Summary
Dokulardan çıkarılan RNA veya proteinin verimini ve kalitesini artırmak ve inflamatuar profillerle ilişkili moleküler profillerin analizini sağlamak için sıvı nitrojen dondurucu değirmeni kullanarak murine patilerini işlemek için kriyojenik pulverizasyon yöntemi geliştirilmiştir. Yanıt.
Abstract
Lokal dokularda moleküler değişikliklerin profilini çıkarmak, terapötik adayların in vivo eylem mekanizmasını anlamak için çok önemlidir. Artrit araştırma alanında, birçok çalışma kemik, kıkırdak, kas, stromal hücreleri ve bağışıklık hücrelerinin karmaşık bir karışımından oluşan iltihaplı eklemler üzerinde durulmuştur. Burada, iltihaplı fare patilerini kriyojenik kontrollü bir ortamda homojen toz haline getirmek için güvenilir ve sağlam bir mekanik yöntem oluşturduk. Proteomik ve transkripsiyonel uç noktaları ve lokal dokudaki ilgili hastalık yollarının moleküler karakterizasyonu için protein ve RNA lysates işlendi.
Introduction
Romatoid artrit (RA) eklemlerde kalıcı simetrik sinovit ve deri, kalp, akciğer ve göz gibi organların ekstra eklem tutulumu ile kronik sistemik inflamatuar bir hastalıktır1. Bağışıklık yanıtının sistemik bulguları insan hastalarda belirgin olmakla birlikte, RA patolojisinin özelliklerinden biri sinovyal dokuda immün hücrelerin infiltrasyonu ve sinovyal fibroblast hücrelerinin çoğalmasıdır2.
Insan RA benzer, fare kollajen indüklenen artrit (CIA) modeli sinovyal dokular ve sistemik bölmelerde aktif bağışıklık yanıtları ile güçlü doku iltihabı ortaya çıkarır. Cia modeline farklı fare suşlarının duyarlılığı Majör Histokompatibilite Kompleksi (MHC) haplotip ve antijen spesifik T hücresi ve B hücre etkileşimleri3,4bağlantılar . Buna ek olarak, otoantikor üretimi, immün kompleks birikimi, miyeloid hücre aktivasyonu, poliartiküler bulgular ve sinovyal immün infiltrasyon ile pannus oluşumu da dahil olmak üzere insan RA birçok patojenik yollar da bu modelde belirgindir 5,6. Müfettişler anti-inflamatuar sitokin tedavileri etkilerini araştırmak için bu köklü CIA modeli istihdam var7. Anti-TNFα ve anti-IL-6 gibi otoimmün veya inflamatuar hastalıklar için onaylanmış birçok biyolojik, CIA modeli nde etkili olduğu bulunmuştur8,9.
Sinovyal dokuda bağışıklık sisteminin etkileşimlerinin profilini ra patogenezi ile ilişkili moleküler mekanizmaları açıklamak için çok önemlidir. İnsan klinik ortamında, yaygın bir uygulama ultrason görüntüleme gözetiminde iğne sinovyal biyopsi yapmaktır. Preklinik ortamlarda, murine eklemlerin küçük mimarisi imkansız olmasa bile biyopsi prosedürleriçok daha zor hale getirir. Son zamanlarda, farklı uç noktaları etkilemek ve bir kombinatoryal yaklaşım10hastalığı çözmek için ilaçların kombinasyonları değerlendirmek için murine CIA modelinin kullanımını gösterdi. Bir kriyojenik dondurucu değirmen tabanlı pulverizasyon yöntemi homojen ince tozlar içine iltihaplı murine pençeleri işlemek için kullanılan ve RNA ve proteinleri ayıklamak için aşağı süreçleri kuruldu. Bu yöntem, RNA ve proteini enzimatik ve kimyasal degratif proseslerden korur ve tek bir homojenize örnek kaynağına birden fazla analitik yöntem uygulamamızı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Janssen Ar-Ge Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) politikaları doğrultusunda yapılmıştır.
1. Kriyojenik Dondurucu Değirmen bazlı Pulverizasyon Yöntemi
- CIA çalışmasının sona ermesiyle, %1.5 isofluran ile kurban fareleri ve ardından servikal çıkış lar devam eder.
- Doku işleme gününde, en az 10 dakika boyunca kuru buz üzerinde tüm aletleri (spatulalar, öğütme şişeleri, vb.) önceden soğutun.
- Şekil 1A'datasvir edildiği gibi kürk hattında bir makas ile kesilmiş arka pençeleri .
- Her pençeyi bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın, sıvı nitrojende hemen dondurun ve dondurulmuş pençeleri -80 °C'de saklayın. Örnekleri bir haftadan fazla dondurulmayın.
- Dondurucu değirmenini Şekil 1B'de gösterildiği gibi sıvı nitrojenle doldurun ve en az 10 dakika boyunca dengelesin.
- İşlenmemiş numuneyi kuru buzda saklayın ve donma-çözülme döngülerinden kaçının.
- Bir arka pençeyi, bir alt çelik fiş ile önceden soğutulmuş büyük polikarbonat taşlama şişesine aktarın, önceden soğutulmuş çelik darbeciyi takın ve polikarbonat taşlama şişesini önceden soğutulmuş üst çelik fiş ile kapatın(Şekil 1C).
- Numunelerle birlikte büyük polikarbonat taşlama şişelerini önceden sıvı dolu dondurucu değirmenine aktarın ve kapağı enstrümanın önünde bulunan kauçuk tokayla kapatın.
- Numuneler sıvı nitrojende 1 dakika soğumaya bırakın.
- Dondurucu değirmenini saniyede 10 döngü ile 1 dakikalık programa ayarlayın ve başlat düğmesine basın. Dondurucu değirmeninin döngüsünü tamamlamasını bekleyin.
NOT: Makine, çelik darbeci ileri geri hareket ettikçe bir davul sesi çıkarır. İşitme kaybını önlemek için kulak tıkacı kullanın. - Dondurucu değirmeninin kapağını açın, büyük polikarbonat öğütme şişesini çıkarve Şekil 1D'detasvir edildiği gibi bir çıkarıcıya yerleştirin. Çelik fiş polikarbonat tüpten kayana kadar siyah tutamak üzerine aşağı doğru basınç yerleştirerek üst çelik fişi çıkarın.
- Açılan büyük polikarbonat öğütme şişesini kuru buzüzerine aktarın. Önceden soğutulmuş çalgılarla çelik darbeyi çıkarın.
- Dondurulmuş tozu önceden soğutulmuş 50 mL konik tüpe aktarın.
- Ağırlık 30-50 mg dondurulmuş toz bir katranlı dondurulmuş içine mg 1.5 RNa ekstraksiyon ve protein ekstraksiyonu için dondurulmuş toz 100-200 mg.
NOT: Dondurulmuş toz Şekil 1E'debetimlenen beyaz veya açık pembe ince kum gibi görünmelidir. - Toz haline getirilmiş numuneleri -80 °C'de saklayın ve 24 saat içinde RNA ve protein izolasyonlarına ilerleyin.
2. RNA Çıkarma
- RLT tamponunun 1 mL'si başına 10 μL β-mercaptoetanol (β-ME) ekleyin.
- Doku 23.3 mL/mg oranına karşılık gelen RLT Tampon hacmini hesaplayın ve dondurulmuş toz ile tüpe β-ME ile uygun RLT Tampon hacmini ekleyin. Bu oran deneysel olarak fare pençeleri için ideal olarak belirlenmiştir.
- 10 s için 3.000 RPM de örnek girdap.
- 1 mL pipettor ile 10 kat daha güçlü bir şekilde yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak iyice karıştırın.
- 20 s için 3.000 RPM tekrar örnek girdap.
- Tüpü 13.000 x g'de 2 dk santrifüj edin.
- Süpernatantların 700 μL'sini yeni bir tüpe aktarın ve %70 etanol 700°L ekleyin.
NOT: Eğer <700 μL tüpteyse, %70 etanol eşdeğer hacim ekleyerek devam etmek kabul edilebilir. - Numunenin 700 μL'sini bir RNA arıtma sütununa yükleyin.
- Tüpü ≥10.000 x g'de 30 s için santrifüj edin.
- Akış tan atın ve numunenin kalan kısmını RNeasy sütununa yükleyin.
- Tüpü ≥10.000 x g'de 30 s için santrifüj edin.
- 30 s için ≥10.000 x g santrifüj ile 700 μL RW1 tampon ekleyerek akışı atın ve yıkayın. DNASE sindirimi seçeneği gerçekleştirilmesi durumunda, DNASE tedavisinden önce 350 μL RW1 eklenir. DNASE tedavisinden sonra 350 μL rw1 ilave edilir.
- İsteğe bağlı) Üreticinin talimatlarına uyarak bir DNase sindirim adımı gerçekleştirin.
- Tüpü 500 μL RPE tamponu ekleyerek iki kez yıkayın ve ardından 30 s. Her seferinde akışı atın ≥10.000 x g'de santrifüj edin.
- 2 dk için ≥10.000 x g'de kolona santrifüj ile kurutun.
- Elute RNA 2 dk. için ≥10.000 x g santrifüjlü 50 μL su ekleyerek akışı toplayın ve yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
- Daha fazla analiz den önce araştırmacının tercih edilen yöntemini kullanarak RNA miktarını belirleyin ve -80 °C'de saklayın.
3. Protein Ekstraksiyonu
- Hücre kültürü sınıf su kullanarak 1x hücre lisis stok çözeltisi 10x hücre lisis stok çözeltisi seyreltin.
- 100x proteaz inhibitör stok yapmak için 1 mL su ile Proteaz Inhibitör Kokteyl Seti I yeniden.
- 1x son stok çözeltisi yapmak için 9,9 mL 1x Hücre lisisine 100 μL proteaz inhibitörü ekleyin.
- Mg doku tozu başına 4 μL buz gibi 1x Hücreli Lysis Tampon ekleyin (örneğin, 800 μL lysis tampon 200 mg doku tozu).
- Boruya bir adet 5 mm paslanmaz çelik boncuk ekleyin.
- Girdap tüp 3.000 RPM 60 s. ıslak buz için tüp aktarın ve bir sonraki örnek devam.
- Tüm numune tüplerini bir kutuya yerleştirin ve santrifüj kutusunu 1.000 RPM,4 °C'de bir rockçının üzerinde 1 saat boyunca sallayın.
NOT: Araştırmacılar kutuyu dikey olarak yerleştirmenin boncukla daha iyi karışmayı kolaylaştırabileceğini görebilirler. - Tüpleri 10.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüj edin.
- Supernatants taze bir tüp içine aktarın ve üst yağ tabakası kaçının.
- Toplam protein konsantrasyonu belirleyin. 10-30 kat protein lisatseyreltmeleri BCA testi için idealdir.
- Numuneyi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe yerleştirin ve daha fazla analiz den önce -80 °C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, Şekil 2A'daCIA farelerinin ön pençelerinden çıkarılan RNA'nın temsili bir jel görüntü görselleştirmesini gösteriyoruz. 28S rRNA ve 18S rRNA bandı tüm numunelerin yeterli miktarda sağlam RNA'ya sahip olduğunu göstermektedir. Daha sonra Şekil 2B'deprotein BCA analizine dayalı toplam protein konsantrasyonlarının temsili bir dağılım çizimi gösteriş. Çeşitli tedaviler altında naif fareler, CIA fareler veya CIA fareler toplam protein konsantrasyonları gruplar arasında karşılaştırılabilir. Protein ekstresindeki inflamatuar sitokin ve kemokin konsantrasyonlarını belirlemek için Luminex analizleri yapıldı. Şekil 2C'denormalleştirilmiş sitokin ve kemokin konsantrasyonlarının (pg/mg total protein) temsili bir dağılım grafiğini gösteriyoruz. Naif fareler ile karşılaştırıldığında, birkaç sitokinler CIA farelerde yükselir ve anti-IL17A antikor ile tedavi önemli ölçüde birkaç sitokin üretimini inhibe. CIA'deki transkripsiyon değişikliklerini ve tedaviye bağlı etkileri değerlendirmek için mikrodizi analizi yapıldı. Cia farelerinde Şekil 2D'deki saf farelere göre önemli ölçüde artmış genlerin temsili bir ısı haritasıçizimigösteriyoruz.
Şekil 1: Murine pençelerini toz haline getirmek için gerekli ekipman. (A) CIA veya naif farelerin iltihaplı veya iltihapsız pençeleri. (B) Sıvı nitrojen Dewar dondurucu değirmenin paslanmaz çelik banyo doldurmak için kullanılır. (C) Monte edilmiş dondurucu değirmen tüp seti. (D) Dondurucu değirmen tüp açacağı. (E) Murine pençelerinden pulverize doku. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Pulverize murine pençelerinden protein ve RNA analizine ilişkin temsili veriler. (A) RNA bütünlüğünün gel görüntü görselleştirmesi. (B) Farklı gruplardan toplam protein konsantrasyonları. (C) Farklı gruplardan keokin ve sitokin ekspresyonu (Luminex). (D) Farklı tedavi gruplarından mikrodizi analizihiyerarşik kümeleme ısı haritası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sinovyal dokularda moleküler yolları değerlendirmek için güçlü bir bilimsel mantık olmasına rağmen, murine CIA modelinin immün profilleme birçok rapor periferik kan üzerinde duruldu, iltihaplı pençeleri protein ve RNA analiz verileri oldukça sınırlıdır iken. Bu önyargı için birkaç olası nedeni vardır: murine ayak bileği eklemleri ~ 2 cm daha büyüktür; etkilenen alanlar genellikle doku öğütücüler, havaneli ve harç, silika boncuk bozulması, triturasyon veya enzimatik sindirim gibi geleneksel yöntemler kullanılarak homojenize etmek zor deri, kemik ve bağ dokuları oluşur. Bu yöntemler genellikle proteolitik ve nükleik asit bozulması nedeniyle eksik homojenizasyon, düşük protein veya RNA verimi veya tutarsız kalite ile sonuçlanır. Burada açıklanan sağlam yöntem, tek bir tek tip örnekten hastalığın moleküler izlerini oluşturmak için proteomik ve transkripsiyonel profil oluşturma çabalarını sağlamak için homojen tozhaline getirilmiş dondurulmuş toz oluşturmak için ayrıntılı bir prosedür sağlar Kaynak.
Bu yöntemi gerçekleştirirken birkaç kritik adım düşünülmelidir. Öncelikle doku hasadı sırasında kürk hattında nürnisi pençeleri kesilmeli ve büyük miktarda saçtan kaçınılmalıdır. Aşırı saç RNA çıkarma sırasında sütunları tıkayabilir ve protein ekstraksiyonu engelleyebilir. İkinci olarak, tüpler, forsepsler ve spatulalar işlem boyunca kuru buzda tutulmalıdır, çünkü doku tozlarında yüksek sıcaklık malzemeyi hızlı bir şekilde amorf "çamura" dönüştürür ve protein ve RNA'nın bütünlüğü tehlikeye girer. Üçüncü olarak, protein veya RNA ekstraksiyonu için kullanılan doku tozu miktarı dikkatle optimize edilmelidir. Daha fazla doku tozu her zaman daha yüksek verim sağlamayabilir, ancak tam DNA bozulmasını önlemek için DNa izolasyon kolonlarının tıkanması, DNa/DNA oranının değiştirilmesi (bu adım kullanılırsa) dahil olmak üzere akış aşağı işlemede ek sorunlara neden olabilir. Son olarak, protein ve RNA girdisinin normalleştirilmesi iş akışı ve veri analizinin ayrılmaz bir parçası olmalıdır. Doku yükündeki değişkenlik, bağıl protein ve RNA düzeylerindeki değişiklikleri önemli ölçüde maskeleyebilir. Total protein veya total RNA'ya ek olarak, temizlik genlerinin ekspresyonu da normalleşme için çapa olarak düşünülebilir.
Kapsamlı deneme yanılma işlemi sayesinde, bu yöntemin ilk kez kullananlar için bazı olası sık sorunları tespit ettik. RNA'nın verimi düşük olabilir. Bu genellikle çok fazla doku ekstresi ile sütun aşırı yükleme sonucudur. Kolon başına doku miktarı ve RLT/toz oranı verimli RNA izolasyonları için çok önemlidir. Bazı ticari 96 kuyu çıkarma kitlerinin bu işlem için işe yaramayabileceğini, çünkü numunelerin sütunda eşdeğer bir oranda dönmeyeceğini, böylece bu numunelerin aşağı yıkama ve elüsasyon adımlarında ödün verdiğini bulduk. BCA analizinde protein konsantrasyonu ve Luminex analizinde sitokin konsantrasyonlarında yüksek değişkenlik olabilir. BCA veya Luminex süreci ile herhangi bir sorun varsa, genellikle protein ekstresinde yağ veya diğer kirleticiler neden olur. Protein ekstraksiyonu için hasat yaparken mikrosantrifüj tüplerinin alt kısmındaki yağ tabakasından veya çözünmez maddeden kaçınmak önemlidir. Gerekirse, spini tekrarlayın ve akış aşağı analizi için süpernatants toplayın.
Bu yöntem özel bir kriyojenik dondurucu değirmeni ve büyük miktarlarda kuru buz ve sıvı azot içerdiğinden, ek güvenlik önlemleri göz önünde bulundurulmalıdır. Güvenlik gözlükleri, laboratuvar önlükleri ve kriyojenik eldivenler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruma ekipmanları, patlamaya bağlı potansiyel donma yanıklarını ve yaralanmayı önlemek için her zaman giyilmelidir. Aerosol üretimi de en aza indirilmeli ve havalandırmalı denge muhafazalarının kullanılması tavsiye edilir. Son olarak, hayvan dokuları işleme diğer protokoller gibi, bakım düzgün tüm kullanılmayan doku örnekleri bertaraf etmek için alınmalıdır, yeniden kullanılabilir tüpler temizlemeden önce dekontamine gerekir iken.
Yöntem geleneksel yöntemlere göre birçok avantajı olsa da, hala bazı sınırlamalar barındırMaktadır. Bir murine bütün pençe gelen transkripsiyon profili önemli ölçüde insan sinovyal biyopsi (veri gösterilmez) transkripsiyon profili ile örtüşmektedir. Kas, deri ve kemik iliğinden gelen ek mRNA sinovyal dokudan gelen sinyalleri seyreltebilir. Alternatif bir çözüm lazer mikrodisze ile murine sinovyal doku toplamaktır, HANGI OCT gömülü fare eklemleri üzerinde yapılabilir. Ancak, düşük iş miktarı ve doku nispeten küçük miktarda lazer mikrodisseksi için geniş uygulama sınırlar. Ayrıca, önemli otomasyon bile, bu yöntem hala oldukça emek yoğundur. 3-4 araştırmacının yardımıyla 30-60 numunenin işlenmesi en az 8 saat sürer. Son olarak, bu yöntem sıvı azot büyük miktarlarda gerektirir (~ 10-15 L 30-60 örnekleri işlemek için).
Önceki yöntem açıklamasında proteomik ve transkripsiyonel uç nokta analizlerinin değerlendirilmesi gösterilmiştir. Ancak, ek uç nokta, lipidomik gibi, metabolomik ve küçük RNA profilleme geniş artrit araştırma topluluğu için ilgi olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BJ, SH, ML, RM, ML, TO ve FS yazarları Janssen Research & Development Inc.'in çalışanlarıdır ve ana şirket Johnson & Johnson, Inc.'in hissedarlarıdır.
Acknowledgments
Yazarlar edith Janssen el yazması ve Navin Rao ve Jennifer Towne eleştirel inceleme için bu makalenin yayınlanmasına destek için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).
- Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).
- David, C. S., Taneja, V. Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis. American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).
- Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. Rheumatoid factors in mice. Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).
- Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma. Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).
- Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra. Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).
- Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. Animal models of rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).
- Williams, R. O. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis. Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).
- Shen, F., et al. Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice. Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).
