Um protocolo de crio-pulverização para processar patas do rato para avaliar caminhos moleculares da inflamação do tecido em um modelo induzido da artrite do colágeno

Summary

Um método criogênico de pulverização para processar patas de urina usando um moinho congelador de nitrogênio líquido foi desenvolvido para melhorar o rendimento e a qualidade do RNA ou proteína extraído dos tecidos e permitir a análise de perfis moleculares associados a inflamatórios Respostas.

Abstract

O perfil de alterações moleculares nos tecidos locais é crucial para entender o mecanismo de ação dos candidatos terapêuticos in vivo. No campo da pesquisa da artrite, muitos estudos são focalizados nas junções inflamadas que são compostas de uma mistura complexa do osso, da cartilagem, do músculo, das pilhas estromais e das pilhas imunes. Aqui, estabelecemos um método mecânico confiável e robusto para interromper as patas inflamadas do rato em amostras pulverizadas homogêneas em um ambiente criogenicamente controlado. As lisatas proteicas e rna foram processadas para permitir desfechos proteômicos e transcricionais e caracterização molecular de vias de doenças relevantes no tecido local.

Introduction

A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória sistêmica crônica com sinofite simétrica persistente nas articulações e envolvimento articular extra de órgãos como a pele, coração, pulmões e olhos¹. Embora as manifestações sistêmicas da resposta imune sejam evidentes em pacientes humanos, uma das características da patologia da RA é a infiltração de células imunes no tecido sinovial e a proliferação de células fibroblastas sinoviais^2.

Semelhante ao AR humano, o modelo de artrite induzida por colágeno do rato (CIA) provoca forte inflamação do tecido com respostas imunes ativas em tecidos sinoviais e compartimentos sistêmicos. A susceptibilidade de diferentes cepas de camundongos para links modelo da CIA para Major Histocompatibilidade Complexo (MHC) haplótipo e antígeno específico célula T e interações celulares B^3,4. Além disso, muitas vias patogênicas na AR humana, incluindo a produção de autoanticorpos, deposição de complexo imune, ativação de células mieloides, manifestações poliarticulares e formação de pannus com infiltração imune sinovial, também são evidentes neste modelo ^5,6. Os investigadores empregaram este modelo bem estabelecido do CIA para investigar efeitos de tratamentos anti-inflamatórios da citocina^7. Muitos produtos biológicos aprovados para doenças auto-imunes ou inflamatórias, como anti-TNFα e anti-IL-6, são encontrados para ser eficaz no modelo da CIA^8,9.

O perfil das interações do sistema imunológico no tecido sinovial é crucial para elucidar os mecanismos moleculares associados à patogênese da AR. No ambiente clínico humano, uma prática comum é realizar biópsias sinoviais de agulha a orientação de imagens de ultrassom. Nas configurações pré-clínicas, a arquitetura menor das articulações de urina torna os procedimentos de biópsia muito mais difíceis, se não impossíveis. Recentemente, demonstramos a utilização do modelo murine CIA para avaliar combinações de drogas para impactar pontos finais díspares e resolver a doença em uma abordagem combinatória¹⁰. Um método criogênico de pulverização à base de uma fábrica de freezer foi empregado para processar patas de urina inflamadas em pós finos homogêneos e estabeleceu processos a jusante para extrair RNA e proteínas. Este método protege o RNA e a proteína dos processos degralísticos enzimáticos e químicos e permite-nos aplicar múltiplos métodos analíticos a uma única fonte homogênea da amostra.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as políticas do Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Janssen R&D.

1. Método de Pulverização baseado em fábrica de freezer criogênico

1. Na terminação do estudo do CIA, os ratos do sacrifício com isoflurane de 1.5% seguidos pela deslocação cervical.
2. No dia do processamento de tecidos, pré-chill todos os instrumentos (espátulas, frascos de moagem, etc) em gelo seco por um mínimo de 10 min. Use luvas térmicas para evitar danos ao congelamento.
3. Corte patas traseiras com uma tesoura na linha de pele como descrito na Figura 1A.
4. Transfira cada pata em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, congele-se imediatamente em nitrogênio líquido e guarde patas congeladas a -80 °C. Não mantenha amostras congeladas por mais de uma semana.
5. Encha o moinho do congelador com nitrogênio líquido, como mostrado na Figura 1B e deixe equilibrar por pelo menos 10 min.
6. Mantenha a amostra não processada em gelo seco e evite ciclos de congelamento-degelo.
7. Transfira uma pata traseira para o frasco de moagem de policarbonato grande pré-refrigerado com um plugue de aço inferior, insira o impactor de aço pré-refrigerado e feche o frasco de moagem de policarbonato com a ficha de aço superior pré-refrigerada (Figura 1C).
8. Transfira grandes frascos de moagem de policarbonato com as amostras para o moinho congelador pré-preenchido com líquido e feche a tampa com o fecho de borracha encontrado na frente do instrumento.
9. Deixe as amostras esfriar em nitrogênio líquido por 1 minuto.
10. Defina a fábrica de freezer saem do programa de 1 minuto com 10 ciclos por segundo e pressione o botão de partida. Aguarde o moinho do congelador para completar o seu ciclo.
    Nota: A máquina faz um som de bateria como o impactor de aço se move para frente e para trás. Use tampões de ouvido para evitar a perda auditiva.
11. Abra a tampa do moinho congelador, tirar o frasco de moagem de policarbonato grande e colocá-lo em um extrator, como descrito na Figura 1D. Retire a ficha de aço superior, colocando pressão para baixo sobre a alça preta até que a ficha de aço desliza para fora do tubo de policarbonato.
12. Transfira o grande frasco de moagem de policarbonato aberto para o gelo seco. Retire o impactor de aço com fórceps pré-refrigerados.
13. Transfira o pó congelado para o tubo cônico pré-refrigerado de 50 mL.
14. Peso 30-50 mg de pó congelado em um tubo de microcentrífuga congelado de 1,5 mL para extração de RNA e 100-200 mg de pó congelado para extração de proteína.
    Nota: O pó congelado deve olhar como a areia fina branca ou cor-de-rosa clara como descrito na figura 1E.
15. Armazenar amostras pulverizadas em -80 °C e proceder a RNA e isolamentos de proteínas dentro de 24 h.

2. Extração de RNA

1. Adicione 10 μL de β-mercaptoetanol (β-ME) por 1 mL de buffer RLT.
2. Calcule o volume de RLT Buffer correspondente a uma proporção de 23,3 mL/mg de tecido e adicione o volume apropriado de RLT Buffer com β-ME ao tubo com pó congelado. Esta relação foi empiricamente determinada a ser ideal para as patas do rato.
3. Vortex a amostra em 3.000 RPM para 10 s.
4. Misture bem por pipetting cima e para baixo 10 vezes vigorosamente com um pipettor 1 mL.
5. Vortex a amostra novamente em 3.000 RPM para 20 s.
6. Centrífuga do tubo a 13.000 x g por 2 min.
7. Transfira 700 μL das supernatantes para um tubo fresco e adicione 700 μL de 70% de etanol.
   Nota: Se o μL está no tubo, é aceitável prosseguir, ainda adicionando volume equivalente de 70% de etanol.
8. Carregue 700 μL da amostra em uma coluna de purificação de RNA.
9. Centrífuga do tubo a ≥10.000 x g para 30 s.
10. Descarte o fluxo e carregue a parte restante da amostra para a coluna RNeasy.
11. Centrífuga do tubo a ≥10.000 x g para 30 s.
12. Descarte o fluxo através e lave a coluna adicionando 700 μL de buffer RW1 com centrífuga de ≥10.000 x g para 30 s. Se executar a digestão de DNASE opção, 350 μL de RW1 é adicionado antes do tratamento de DNASE.  E um adicional de 350 μL de RW1 é adicionado após o tratamento de DNASE.
13. Opcional) Realize uma etapa de digestão de DNase siga as instruções do fabricante.
14. Lave o tubo duas vezes adicionando 500 μL de buffer RPE seguido de centrífugação em ≥10,000 x g para 30 s. Descarte fluxo através de cada vez.
15. Seque a coluna por centrífuga a ≥10.000 x g por 2 min.
16. RNA elute adicionando 50 μL de água com centrífuga em ≥10.000 x g para 2 min. Coletar fluxo através e transferência para um novo tubo de 1,5 mL.
17. Determine a quantidade de RNA usando o método de escolha e armazenação do pesquisador a -80 °C antes de uma análise mais aprofundada.

3. Extração de proteína

1. Diluir a solução de estoque de lyse de células 10x na solução de estoque de lyse de células 1x usando água de grau de cultura celular.
2. Reconstituir o inibidor protease cocktail conjunto i com 1 mL de água para fazer um estoque inibidor de protease 100x.
3. Adicione 100 μL de inibidor de protease a 9,9 mL de lyse celular 1x para fazer uma solução de estoque final 1x.
4. Adicione 4 μL de gelo frio 1x Cell Lysis Buffer por mg de tecido em pó (por exemplo, 800 μL de dbuffer de lyse para 200 mg de tecido em pó).
5. Adicione uma conta de aço inoxidável de 5 mm ao tubo.
6. Vortex o tubo em 3.000 RPM para 60 s. Transfira o tubo para o gelo molhado e continue para a próxima amostra.
7. Coloque todos os tubos de amostra em uma caixa e agite a caixa de centrífuga em um roqueiro a 1.000 RPM, 4 °C por 1 h.
   Nota: Os investigadores podem encontrar que coloc a caixa vertical pode facilitar a melhor mistura com o grânulo.
8. Centrífugas os tubos a 10.000 x g e 4 °C por 15 min.
9. Transfira as supernatantes em um tubo fresco e evite a camada gorda na parte superior.
10. Determinar a concentração total de proteínas. 10 a 30 vibrações duplas de liceu de proteína são ideais para um teste de BCA.
11. Aliquot a amostra em tubos de microcentrírífuga de 1,5 mL e armazenar a -80 °C antes de uma análise mais aprofundada.

Representative Results

Aqui, nós mostramos uma visualização representativa da imagem do gel do RNA extraído das patas dianteiras de ratos do CIA na figura 2A. O rRNA 28S e a banda rRNA 18S indicam que todas as amostras têm quantidade suficiente de RNA intacto. Em seguida, mostramos um gráfico representativo de dispersão de concentrações totais de proteínas com base na análise de proteína BCA na Figura 2B. As concentrações totais da proteína dos ratos ingénuos, dos ratos do CIA ou dos ratos do CIA vários tratamentos são comparáveis entre grupos. Para determinar as concentrações de citocinas inflamatórias e quimiocinas no extrato de proteína, foram realizadas análises luminex. Mostramos uma parcela representativa de dispersão das concentrações de citocinas normalizadas e quimiocinas (proteína total pg/mg) na Figura 2C. Em comparação com camundongos ingênuos, várias citocinas são elevadas em camundongos da CIA e tratamento com anticorpo anti-IL17A inibe significativamente a produção de várias citocinas. Para avaliar as alterações de transcriptoma na CIA e os efeitos relacionados ao tratamento, foi realizada a análise de microarray. Nós mostramos um lote representativo do heatmap dos genes aumentados significativamente em ratos do CIA comparados aos ratos ingénuos na figura 2D.

Figura 1: Equipamento necessário para pulverizar patas de urina. (A)Patas inflamadas ou não inflamadas da CIA ou ratos ingênuos. (B)Nitrogênio líquido Dewar usado para encher o banho de aço inoxidável do moinho congelador. (C)Conjunto de tubos de moinho congelador montado. (D)Abridor do tubo do moinho do congelador. (E)Tecido pulverizado das patas de urina. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Dados representativos sobre a análise de proteínas e RNA de patas de urina pulverizadas. (A)Visualização de imagem gel da integridade do RNA. (B) Concentrações totais de proteínas de diferentes grupos. (C)Expressão de quimiocina e citocina (Luminex) de diferentes grupos. (D)Mapa hierárquico de agrupamento da análise de microarray de diferentes grupos de tratamento. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Discussion

Embora haja uma forte lógica científica para avaliar as vias moleculares nos tecidos sinoviais, muitos relatórios sobre o perfil imunológico do modelo da CIA murine foram focados no sangue periférico, enquanto os dados de análise de proteínas e RNA de patas inflamadas são bastante limitados. Existem várias razões possíveis para este viés: as articulações do tornozelo murine não são maiores do que ~ 2 cm; as áreas afetadas consistem em tecidos de pele, osso e conjuntivo, que muitas vezes são difíceis de homogeneizar usando métodos tradicionais como moedores de tecidos, pilão e argamassa, interrupção de contas de sílica, trituração ou digestão enzimática. Esses métodos geralmente resultam em homogeneização incompleta, baixa proteína ou rendimento de RNA, ou qualidade inconsistente devido à degradação do ácido proteolítico e nucleico. O método robusto descrito aqui fornece um procedimento detalhado para gerar um pó congelado pulverizado homogêneo para permitir esforços de perfil proteômico e transcricional a jusante para estabelecer assinaturas moleculares da doença a partir de uma única amostra uniforme Fonte.

Várias etapas críticas devem ser consideradas ao executar esse método. Em primeiro lugar, as patas de urina devem ser cortadas na linha da pele durante a colheita de tecidos e grandes quantidades de cabelo devem ser evitadas. O cabelo excessivo pode entupir colunas durante a extração de RNA e interferir na extração de proteínas. Em segundo lugar, tubos, fórceps e espátulas devem ser mantidos em gelo seco durante todo o procedimento, porque a temperatura elevada em pós de tecido rapidamente transformaro o material em "lama" amorfa e a integridade da proteína e do RNA será comprometida. Em terceiro lugar, a quantidade de tecido em pó utilizado para extração de proteínaou RNA deve ser cuidadosamente otimizada. Mais pó de tecido nem sempre pode fornecer maior rendimento, mas pode causar problemas adicionais no processamento a jusante, incluindo entupimento colunas de isolamento rna, alterando a relação DNase / DNA (se esta etapa é empregada) para evitar a degradação completa do DNA. Finalmente, a normalização da entrada de proteínas e RNA deve ser parte integrante do fluxo de trabalho e análise de dados. A variabilidade na carga de tecido pode mascarar significativamente as alterações nos níveis relativos de proteína e RNA. Além da proteína total ou do RNA total, a expressão de genes de limpeza também pode ser considerada como âncoras para normalização.

Através de um extenso processo de tentativa e erro, identificamos alguns problemas frequentes potenciais para usuários iniciantes deste método. Pode haver baixo rendimento de RNA. Isso geralmente é resultado da sobrecarga da coluna com extrato de tecido demais. A quantidade do tecido por coluna e a proporção de RLT/pó são cruciais para isolados eficientes do RNA. Descobrimos que alguns kits comerciais de extração de 96 poços podem não funcionar para este processo, pois as amostras não girarão através da coluna a uma taxa equivalente, comprometendo assim essas amostras em etapas de lavagem e elução a jusante. Pode haver alta variabilidade na concentração de proteínas na análise bca e concentrações de citocina na análise de Luminex. Se não houver problemas com o BCA ou o processo Luminex, normalmente é causado por gordura ou outros contaminantes no extrato de proteína. É importante evitar a camada de gordura na parte superior ou matéria insolúvel na parte inferior dos tubos de microcentrífuga ao colher para extração de proteína. Se necessário, repita a rotação e colete supernatantes para análise a jusante.

Como este método envolve uma fábrica de freezer criogênica especializada e grandes quantidades de gelo seco e nitrogênio líquido, medidas de segurança adicionais devem ser consideradas. O equipamento apropriado da proteção pessoal que inclui vidros de segurança, revestimentos de laboratório e luvas criogenic deve sempre ser desgastado para impedir queimaduras e ferimento potenciais do gelo devido à explosão. A geração de aerossóis deve igualmente ser minimizada e usar de cercos exalados do contrapeso é recomendado. Finalmente, similar a todos os outros protocolos que seguram tecidos animais, o cuidado deve ser tomado para dispr corretamente de todas as amostras não utilizadas do tecido, quando os tubos reusáveis precisarem de ser descontaminados antes da limpeza.

Enquanto o método tem muitas vantagens sobre os métodos convencionais, ele ainda abriga algumas limitações. O perfil do transcriptoma de uma pata inteira do murine sobrepõe significativamente com o perfil do transcriptome da biópsia sinovial humana (dados não mostrados). MRNA adicional do músculo, da pele e da medula óssea poderia diluir os sinais do tecido sinovial. Uma solução alternativa é coletar o tecido sinovial do murine através da microdissecção do laser, que pode ser executada em junções encaixadas oct do rato. No entanto, a baixa produtividade e a quantidade relativamente pequena de tecido limitam a ampla aplicação para a microdissecção a laser. Além disso, mesmo com automação significativa, este método ainda é bastante trabalhoso. Leva pelo menos 8 h para processar 30-60 amostras com a ajuda de 3-4 investigadores. Finalmente, este método requer grandes quantidades de nitrogênio líquido (~10-15 L para o processamento de 30-60 amostras).

Na descrição do método anterior, foi demonstrada a avaliação das análises proteômicas e transcricionais de pontos finais. No entanto, o ponto final adicional, como lipidomic, metabolômico e pequeno perfil de RNA pode ser de interesse para a comunidade de pesquisa de artrite mais ampla.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mm stainless steel bead	Qiagen	69989
beta-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit	Agilent	5067-1511	RNA qualification kit
b-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CI	Water
Cell lysis stock solution	Cell Signaling	9803
Eppendorf Tube	Eppendorf	22363204	Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box	Nalgene	5055	Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
Freezer Mill	Spex Sample Prep	6875	Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial	Spex Sample Prep	6801	Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Protease Inhibitors
Protein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Centrifugation
RLT Buffer	Qiagen	79216	RNA extraction buffer
RNeasy mini kit	Qiagen	74104	including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatula	VWR	10806-412	Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead	Qiagen	69989	Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor	Spex Sample Prep	6884	Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer	VWR	10153-838	Sample mixing