Summary
액체 질소 냉동고 밀을 사용하여 뮤린 발을 처리하는 극저온 분쇄 방법은 조직에서 추출 된 RNA 또는 단백질의 수율과 품질을 개선하고 염증과 관련된 분자 프로파일의 분석을 가능하게하기 위해 개발되었습니다. 응답.
Abstract
국소 조직에서 의 분자 변화를 프로파일링은 생체 내에서 치료 후보의 작용의 메커니즘(들)을 이해하는 데 매우 중요하다. 관절염 연구 분야에서, 많은 연구는 뼈의 복잡한 혼합물로 구성된 염증 관절에 초점을 맞추고, 연골, 근육, 기질 세포와 면역 세포. 여기에서, 우리는 극저온 통제된 환경에서 균일한 분쇄된 견본으로 불을 붙인 마우스 발을 중단하는 믿을 수 있고 강력한 기계적인 방법을 설치했습니다. 단백질 및 RNA 분해제는 국소 조직에서 관련 질병 경로의 단백질 및 전사 종점 및 분자 특성을 가능하게 하기 위해 처리되었습니다.
Introduction
류마치스성 관절염 (RA)는 피부, 심혼, 폐 및 눈과 같은 기관의 합동 그리고 추가 관절 에 있는 지속적인 대칭 활막염을 가진 만성 조직 선동적인 질병1. 면역 반응의 전신 발현은 인간 환자에서 분명하지만, RA 병리학의 특징 중 하나는 활액 상 조직내 면역 세포의 침투및 활액 섬유 아세포의증식2.
인간 RA와 유사하게, 마우스 콜라겐 유도 관절염 (CIA) 모델은 활액 조직 및 전신 구획에 있는 활성 면역 반응으로 강한 조직 염증을 이끌어 냅니다. CIA 모델에 대한 상이한 마우스 균주의 감수성은 주요 조직 적합성 복합체(MHC) haplotype 및 항원 특이적 T 세포 및 B 세포 상호작용3,4로연결된다. 또한, 자가 항체 생산, 면역 복합체 침착, 골수성 세포 활성화, 활액 면역 침윤을 통한 다관절 증상 및 판누스 형성을 포함한 인간 RA의 많은 병원성 경로도 이 모델에서 분명하게 드러납니다. 5,6. 수사관은 항 염증 성 사이토 카인 치료의 효과를 조사하기 위해이 잘 설립 된 CIA 모델을채택7. 항-TNFα 및 항-IL-6과 같은 자가면역 또는 염증성 질환에 대해 승인된 많은 생물학적 제제는 CIA 모델8,9에서효과적인 것으로 밝혀졌다.
활액 조직에서 면역 계통의 상호 작용을 프로파일링은 RA의 병인과 관련되었던 분자 기계장치를 해명하기 위하여 결정적이다. 인간 임상 환경에서, 일반적인 관행은 초음파 화상 진찰의 지도의 밑에 바늘 활액 생검을 능력을 발휘하는 것입니다. 전임상 환경에서, 뮤린 관절의 작은 구조는 불가능하지 않을 경우 생검 절차를 훨씬 더 어렵게 만듭니다. 최근에는 이질적인 종점에 영향을 미치고 질병을 해결하는 약물의 조합을 평가하기 위해 뮤린 CIA 모델의 활용도를10으로입증했다. 극저온 냉동고 밀 기반 분쇄 방법은 염증이 있는 뮤린 발을 균일한 미세 분말로 처리하고 RNA와 단백질을 추출하기 위해 하류 공정을 확립하는 데 사용되었습니다. 이 방법은 효소 및 화학 적 탈지 공정으로부터 RNA 및 단백질을 보호하고 단일 균질화 된 샘플 소스에 여러 분석 방법을 적용 할 수 있게합니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 얀센 R&D의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 정책에 따라 수행되었습니다.
1. 극저온 냉동고 밀 기반 분쇄 방법
- CIA 연구의 종료에, 희생 마우스와 함께 1.5% 이소플루란 다음 자궁 경부 탈구.
- 티슈 처리 당일, 모든 기구(주걱, 갈기 바이알 등)를 드라이 아이스에 최소 10분 동안 식히십시오.
- 그림 1A에묘사 된 모피 선에서 가위로 뒷발을 잘라 .
- 각 발을 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮기고 액체 질소에 즉시 얼린 다음 냉동 발을 -80 °C에서 보관하십시오. 샘플을 1주일 이상 냉동 보관하지 마십시오.
- 그림 1B에 나타난 바와 같이 액체 질소로 냉동실 밀을 채우고 적어도 10 분 동안 평형화하십시오.
- 처리되지 않은 시료를 드라이 아이스에 보관하고 동결 해동 주기를 피하십시오.
- 한 뒷발을 바닥 강철 플러그로 미리 냉각된 대형 폴리카보네이트 연삭 바이알에 옮기고, 미리 냉각된 강철 임팩터를 삽입하고 미리 냉각된 상부 강철 플러그로 폴리카보네이트 연삭 바이알을닫습니다(그림 1C).
- 샘플과 함께 대형 폴리카보네이트 분쇄 바이알을 액체로 미리 채워진 냉동실 밀에 옮기고 기기 앞쪽에 있는 고무 걸쇠로 뚜껑을 닫습니다.
- 샘플을 액체 질소에서 1분 동안 식힙니다.
- 냉동고 밀을 초당 10사이클로 1분 프로그램으로 설정하고 시작 버튼을 누릅니다. 냉동고 공장이 주기를 완료할 때까지 기다립니다.
참고: 강철 충격기가 앞뒤로 움직일 때 기계가 드럼 사운드를 냅니다. 청력 손실을 피하기 위해 귀 마개를 사용하십시오. - 냉동실 의 뚜껑을 열고, 큰 폴리 카보네이트 연삭 바이알을 꺼내 도 1D에묘사 된 바와 같이 추출기에 놓습니다. 강철 플러그가 폴리 카보네이트 튜브에서 미끄러 지 때까지 검은 색 핸들에 하향 압력을 가하여 상단 강철 플러그를 제거하십시오.
- 열린 대형 폴리카보네이트 연삭 바이알을 드라이 아이스에 옮김을 옮김. 미리 냉각된 집게로 강철 충격기를 제거합니다.
- 냉동 분말을 미리 냉각된 50 mL 원추형 튜브로 옮니다.
- RNA 추출을 위한 타르 냉동 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 냉동 분말 30-50 mg과 단백질 추출을 위한 냉동 분말 100-200 mg의 무게.
참고: 동결 된 분말은 그림 1E에묘사 된 흰색 또는 밝은 분홍색 미세 모래처럼 보일 것입니다. - 분쇄된 샘플을 -80°C에서 저장하고 24시간 이내에 RNA 및 단백질 분리를 진행합니다.
2. RNA 추출
- RLT 버퍼의 1 mL 당 β-메르카포에탄올(β-ME)의 10 μL을 첨가합니다.
- 조직의 23.3 mL / mg의 비율에 해당하는 RLT 버퍼의 부피를 계산하고 동결 분말튜브에 β-ME와 RLT 버퍼의 적절한 볼륨을 추가합니다. 이 비율은 경험적으로 마우스 발에 이상적이라고 결정되었습니다.
- 10초 동안 3,000 RPM에서 샘플을 소용돌이.
- 1 mL 파이펫터로 10회 위아래로 활발하게 파이펫팅하여 잘 섞어보시기.
- 20초 동안 3,000 RPM에서 다시 샘플을 소용돌이.
- 튜브를 13,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리합니다.
- 700 μL의 초나토네이트를 신선한 튜브로 옮기고 700 μL의 700 μL을 첨가합니다.
참고: <700 μL이 튜브에 있는 경우, 70% 에탄올의 상응하는 부피를 추가하면서 진행할 수 있다. - 시료의 700 μL을 RNA 정제 컬럼에 로드합니다.
- 30초 동안 ≥10,000 x g에서 튜브를 원심분리합니다.
- 흐름을 삭제하고 샘플의 나머지 부분을 RNeasy 열에 로드합니다.
- 30초 동안 ≥10,000 x g에서 튜브를 원심분리합니다.
- 흐름을 버리고 30초 동안 ≥10,000 x g의 원심분리로 RW1 버퍼700 μL을 추가하여 컬럼을 세척합니다. 옵션 DNASE 소화를 수행하는 경우, 350 μL의 RW1은 DNASE 치료 전에 첨가된다. 그리고 DNASE 처리 후 RW1의 추가 350 μL이 첨가된다.
- 선택 사항) 제조업체의 지침에 따라 DNase 소화 단계를 수행합니다.
- 500 μL의 RPE 버퍼를 추가한 다음 30초 동안 ≥10,000 x g의 원심분리를 추가하여 튜브를 두 번 세척합니다.
- 2 분 동안 ≥10,000 x g에서 원심 분리에 의해 컬럼을 건조시다.
- 2 분 동안 ≥10,000 x g에서 원심분리로 50 μL 물을 첨가하여 RNA를 용출.
- 추가 분석 전에 연구원의 선택 방법을 사용하여 RNA의 양을 결정하고 -80 °C에 저장하십시오.
3. 단백질 추출
- 세포 배양 등급의 물을 사용하여 10x 셀 용해 스톡 용액을 1x 셀 용해 스톡 용액에 희석합니다.
- 프로테아제 억제제 칵테일 세트 I을 1 mL의 물로 재구성하여 100x 프로테아제 억제제 스톡을 만듭니다.
- 1x 셀 용해의 9.9 mL에 프로테아제 억제제 100 μL을 추가하여 1x 최종 재고 용액을 만듭니다.
- mg 조직 분말 당 얼음 차가운 1x 세포 용해 완충액 4 μL을 추가하십시오 (예를 들어, 800 μL의 용해 완충액을 200 mg의 조직 분말).
- 튜브에 5mm 스테인리스 스틸 비드 1개를 추가합니다.
- 60s에 대한 3,000 RPM에서 튜브를 소용돌이.
- 모든 샘플 튜브를 상자에 놓고 1,000 RPM, 4 °C에서 1 시간 동안 로커에 원심 분리기 상자를 흔들어 줍니다.
참고: 연구원은 상자를 수직으로 배치하면 비드와 더 잘 혼합할 수 있음을 발견 할 수 있습니다. - 튜브를 10,000 x g 및 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.
- 상급제를 신선한 튜브로 옮기고 상단의 지방 층을 피하십시오.
- 총 단백질 농도를 결정합니다. 단백질 용해물의 10-30배 희석은 BCA 검사에 이상적입니다.
- 시료를 1.5 mL 마이크로원지 튜브로 Aliquot하고 추가 분석 전에 -80°C에서 보관합니다.
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Representative Results
여기서, 우리는 도 2A에서CIA 마우스의 앞발에서 추출된 RNA의 대표적인 겔 이미지 시각화를 보여준다. 28S rRNA 및 18S rRNA 대역은 모든 샘플이 충분한 양의 손상되지 않은 RNA를 가지고 있음을 나타냅니다. 다음으로, 도 2B에서단백질 BCA 분석을 기반으로 총 단백질 농도의 대표적인 산산도를 보여 준다. 순진한 마우스, CIA 마우스 또는 다양한 치료법하에 CIA 마우스로부터의 총 단백질 농도는 그룹 전반에 걸쳐 비교된다. 단백질 추출물에서 염증성 사이토카인 및 케모카인의 농도를 결정하기 위해 Luminex 분석을 수행했습니다. 우리는 도 2C에서정규화된 사이토카인 및 케모카인(pg/mg 총 단백질)의 농도에 대한 대표적인 산란플롯을 보여 준다. 순진한 마우스에 비해, 몇몇 사이토카인은 CIA 마우스에서 상승하고 항 IL17A 항체를 가진 처리는 몇몇 사이토카인의 생산을 현저하게 억제합니다. CIA의 전사체 변화 및 치료 관련 효과를 평가하기 위해 마이크로어레이 분석을 수행했습니다. 우리는 도 2D에서순진한 마우스에 비해 CIA 마우스에서 유의하게 증가된 유전자의 대표적인 히트맵 플롯을 보여준다.
그림 1: 뮤린 발을 분쇄하는 데 필요한 장비. (A)CIA 또는 순진한 마우스에서 염증이 있거나 염증이 없는 발. (B)냉동실의 스테인리스 욕조를 채우는 데 사용되는 액체 질소 Dewar. (C)조립 된 냉동 고 밀 튜브 세트. (D)냉동고 밀 튜브 오프너. (E)뮤린 발에서 조직을 분쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 분쇄된 뮤린 발에서 단백질 및 RNA 분석에 대한 대표적인 데이터. (A)RNA 무결성의 겔 이미지 시각화. (B)다른 그룹에서 총 단백질 농도. (C)다른 그룹에서 케모카인 및 사이토카인 발현(Luminex). (D)상이한 처리 군으로부터의 마이크로어레이 분석의 계층적 군집화 히트맵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
활액 조직에서 분자 경로를 평가하는 강력한 과학적 근거가 있지만, 뮤린 CIA 모델의 면역 프로파일링에 대한 많은 보고서는 말초 혈액에 초점을 맞춘 반면 염증이있는 발의 단백질 및 RNA 분석 데이터는 다소 제한적입니다. 이 편견에 대한 몇 가지 가능한 이유가 있습니다 : 뮤린 발목 관절은 ~ 2cm보다 크지 않습니다. 영향 받은 지역은 조직 분쇄기, 유봉 및 박격포, 실리카 비드 중단, trituration 또는 효소 소화와 같은 전통적인 방법을 사용하여 균질화하기 어려운 피부, 뼈 및 결합 조직으로 이루어져 있습니다. 이러한 방법은 전형적으로 불완전한 균질화, 낮은 단백질 또는 RNA 수율, 또는 단백질 분해 및 핵산 분해로 인한 일관되지 않은 품질을 초래한다. 본 명세서에 기재된 견고한 방법은 단일 균일한 샘플에서 질병의 분자 시그니처를 확립하기 위한 다운스트림 프로테오믹 및 전사 프로파일링 노력을 가능하게 하는 균질분쇄 된 냉동 분말을 생성하는 상세한 절차를 제공합니다. 소스.
이 메서드를 수행할 때 몇 가지 중요한 단계를 고려해야 합니다. 첫째, 뮤린 발은 조직 수확 중에 모피 라인에서 절단되어야하며 많은 양의 머리카락을 피해야합니다. 과도한 모발은 RNA 추출 중에 컬럼을 막고 단백질 추출을 방해할 수 있습니다. 둘째, 튜브, 집게 및 주걱은 조직 분말의 온도가 빠르게 비정질 "진흙"으로 재료를 설정하고 단백질과 RNA의 무결성이 손상될 것이기 때문에 절차 전반에 걸쳐 드라이 아이스에 보관해야합니다. 셋째, 단백질 또는 RNA 추출에 사용되는 조직 분말의 양은 신중하게 최적화되어야 합니다. 더 많은 조직 분말 항상 더 높은 수율을 제공 하지 않을 수 있습니다 하지만 막힘 RNA 격리 열을 포함 하 여 다운 스트림 처리에 추가 문제를 일으킬 수 있습니다., DNase/DNA 비율을 변경 (이 단계는 사용 하는 경우) 완전 한 DNA 저하를 방지 하기 위해. 마지막으로, 단백질 및 RNA 입력의 정상화는 워크플로우 및 데이터 분석의 필수적인 부분이어야 합니다. 조직 부하의 가변성은 상대 단백질 및 RNA 수준의 변화를 크게 가릴 수 있습니다. 총 단백질 또는 총 RNA 이외에, 하우스키핑 유전자의 발현은 또한 정상화를 위한 닻으로 고려될 수 있습니다.
광범위한 시행 착오 프로세스를 통해 이 메서드를 처음 사용하는 사용자에게 몇 가지 잠재적인 빈번한 문제를 확인했습니다. RNA의 낮은 수율이 있을 수 있습니다. 이것은 종종 너무 많은 조직 추출 물으로 컬럼을 과부하의 결과. 컬럼당 조직의 양과 RLT/분말의 비율은 효율적인 RNA 분리에 매우 중요합니다. 우리는 샘플이 동등한 속도로 열을 통해 회전하지 않기 때문에 일부 상용 96 웰 추출 키트가이 공정에 작동하지 않을 수 있음을 발견했습니다. 루미넥스 분석에서 BCA 분석 및 사이토카인 농도에서 단백질 농도가 높을 수 있습니다. BCA 또는 Luminex 프로세스에 문제가 없는 경우, 그것은 일반적으로 지방 또는 단백질 추출 물에서 다른 오염 물질에 의해 발생. 단백질 추출을 위해 수확할 때 미세 원심 분리기 튜브의 맨 위에 있는 지방 층이나 불용성 물질을 피하는 것이 중요합니다. 필요한 경우 스핀을 반복하고 다운스트림 분석을 위해 초자연자를 수집합니다.
이 방법은 특수 극저온 냉동 공장과 다량의 드라이 아이스 및 액체 질소를 포함하므로 추가 안전 조치를 고려해야합니다. 안전 안경, 실험실 코트 및 극저온 장갑을 포함한 적절한 개인 보호 장비는 항상 폭발로 인한 잠재적 인 동결 화상과 부상을 방지하기 위해 착용해야합니다. 에어로졸의 생성도 최소화되어야 하며 통풍 밸런스 인클로저를 사용하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 동물 조직을 처리하는 다른 프로토콜과 유사하게, 재사용 가능한 튜브는 세척 전에 오염제거되어야 하는 동안, 사용하지 않는 모든 조직 견본을 제대로 폐기하기 위하여 주의를 기울여야 합니다.
이 방법은 기존의 방법에 비해 많은 장점을 가지고 있지만, 여전히 몇 가지 한계를 보유하고 있습니다. 뮤린 전체 발에서 전사 프로필은 인간의 활액 생검에서 전사 체 프로필과 크게 겹칩니다 (데이터는 표시되지 않음). 근육, 피부 및 골수에서 추가 mRNA활활 조직에서 신호를 희석 수 있습니다. 대체 해결책은 OCT 임베디드 마우스 조인트에서 수행 될 수있는 레이저 미세 해부를 통해 뮤린 활액 조직을 수집하는 것입니다. 그러나, 낮은 처리량과 조직의 상대적으로 적은 양은 레이저 미세 해부에 대한 광범위한 응용을 제한합니다. 또한 상당한 자동화를 통해도 이 방법은 여전히 노동 집약적입니다. 3-4명의 조사자의 도움으로 30-60개의 샘플을 처리하는 데는 적어도 8시간이 걸립니다. 마지막으로, 이 방법은 다량의 액체 질소(30-60개 시료 처리를 위해 10-15L)를 필요로 합니다.
상기 방법 설명에서, 프로테오믹 및 전사 종점 분석의 평가가 입증되었다. 그러나, 지질학, 대사체학 및 작은 RNA 프로파일링과 같은 추가 종점은 더 넓은 관절염 연구 커뮤니티에 관심이 있을 수 있습니다.
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Disclosures
저자 BJ, SH, ML, RM, ML, TO 및 FS는 Janssen 연구 및 개발 Inc.의 직원이며 모회사인 Johnson & Johnson, Inc.의 주주입니다.
Acknowledgments
저자는 이 원고의 출판을 지지해 준 에디스 얀센과 나빈 라오와 제니퍼 타운에 대한 비판적 검토에 감사를 표하고자 한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
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