Un protocolo de Cryo-pulverización para el procesamiento de patas de ratón para evaluar las vías moleculares de la inflamación del tejido en un modelo de artritis inducida por colágeno

Summary

Se desarrolló un método de pulverización criogénica para procesar patas murinas utilizando un molino congelador de nitrógeno líquido para mejorar el rendimiento y la calidad del ARN o proteína extraída de los tejidos y permitir el análisis de perfiles moleculares asociados con Respuestas.

Abstract

La elaboración de perfiles de cambios moleculares en los tejidos locales es crucial para comprender los mecanismos de acción de los candidatos terapéuticos in vivo. En el campo de la investigación de la artritis, muchos estudios se centran en las articulaciones inflamadas que se componen de una mezcla compleja de hueso, cartílago, músculo, células estromales y células inmunitarias. Aquí, establecimos un método mecánico fiable y robusto para interrumpir las patas de ratón inflamadas en muestras pulverizadas homogéneas en un entorno croogénicamente controlado. Se procesaron lelíforos de proteínas y ARN para permitir las variables proteómicas y transcripcionales y la caracterización molecular de las vías de enfermedad relevantes en el tejido local.

Introduction

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria sistémica crónica con sinovitis simétrica persistente en las articulaciones y afectación articular adicional de órganos como la piel, el corazón, los pulmones y los ojos¹. Aunque las manifestaciones sistémicas de la respuesta inmunitaria son evidentes en pacientes humanos, una de las señas de identidad de la patología de la AR es la infiltración de células inmunitarias en el tejido sinovial y la proliferación de células fibroblastos sinoviales².

Al igual que la AR humana, el modelo de artritis inducida por colágeno de ratón (CIA) provoca una fuerte inflamación del tejido con respuestas inmunitarias activas en tejidos sinoviales y compartimentos sistémicos. La susceptibilidad de diferentes cepas de ratón a los enlaces del modelo CIA a los principales haplotipos del Complejo histocompatibilidad (MHC) y las interacciones específicas del antígeno T y de la célula B^3,4. Además, muchas vías patógenas en la AR humana, incluyendo la producción de autoanticuerpos, deposición del complejo inmune, activación de células mieloides, manifestaciones poliarticulares y formación de pannus con infiltración inmune sinovial, también son evidentes en este modelo ^5,6. Los investigadores han empleado este modelo bien establecido de la CIA para investigar los efectos de los tratamientos antiinflamatorios de citoquinas⁷. Muchos productos biológicos aprobados para enfermedades autoinmunes o inflamatorias, tales como anti-TNF y anti-IL-6, se encuentran para ser eficaces en el modelo de la CIA^8,9.

La elaboración de perfiles de las interacciones del sistema inmunitario en el tejido sinovial es crucial para dilucidar los mecanismos moleculares asociados con la patogénesis de la AR. En el entorno clínico humano, una práctica común es realizar biopsias sinoviales de aguja bajo la guía de imágenes por ultrasonido. En los entornos preclínicos, la arquitectura más pequeña de las articulaciones murinas hace que los procedimientos de biopsia sean mucho más difíciles si no imposibles. Recientemente, demostramos la utilización del modelo de la CIA murina para evaluar combinaciones de fármacos para impactar puntos finales dispares y resolver enfermedades en un enfoque combinatorio^10. Se empleó un método de pulverización a base de molino de congelador criogénico para procesar patas murinos inflamadas en polvos finos homogéneos y estableció procesos aguas abajo para extraer ARN y proteínas. Este método protege el ARN y las proteínas de los procesos de degrativos enzimáticos y químicos y nos permite aplicar múltiples métodos analíticos a una sola fuente de muestra homogeneizada.

Protocol

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las políticas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Janssen I+D.

1. Método de pulverización a base de molino de congelador criogénico

1. Al finalizar el estudio de la CIA, sacrificar ratones con 1.5% de isoflurano seguido de dislocación cervical.
2. El día del procesamiento de tejidos, enfríe previamente todos los instrumentos (espátulas, viales de molienda, etc.) sobre hielo seco durante un mínimo de 10 minutos.
3. Corte las patas traseras con una tijera en la línea de piel como se muestra en la Figura 1A.
4. Transfiera cada pata en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, congele inmediatamente la congelación en líquido y almacene las patas congeladas a -80 oC. No mantenga las muestras congeladas durante más de una semana.
5. Llene el molino congelador con nitrógeno líquido como se muestra en la Figura 1B y déjelo equilibrar durante al menos 10 minutos.
6. Conservar la muestra sin procesar sobre hielo seco y evitar ciclos de congelación-descongelación.
7. Transfiera una pata trasera al vial de molienda de policarbonato grande pre-enfriado con un tapón de acero inferior, inserte el impactador de acero preenfriado y cierre el vial de molienda de policarbonato con el tapón de acero superior pre-enfriado(Figura 1C).
8. Transfiera grandes viales de molienda de policarbonato con las muestras al molino congelador precargados de líquido y cierre la tapa con el cierre de goma que se encuentra en la parte delantera del instrumento.
9. Deje que las muestras se enfríen en nitrógeno líquido durante 1 minuto.
10. Ajuste el molino congelador al programa de 1 minuto con 10 ciclos por segundo y pulse el botón de inicio. Espere a que el molino congelador complete su ciclo.
    NOTA: La máquina hace un sonido de tambor a medida que el impactador de acero se mueve hacia adelante y hacia atrás. Use tapones para los oídos para evitar la pérdida auditiva.
11. Abra la tapa del molino congelador, saque el gran vial de molienda de policarbonato y colóquelo en un extractor como se muestra en la Figura 1D. Retire el tapón de acero superior colocando presión hacia abajo sobre el mango negro hasta que el tapón de acero se deslice fuera del tubo de policarbonato.
12. Transfiera el vial de molienda de policarbonato grande abierto al hielo seco. Retire el impactador de acero con fórceps pre-enfriados.
13. Transfiera el polvo congelado al tubo cónico preenfriado de 50 ml.
14. Peso 30-50 mg de polvo congelado en un tubo de microcentrífuga congelado tarado de 1,5 ml para extracción de ARN y 100-200 mg de polvo congelado para la extracción de proteínas.
    NOTA: El polvo congelado debe parecerse a arena fina de color blanco o rosa claro como se muestra en la Figura 1E.
15. Almacene las muestras pulverizadas a -80 oC y proceda a los aislamientos de ARN y proteínas en un plazo de 24 h.

2. Extracción de ARN

1. Añadir 10 ml de mercaptoetanol (-ME) por 1 ml de búfer RLT.
2. Calcular el volumen de tampón RLT correspondiente a una proporción de 23,3 ml/mg de tejido y añadir el volumen adecuado de tampón RLT con el tubo con polvo congelado. Esta relación se determinó empíricamente para ser ideal para las patas de ratón.
3. Vortex la muestra a 3.000 RPM durante 10 s.
4. Mezcle bien pipeteando 10 veces vigorosamente con un pipeteador de 1 ml.
5. Vortex la muestra de nuevo a 3.000 RPM para 20 s.
6. Centrifugar el tubo a 13.000 x g durante 2 min.
7. Transfiera 700 l de los supernatantes a un tubo nuevo y agregue 700 ml de etanol al 70%.
   NOTA: Si <700 l está en el tubo, es aceptable proceder, todavía añadiendo un volumen equivalente de 70% de etanol.
8. Cargue 700 l de la muestra en una columna de purificación de ARN.
9. Centrifugar el tubo a 10.000 x g durante 30 s.
10. Deseche el flujo y cargue la parte restante de la muestra en la columna RNeasy.
11. Centrifugar el tubo a 10.000 x g durante 30 s.
12. Deseche el flujo y lave la columna añadiendo 700 ml de tampón de RW1 con una centrifugación de 10.000 x g durante 30 s. Si se realiza la opción de digestión DNASE, se añaden 350 ml de RW1 antes del tratamiento con DNASE.  Y se añaden 350 ol de RW1 adicionales después del tratamiento con DNASE.
13. Opcional) Realice un paso de digestión DNase siga las instrucciones del fabricante.
14. Lave el tubo dos veces añadiendo 500 ml de tampón de RPE seguido de centrifugación a 10.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo cada vez.
15. Seque la columna por centrifugación a 10.000 x g durante 2 min.
16. Elute el ARN añadiendo agua de 50 l con centrifugación a 10.000 x g durante 2 min. Recoja el flujo y transfiera a un nuevo tubo de 1,5 ml.
17. Determinar la cantidad de ARN utilizando el método de elección del investigador y almacenar a -80 oC antes de un análisis posterior.

3. Extracción de proteínas

1. Diluir la solución de stock de lisis celular 10x en solución de stock de lisis de 1x célula utilizando agua de grado de cultivo celular.
2. Reconstituir el conjunto de cócteles inhibidor de proteasa I con 1 ml de agua para hacer un stock inhibidor de proteasa 100x.
3. Añadir 100 l de inhibidor de la proteasa a 9,9 ml de lisis celular 1x para hacer una solución de stock final 1x.
4. Añadir 4 ml de tampón de lisis celular en frío 1x por mg de polvo de tejido (p. ej., 800 l de tampón de lisis a 200 mg de polvo tisular).
5. Añadir una perla de acero inoxidable de 5 mm al tubo.
6. Vortex el tubo a 3.000 RPM durante 60 s. Transfiera el tubo al hielo húmedo y continúe con la siguiente muestra.
7. Coloque todos los tubos de muestra en una caja y agite la caja centrífuga en un balancín a 1.000 RPM, 4 oC durante 1 h.
   NOTA: Los investigadores pueden encontrar que la colocación de la caja vertical puede facilitar una mejor mezcla con el cordón.
8. Centrifugar los tubos a 10.000 x g y 4oC durante 15 min.
9. Transfiera los sobrenatodores a un tubo nuevo y evite la capa de grasa en la parte superior.
10. Determinar la concentración total de proteínas. Las diluciones de 10 a 30 veces de lisato proteico son ideales para una prueba de BCA.
11. Alícuota la muestra en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y guárdela a -80 oC antes de realizar un análisis posterior.

Representative Results

Aquí, mostramos una visualización representativa de la imagen de gel de ARN extraído de las patas delanteras de los ratones de la CIA en la Figura 2A. El ARNm 28S y la banda rRNA 18S indican que todas las muestras tienen una cantidad suficiente de ARN intacto. A continuación, mostramos una gráfica de dispersión representativa de las concentraciones totales de proteínas basadas en el análisis de proteína BCA en la Figura 2B. Las concentraciones totales de proteínas de ratones ingenuos, ratones de la CIA o ratones de la CIA bajo diversos tratamientos son comparables entre grupos. Para determinar las concentraciones de citoquinas inflamatorias y quimioquinas en el extracto proteico, se realizaron análisis de Luminex. Mostramos una gráfica de dispersión representativa de las concentraciones de citoquinas normalizadas y quimioquinas (proteína total pg/mg) en la Figura 2C. En comparación con los ratones ingenuos, varias citoquinas son elevadas en ratones de la CIA y el tratamiento con anticuerpos anti-IL17A inhibe significativamente la producción de varias citoquinas. Para evaluar los cambios en el transcriptoma en la CIA y los efectos relacionados con el tratamiento, se realizó un análisis de microarray. Mostramos una gráfica representativa de los mapas de calor de genes que aumentó significativamente en ratones de la CIA en comparación con los ratones ingenuos en la Figura 2D.

Figura 1: Equipo necesario para pulverizar las patas murinas. (A) Patas inflamadas o desinflamadas de la CIA o de ratones ingenuos. (B) Dewar de nitrógeno líquido utilizado para llenar el baño de acero inoxidable del molino congelador. (C) Conjunto de tubos de molino de congelador ensamblados. (D) Abridor de tubo de molino congelador. (E) Tejido pulverizado de patas murinas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Datos representativos sobre el análisis de proteínas y ARN a partir de patas murinas pulverizadas. (A) Visualización de imágenes de gel de la integridad del ARN. (B) Concentraciones totales de proteínas de diferentes grupos. (C) Expresión de quimioquina y citoquina (Luminex) de diferentes grupos. (D) Mapa térmico jerárquico de análisis de microarrays de diferentes grupos de tratamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Aunque existe una sólida lógica científica para evaluar las vías moleculares en los tejidos sinoviales, muchos informes sobre el perfil inmune del modelo de la CIA murina se centraron en la sangre periférica, mientras que los datos de análisis de proteínas y ARN de las patas inflamadas son bastante limitados. Hay varias razones posibles para este sesgo: las articulaciones del tobillo murino no son más grandes que 2 cm; las zonas afectadas consisten en piel, hueso y tejidos conectivos que a menudo son difíciles de homogeneizar utilizando métodos tradicionales como molinillos de tejido, mortero y mortero, alteración de perlas de sílice, trituración o digestión enzimática. Estos métodos suelen dar lugar a una homogeneización incompleta, bajo rendimiento de proteínao o ARN, o una calidad inconsistente debido a la degradación del ácido proteolítico y nucleico. El método robusto descrito en este documento proporciona un procedimiento detallado para generar un polvo congelado pulverizado homogéneo que permita los esfuerzos proteómicos y transcripcionales aguas abajo para establecer firmas moleculares de la enfermedad a partir de una sola muestra uniforme Fuente.

Se deben tener en cuenta varios pasos críticos al realizar este método. En primer lugar, las patas murinas deben cortarse en la línea de piel durante la cosecha de tejido y se deben evitar grandes cantidades de pelo. El cabello excesivo puede obstruir las columnas durante la extracción de ARN e interferir con la extracción de proteínas. En segundo lugar, los tubos, fórceps y espátulas deben mantenerse en hielo seco durante todo el procedimiento, ya que la temperatura elevada en polvos tisulares convertirá rápidamente el material en "lodo" amorfo y la integridad de la proteína y el ARN se verá comprometida. En tercer lugar, la cantidad de polvo de tejido utilizado para la extracción de proteínas o ARN debe optimizarse cuidadosamente. Más polvo de tejido no siempre puede proporcionar un mayor rendimiento, pero puede causar problemas adicionales en el procesamiento aguas abajo, incluyendo obstrucción de columnas de aislamiento de ARN, alterar la relación DNase / ADN (si se emplea este paso) para evitar la degradación completa del ADN. Por último, la normalización de la entrada de proteínas y ARN debe ser una parte integral del flujo de trabajo y el análisis de datos. La variabilidad en la carga tisular puede enmascarar significativamente los cambios en los niveles relativos de proteína y ARN. Además de la proteína total o el ARN total, la expresión de los genes de limpieza también puede considerarse como anclajes para la normalización.

A través de un extenso proceso de prueba y error, hemos identificado algunos posibles problemas frecuentes para los usuarios por primera vez de este método. Puede haber bajo rendimiento de ARN. Esto es a menudo el resultado de sobrecargar la columna con demasiado extracto de tejido. La cantidad de tejido por columna y la proporción de RLT/polvo son cruciales para aislamientos eficientes de ARN. Hemos encontrado que algunos kits comerciales de extracción de pozos 96 pueden no funcionar para este proceso, ya que las muestras no girarán a través de la columna a una velocidad equivalente, comprometiendo así estas muestras en pasos de lavado y elución aguas abajo. Puede haber alta variabilidad en la concentración de proteínas en el análisis de BCA y las concentraciones de citoquinas en el análisis de Luminex. Si no hay problemas con el BCA o el proceso de Luminex, por lo general es causado por grasa u otros contaminantes en el extracto de proteína. Es importante evitar la capa de grasa en la parte superior o la materia insoluble en la parte inferior de los tubos de microcentrífuga al cosechar para la extracción de proteínas. Si es necesario, repita el giro y recoja los sobrenatantes para el análisis posterior.

Dado que este método implica un molino de congelador criogénico especializado y grandes cantidades de hielo seco y nitrógeno líquido, deben tenerse en cuenta medidas de seguridad adicionales. Siempre se debe usar un equipo de protección personal adecuado, incluidos gafas de seguridad, batas de laboratorio y guantes criogénicos, para evitar posibles quemaduras por congelación y lesiones debidas a la explosión. La generación de aerosoles también debe minimizarse y se recomienda el uso de carcasas de equilibrio ventilado. Por último, de forma similar a cualquier otro protocolo que manipule tejidos animales, se debe tener cuidado de eliminar adecuadamente todas las muestras de tejido no utilizadas, mientras que los tubos reutilizables deben descontaminarse antes de la limpieza.

Si bien el método tiene muchas ventajas sobre los métodos convencionales, todavía alberga algunas limitaciones. El perfil de transcriptoma de una pata entera murina se superpone significativamente con el perfil de transcriptoma de la biopsia sinovial humana (datos no mostrados). El ARNm adicional del músculo, la piel y la médula ósea podría diluir las señales del tejido sinovial. Una solución alternativa es recoger tejido sinovial murino a través de microdisección láser, que se puede realizar en las articulaciones de ratón incrustadas OCT. Sin embargo, el bajo rendimiento y la cantidad relativamente pequeña de tejido limitan la amplia aplicación para la microdisección láser. Además, incluso con una automatización significativa, este método sigue siendo bastante laborioso. Se necesitan al menos 8 h para procesar 30-60 muestras con la ayuda de 3-4 investigadores. Por último, este método requiere grandes cantidades de nitrógeno líquido (10-15 L para el procesamiento de 30-60 muestras).

En la descripción del método anterior, se demostró la evaluación de los análisis de puntos finales proteómicos y transcripcionales. Sin embargo, una variable adicional, como lipidómica, metabolómica y pequeño perfildeo de ARN podría ser de interés para la comunidad de investigación de artritis en general.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mm stainless steel bead	Qiagen	69989
beta-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit	Agilent	5067-1511	RNA qualification kit
b-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CI	Water
Cell lysis stock solution	Cell Signaling	9803
Eppendorf Tube	Eppendorf	22363204	Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box	Nalgene	5055	Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
Freezer Mill	Spex Sample Prep	6875	Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial	Spex Sample Prep	6801	Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Protease Inhibitors
Protein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Centrifugation
RLT Buffer	Qiagen	79216	RNA extraction buffer
RNeasy mini kit	Qiagen	74104	including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatula	VWR	10806-412	Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead	Qiagen	69989	Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor	Spex Sample Prep	6884	Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer	VWR	10153-838	Sample mixing