Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een Cryo-pulverisatie protocol voor het verwerken van muis poten voor het evalueren van moleculaire trajecten van weefsel ontsteking in een model van collageen geïnduceerde artritis

Published: October 30, 2019 doi: 10.3791/60229

Summary

Een cryogene verpulveringsmethode om muriene poten te verwerken met behulp van een vloeibare stikstof vriezer molen werd ontwikkeld om de opbrengst en kwaliteit van RNA of eiwit geëxtraheerd uit de weefsels te verbeteren en de analyse van Moleculaire profielen in verband met inflammatoire Reacties.

Abstract

Profilering van moleculaire veranderingen in lokale weefsels is van cruciaal belang om het mechanisme (s) van de therapeutische kandidaten in vivo te begrijpen. Op het gebied van artritis Research, veel studies zijn gericht op ontstoken gewrichten die zijn samengesteld uit een complex mengsel van bot, kraakbeen, spier, stromale cellen en immuuncellen. Hier hebben we een betrouwbare en robuuste mechanische methode opgezet om ontstoken muis poten te verstoren in homogene verpulverd monsters in een cryogene gecontroleerde omgeving. Eiwit en RNA lysaten werden verwerkt om Proteomic en transcriptionele eindpunten en moleculaire karakterisering van relevante ziekte trajecten in lokaal weefsel mogelijk te maken.

Introduction

Reumatoïde artritis (RA) is een chronische systemische ontstekingsziekte met aanhoudende symmetrische inflammatoire in gewrichten en extra articulaire betrokkenheid van organen zoals de huid, hart, longen en ogen1. Hoewel de systemische manifestaties van de immuunrespons duidelijk zijn bij menselijke patiënten, is een van de kenmerken van RA pathologie infiltratie van immuuncellen in synoviale weefsels en proliferatie van synoviale fibroblast-cellen2.

Net als bij Human RA, ontlokte muis collageen geïnduceerde artritis (CIA) model sterke ontsteking van het weefsel met actieve immuunresponsen in synoviale weefsels en systemische compartimenten. De gevoeligheid van verschillende muis stammen naar CIA model links naar Major histocompatibility complex (MHC) Haplotype en antigeen specifieke T cel en B celinteracties3,4. Bovendien zijn veel pathogene trajecten in menselijke RA, met inbegrip van de productie van autoantilichamen, immuun complexe depositie, myeloïde celactivering, polyarticulaire manifestaties en pannus vorming met synoviale immuuninfiltratie, ook duidelijk in dit model 5,6. Onderzoekers hebben dit gevestigde CIA-model gebruikt om de effecten van ontstekingsremmende cytokine-behandelingen te onderzoeken7. Veel Biologics die zijn goedgekeurd voor auto-immune of ontstekingsziekten, zoals anti-tnfα en anti-Il-6, bleken werkzaam te zijn in het CIA-model8,9.

Profilering van de interacties van het immuunsysteem in synoviale weefsel is cruciaal om te verhelmaken moleculaire mechanismen geassocieerd met de pathogenese van RA. In de humane klinische setting is een gebruikelijke praktijk om naald synoviale biopsieën uit te voeren onder leiding van echografie. In de preklinische instellingen maakt de kleinere architectuur van de Murine gewrichten biopsie procedures veel moeilijker, zo niet onmogelijk. Onlangs toonden we het gebruik van het Murine CIA-model om combinaties van geneesmiddelen te evalueren om verschillende eindpunten te beïnvloeden en de ziekte op te lossen in een combinatorische aanpak10. Een cryogene Vries molen gebaseerde pulverisatie methode werd gebruikt om ontstoken muriene poten te verwerken in homogene fijne poeders en stroomafwaarts processen om RNA en eiwitten te extraheren. Deze methode beschermt RNA en eiwitten tegen enzymatische en chemische degratieve processen en stelt ons in staat om meerdere analytische methoden toe te passen op een enkele gehomogeniseerde monsterbron.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met het beleid van het Comité voor de instelling van de instellingen voor dierenverzorging en-gebruik (IACUC) van Janssen R & D.

1. cryogene Vries molen-gebaseerde Verpulsing methode

  1. Bij beëindiging van de CIA-studie, offerande muizen met 1,5% Isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie.
  2. Op de dag van de weefsel verwerking, pre-chill alle instrumenten (spatels, slijpen flesjes, enz.) op droogijs voor een minimum van 10 min. Draag thermische handschoenen om bevriezing schade te voorkomen.
  3. Knip achterpoten met een schaar aan de pels lijn zoals afgebeeld in Figuur 1a.
  4. Breng elke poot in één micro centrifugebuis van 1,5 mL, klik onmiddellijk in vloeibare stikstof en bewaar bevroren poten bij-80 °C. Houd de monsters niet langer dan een week bevroren.
  5. Vul de Vries molen met vloeibaar stikstof zoals afgebeeld in Figuur 1B en laat deze ten minste 10 min.
  6. Bewaar onverwerkte monsters op droogijs en Vermijd vries dooi cycli.
  7. Breng een achterpoot in de voorgekoelde grote polycarbonaat slijp flacon met een bodem stalen plug, plaats het voorgekoelde stalen botslichaam en sluit de polycarbonaat slijp flacon met de voorgekoelde bovenste stalen plug (Figuur 1C).
  8. Breng grote polycarbonaat slijp flacons met de monsters in de Vries molen die vooraf is gevuld met vloeistof en sluit de deksel met de rubberen sluiting aan de voorkant van het instrument.
  9. Laat monsters 1 minuut afkoelen in vloeibare stikstof.
  10. Stel de Vries molen in op het 1 minuten programma met 10 cycli per seconde en druk op de startknop. Wacht tot de Vries molen zijn cyclus heeft voltooid.
    Opmerking: De machine maakt een drummen geluid als het stalen botslichaam beweegt heen en weer. Gebruik oordopjes om gehoorverlies te voorkomen.
  11. Open de deksel van de Vries molen, haal de grote polycarbonaat slijp flacon eruit en plaats deze in een afzuigkap zoals afgebeeld in Figuur 1D. Verwijder de bovenste stalen plug door neerwaartse druk op de zwarte hendel te plaatsen totdat de stalen stekker uit de polycarbonaat buis glijdt.
  12. Breng de geopende grote polycarbonaat slijp flacon over op droogijs. Verwijder het stalen botslichaam met voorgekoelde Tang.
  13. Breng het bevroren poeder over in de voorgekoelde 50 mL conische buis.
  14. Gewicht 30-50 mg bevroren poeder in een getarreerde bevroren 1,5 mL micro centrifugebuis voor RNA-extractie en 100-200 mg bevroren poeder voor EiwitExtractie.
    Opmerking: Het bevroren poeder moet er uitzien als wit of lichtroze fijn zand zoals afgebeeld in Figuur 1E.
  15. Bewaar verpulverd monsters bij-80 °C en ga binnen 24 uur naar RNA-en eiwithoudende isolaties.

2. RNA-extractie

  1. Voeg 10 μL β-mercaptoethanol (β-ME) toe per 1 mL RLT-buffer.
  2. Bereken het volume van de RLT-buffer overeenkomend met een verhouding van 23,3 mL/mg weefsel en voeg het juiste volume van de RLT-buffer met β-ME toe aan de buis met bevroren poeder. Deze ratio werd empirisch bepaald om ideaal te zijn voor muis poten.
  3. Vortex het monster bij 3.000 RPM gedurende 10 sec.
  4. Meng goed door 10 keer krachtig te pipetteren met een 1 mL pipettor.
  5. Vortex het monster opnieuw bij 3.000 RPM gedurende 20 sec.
  6. Centrifugeer de buis bij 13.000 x g gedurende 2 minuten.
  7. Breng 700 μl van de supernatanten over naar een frisse buis en voeg 700 μl 70% ethanol toe.
    Opmerking: Als < 700 μL in de buis zit, is het aanvaardbaar om verder te gaan, waarbij nog steeds een equivalent volume van 70% ethanol wordt toegevoegd.
  8. Laad 700 μL van het monster op een RNA-zuiverings kolom.
  9. Centrifugeer de buis bij ≥ 10.000 x g gedurende 30 sec.
  10. Gooi de doorstroming weg en laad het resterende deel van het monster in de RNeasy-kolom.
  11. Centrifugeer de buis bij ≥ 10.000 x g gedurende 30 sec.
  12. Gooi de stroom weg en was de kolom door toevoeging van 700 μL RW1-buffer met centrifugeren van ≥ 10.000 x g gedurende 30 sec. Bij het uitvoeren van de optie DNASE spijsvertering, wordt 350 μL van RW1 toegevoegd vóór de behandeling met DNASE.  En een extra 350 μL van RW1 wordt toegevoegd na behandeling met DNASE.
  13. Optioneel) Voer een DNase digestie stap Volg de instructies van de fabrikant.
  14. Was de buis tweemaal door toevoeging van 500 μL RPE-buffer, gevolgd door centrifugeren bij ≥ 10.000 x g gedurende 30 sec. Gooi de stroom door elke keer weg.
  15. Droog de kolom door centrifugeren bij ≥ 10.000 x g gedurende 2 min.
  16. Elute RNA door toevoeging van 50 μL water met centrifugeren bij ≥ 10.000 x g gedurende 2 min. Verzamel stroom door en breng in een nieuwe 1,5 ml buis.
  17. Bepaal de hoeveelheid RNA met behulp van de methode naar keuze van de onderzoeker en bewaar bij-80 °C vóór verdere analyse.

3. EiwitExtractie

  1. Verdun de lysis-stamoplossing met 10x cel in 1x celllysis Stock-oplossing met behulp van celcultuurgrade water.
  2. Reconstitueer de protease inhibitor cocktail set I met 1 mL water om een 100x protease remmer voorraad te maken.
  3. Voeg 100 μL proteaseremmer toe aan 9,9 mL 1x Celllysis om een 1x Final stockoplossing te maken.
  4. Voeg 4 μL ijskoud 1x Celllysisbuffer per mg weefsel poeder toe (bijv. 800 μL lysisbuffer tot 200 mg weefsel poeder).
  5. Voeg een roestvrijstalen kraal van 5 mm toe aan de buis.
  6. Vortex de buis bij 3.000 RPM voor 60 s. Breng de buis over naar nat ijs en ga verder naar het volgende monster.
  7. Plaats alle monsterbuisjes in een doos en schud de centrifuge box op een rocker bij 1.000 RPM, 4 °C gedurende 1 uur.
    Opmerking: Onderzoekers kunnen vinden dat het plaatsen van de doos verticaal kan beter mengen met de kraal te vergemakkelijken.
  8. Centrifugeer de buisjes op 10.000 x g en 4 °c gedurende 15 minuten.
  9. Breng de supernatanten over in een frisse buis en Vermijd de vetlaag bovenaan.
  10. Bepaal de totale eiwitconcentratie. 10 tot 30-voudige verdunningen van proteïne lysaat zijn ideaal voor een BCA-test.
  11. Aliquot het monster in 1,5 mL micro centrifugebuizen en bewaar bij-80 °C vóór verdere analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier tonen we een representatieve gel beeld visualisatie van RNA geëxtraheerd uit voorste poten van CIA muizen in Figuur 2a. De 28S rRNA en de 18S rRNA band geven aan dat alle monsters voldoende intact RNA hebben. Vervolgens tonen we een representatieve Scatter plot van totale eiwit concentraties op basis van eiwit BCA-analyse in Figuur 2B. De totale eiwit concentraties van naïeve muizen, CIA-muizen of CIA-muizen onder verschillende behandelingen zijn vergelijkbaar tussen groepen. Om de concentraties van inflammatoire cytokinen en chemokines in het eiwitextract te bepalen, werden luminex-analyses uitgevoerd. We tonen een representatieve Scatter plot van de concentraties van genormaliseerde cytokines en chemokines (PG/mg totaal eiwit) in Figuur 2C. In vergelijking met naïeve muizen worden verschillende cytokinen in CIA-muizen verhoogd en de behandeling met anti-IL17A antilichaam remt de productie van verschillende cytokines aanzienlijk. Om transcriptome veranderingen in CIA en behandelingsgerelateerde effecten te evalueren, werd microarray analyse uitgevoerd. We tonen een representatieve heatmap-plot van genen die significant zijn toegenomen in CIA-muizen in vergelijking met naïeve muizen in Figuur 2D.

Figure 1
Figuur 1: benodigde apparatuur voor het pulseren van muriene poten. A) ontstoken of ontstoken poten van CIA-of naïeve muizen. B) vloeibare stikstof Dewar gebruikt om het roestvrijstalen bad van de Vries molen te vullen. C) geassembleerde vriezer molen buis set. D) buis opener van de Vries molen. E) verpulverd weefsel van muriene poten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: representatieve gegevens over de analyse van eiwitten en RNA uit verpulverd muriene poten. A) gel-beeld visualisatie van RNA-integriteit. B) totale eiwit concentraties van verschillende groepen. C) Chemokine-en cytokine-expressie (luminex) uit verschillende groepen. (D) hiërarchische clustering heatmap van microarray analyse van verschillende behandelingsgroepen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hoewel er een sterke wetenschappelijke onderbouwing is om moleculaire trajecten in synoviale weefsels te evalueren, waren veel rapporten over immuun profilering van het Murine CIA-model gericht op perifeer bloed, terwijl eiwit-en RNA-analysegegevens van ontstoken poten vrij beperkt zijn. Er zijn verschillende mogelijke redenen voor deze bias: Murine enkelgewrichten zijn niet groter dan ~ 2 cm; de aangetaste gebieden bestaan uit huid, botten en bindweefsels die vaak moeilijk te homogeniseren zijn met behulp van traditionele methoden zoals weefsel slijpers, stamper en mortel, silica kraal verstoring, trituratie of enzymatische spijsvertering. Deze methoden resulteren meestal in onvolledige homogenisatie, lage eiwit-of RNA-opbrengst, of inconsistente kwaliteit als gevolg van afbraak van Proteolytische en nucleïnezuur. De hier beschreven robuuste methode biedt een gedetailleerde procedure voor het genereren van een homogeen gepulseerd bevroren poeder, zodat downstream Proteomic-en transcriptionele profilerings inspanningen kunnen worden geleverd om moleculaire handtekeningen van ziekten uit één uniform monster vast te stellen. Bron.

Bij het uitvoeren van deze methode moeten verschillende kritieke stappen worden overwogen. Ten eerste moeten de muriene poten tijdens de weefsel oogst aan de vacht lijn worden geknipt en moeten grote hoeveelheden haar worden vermeden. Overmatig haar kan kolommen verstoppen tijdens RNA-extractie en interfereren met EiwitExtractie. Ten tweede moeten buizen, Tang en spatels gedurende de hele procedure op droogijs worden gehouden omdat verhoogde temperatuur in weefsel poeders het materiaal snel in amorfe "modder" zal veranderen en de integriteit van eiwitten en RNA in het gedrang zal komen. Ten derde moet de hoeveelheid weefsel poeder die wordt gebruikt voor de extractie van eiwitten of RNA zorgvuldig worden geoptimaliseerd. Meer weefsel poeder kan niet altijd bieden hogere opbrengst, maar kan extra problemen veroorzaken in de downstream-verwerking, met inbegrip van verstopping RNA isolatie kolommen, wijzigen van de DNase/DNA-verhouding (als deze stap wordt gebruikt) om te voorkomen dat volledige DNA-degradatie. Ten slotte moet normalisering van eiwit-en RNA-input een integraal onderdeel zijn van de workflow en gegevensanalyse. Variabiliteit in weefsel belasting kan aanzienlijk veranderingen in relatieve eiwitten en RNA niveaus maskeren. Naast totaal eiwit of totaal RNA, kan expressie van huishoudelijke genen ook worden beschouwd als ankers voor normalisatie.

Door middel van uitgebreide trial and error proces, we hebben een aantal potentiële frequente problemen voor de eerste keer gebruikers van deze methode geïdentificeerd. Er kan een lage opbrengst van RNA. Dit is vaak het gevolg van overbelasting van de kolom met te veel weefsel extract. De hoeveelheid weefsel per kolom en verhouding van RLT/poeder is cruciaal voor efficiënte RNA-isolaties. We hebben geconstateerd dat sommige commerciële 96 put extractie kits niet werken voor dit proces als de monsters niet zal draaien door de kolom in een gelijkwaardig tempo, dus afbreuk te doen aan deze monsters in downstream wassen en elutie stappen. Er kan een hoge variabiliteit in eiwitconcentratie in BCA-analyse en cytokine concentraties in luminex-analyse zijn. Als er geen problemen zijn met de BCA of het luminex-proces, wordt dit meestal veroorzaakt door vet of andere verontreinigingen in het eiwitextract. Het is belangrijk om te voorkomen dat de vetlaag aan de bovenkant of onoplosbare materie aan de onderkant van de micro centrifugebuizen bij het oogsten voor EiwitExtractie. Indien nodig, herhaal de spin en verzamel supernatanten voor downstream analyse.

Aangezien deze methode een gespecialiseerde cryogene Vries molen en grote hoeveelheden droogijs en vloeibare stikstof omvat, moeten aanvullende veiligheidsmaatregelen worden overwogen. Goede persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder veiligheidsbrillen, labjassen en cryogene handschoenen moeten altijd worden gedragen om mogelijke vriesbrand wonden en letsel door explosie te voorkomen. Het genereren van aërosolen moet ook worden geminimaliseerd en het gebruik van geventileerde balans behuizingen wordt geadviseerd. Ten slotte moet, net als bij andere protocollen die dierlijk weefsel hanteren, worden gezorgd dat alle ongebruikte weefselmonsters op de juiste wijze worden weggegooid, terwijl herbruikbare buisjes vóór reiniging moeten worden ontsmet.

Hoewel de methode veel voordelen heeft ten opzichte van conventionele methoden, herbergt het nog steeds enkele beperkingen. De transcriptome Profiel van een Murine hele poot aanzienlijk overlapt met transcriptome Profiel van menselijke synoviale biopsie (gegevens niet weergegeven). Extra mRNA van spier, huid en beenmerg kon de signalen van synoviale weefsel verdunnen. Een alternatieve oplossing is om muriene synoviale weefsel te verzamelen door middel van laser microdissection, die kan worden uitgevoerd op ingesloten muis gewrichten van OCT. Echter, lage doorvoer en de relatief kleine hoeveelheid weefsel beperkt de brede toepassing voor laser microdissectie. Bovendien, zelfs met aanzienlijke automatisering, deze methode is nog steeds heel arbeidsintensief. Het duurt minstens 8 uur om 30-60 samples te verwerken met de hulp van 3-4 onderzoekers. Tot slot, deze methode vereist grote hoeveelheden vloeibare stikstof (~ 10-15 L voor het verwerken van 30-60 monsters).

In de voorgaande beschrijving van de methode werd de evaluatie van de Proteomic-en transcriptionele eindpunt analyses aangetoond. Echter, extra eindpunt, zoals lipidomic, metabolomica en kleine RNA profilering kan van belang zijn voor de bredere artritis Research Gemeenschap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs BJ, SH, ML, RM, ML, TO en FS zijn medewerkers van Janssen Research & Development Inc en zijn aandeelhouders in de moedermaatschappij, Johnson & Johnson, Inc.

Acknowledgments

De auteurs willen Edith Janssen bedanken voor de kritische beoordeling van het manuscript en Navin Rao en Jennifer Towne voor hun steun aan de publicatie van dit manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mm stainless steel bead Qiagen 69989
beta-mercaptoethanol Sigma M6250 Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit Agilent 5067-1511 RNA qualification kit
b-mercaptoethanol Sigma M6250
Cell Culture Grade Water Corning 25-055-CI Water
Cell lysis stock solution Cell Signaling 9803
Eppendorf Tube Eppendorf 22363204 Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box Nalgene 5055 Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker Benchmark Scientific BR5000
Freezer Mill Spex Sample Prep 6875 Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial Spex Sample Prep 6801 Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit Pierce 23225 Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1 Calbiochem 539131 Protease Inhibitors
Protein BCA Kit Pierce 23225
Quantigene Kit Thermofisher QP1013 bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf 5417R Centrifugation
RLT Buffer Qiagen 79216 RNA extraction buffer
RNeasy mini kit Qiagen 74104 including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker Benchmark Scientific BR5000 Rocker/Shaker
Spatula VWR 10806-412 Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead Qiagen 69989 Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor Spex Sample Prep 6884 Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer VWR 10153-838 Sample mixing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
  2. McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).
  3. Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).
  4. David, C. S., Taneja, V. Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis. American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).
  5. Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. Rheumatoid factors in mice. Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).
  6. Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma. Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).
  7. Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra. Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).
  8. Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. Animal models of rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).
  9. Williams, R. O. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis. Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).
  10. Shen, F., et al. Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice. Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).

Tags

Immunologie en infectie probleem 152 collageen geïnduceerde artritis Gewrichtsweefsel ontsteking Cryo-verpulveren eiwitten RNA luminex microarray
Een Cryo-pulverisatie protocol voor het verwerken van muis poten voor het evalueren van moleculaire trajecten van weefsel ontsteking in een model van collageen geïnduceerde artritis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jones, B., Hitchcock, S., Loza, M.,More

Jones, B., Hitchcock, S., Loza, M., Malaviya, R., Ort, T., Shen, F. A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model. J. Vis. Exp. (152), e60229, doi:10.3791/60229 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter