在胶原蛋白诱发关节炎模型中，用于处理小鼠爪的冷冻粉碎协议，用于评估组织炎症的分子通路

Summary

开发了一种使用液氮冷冻机加工鼠爪的低温粉碎方法，以提高从组织中提取的RNA或蛋白质的产量和质量，并分析与炎症相关的分子图谱反应。

Abstract

分析局部组织的分子变化对于理解体内治疗候选者的作用机制至关重要。在关节炎研究领域，许多研究都集中在由骨、软骨、肌肉、基质细胞和免疫细胞的复杂混合物组成的发炎关节上。在这里，我们建立了一种可靠而可靠的机械方法，在低温控制的环境中将发炎的小鼠爪子干扰成均匀的粉碎样品。蛋白质和RNA解热物被加工，使蛋白质组和转录端点和分子表征相关疾病途径在局部组织。

Introduction

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性全身性炎症性疾病，关节持续对称性脊柱炎，皮肤、心脏、肺和眼睛等器官的关节外^介入1。虽然免疫反应的系统性表现在人类患者中是明显的，但RA病理学的标志之一是免疫细胞在阴膜组织中渗透和阴纤维^细胞2的增殖。

与人类RA类似，小鼠胶原蛋白诱发关节炎（CIA）模型引起强烈的组织炎症，在阴膜组织和系统隔间中产生活跃的免疫反应。不同小鼠菌株对CIA模型的易感性与主要组织相容性复合物（MHC）单倍型和抗原特异性T细胞和B细胞^{相互作用3、4。}此外，人类RA中的许多致病途径，包括自身抗体产生、免疫复合沉积、骨髓细胞活化、多关节表现和带子免疫渗透的泛鼻形成，也在这个模型中明显^5，6.调查人员已经利用这个成熟的中情局模型来调查抗炎细胞因子治疗^的效果。在中情局^模型8、9中，许多被批准用于自身免疫或炎症性疾病的生物制剂，如抗TNF®和抗IL-6，都有效。

分析免疫系统在系统组织中的相互作用对于阐明与RA的发病机制相关的分子机制至关重要。在人类临床环境中，一种常见的做法是在超声成像的指导下进行针刺活检。在临床前环境中，鼠关节的较小结构使得活检程序更加困难，如果不是不可能的话。最近，我们演示了利用鼠中情局模型来评估药物组合，以影响不同的终点和解决疾病的组合^方法10。采用低温冷冻机粉碎法，将发炎的鼠爪加工成均匀的细粉，并建立了下游工艺，以提取RNA和蛋白质。该方法保护RNA和蛋白质免受酶和化学降解过程的刺激，并使我们能够将多种分析方法应用于单一均质样品源。

Protocol

所有动物实验均按照扬森研发机构动物护理和使用委员会（IACUC）的政策进行。

1. 低温冷冻机机粉碎法

1. 在中情局的研究结束时，牺牲的小鼠有1.5%的异脱，然后是宫颈脱位。
2. 在组织处理当天，在干冰上预冷所有仪器（纸巾、磨瓶等）至少10分钟。戴上热手套，避免冻伤。
3. 切割后爪与剪刀在毛皮线如图1A所示。
4. 将每个爪子转移到一个1.5 mL微离心管中，立即在液氮中冷冻，并将冷冻爪储存在-80°C。请勿将样品冷冻超过一周。
5. 如图1B所示，将冷冻机中填充液氮，使其平衡至少 10 分钟。
6. 将未经加工的样品保存在干冰上，避免冻融周期。
7. 将一个后爪转移到带底钢塞的预冷却大型聚碳酸酯研磨瓶中，插入预冷却钢冲击器，用预冷却的顶钢塞合上聚碳酸酯研磨瓶（图1C）。
8. 将带有样品的大型聚碳酸酯研磨瓶转移到预装液体的冷冻机中，用仪器正面的橡胶扣合盖。
9. 让样品在液氮中冷却1分钟。
10. 将冷冻机设置为 1 分钟程序，每秒 10 次循环，然后按启动按钮。等待冷冻机完成其循环。
    注：当钢冲击器来回移动时，机器发出敲击声。使用耳塞避免听力损失。
11. 打开冷冻机盖，取出大型聚碳酸酯研磨瓶，并将其放入提取器中，如图1D所示。在黑色手柄上施加向下压力，直到钢塞从聚碳酸酯管中滑出，拆下顶部钢塞。
12. 将打开的大型聚碳酸酯研磨瓶转移到干冰上。用预冷却钳拆下钢冲击器。
13. 将冷冻粉末转移到预冷却的 50 mL 锥形管中。
14. 重量30-50毫克冷冻粉末放入焦油冷冻1.5 mL微离心管中，用于RNA提取和100-200毫克冷冻粉末用于蛋白质提取。
    注：冷冻粉末应看起来像白色或浅粉状细沙，如图1E所示。
15. 将粉碎样品储存在-80°C，并在24小时内进行RNA和蛋白质分离。

2. RNA提取

1. 每1mL的RLT缓冲液加入10μLβ-甲氧醇（β-ME）。
2. 计算与组织比例为23.3 mL/mg对应的RLT缓冲液的体积，并在冷冻粉末的管中加入适当的RLT缓冲液，带β-ME。这个比例被经验确定是理想的小鼠爪。
3. 在 3，000 RPM 下涡流样品 10 s。
4. 使用 1 mL 移液器大力移液 10 次，将混合良好。
5. 再次涡旋样品在3000RPM为20s。
6. 将管在 13，000 x g下离心 2 分钟。
7. 将700μL的超生物转移到新鲜的管子中，加入700μL的70%乙醇。
   注：如果 <700 μL 在管中，则可以接受继续，但仍添加相当于 70% 的乙醇。
8. 将样品的 700 μL 加载到 RNA 纯化柱上。
9. 将管在 ±10，000 x g下，30 s。
10. 放弃流通，并将样品的剩余部分加载到 RNasy 列。
11. 将管在 ±10，000 x g下，30 s。
12. 通过添加 700 μL RW1 缓冲液，离心为 ±10，000 x g 30 s，丢弃流过流并洗涤柱。如果执行选项 DNASE 消化，在 DNASE 治疗之前添加 350 μL RW1。 在DNASE处理后，再加入350μLRW1。
13. 可选） 按照制造商的说明执行 DNase 消化步骤。
14. 通过加入 500 μL 的 RPE 缓冲液，然后以 ±10，000 x g离心 30 s，将管洗两次。
15. 以 ±10，000 x g离心干燥柱 2 分钟。
16. 通过加入50 μL水，在±10，000 x g下，2分钟，收集流量并转移到新的1.5 mL管中，从而将ELute RNA注入。
17. 在进一步分析之前，使用研究人员的选择方法确定RNA的数量，并储存在-80°C。

3. 蛋白质提取

1. 使用细胞培养级水稀释1x细胞解液中1x细胞解液溶液中的10倍细胞解液。
2. 用1mL的水重组蛋白酶抑制剂鸡尾酒组I，形成100倍蛋白酶抑制剂。
3. 将100μL蛋白酶抑制剂加入1x细胞解液的9.9 mL，以制作1x最终库存溶液。
4. 每毫克组织粉（例如，800 μL的流合缓冲液至200mg组织粉）加入4μL冰冷1x细胞莱沙缓冲液。
5. 在管中加入一个 5 毫米不锈钢珠。
6. 涡旋管在3000RPM下60s.将管转移到湿冰，并继续到下一个样品。
7. 将所有样品管放入一个盒子里，在1000 RPM、4°C下摇动离心盒，1小时。
   注：研究人员可能会发现，将盒子垂直放置有助于更好地与珠子混合。
8. 在 10，000 x g和 4 °C 下离心管 15 分钟。
9. 将上生物转移到新鲜的管子中，避免顶部的脂肪层。
10. 确定蛋白质总浓度。10 至 30 倍的蛋白质解液稀释是 BCA 测试的理想选择。
11. 将样品与1.5 mL微离心管进行比分，并在-80°C下储存，然后再进行进一步分析。

Representative Results

在这里，我们展示了如图2A中从CIA小鼠前爪中提取的RNA的代表性凝胶图像可视化。28S rRNA 和 18S rRNA 波段指示所有样本都有足够的完整 RNA。接下来，在图2B中，我们根据蛋白质BCA分析，显示了总蛋白质浓度的代表性散点图。不同组下天真小鼠、CIA小鼠或中情局小鼠的总蛋白质浓度可比较。为了确定蛋白提取物中炎症细胞因子和化学因子的浓度，Luminex进行了分析。在图2C中，我们显示了标准化细胞因子和化学因子（pg/mg总蛋白）浓度的代表性散射图。与幼鼠相比，在CIA小鼠中，几种细胞因子升高，使用抗IL17A抗体治疗可显著抑制几种细胞因子的产生。为了评估中情局的转录组变化和治疗相关效果，进行了微阵列分析。在图2D中，我们发现CIA小鼠的基因热图图比天真的小鼠明显增加。

图1：粉碎鼠爪所需的设备。（A） 中情局或幼鼠的发炎或未发炎的爪子.（B） 液氮德瓦尔用于填充冷冻机的不锈钢浴。（C） 组装的冷冻机管套。（D） 冷冻机机管开瓶器。（E） 从鼠爪中粉碎的组织.请点击此处查看此图的较大版本。

图2：粉化鼠爪中蛋白质和RNA分析的代表性数据。（A） RNA完整性的凝胶图像可视化.（B） 不同组的总蛋白质浓度。（C） 来自不同组的化学素和细胞因子表达（Luminex）。（D） 不同治疗组的微阵列分析的分层聚类热图.请点击此处查看此图的较大版本。

Discussion

虽然评估阴骨组织分子通路有强有力的科学依据，但许多关于鼠CIA模型免疫分析的报告都集中在外周血上，而发炎的爪子的蛋白质和RNA分析数据则相当有限。造成这种偏差的原因有几个：鼠脚踝关节不超过±2厘米;受影响的区域包括皮肤、骨骼和结缔组织，这些组织通常难以使用传统方法，如组织磨床、刺和砂浆、硅珠破坏、三聚体或酶消化等，难以同质化。这些方法通常会导致不完全均质化、蛋白质或RNA产量低，或由于蛋白解物和核酸降解而导致质量不一致。本文描述的稳健方法提供了生成均质粉碎冷冻粉末的详细过程，使下游蛋白组和转录分析工作能够从单个均匀样本中建立疾病的分子特征源。

执行此方法时应考虑几个关键步骤。首先，在组织收获期间，应在毛皮线切割鼠爪，避免大量毛发。过量的头发会堵塞RNA提取过程中的柱，并干扰蛋白质的提取。其次，在整个过程中，管子、钳子和铲子应保存在干冰上，因为组织粉末中温度升高会迅速使材料变成无定形的"泥浆"，蛋白质和RNA的完整性也会受到损害。第三，应仔细优化用于蛋白质或RNA提取的组织粉末量。更多的组织粉末可能并不总是提供更高的产量，但可能导致下游处理的其他问题，包括堵塞RNA分离柱，改变DNase/DNA比（如果采用此步骤），以防止完全的DNA降解。最后，蛋白质和RNA输入的规范化应该是工作流程和数据分析的一个组成部分。组织负荷的可变性可以显著掩盖相对蛋白质和RNA水平的变化。除了总蛋白质或总RNA外，内务基因的表达也可以被视为正常化的锚。

通过广泛的试验和错误过程，我们已经为首次使用此方法的用户确定了一些潜在的常见问题。RNA的收率可能较低。这通常是由于过多的组织提取物使列过载。每柱的组织量和RLT/粉末的比例对于有效的RNA分离至关重要。我们发现，一些商业96井萃取试剂盒可能不适用于这一过程，因为样品不会以同等速率在柱中旋转，从而在下游洗涤和洗脱步骤中损害这些样品。在BCA分析和Luinex分析中，蛋白质浓度可能具有很高的变异性。如果 BCA 或 Luminex 工艺没有问题，则通常是由蛋白质提取物中的脂肪或其他污染物引起的。在收获蛋白质提取时，避免微离心管顶部的脂肪层或不溶性物质。这一点很重要。如果需要，重复旋转并收集上生子进行下游分析。

由于这种方法涉及专门的低温冷冻机和大量的干冰和液氮，因此应考虑采取额外的安全措施。应始终佩戴适当的个人防护设备，包括安全眼镜、实验室外套和低温手套，以防止爆炸造成潜在的冻伤和伤害。气溶胶的产生也应最小化，建议使用通风平衡外壳。最后，与处理动物组织的任何其他协议类似，应注意妥善处理所有未使用的组织样本，而可重复使用的管在清洁前需要清除。

虽然该方法与传统方法相比有许多优点，但仍存在一些局限性。来自一只鼠全爪的转录组轮廓与人类阴骨活检的转录体轮廓显著重叠（未显示数据）。来自肌肉、皮肤和骨髓的额外mRNA可以稀释来自阴膜组织的信号。另一种解决方案是通过激光微解剖收集鼠阴膜组织，可以在OCT嵌入式小鼠关节上进行。然而，低通量和相对较少的组织数量限制了激光微解剖的广泛应用。此外，即使具有显著的自动化，此方法仍然相当耗费大量人力。在3-4名调查员的帮助下，至少需要8小时处理30-60个样品。最后，此方法需要大量的液氮（处理 30-60 个样品的±10-15 L）。

在前面的方法描述中，演示了蛋白组和转录端点分析的评价。然而，其他端点，如脂质组，代谢组学和小型RNA分析可能感兴趣的更广泛的关节炎研究社区。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mm stainless steel bead	Qiagen	69989
beta-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit	Agilent	5067-1511	RNA qualification kit
b-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CI	Water
Cell lysis stock solution	Cell Signaling	9803
Eppendorf Tube	Eppendorf	22363204	Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box	Nalgene	5055	Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
Freezer Mill	Spex Sample Prep	6875	Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial	Spex Sample Prep	6801	Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Protease Inhibitors
Protein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Centrifugation
RLT Buffer	Qiagen	79216	RNA extraction buffer
RNeasy mini kit	Qiagen	74104	including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatula	VWR	10806-412	Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead	Qiagen	69989	Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor	Spex Sample Prep	6884	Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer	VWR	10153-838	Sample mixing