cm machen.
    3. Schneiden Sie durch den Rippenkäfig entlang der beiden Seiten des Körpers, um die Brusthöhle freizulegen. Achten Sie darauf, das Herz nicht zu schädigen und die Lunge zu vermeiden. Heben Sie das Brustbein nach oben, um das Herz freizulegen.
    4. Sobald das Herz sichtbar ist, injizieren Sie 0,05 ml Heparin-Natriumlösung (1.000 USP pro ml) als Antikoagulans in den linken Ventrikel. Dann perfusion Nadel vorsichtig in den linken Ventrikel einfügen. Stellen Sie sicher, dass die Nadel im Ventrikel verbleibt und nicht in andere Herzkammern durchdringt. Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Atrium mit Irisschere.
    5. Durchdringen Sie mit ACSF-Lösung mit einer Rate von ca. 10 ml/min, bis die flüssigkeitserhaltende Flüssigkeit von Blut gereinigt wird (1 x 2 min).
    6. Wechseln Sie von der ACSF-Lösung zur fixativen Lösung, ohne Luftblasen einzuführen. Perfuse mit fixativer Lösung für 10 min bei 10 x 20 ml/min.
      ACHTUNG: Achten Sie darauf, dass keine fixative Lösung aus der Nase abfließt. Dies deutet darauf hin, dass die Nadel den rechten Ventrikel erreicht hat und das Fixativ in die Lunge und nicht durch den systemischen Kreislauf zum Rest des Körpers wandert.
  3. Zerlegung des Gehirns
    1. Entfernen Sie den Kopf der Maus mit einer Schere und sezieren Sie vorsichtig das Maushirn aus dem Schädel. In fixative Lösung für 1,5 h bei Raumtemperatur für eine kurze Nachfixierungszeit platzieren.
      HINWEIS: Eine gute Perfusion ist für eine erfolgreiche LY-Iontophorese notwendig. Gehirn sollte weiß gefärbt sein und fehlt Blut in Gehirn Vaskulatur. Körper und Gliedmaßen sollten steif erscheinen.

3. Scheibenvorbereitung

  1. Zubereitung von Hippocampusscheiben
    1. Waschen Sie das Gehirn mit 0,1 M Phosphat gepufferte Saline (PBS) bei Raumtemperatur für 5 min. Dann trocknen Sie das Gehirn mit Filterpapier aus und entfernen Sie die Olfaktor-Lampe und Kleinhirn mit einer scharfen Rasierklinge.
    2. Montieren Sie das Gehirn auf dem Vibram-Tablett mit Cyanoacrylatkleber und füllen Sie das Fach mit PBS bei Raumtemperatur. Schneiden Sie hippocampale koronale Abschnitte von 110 m Dicke.
      HINWEIS: Passen Sie die Einstellung des Vibratom an, um sicherzustellen, dass die Scheiben die gleiche Dicke und gleichmäßige Oberfläche haben. Für dieses Experiment wurden eine Geschwindigkeitseinstellung von 4,5 und eine Frequenzeinstellung von 8 verwendet, die beliebige Einstellungen auf dem Instrument sind (Tabelle der Materialien). Benutzer müssen möglicherweise mit den Einstellungen auf anderen Geräten experimentieren.
    3. Sammeln Sie die Abschnitte aus dem Tablett und legen Sie in einer Schüssel von PBS auf Eis.

4. Elektrodenvorbereitung

  1. Bereiten Sie eine scharfe Elektrode mit entsprechendem Widerstand vor.
    1. Verwenden Sie eine Borosilikatglas-Einfasselektrode mit Filament (O.D. 1,0 mm, I.D. 0,58 mm). Ziehen Sie eine Elektrode auf einem Mikropipette-Puller (Tisch der Materialien). Ideale Elektroden, die mit 1,5% LY in 5 mM KCl gefüllt sind, sollten einen Widerstand von 200 M a haben, wenn sie in ein PBS-Bad gelegt werden.
      HINWEIS: Die Pullereinstellung variiert je nach Gerät (Typ der verwendeten Maschine und Puller-Filament). Eine höhere Wärmeeinstellung gibt in der Regel längere und feinere Spitzen. Für den mikropipette Puller, der in diesem Experiment verwendet wurde, waren die Einstellungen: Hitze: 317, Ziehen: 90, Geschwindigkeit: 70 und Verzögerung: 70. Es wurde ein Trog-Filament verwendet.
    2. Elektroden in einem geschlossenen Behälter aufbewahren, um zu verhindern, dass Staub in die Spitze gelangt. Halten Sie Elektroden von der Unterseite der Box erhöht, um zu verhindern, dass die Spitze bricht.
  2. Füllen Sie die Elektrode mit LY Farbstofflösung.
    1. Platzieren Sie eine Elektrode in vertikaler Position mit der Spitze nach unten. Pipette 1-2 l LY-Lösung in die Rückseite der Elektrode und warten Sie 5 x 10 min, bis die Lösung über Kapillarwirkung zur Spitze bewegt wird.
    2. Sichern Sie die gefüllte Elektrode vorsichtig im Elektrodenhalter, der mit einem Manipulator verbunden ist.
      HINWEIS: Der Silberdraht des Elektrodenhalters muss mit dem LY innerhalb der Elektrode in Kontakt sein. Passen Sie die Lautstärke der LY-Lösung bei Bedarf an, abhängig von der Drahtlänge.

5. Füllen von Astrozyten mit Iontophorese

  1. Testen Sie die Elektrode.
    1. Legen Sie eine Gehirnscheibe vorsichtig in eine Glasbodenschale, gefüllt mit 0,1 M PBS bei Raumtemperatur. Halten Sie die Scheibe mit einer Platinharfe mit Nylonsaiten an Ort und Stelle.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Elektrode mit einer Spannungsquelle verbunden ist, und legen Sie die Bodenelektrode in das Bad, das die Gehirnscheibe enthält.
    3. Verschieben Sie das Ziel in die Voninteressee des Gehirns.
    4. Senken Sie die Elektrode in die Lösung. Unter dem hellen Feld, bewegen Sie es in die Mitte des Sichtfeldes und untersuchen Sie es sorgfältig mit der 40x Wasser-Immersion-Linse, um sicherzustellen, dass es klar und ohne Schmutz oder Blasen erscheint. Wenn es etwas gibt, das die Elektrodenspitze verstopft, ersetzen Sie sie durch eine neue.
      HINWEIS: Verstopfung ist ein Problem für die 200-M-Elektrode. Bei Zentrifugierung und Filtration der Farbstofflösung vor jedem Experiment sollte dies kein häufiges Problem sein. Da die Spitze der Elektrode jedoch klein ist, kann Gewebe manchmal in der Öffnung stecken bleiben. Die Autoren haben keinen Weg gefunden, dies zu verhindern, aber es kann leicht durch die Verwendung einer neuen Elektrode behandelt werden.
    5. Beobachten Sie die Spitze der Elektrode unter dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit dem 488 nm Laser. Dann testen Sie den Farbstoffauswurf, indem Sie den Stimulator bei 12 V einschalten. Beachten Sie eine große fluoreszierende Farbwolke um die Spitze der Elektrode, während der Stimulator eingeschaltet ist. Wenn bei der Spannungsstimulation kein oder weniger Farbstoff ausgeworfen wird, ersetzen Sie die Elektrode.
    6. Unter dem hellen Feld, senken Sie langsam die Elektrode in Richtung der Scheibe, die knapp über der Oberfläche anhält.
  2. Füllen Sie Astrozyten mit Iontophorese.
    1. Identifizieren Sie Astrozyten 40 x 50 m unter der Schnittfläche mit dem Infrarot-Differentialinterferenzkontrast (IR-DIC). Suchen Sie nach Zellen mit langgestreckter, ovaler Somata mit einem Durchmesser von ca. 10 m. Sobald ein Astrozyten ausgewählt wurde, verschieben Sie es in die Mitte des Sichtfeldes.
      HINWEIS: Eine gute Zelle für die Iontophorese hat klare, definierte Grenzen um sie herum. Wählen Sie Zellen nicht zu nah an der Oberfläche des Slices aus, da sie nicht vollständig gefüllt werden können. Es dauert einige Übung über ein paar Tage, um in der Lage zu sein, routinemäßig Astrozyten für die Färberei zu identifizieren. Je nach dem für das Experiment verwendeten Hirnbereich kann die Anzahl der Astrozyten variieren. Dies kann sich auf die Zeit auswirken, die benötigt wird, um eine Astrozyten vor dem Füllen zu identifizieren.
    2. Senken Sie langsam die Elektrodenspitze in die Scheibe, navigieren sie durch das Gewebe, bis sie sich auf der gleichen Ebene wie der Zellkörper befindet.
      HINWEIS: Bewegen Sie die Elektrode langsam, um eine Beschädigung des Gewebes zu vermeiden.
    3. Sobald der Zellkörper der Astrozyten deutlich sichtbar und umrissen ist, bringen Sie die Elektrode langsam und sanft voran. Bewegen Sie die Elektrode, bis die Spitze das Soma der Zelle aufspießt. Bewegen Sie den Fokus des Objektivs langsam nach oben und unten, um zu beachten, ob sich die Elektrode im Inneren des Soma befindet.
      HINWEIS: Die Elektrodenspitze muss sich im Zellkörper befinden, und es sollte eine kleine Einbuchtung des Soma beobachtet werden. Bewegen Sie die Elektrode nicht weiter, um zu vermeiden, dass die Spitze durch die Zelle geht.
    4. Sobald sich die Elektrodenspitze innerhalb der Zelle befindet, schalten Sie den Stimulator bei 0,5 bis 1 V ein und leiten kontinuierlich Strom in die Zelle aus. Beobachten Sie mit dem konfokalen Mikroskop die Zellfüllung. Erhöhen Sie den digitalen Zoom, um die Details der Zelle zu sehen, und stellen Sie sicher, dass die Spitze der Elektrode innerhalb der Zelle sichtbar ist.
      HINWEIS: Senken Sie die Spannung, wenn es scheint, dass Farbstoff aus der Zelle austritt oder andere Zellen in der Nähe füllt. Wenn es scheint, dass Farbstoff immer noch aus der Zelle austritt, ziehen Sie die Elektrode langsam heraus und finden Sie eine andere Zelle. Es ist wichtig, dass der Farbstoff nicht austritt, um ein hohes Signal-Hintergrund-Verhältnis im endgültigen Bild zu haben.
    5. Warten Sie ca. 15 min, bis die feineren Zweige und Prozesse definiert erscheinen, schalten Sie die Spannung aus und ziehen Sie die Elektrodenspitze vorsichtig aus der Zelle.
  3. Bild der gefüllten Zelle.
    HINWEIS:
    Die Bildgebung kann unmittelbar nach dem Füllen oder nach der Färbung mit Derimmunhistochemie durchgeführt werden. Ein Ziel mit einer höheren numerischen Blende (NA) führt zu einer besseren Auflösung.
    1. Warten Sie, bis die Zelle zur ursprünglichen Form zurückkehrt, bevor Sie sich (15-20 min) mit 40-fachem Objektiv abbilden. Um die Zelle abzubilden, passen Sie die Einstellung auf dem Konfokland an, um sicherzustellen, dass die feineren Verzweigungen und Prozesse definiert erscheinen.
    2. Richten Sie einen Z-Stack mit einer Schrittgröße von 0,3 m ein. Bewegen Sie das Objektiv während der Bildgebung so lange, bis kein Signal von der Zelle gegeben ist, und legen Sie es als Oberseite fest. Dann bewegen Sie das Ziel nach unten (Fokussierung durch die Zelle), bis es kein Signal gibt, stellen Sie das als unten.
    3. Überprüfen Sie nach Abschluss der Bildgebung die Elektrode auf Farbstoffauswurf. Wenn eine große Farbstoffwolke erscheint, kann sie für das nächste Segment verwendet werden. Andernfalls ersetzen Sie es durch eine neue Elektrode.
      HINWEIS: Die Farbfüllung einer einzelnen Astrozyten- und Bildgebung dauert etwa 45 min bis 1 h. Für dieses spezifische Experiment war es möglich, etwa 3-6 Zellen pro Maus zu erhalten. Bei Bedarf können mehrere Zellen auf demselben Slice beschriftet werden. Um jedoch einzelne Astrozyten zu unterscheiden, achten Sie darauf, einen Abstand von etwa 200 m zwischen den Zellen zu halten.

6. Färbung mit Immunhistochemie (optional)

  1. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, legen Sie die Scheibe sofort in 10% Formalin auf Eis, um für die Immunhistochemie zu erhalten. Gehirnscheiben im Dunkeln aufbewahren und über Nacht bei 4 °C lagern.
  2. Waschen Sie Hirnabschnitte 3x in 0,1 M PBS mit 0,5% nichtionischem Tensid (d. h. Triton X 100) für jeweils 5 min. Dann in einer Blockierlösung von 0,1 M PBS mit 0,5% nichtionischem Tensid und 10% normalem Ziegenserum (NGS) für 1 h bei Raumtemperatur mit sanfter Rührung inkubieren.
  3. Inkubieren Sie die Abschnitte mit Rührung in primären Antikörpern, die in 0,1 M PBS mit 0,5% nichtionischem Tensid und 5% NGS für 2 Tage bei 4 °C verdünnt werden.
    HINWEIS: Aufgrund der Dicke der Gehirnscheiben muss die Inkubationszeit der primären Antikörper für eine bessere Penetration verlängert und die Antikörperkonzentration erhöht werden. In diesem Experiment wurde eine Verdünnung von 1:500 für Anti-GFAP-Antikörper und eine 1:500-Verdünnung für Anti-Aquaporin-4-Antikörper verwendet.
  4. Waschen Sie die Abschnitte 3x in 0,1 M PBS mit 0,5% nichtionischem Tensid für jeweils 10 min und inkubieren Sie dann mit sekundären Antikörpern, die in 0,1 M PBS mit 0,5% nichtionischem Tensid und 10% NGS für 6 h bei Raumtemperatur verdünnt werden.
    HINWEIS: Wählen Sie keinen sekundären Antikörper, der von 488 nm angeregt wird, was der Wellenlänge entspricht, die zur Visualisierung des LY-Farbstoffs verwendet wird. In diesem Experiment wurde eine 1:1.000 Verdünnung für Alexa Fluor 546 Ziegenanti-Huhn IgG (H+L) und Alexa Fluor 647 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) verwendet.
  5. Spülen Sie die Abschnitte 3x in 0,1 M PBS für je 10 min. Dann montieren Sie die Abschnitte auf Glasmikroskop-Dias in Montagemedien, die für die Fluoreszenz geeignet sind. Siegel gleitet. Bildzellen mit einer Schrittgröße von 0,3 m.

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Representative Results

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Die in dieser Studie berichteten Daten stammen aus 7 bis 12 Zellen von 4 Mäusen in jedem Experiment. Die durchschnittlichen Daten werden gegebenenfalls in den Abbildungspanels gemeldet.

Um die Astrozytenmorphologie zu bewerten, führten wir eine intrazelluläre Iontophorese mit LY-Farbstoff durch, um Astrozyten im CA1-Stratum-Radiatum zu füllen, die in Abbildung 1zusammengefasst ist. Abbildung 2 zeigt eine repräsentative Astrozyten und ihre ausgeklügelte morphologische Struktur. Die Zelle wurde nach der Fixierung mit der 60-fachen Öl-Tauchlinse auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit der 488 nm Laserlinie (Schrittgröße von 0,3 m und 3,0 x 3,5x Digitalzoom) abgebildet. Die Photomultiplierröhrchen (PMT), Offset- und Verstärkungsfunktionen des Konfokalmikroskops wurden angepasst, um im Endbild ein hohes Signal-Hintergrund-Verhältnis zu erzeugen. In Abbildung 2Azeigen einzelne optische Ebenenbilder aus verschiedenen Z-Schritten (alle 10 m, in der Reihenfolge von 1 bis 6) das zentrale Soma und mehrere Hauptzweige, die sich in ein dichtes Prozessnetz aufteilen. Durch die Erzeugung einer maximalen Intensitätsprojektion (Stapelgröße von 85 m) beobachteten wir eine detaillierte Ansicht der Struktur der Astrozyten und ihrer Domäne (Abbildung 2B). Die Hauptkomponenten der Astrozytenstruktur wurden ebenfalls erwähnt. Abbildung 2 C zeigt eine Zoom-In(x4) maximale Intensitätsprojektion eines Hauptzweigs, mehrerer sekundärer Zweige und die Verteilung der umgebenden Verzweigungen und Faltblätter.

Morphologische Analysen und Rekonstruktionen von Astrozyten wurden mit der Imaris-Analysesoftware (Tabelle der Materialien) mit den Post-Fixationsbildern von LY-gefüllten Astrozyten durchgeführt (andere Software wie ImageJ könnte ebenfalls verwendet werden). Nach Abschluss der Rekonstruktion jedes Astrozyten wurden die Volumina des Soma, die wichtigsten Zweige, Prozesse und das Territorium quantifiziert. Das Soma wurde zuerst mit einer Oberflächenglättung erstellt, die auf die x-y-Ebenenauflösungsgrenze (0,25 m) eingestellt ist. Der minimale Objektdurchmesser wurde auf 3,0 m festgelegt, um andere Objekte zu entfernen, die nicht mit dem Zellkörper verknüpft sind. Um die Hauptzweige zu erstellen, wurde die Intensität des Soma maskiert, aufgrund seiner Helligkeit relativ zum Rest der Zelle. Die Oberflächenglättung und der minimale Objektdurchmesser der Hauptzweige wurden auf 0,3 m (z-Ebenenschrittgröße) eingestellt. Um die Prozesse zu erstellen, wurde auch die Intensität der Hauptzweige maskiert. Die Oberflächenglättung wurde auf 0,18 m und der minimale Objektdurchmesser auf 0,3 m eingestellt. Das Gebiet der Astrozyten wurde mit einer niedrigeren Intensitätsschwelle und Oberflächenglättung auf 0,75 m erstellt. Abbildung 3A zeigt das Originalbild einer CA1-Astrozyten. Der Zellkörper, die Hauptzweige, die Prozesse und das von der Astrozyten eingeschlossene Gebietsvolumen sind in Abbildung 3B-Erekonstruiert. Nachdem die Rekonstruktionen der Zellen erstellt wurden, wurden die Volumina des Soma, der gesamten Zelle und des Territoriums quantifiziert und die Anzahl der Hauptzweige gezählt (Tabelle 1). CA1-Astrozyten aus dem Stratum radiatum hatten ein durchschnittliches Somavolumen von 488,91 m3, durchschnittlich 7 Primärzweige, ein durchschnittliches Zellvolumen von 5,58 x 103 m3und ein durchschnittliches Gebietsvolumen von 2,94 x 104 m3.

Der gut charakterisierte Astrozytenmarker GFAP ist ein Zytoskelettprotein, das die Zwischenfilamente eines Astrozyten8beschriftet. Nachdem Astrozyten gefärbt wurden, führten wir eine Immunfärbung für GFAP durch, um die Expression in einzelnen Astrozyten zu visualisieren (Abbildung 4). Wir fanden heraus, dass GFAP in dem Zellsoma, den Hauptzweigen und einigen sekundären Zweigen von Astrozyten exprimiert wurde, aber nicht in den feineren Zweigen und Prozessen (Abbildung 4A). Es wurde kein signifikanter Unterschied bei der Anzahl der durch GFAP gekennzeichneten Primärzweige und der durch LY visualisierten Zweigen (p = 0,1573; Abbildung 4 B). Die Zellfläche und das Volumen des mit GFAP beschrifteten Astrozyten waren deutlich kleiner als die mit LY visualisierte Fläche und das Volumen (p < 0.0001; Abbildung 4 C,D). Dies zeigt, dass GFAP ein zuverlässiger Marker für die Kennzeichnung wichtiger Zweige ist, aber nicht nützlich ist, um die Gesamtfläche oder das Volumen der Zelle zu bestimmen.

Ein wichtiges Merkmal von Astrozyten sind ihre Endfüße, die mit Blutgefäßen in Kontakt treten und vorgeschlagen werden, den Blutfluss im ZNS zu regulieren. Um die räumliche Beziehung zwischen Astrozyten und Gehirnvaskulatur weiter zu verstehen, haben wir nach der Farbfüllung Antikörper gegen Aquaporin-4 gefärbt. Aquaporin-4 ist ein Wasserkanalprotein, das auf Astrozyten und ependymen Zellen gefunden wird und in Gebieten in der Nähe von Ventrikeln und Blutgefäßen stark exprimiert wird15. Wir fanden heraus, dass Aquaporin-4 auf Astrozyten-Endfüßen in unmittelbarer Nähe zur Gehirnvaskulatur exprimiert wird (Abbildung 5A). Das Bild zeigt drei Astrozyten-Endfüße, die an verschiedenen Stellen mit einem Blutgefäß in Berührung kommen (angezeigt durch die weißen Pfeile). Im CA1-Stratum-Radiatum betrug die durchschnittliche Anzahl der Endfüße pro Astrozyten 2 (Abbildung 5B). Interessanterweise waren die Zweige, die Endfüße enthielten, deutlich dicker als die anderen Primärzweige der Astrozyten, mit den wichtigsten Zweigrekonstruktionen (p = 0,0038; Abbildung 5 C). Wir haben auch die Länge der Zweige mit Endfüßen vom Zentrum des Soma bis zum Blutgefäß gemessen und diese mit dem kürzesten, direkten Weg zum Blutgefäß verglichen. Die tatsächliche Länge der Zweige zum Blutgefäß war signifikant größer als der kürzeste Weg (p = 0,0333; Abbildung 5 D), was darauf hindeutet, dass diese Zweige dazu neigen, einen längeren, kreisförmigen Weg zum Blutgefäß zu nehmen. Film 1 zeigt einen Film über eine Rekonstruktion einer LY-gefüllten Astrozyten- und Aquaporin-4-Färbung. Die verschiedenen Strukturkomponenten der Astrozyten (Soma, Hauptzweige, Prozesse und Territorium) sind in drei Dimensionen dargestellt. Die LY-gefüllte Astrozyten bilden zusammen mit der Aquaporin-4-Färbung die Astrozyten-Endfüße, die das Blutgefäß umgeben. Von der Rekonstruktion der Hauptzweige und des Blutgefäßes können die Äste, die Endfüße enthalten, visualisiert werden, die sich vom Soma bis zum Gefäß erstrecken.

In den vorhergehenden Abschnitten, in denen p-Werte gemeldet werden, haben wir einen nicht gepaarten Schüler-t-Test mit Signifikanz bei p < 0,05 verwendet.

Figure 1
Abbildung 1: Diagramm des Workflows in der LY-Iontophorese. Schematische Darstellung des Protokolls, das die kritischen Schritte hervorhebt. Nachdem die Maus mit Fixativ durchsetzt war, wurde das Gehirn seziert. Nach einer kurzen Nachfixierungsphase wurden koronale Abschnitte mit einem Vibratom geschnitten. Die Elektrode wurde mit 1,5% LY-Farbstoff verfüllt. Astrozyten wurden im CA1-Stratum-Radiatum mit IR-DIC auf einem Lichtmikroskop identifiziert. Das Soma der Zelle wurde durch die Elektrode aufgespießt, und Farbstoff wurde in die Zelle injiziert, indem 0,5-1 V aufgebracht wurden, bis die feineren Prozesse vollständig gefüllt waren. Die Scheibe wurde mit konfokaler Mikroskopie mit einer 40-fachen Wassertauchlinse abgebildet und dann für die Immunhistochemie verarbeitet. Die weitere Bildgebung wurde mit einer 60-fachen Öl-Tauchlinse zur Zellrekonstruktion und morphologischen Analyse vervollständigt. Gezeigt wird ein Beispiel für die Rekonstruktion der Prozesse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: LY-gefüllte Astrozyten von CA1-Stratum radiatum. (A) Einzelne optische Ebenenbilder eines Astrozyten, die alle 10 m gezeigt werden (mit der Bezeichnung 1 x 6). (B) Maximale Projektion der Astrozyten, die das Zellsoma, mehrere Hauptzweige und zahlreiche Prozesse, die sein buschiges Gebiet bilden, darstellen. (C) Maximale Projektion (Zoom x4) eines Hauptzweigs (aus gelb umrissenem Abschnitt), zwei sekundären Zweigen, mehreren Branchen und der Organisation der umgebenden Prozesse. Maßstabsleiste = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Rekonstruktion einer LY-gefüllten Astrozyten und ihrer Komponenten. (A) CA1-Astrozyten gefüllt mit LY. (B-E) Dreidimensionale Rekonstruktion des Soma (B), soma und der Hauptzweige (C), Prozesse (D) und Desland (E) bei 0° und 45° Ausrichtung. Maßstabsleiste = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: GFAP-Immunostainierung in LY-gefüllten Astrozyten. (A) Repräsentative z-Projektion der LY -Färbung (grün) und GFAP (Magenta). GFAP wird in erster Linie in den primären und einigen sekundären Zweigen der Astrozyten ausgedrückt, wurde aber nicht innerhalb des gesamten Astrozytengebiets gefunden. Skala bar = 10 m. (B) Diagramm der Anzahl der primären Zweige, die durch LY und GFAP beschriftet sind. (C) Zellbereich, der durch LY- und GFAP-Färbung bezeichnet wird. (D) Zellvolumen, bezeichnet durch LY- und GFAP-Färbung. Offene Kreise sind Rohdaten mit geschlossenen Quadraten, die auf den Mittelwert von SEM hinweisen. Daten wurden aus 12 Zellen von 4 Mäusen gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Aquaporin-4-Immunostainierung in LY-gefüllten Astrozyten. (A) Repräsentative z-Projektion von LY (grün) und Aquaporin-4 Färbung (Magenta). Aquaporin-4 wird hauptsächlich in den Endfüßen der Astrozyten ausgedrückt. Weiße Pfeile bezeichnen die drei Endfüße, wenn sie ein nahe gelegenes Blutgefäß kontaktieren. Skala bar = 10 m. (B) Anzahl der Zweige mit Endfüßen pro Astrozyten. (C) Dicke der Zweige mit Endfüßen im Vergleich zu den anderen primären Zweigen von Astrozyten. (D) Länge der Zweige mit Endfüßen im Vergleich zum kürzesten Weg zum Blutgefäß. Offene Kreise sind Rohdaten mit geschlossenen Quadraten, die auf den Mittelwert von SEM hinweisen. Daten wurden aus 7 Zellen von 4 Mäusen gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Movie 1
Film 1: Rekonstruktion einer LY-gefüllten Astrozyten- und Aquaporin-4-Färbung. Repräsentativer Film einer CA1-Astrozyten in der Nähe eines Blutgefäßes. Das Soma, die Hauptzweige, Prozesse und das Gebiet wurden rekonstruiert, um die Morphologie der Zelle zu analysieren. Die Rekonstruktion der Hauptzweige zusammen mit Aquaporin-4 zeigt zwei Astrozyten-Endfüße, die direkt mit dem Blutgefäß in Kontakt stehen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)

Morphologische Merkmale Mittelwert - SEM
Soma-Volumen (m3) 489 x 30
Anzahl der Primärzweige 7,0 x 0,5
Zellvolumen (m3) 5580 bei 425
Gebietsvolumen (m3) 29391 bei 8150
Anzahl der Zellen 14

Tabelle 1: Morphologische Analyse der Astrozytenstruktur. Das Astrozyten-Soma-Volumen, die Anzahl der Primärzweige pro Astrozyten, das Volumen der Astrozytenzellen und das vom Astrozytengebiet umschlossene Volumen werden angezeigt. Die Daten wurden von 14 Zellen von 7 Mäusen gesammelt.

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Discussion

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Die in diesem Artikel beschriebene Methode beschreibt eine Möglichkeit, die Astrozytenmorphologie mit intrazellulärer Iontophorese von LY-Farbstoff in leicht fixierten Gehirnscheiben zu visualisieren. Es gibt mehrere kritische Faktoren, die in diesem Protokoll hervorgehoben werden, die zu einer erfolgreichen LY-Iontophorese und morphologischen Rekonstruktion der Zellen beitragen. Ein Faktor ist die Qualität und Reproduzierbarkeit der Bilder, die weitgehend durch das Alter der Maus und das Ergebnis der Perfusion bestimmt wird. In dieser Studie verwendeten wir C57/BL6N-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen. Eine erfolgreiche Perfusion (in hohem Maße abhängig von der richtigen Platzierung der durchdringenden Nadel und festgestellt durch ein weiß gefärbtes Gehirn und Das Fehlen von Blut in der Vaskulatur des Gehirns) ist für die detailliertesten und klar gefüllten Zellen notwendig. Nach dem Aufspießen durch eine Elektrode sollte die Zellmembran eine enge Abdichtung um die Spitze der Elektrode halten und das Austreten von Farbstoffen verhindern. Trotz aller Bemühungen werden gelegentlich andere Strukturen außerhalb der Zelle gefüllt, da die Pipette durch Hirngewebe vorgereicht wird: Wir haben diese Zellen von der Analyse ausgeschlossen. Ein weiterer Schlüsselfaktor ist der Widerstand der Elektroden. Der hohe Widerstand ermöglicht nur einen stetigen Auswurf von Farbstoff aus der Elektrodenspitze bei Spannungsstimulation. Technisch gesehen ist es wichtig, sanfte, langsame Bewegungen beizubehalten, wenn das Soma der Zelle mit der Elektrode aufgespießt wird. Das Eindringen der Elektroden durch die Zelle kann zu Farbstofflecks aus dem Soma führen. Eine erfolgreiche Aufhellung gefolgt von Spannungsanwendung sollte zu einer nahezu sofortigen Färbefüllung des Zellkörpers und der Prozesse (d.h. innerhalb weniger Sekunden) führen. Die Zeit, die benötigt wird, um eine Astrozyten vollständig zu füllen, hängt mit dem Gebiet zusammen, das sie umfasst; Warten Sie jedoch, bis die feineren Prozesse vollständig gefüllt sind (mindestens 15 min).

Wir fanden dieses Protokoll eine sehr treue Möglichkeit, Astrozytenmorphologie im Detail zu studieren, dennoch hat die Methode ihre Grenzen. Das Identifizieren einer Zelle kann zeitaufwändig und fehleranfällig sein. Unter IR-DIC sollte man Unterscheidungsmerkmale identifizieren, die den spezifischen Zelltyp kennzeichnen (Soma-Form und -Größe). Alternativ ermöglicht die Expression roter fluoreszierender Reporter speziell in Astrozyten, durch virale Injektion oder eine transgene Mausreporterlinie eine einfachere Identifizierung dieser Zellen vor demFüllen. Außerdem ist LY als zytosolischer Farbstoff begrenzt, da es nicht verwendet werden kann, um die Astrozytenmembran zu beschriften, im Vergleich zur Beschriftung mit einem membrangebundenen GFP, wie Lck-GFP16. Lck-GFP würde eine genauere Darstellung des gesamten Gebietsgebiets geben, da die LY-Iontophorese das innere Volumen eines Astrozyten enthüllt. Je nach experimentellem Design ist die LY-Iontophorese jedoch besser geeignet, das gesamte interne Volumen der Astrozyten zu lösen, dreidimensionale Rekonstruktionen zu entwickeln und die anatomischen Komponenten zu quantifizieren, aus denen die Struktur eines Astrozyten besteht6 . Schließlich, wie bei allen Formen der konfokalen Mikroskopie, wird die räumliche Auflösung durch Beugung begrenzt, die als Punktausbreitungsfunktion der Mikroskopoptik 17 bezeichnetwird. Das Ändern von Komponenten des Bildgebungssystems, wie z. B. die Verringerung des Lochdurchmessers, wird dazu beitragen, die Bilder zu verbessern, aber die wahre Auflösung wird durch die Wellenlänge des Lichts und die numerische Blende der Objektivlinse bestimmt. In unserem Fall schätzen wir, dass die bestmögliche Auflösung wahrscheinlich bei etwa 300 nm liegt, was in der Z-Achse wahrscheinlich schlechter sein wird.

LY Iontophorese bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen häufig verwendeten Methoden zur Kennzeichnung von Astrozyten. Das Protokoll kann in jedem etablierten Mausmodell, Zellpopulation oder Hirnbereich18,19,20 angewendet werden, da es nicht durch einen astrozytenspezifischen Promotor oder eine transgene Mauslinie begrenzt ist. Genetische Ansätze zur Expressausdrücke fluoreszierender Proteine, die in Astrozyten durch virale Injektionen oder transgene Mausreporterlinien (d. h. td-Tomato) allgegenwärtig sind, erfordern die Verwendung eines Astrozytenpromotors, der in einigen Regionen in anderen Zelltypen exprimiert werden kann oder nicht. alle Astrozytenenthalten 21. Die LY-Iontophorese ist auch zeiteffizient, da virale Injektionen fluoreszierender Proteine eine Operation und Zeit erfordern, um das spezifische Virus auszudrücken, und transgene Mauslinien erfordern Zucht. Schließlich ist die LY-Iontophorese eine nützliche Methode, um einzelne Zellen zu unterscheiden, während andere Strategien auch mit einer Methode zur spärlichen Etikettierung kombiniert werden müssten, um die Territorien einzelner Astrozyten zu visualisieren22,23, 24. Allerdings ist keine einzige Methode ein Allheilmittel, und die Wahl, von der sie verwendet wird, muss auf die spezifische Frage zugeschnitten werden, die behandelt wird.

Zukünftige Studien können spezifische experimentelle Manipulationen anwenden und verschiedene Komponenten der Astrozytenstruktur (Soma, Zweige, Prozesse, Territorium usw.) untersuchen, um morphologische Fragen zu beantworten. Dies könnte Einblicke und Richtungen in die Astrozytenmorphologie und ihre funktionellen Implikationen geben, die durch Superauflösungslichtmikroskopie oder Elektronenmikroskopie4weiter analysiert werden könnten. Zum Beispiel bietet die LY-Iontophorese eine Möglichkeit, feine Astrozytenprozesse zu visualisieren, die Tausende von Synapsen kontaktieren und an synaptischen Funktionen beteiligt sind. Die Untersuchung, wie sich die Struktur dieser Prozesse in verschiedenen pathologischen Bedingungen verändert, könnte helfen, die Rolle von Astrozyten in Gesundheit und Krankheit aufzuklären. LY Iontophorese ist eine wichtige Technik, um detaillierte Zellmorphologie zu visualisieren und Astrozyteneigenschaften zu charakterisieren, um ihre Funktionen im zentralen Nervensystem besser zu verstehen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren danken Frau Soto, Dr. Yu und Dr. Octeau für die Anleitung sowie Kommentare zum Text. Diese Arbeit wird von NS060677 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Buffered Formalin Phosphate Fisher SF 100-20 An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane Pall 4692 An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet WPI EP2 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) Thermo Scientific A-11040 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Scientific A27040 A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody Novus Biologicals NBP1-87679 A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody Abcam ab4674 A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament World precision instruments 1B150F-4
C57BL/6NTac mice Taconic Stock B6 A similar alternative can be used
Calcium Chloride Sigma 21108 An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000MPE A similar alternative can be used
D-glucose Sigma G7528 An identical alternative can be used
Disodium Phosphate Sigma 255793 An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97 Sutter P-97 A similar alternative can be used
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) Sagent Pharmaceuticals 400-10 An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5) Bitplane Inc. A similar alternative can be used
Isofluorane Henry Schein Animal Health 29404 An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) Clipper 1050035 An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt Sigma L0144
Magnesium Chloride Sigma M8266 An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass Thermo Scientific 24X60-1 An identical alternative can be used
Microscope Slides Fisher 12-544-2 An identical alternative can be used
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000 An identical alternative can be used
Objective lens (40x) Olympus LUMPLFLN 40XW A similar alternative can be used
Objective lens (60x) Olympus PlanAPO 60X A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL VWR VWRVE404 An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200 Sutter MP-285 / ROE-200 / MPC-200 A similar alternative can be used
Potassium Chloride Sigma P3911 An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 An identical alternative can be used
Sodium Chloride Sigma S5886 An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010 World precision instruments Omnical 2010 A similar alternative can be used
Triton X 100 Sigma T8787 An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000 Pelco 100-S A similar alternative can be used

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References

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Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Luzifer gelben Iontophorese
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Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).More

Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).

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