Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Summary

Hier beschreiben wir eine In-vitro-Live-Imaging-Methode zur Visualisierung des intrazellulären Transports von Organellen und des Handels mit Plasmamembranproteinen in murinen Astrozyten. Dieses Protokoll stellt auch eine Bildanalysemethodik zur Bestimmung von Frachttransportrouten und Kinetik dar.

Abstract

Astrozyten gehören zu den häufigsten Zelltypen im erwachsenen Gehirn, wo sie eine Schlüsselrolle in einer Vielzahl von Funktionen spielen. Als zentraler Akteur bei der Homöostase des Gehirns versorgen Astrozyten Neuronen mit lebenswichtigen Metaboliten und puffern extrazelluläres Wasser, Ionen und Glutamat. Astrozyten sind ein integraler Bestandteil der "Tripartiten"-Synapse und sind auch entscheidend für die Bildung, Beschnitt, Wartung und Modulation von Synapsen. Um diese hochinteraktiven Funktionen zu ermöglichen, kommunizieren Astrozyten untereinander und mit anderen Gliazellen, Neuronen, der Gehirnvaskulatur und der extrazellulären Umgebung durch eine Vielzahl von spezialisierten Membranproteinen, die Zell Adhäsionsmoleküle, Aquaporine, Ionenkanäle, Neurotransmitter-Transporter und Spaltknotenmoleküle. Um diesen dynamischen Fluss zu unterstützen, verlassen sich Astrozyten, wie Neuronen, auf eng koordinierten und effizienten intrazellulären Transport. Im Gegensatz zu Neuronen, wo der intrazelluläre Handel umfassend abgegrenzt wurde, wurde der mikrotubulierbasierte Transport in Astrozyten weniger untersucht. Nichtsdestotrotz orchestriert der exo- und endozytische Handel mit Zellmembranproteinen und intrazellulären Organellentransporten die normale Biologie von Astrozyten, und diese Prozesse sind oft bei Krankheiten oder als Reaktion auf Verletzungen betroffen. Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll zur Kultur hochwertiger muriner Astrozyten, zur fluoreszierenden Kennzeichnung von astrozytären Proteinen und Organellen von Interesse und zur Aufzeichnung ihrer intrazellulären Transportdynamik mittels zeitrafferkonfokaler Mikroskopie. Wir zeigen auch, wie man relevante Transportparameter aus den aufgenommenen Filmen mit verfügbaren Bildanalyse-Software (d.h. ImageJ/FIJI) Plugins extrahiert und quantifiziert.

Introduction

Astrozyten sind die am häufigsten vorkommenden Zellen im erwachsenen Zentralnervensystem, wo sie einzigartige entwicklungs- und heimostatische Funktionen ausführen¹. Astrozyten modulieren synaptische Entwicklung durch direkten Kontakt mit prä- und postsynaptischen Terminals als Teil der Tripartit-Synapse, die Neurotransmitter-Rezeptoren, Transporter und Zelladhäsionsmoleküle enthält, die die Synapsenbildung erleichtern und Neuron-Astrozyten-Kommunikation². Darüber hinaus steuern Astrozyten aktiv die synaptische Übertragung und verhindern neuronale Exzitotoxizität, indem sie exzitatorische Neurotransmitter schnell aus dem synaptischen Spalten entfernen, Neurotransmitter recyceln und an synaptischem Schnitt teilnehmen^{3 , 4 , 5 , 6}. Um diese hochinteraktiven Funktionen zu ermöglichen, kommunizieren Astrozyten untereinander, mit anderen Gliazellen und mit Neuronen durch spezialisierte Membranproteine, einschließlich Zelladhäsionsmoleküle, Aquaporine, Ionenkanäle, Neurotransmitter-Transporter und Lückenknotenmoleküle. Astrozyten verändern aktiv die Oberflächenniveaus dieser Proteine als Reaktion auf Schwankungen in ihrer intra- und extrazellulären Umgebung⁷. Darüber hinaus modulieren Veränderungen in den Konzentrationen und der Verteilung von Mitochondrien, Lipidtröpfchen und abbauenden und recycelnden Organellen die Energieversorgung, die Verfügbarkeit von Metaboliten und zelluläre Clearingprozesse, die für die Astrozytenfunktion und überleben.

Die dynamischen Veränderungen des Membranprotein- und Organellenhandels und der Positionierung in Astrozyten werden durch die konzertierte Funktion von motorischen Proteinen und Adaptern erleichtert, die die Beweglichkeit^derLadung 8^,9fördern. In ähnlicher Weise werden die Oberflächenniveaus von Membranproteinen durch Internalisierung simonieren und Recyceln¹⁰moduliert. Diese Ladungen werden über ein kompliziertes Netz von Actin, Mikrotubuliund möglicherweise Zwischenfilamenten 8 transportiert. Studien auf der Grundlage der Immunfluoreszenzfärbung des Endbindungsproteins 1 (EB1), das sich an den wachsenden Mikrotubuli plus Enden ansammelt, deuten darauf hin, dass in Astrozyten Bündel von Mikrotubuli aus dem Perinucleus ausstrahlen und ihr Plus-Ende in Richtung Peripherie¹¹. Eine umfassende Untersuchung der Organisation und Polarität von Mikrotubuli und anderen zytoskelettalen Elementen mittels Live-Zell-Bildgebung fehlt jedoch noch. Während viele der Mechanismen, die der Dynamik von Organellen und Membranproteinen zugrunde liegen, ausgiebig in Neuronen und anderen Zelltypen untersucht wurden, ist die Beweglichkeit der Ladung in Astrozyten weniger gut verstanden. Der größte Teil unseres derzeitigen Wissens über Veränderungen der Protein- und Organellenverteilung in Astrozyten basiert auf der traditionellen Antikörper-basierten Kennzeichnung fester Zubereitung, die eine genaue räumliche und zeitliche Untersuchung der Ladungsdynamik ausschließt^{7, 12}.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Kennzeichnung von Membranproteinen und Organellen für live-Bildgebung in hochreinen primären Maus-Astrozytenkulturen. Anhand dieses Protokolls liefern wir Beispiele, in denen wir die dynamische Lokalisierung von grünen fluoreszierenden Proteinen (GFP) verfolgen, die mit Membranproteinen in transfizierten Astrozyten getaggt sind, einschließlich des Spaltknotenproteins Connexin 43 (Cx43-GFP) und der exzitatorischen Aminosäure Transporter 1 (EAAT1-GFP). Wir beschreiben auch die Verwendung einer fluoreszierenden säureotropen Sonde, um saure Organellen zu visualisieren und deren Handelsdynamik in lebenden Astrozyten zu verfolgen. Abschließend zeigen wir, wie die Zeitrafferdaten analysiert werden, um Transportparameter für einzelne Ladungen zu extrahieren und auszuwerten.

Protocol

Alle tierischen Eingriffe wurden mit Genehmigung der University of North Carolina im Chapel Hill Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt.

1. Hirnsektion und Kultur der primären Mausastrozyten

HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde von veröffentlichten Methoden angepasst, die dem ursprünglichen Verfahren folgen, das von McCarthy und deVellis^13,14,15entwickelt wurde. Gemischte Zellkulturen von McCarthy/deVellis (MD)-Astrozyten werden aus postnatalen Tag 2-4 (P2-P4) Mauskortika hergestellt, mit einem anti-mitotischen Faktor behandelt und gereinigt, um die endgültige angereicherte Astrozytenkultur zu ergeben. Vier Kortiken von Mauswelpen beiderGeschlechter reichen aus, um eine T75-Gewebekultur-Kulturzufaltkultur zu erzeugen.

1. Den Boden der T75-Kolben (100% abgewinkelter Nackenzugang, 0,22 m hydrophobe belüftete Filterkappe) mit Poly-D-Lysin (1 mg/ml in 0,1 M Tris-Puffer, pH 8,5) beschichten und bei 37 °C für 24 h vor Beginn der Zerlegung inkubieren.
2. Vor Beginn des Dissektionsverfahrens, warm 30 ml Astrozytenkulturmedien (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium [DMEM] hohe Glukose, 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum, 1% Penicillin/Streptomycin) bei 37 °C und tauen eine 5 ml Aliquot von 2,5% Trypsin auf Eis auf. Bereiten Sie zwei Sezieren desiede Schalen (60 mm Durchmesser) auf Eis vor, gefüllt mit 6 ml Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) ohne Ca²⁺ oder Mg²⁺.
3. Desinfizieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge (Feinspitzen-Pinzette, Schere, Vannas Schere gerade, Graefe Zange mit gekrümmten Spitzen) in 70% Ethanol vor und zwischen jeder Sebung.
4. Sprühen Sie Kopf und Hals der P2-P4-Mauswelpen mit 70% Ethanol, bevor Sie sie durch Enthauptung mit einer chirurgischen Schere schnell einschläfern. Führen Sie einen hinteren bis vorderen Mittellinienschnitt entlang der Kopfhaut durch, um den Schädel freizulegen. Schneiden Sie den Schädel vorsichtig vom Hals bis zur Nase.
5. Führen Sie zwei zusätzliche seitliche Einschnitte von den Augen aus. Mit feiner Spitzenpinzette kippen Sie die Schädelklappen vorsichtig zur Seite. Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie es in die erste Sezieren Schale gefüllt mit eiskalten HBSS ohne Ca²⁺ oder Mg²⁺. Halten Sie das Gericht auf Eis und weiter ernten sie den Rest des Gehirns.
   HINWEIS: Führen Sie den Rest der Sezierprozedur in einem Sezierbereich aus.
6. Entfernen Sie die Olfaktor-Lampen mit Vannas Schere oder feine Pinzette (Abbildung 1Ai). Mit den gekrümmten Spitzenzangen am Schnittpunkt der Quer- und Interhämisphärischen Risse, legen Sie vorsichtig ein zweites Paar gekrümmter Spitzenzange zwischen dem Kortex und diencephalon, langsam öffnen die Zange, um die zerebralen Hemisphären vom Rest der das Gehirn (Abbildung 1Aii,Aiii). Entfernen Sie das unerwünschte Gewebe (Abbildung 1Aiv).
7. Für jede kortikale Hemisphäre, entfernen Sie vorsichtig die Meninges mit feiner SpitzenPinzette. Optional entfernen Sie den Hippocampus aus den Kortiken. Übertragen Sie die sezierten Mauskortika in eine zweite Schale, gefüllt mit eiskaltem HBSS ohne Ca²⁺ oder Mg^2+, und halten Sie sie auf Eis, während Sie die restlichen Gehirne sezieren.
   HINWEIS: Führen Sie die nächsten Schritte unter aseptischen Bedingungen in einer laminaren Durchflusshaube durch.
8. Schneiden Sie die sezierten Kortiken mit einer sterilen scharfen chirurgischen Schere oder einem Skalpell in kleine Stücke (ca. 2 x 4 mm). Übertragen Sie das sezierte Gewebe in eine 50 ml konische Röhre, die Enzymlösung enthält (22,5 ml HBSS ohne Ca²⁺ oder Mg^2+,2,5 ml 2,5% Trypsin). Bei 37 °C für 30 min mit sanfter Inversion alle 10 min inkubieren.
9. Sammeln Sie das verdaute Gewebe durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min und entfernen Sie die Enzymlösung durch Dekantation (verwenden Sie keinen Vakuum-Aspirator). Fügen Sie 10 ml Astrozytenkulturmedien hinzu und dissoziieren Sie das Gewebe in einzelne Zellen, indem Sie die Lösung 20 bis 30x mit einer 10 ml serologischen Pipette pipetieren.
10. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-m-Zellsieb, um Zellklumpen und unverdautes Gewebe zu minimieren. Sammeln Sie das Filtrat in einem sauberen 50 ml konischen Rohr und passen Sie das Gesamtvolumen auf 20 ml mit Astrozytenkulturmedien an. Bewerten Sie an dieser Stelle die Effizienz der kortikalen Dissoziation, indem Sie 10 l der Zellsuspension mit 10 l Trypanblau und Zählzellen mit einem Hämozytometer mischen.
    HINWEIS: Ein Präparat aus vier P2-P4-Mauskortika ergibt 10 x 15 x 10⁶ Einzelzellen.
11. Die Poly-D-Lysin-Beschichtungslösung aus den T75-Kulturkolben ansaugen und zweimal mit sterilem Wasser waschen. Die 20 ml Zellsuspension verfestigen und bei 37°C und 5% CO2 inkubieren.

2. Reinigung und Pflege von Astrozytenkulturen

HINWEIS: Führen Sie alle Medienänderungen unter aseptischen Bedingungen in einer laminaren Durchflusshaube mit sterilgefilterten (0,22 m Filtermembran) auf 37 °C erwärmten Astrozytenmedien durch.

1. Ersetzen Sie das Zellmedium 48 h nach der Beschichtung (Tag in vitro 2, DIV2).
2. Ersetzen Sie bei DIV5 die Medien durch frische Astrozytenkulturmedien, die durch 10 M Cytosin-Arabinosid (AraC) ergänzt werden.
   HINWEIS: Dieser Schritt erleichtert die Entfernung von Schadstoffzellen, einschließlich Fibroblasten und anderen Gliazellen. Es ist wichtig, die Kulturen mit AraC nicht länger als 48 h zu behandeln, da längere Inkubationszeiten die Astrozytenlebensfähigkeit reduzierenwerden.
3. Wechseln Sie bei DIV7 Medien zu Astrozytenkulturmedien ohne AraC und beginnen Sie täglich, die Kulturzusammenfluss zu überprüfen. Sobald die Zellen 80 % Zusammenfluss erreicht haben, schichten Sie zwei-T75-Flaschen für jeden ungereinigten Astrozyten-Kulturkolben mit Poly-D-Lysin und inkubieren sie bei 37 °C für mindestens 8 h bis über Nacht.
4. Beginnen Sie am nächsten Tag mit der Astrozytenreinigung, indem Sie die Kulturkolben 30 min lang in einem 37 °C-Orbital-Shaking-Inkubator bei 180 U/min schütteln. Entfernen Sie die Medien und ersetzen Sie sie durch neue Astrozytenkulturmedien. Schütteln Sie Zellen bei 240 Umdrehungen pro Minute für 6 h in einem 37 °C Orbital-Shaking-Inkubator. Vorwarme 1x phosphatgepufferte Saline (PBS), Astrozytenkulturmedien und 0,25% Trypsin-EDTA bis 37 °C 20 bis 30 min vor dem Ende der Schüttelzeit.
   HINWEIS: EineCO2-Inkubationist während der Schüttelschritte nicht erforderlich. Auf Wunsch können die nach den 30-min- und 6-h-Schüttelungsschritten gesammelten Medien zur Kultur von Mikroglia bzw. Oligodendrozyten verwendet werden. Die AraC-Behandlung der Mischkultur wird jedoch die Fülle der anderen Gliazellen verringern.
5. Entfernen Sie die Kulturkolben aus dem Shaker und ersetzen Sie das Medium sofort durch 10 ml warme 1x PBS pro Kolben. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 3 ml von 0,25% Trypsin-EDTA pro Kolben hinzu. Bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren, alle 5 min auf Ablösung prüfen.
6. Sobald sich zellenvom Kolben gelöst haben, stoppen Sie die Trypsinisierung, indem Sie 10 ml Astrozytenkulturmedien hinzufügen. Übertragen Sie abgetrennte Astrozyten durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min auf eine 50 ml konische Röhre und Pelletzellen. Aspirieren Sie überstand und suspendiert die Zellen in 40 ml Astrozytenkulturmedien.
7. Waschen Sie die poly-D-Lysin-beschichteten T75-Kolben zweimal mit sterilem Wasser und Platte 20 ml der gereinigten Astrozytensuspension. Kehren Sie zum 37 °C und 5% CO2-Inkubator zurück. Ändern Sie die Astrozytenkulturmedien alle zwei Tage für weitere 10 Tage, bis die Astrozyten reifen.
   HINWEIS: Jeder T75-Kolben gereinigter Astrozyten sollte ausreichen, um 2 neue T75-Flaschen mit je 3 x 10⁵ Zellen bei der Beschichtung zu produzieren.
8. Wiederholen Sie die Schritte 2.5-2.7 für nachfolgende Durchgänge oder zu Plattenastrozyten für die Mikroskopie.
   ANMERKUNG: Die Reinheit der Astrozytenkulturen nach zugabe von AraC und anschließender Reinigung kann qualitativ durch Hellfeldmikroskopie beurteilt werden, genauer gesagt durch Quantifizierung des Prozentsatzes des Glialfibrillary Acid Proteins (GFAP)-positive Zellen pro Sichtfeld in fluoreszierenden Bildern (Abbildung 1B,C).

3. Transfektion von fluoreszierend getaggten Plasmiden

1. Am Tag vor der Transfektion oder Etikettierung, Samen-Astrozyten mit der gewünschten Dichte für die Bildgebung 24-48 h Post-Transfektion. Eine empfohlene Dichte für 24-Well-Platten oder 14 mm Glasbodenbrunnen beträgt 2 x 10⁴ Zellen/Well.
   HINWEIS: Dieses Protokoll ist für die Transfektion von Astrozyten optimiert, die auf 12 mm Glasabdeckungen auf 24-Well-Platten oder 14 mm Glasbodenbrunnen mit einem Lipofection-basierten Verfahren plattiert sind. Reagenzien sollten je nach Größe des Kulturgerichts, in dem die Astrozyten wachsen, skaliert werden.
2. Verdünnen Sie das Lipofektionsreagenz (Materialtabelle) in reduzierten Serummedien (Materialtabelle). Um das Verhältnis von Lipofektionsreagenz zu DNA zu optimieren, testen Sie eine Reihe von ausreichenden Verdünnungen. Wenn Sie z. B. das in diesem Protokoll verwendete Reagenz verwenden (Materialtabelle), 2, 3, 4 und 5 l des Lipofektionsreagenzes in 50 l reduzierten Serummedien verdünnen.
3. Verdünnen Sie 5 g hochreine DNA in 250 l reduzierten Serummedien. Fügen Sie 5 l Lipofection Enhancer Reagenz (Tabelle der Materialien) hinzu. Kombinieren Sie die Tube, die das Lipofektionsreagenz enthält, mit einem gleichen Volumen der DNA-Lipofection Enhancer-Mischung. Durch Pipettieren mischen und bei Raumtemperatur (RT) für 15 min inkubieren.
4. Entfernen Sie Astrozytenkulturmedien und fügen Sie den Zellen tropfenweise einen Transfektionsmix (Schritt 3.3) hinzu. Nach einer 6-h-Inkubation bei 37°C und 5% CO2 ersetzen Sie den Transfektionskomplex durch ein entsprechendes Volumen an Astrozytenkulturmedien (2 ml für 14 mm Glasbodenschalen). Inkubieren Sie für weitere 24 x 72 h, bevor Sie mit der Bildaufnahme fortfahren. Beobachten Sie die Dauer des Inkubationsschritts genau, um das beste Gleichgewicht zwischen Proteinexpression und Zelllebensfähigkeit zu erreichen.

4. Kennzeichnung von späten Endosomen/Lysosomen mit fluoreszierenden Sonden

HINWEIS: Einige Ladungen können mit fluoreszierenden Farbstoffen mit hoher Affinität für ladungsspezifische Proteine gekennzeichnet werden. Das folgende Beispiel ermöglicht die Kennzeichnung von späten Endosomen/Lysosomen mit einer fluoreszierenden sinatropen Sonde.

1. Verdünnen Sie die lysosomal-etikettierende Sonde (Materialtabelle) in 200 l Astrozytenkulturmedien auf eine Arbeitskonzentration von 1 m und gelten für Astrozyten ab Schritt 3.1 bei einer Dichte von 2 x 10⁴ Zellen/Well. 30 min bei 37 °C inkubieren.
2. Waschen Sie die Zellen einmal mit warmen Astrozytenkulturmedien und ersetzen Sie durch bildgebende Medien (Tabelle der Materialien). Fahren Sie sofort mit der Live-Bildgebung fort.

5. Bildaufnahme mit einem Zeitraffer-Bildgebungssystem

HINWEIS: Die Zeitraffer-Live-Bildgebung sollte mit einem Fluoreszenzmikroskop durchgeführt werden, das mit einer Hochgeschwindigkeitskamera, einem bestimmten Fokus, einer Inkubationskammer und einem 40-fachen Ölobjektiv mit einer hohen numerischen Blende (z. B. Plan-Apochromat 1.4NA) ausgestattet ist. Für die Zeitraffer-Bildgebung steht eine Vielzahl von Erfassungssoftware zur Verfügung. Die Auswahl des Mikroskopiesystems und der Erfassungssoftware sollte auf deren Verfügbarkeit und Eignung für die Ziele der jeweiligen Studie basieren. Im Folgenden finden Sie einige allgemeine Richtlinien.

1. Legen Sie die Kulturkammer oder Schale in den richtigen Adapter auf der Mikroskopbühne. Wählen Sie mithilfe von Epifluoreszenzlicht die Zelle(n) aus, die fluoreszierende Proteine oder Sonden ausdrücken, um sie aufzuzeichnen. Passen Sie die fluoreszierende Probenbeleuchtung an, um die ausgewählten Zellen mit der Digitalkamera zu visualisieren. Vermeiden Sie hohe Beleuchtung, die Photobleichungen und Phototoxizität verursachen könnte. Passen Sie den Fokus und den Zoom an.
2. Erfassen Sie einzelne Z-Stack-Zeitrafferserien mit einer Frequenz von 1 Frame alle 2 s für Zeitintervalle zwischen 300 s und 500 s mit den Zoom- und bestimmten Fokusfunktionen.
   ANMERKUNG: Die Handelsdynamik (Geschwindigkeit, Bewegungshäufigkeit usw.) variiert je nach Protein des Interesses, so dass der Zeitverlauf des Erwerbs angepasst werden muss. Zum Beispiel sind Mitochondrien weniger motil als Lysosomen und weisen häufige Pausen auf. In diesem Fall ist es besser, die Erfassungsparameter auf 1 Frame alle 5 s für 800 s einzustellen.
3. Speichern Sie Zeitrafferbilder und exportieren Sie sie als AVI- oder TIFF-Stack-Dateien.

6. Bildanalyse

HINWEIS: Die Bildanalyse wurde mit dem KymoToolBox Plugin für ImageJ/Fiji¹⁶durchgeführt. Detaillierte Schritt-für-Schritt-Schriftliche Anweisungen sind online verfügbar¹⁷. Die folgenden abgekürzten Schritte sollten ausreichen, um die Kymographen zu erstellen und die Partikeltransportparameter zu extrahieren.

1. Öffnen Sie die Zeitraffer-Bildsequenz in der ImageJ/Fiji-Software. Importieren Sie Bilder aus dem Menü Datei als AVI- oder TIFF-Stack-Dateien. Konvertieren Sie die Bilder in 8-Bit oder 16-Bit, indem Sie einen dieser Bildtypen mithilfe des Werkzeugs Typ im Menü Bild auswählen. Wenn Sie mit RGB-Dateien arbeiten, teilen Sie Kanäle mit dem Werkzeug "Kanal teilen", das unter der Funktion Farbe im Menü Bild verfügbar ist.
2. Um einen Kymographen (Darstellung in Position und Zeit der Partikelbahnen) zu erzeugen, zeichnen Sie jede Spur, in der sich Partikel bewegen, indem Sie eine Linie entlang der Flugbahnen der Teilchen mit dem segmentierten Linienwerkzeug verfolgen. Um die Richtung der Bewegung korrekt zuzuweisen, zeichnen Sie die Polylinie mit der gleichen gewünschten Richtungskonvention für alle Filme, sodass die Polarität innerhalb und über alle untersuchten Zellen konsistent ist. Zeichnen Sie beispielsweise die Polylinie von der Mitte der Zelle in Richtung Peripherie oder umgekehrt. Passen Sie die Linienbreite an die Dicke der Spur an, indem Sie auf das Linienwerkzeug doppelklicken.
3. Führen Sie das Draw Kymo-Makro des KymoToolBox-Plugins mit einer Linienbreite von 10 aus. Es wird eine Aufforderung angezeigt, das Bild in zeitweise (Anzahl der Frames, Bildrate) und Leerzeichen (x,y-Auflösung) zu kalibrieren. Nach der Kalibrierung werden die Kymographen generiert und können als TIFF-Dateien für die Datendarstellung oder weitere Partikelanalyse gespeichert werden.
4. Weisen Sie Partikelbahnen zu, indem Sie jedes Partikel im Kymographen manuell mit dem segmentierten Linienwerkzeug für die gesamte Dauer der Erfassung verfolgen. Zeichnen Sie jede Partikelbahn als Region von Interesse (ROI) mit dem ROI-Manager-Tool auf, das Sie im Menü Analysieren/Tools finden. Speichern Sie alle ROIs pro Zeitraffervideo für weitere Analysen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die richtige Flugbahn für einzelne Teilchen auf dem Kymographen zuzuweisen, um die genaueste Berechnung der Transportparameter zu erreichen.
   1. Führen Sie das Analyze Kymo-Makro des KymoToolBox-Plugins aus. Im Dropdown-Menü wird ein Fenster geöffnet, in dem sie darum bittet, die "nach außen gerichtete" Richtung der Partikelbewegung (von links nach rechts oder umgekehrt) zu definieren. Diese Auswahl hängt von der Position der fluoreszierenden Ladungen ab, die relativ zum Kern oder zur Zellperipherie abgebildet sind, wie in Schritt 6.2 festgelegt. Wenn z. B. der Kern links von den Ladungen positioniert ist und die Polylinie in Schritt 6.2 vom Kern weggezogen wurde, definieren Sie die äußere Partikelbewegung als "von links nach rechts".
   2. Definieren Sie die Grenzgeschwindigkeit (Mindestgeschwindigkeit, mit der eine Ladung als motil betrachtet wird) im Fenster Kymo analysieren. Für Ladungen, die sich mit schnellen intrazellulären Transportgeschwindigkeiten bewegen, sind 0,1 m/Sekunde eine geeignete Wahl. Ändern Sie diesen Wert, um die Empfindlichkeit der Software für jede Ladung von Interesse anzupassen. Passen Sie die Linienbreite an die Dicke jeder Partikelbahn an.
   3. Wählen Sie im Fenster Kymo analysieren die Optionen Alle Daten protokollieren und extrapolierte Koordinaten protokollieren aus. Dadurch werden verschiedene Parameter für den Frachttransport berechnet, einschließlich mittlerer Geschwindigkeit, Nachinnengeschwindigkeit, Zuggeschwindigkeit, kumulierte zurückgelegte Strecke, zurückgelegte Strecke in Ein- oder Nachfahrtsrichtung, Anzahl der Schalter für jedes Teilchen, Prozentsatz der Zeit sich in jede Richtung bewegen oder angehalten usw. Die für einzelne Spuren berechneten Daten werden dann per Kymograph gepoolt und in Textdateien gespeichert, die für jedes Bild spezifisch sind.
      HINWEIS: Die Option Farbiges Kymo anzeigen des Kymo-Makros analysieren generiert eine farbcodierte Überlagerung des Pfads über den ursprünglichen Kymographen. Partikel, die nach außen reisen, sind in Grün, nach innen in Rot und stationäre Partikel in Blau gefärbt. Die Option "Berichtskoordinaten auf Originalstapel" des Makros Kymo analysieren generiert eine farbcodierte Überlagerung der Position des extrapolierten Objekts auf dem ursprünglichen Zeitraffervideo und Kymographen.

Representative Results

Das oben beschriebene Protokoll zur Etablierung primärer Maus-MD-Astrozyten sollte reproduzierbare, hochwertige Kulturen liefern. Obwohl Kulturen zunächst eine Mischung aus Astrozyten, Fibroblasten und anderen Gliazellen, einschließlich Mikroglia und Oligodendrozyten enthalten (Abbildung 1Bi,Biv; rote Pfeilspitzen), minimiert die Zugabe von AraC zur Mischkultur zwischen DIV5-DIV7 die Proliferation dieser Schadstoffzellen. Die kombinierte AraC-Behandlungs- und Schüttelreinigungsstrategie bereichert die Reinheit der Astrozytenkulturen (Abbildung 1Bii) gegenüber traditionellen Protokollen, die nur die Reinigungsschritte enthalten (Abbildung 1Bv; blau Pfeilspitzen)¹³. Die erwartete Morphologie und Zusammensetzung (bewertet durch GFAP und 4',6-Diamidino-2-Phenylindole [DAPI] Färbung) der gereinigten Astrozytenkulturen, die mit AraC behandelt oder unbehandelt gelassen wurden, ist in Abbildung 1Biii,Bvidargestellt. Quantifizierung des Prozentsatzes der GFAP⁺ Zellen pro Sichtfeld (Verhältnis der Anzahl der Zellen mit GFAP-Färbung zur Gesamtzahl der durch DAPI-Färbung identifizierten Zellen) zeigt einen Anstieg der Reinheit summieren deiner Aranität um über 27% (Abbildung1 C). Diese hochreine Maus-Astrozytenkultur eignet sich zur Bewertung von RNA- und Proteinexpression, Zellmorphologie und anderen funktionellen Assays.

Wir verwendeten Lipofection-basierte Transfektion, um GFP-markierte Versionen des Spaltknotenproteins Cx43 und des EAAT1-Transporters in murinen Astrozyten auszudrücken. Diese Methode ermöglicht die vorübergehende Expression von Proteinen auf Einem Niveau, das für die Bildgebung von lebenden Zellen optimal ist, ohne Toxizität zu verursachen oder die Astrozytenlebensfähigkeit zu beeinträchtigen (Abbildung 2A,E). In ähnlicher Weise ermöglichte die Verwendung einer fluoreszierenden Sonde eine schnelle und effiziente Kennzeichnung saurer endolysosomaler Organellen (Abbildung 2I), um deren Dynamik in Astrozyten zu verfolgen.

Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse der Analysen der Frachtdynamik in Astrozyten, die vorübergehend mit EAAT1-GFP, Cx43-GFP transfiziert oder mit einem selektiven Farbstoff gekennzeichnet sind, der saure endolysosomale Vesikel erkennt. Jede dieser Ladungen erschien als fluoreszierendes Punktspiel, das die perinukleare Region, Cytosol und Prozesse von Astrozyten schmückte (Abbildung2A,E,I, linke Paneele). Die Zeitrafferdaten wurden verwendet, um Kymographen zu generieren, die Ladungsbewegungen in Zeit und Raum verfolgen (Abbildung 2A,E,I, rechte Paneele). In diesen Kymographen wird anterograde und retrograde Bewegung der angegebenen Ladung durch Flugbahnen mit negativen (grünen Linien) bzw. positiven (roten Linien) Steigungen dargestellt. Stationäre Vesikel werden als vertikale Flugbahnen (blaue Linien) dargestellt. Die Kymographenanalyse ergab, dass die drei analysierten Frachtarten einem bidirektionalen Transport mit gelegentlichschnellen, prozessiven Durchläufen in beide Richtungen unterzogen werden. Darüber hinaus ergab die Quantifizierung des Flusses einer Ladung durch einen Bereich der Astrozyten (rote Box) Unterschiede im Anteil der motilen Teilchen unter den Ladungen. Während beispielsweise 70 % der EAAT1-GFP-Punkte stationär sind (Abbildung 2B), sind weniger als 20 % der Cx43-GFP (Abbildung 2F) und 45 % der mit Sonden gekennzeichneten endolysosomalen Ladungen (Abbildung 2J) nicht motil. Diese Unterschiede in der Beweglichkeit zwischen den Ladungen sind wahrscheinlich repräsentativ für ihre normale, grundlegende Beweglichkeit in der Region der Astrozyten, in der die Filme erworben wurden.

Die genaue Abbildung der Änderung der X-Y-Position entlang der Vollzeitskala für jedes aus dem Kymographen erhaltene Teilchen kann auch zur Auswertung anderer Bewegungsparameter wie Frachtgeschwindigkeit (Abbildung2C,G,K) und Lauflänge (Entfernung gereist) (Abbildung 2D,H,L). Bewegungsparameter können für einzelne Ladungen weiter analysiert werden, um Veränderungen der Bewegungsrichtung (Anterograde vs retrograde Bewegung) sowie Umkehrungen in Partikelrichtung, Bewegungsanzahl, Anzahl der Pausen usw. zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Arten von Analysen können aussagekräftige quantitative Informationen über Veränderungen in der zellulären Verteilung von Organellen und Membranproteinen in Astrozyten unter basalen oder abnormalen Bedingungen in der intra- und extrazellulären umgebung.

Abbildung 1: Etablierung primärer Mausastrozytenkulturen.
(A) Schritte erforderlich für die Zerlegung von P2-P4-Mausgehirnen. (B) (i,iv) Hellfeldbilder gemischter Gliakulturen, die mit AraC behandelt wurden (i) und nicht behandelt (iv). Rote Pfeilspitzen weisen auf verunreinigungsmikroglia hin. (ii,v) Bilder von gereinigten Astrozytenkulturen, die mit AraC behandelt wurden (ii) und nicht behandelt (v). Blaue Pfeilspitzen weisen auf kontaminierende Oligodendrozyten hin. (iii,vi) Konfokale Bilder von gereinigten Astrozytenkulturen, die mit AraC behandelt wurden (iii) und nicht behandelt (vi). Grün zeigt GFAP-Färbung und DAPI (blau) beschriftet alle Kerne. (C) Prozentsatz der GFAP-positiven Zellen. Die Daten stehen für den Mittelwert von SEM. ***p < 0.001, ungepaarter t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Quantitative Analysen der Ladungsdynamik in Astrozyten.
(A,E,I) Linke Paneele: Astrozyten, die EAAT1-GFP (A), Cx43-GFP (E) oder mit einer Sonde behandeln, die späte Endosomen und Lysosomen (I) kennzeichnet Rote Felder zeigen Bereiche an, die zur Analyse der Partikeldynamik verwendet werden. Rechte Paneele: Original- und farbkodierte Kymographen, die Flugbahnen für die angegebenen Ladungen zeigen. Rote Linien stellen retrograde-bewegte Ladungen, grüne Linien anterograde-moving Ladungen und blaue Linien nicht-motile Ladungen. (B,F,J) Prozentsatz der stationären und motilen Partikel. (C,G,K) Quantifizierung der anterograde und retrograde Geschwindigkeit und (D,H,L) Lauflänge. Die Daten stehen für den Mittelwert SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Hier beschreiben wir einen experimentellen Ansatz, um fluoreszierend markierte Organellen und Membranproteine von Interesse mithilfe der Zeitraffer-Videomikroskopie in hochreinen primären Maus-Kortikus-Astrozyten auszudrücken, zu visualisieren und zu verfolgen. Wir skizzieren auch eine Methodik zur Messung der Partikeldynamik. Die direkte Visualisierung der Protein- und Organellendynamik in primären Astrozyten bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Regulierung des intrazellulären Transports in diesen Zellen in vitro zu untersuchen.

Die oben beschriebene Methode zur Etablierung von Md-Astrozytenkulturen der Maus kombiniert Schritte aus anderen veröffentlichten Protokollen^13,14,15, was sowohl zu einer einfacheren Methode als auch zu einer höheren Reinheit und Qualität führt. Kulturen. Die Kombination von AraC¹⁵ Behandlung und schüttelbasierter Reinigung^13,14 kann Astrozytenkulturen mit einer Reinheit von bis zu 98% ergeben (bewertet durch das Verhältnis von GFAP⁺ Zellen Gesamtzellen), was in unserem Beispiel zu eine Erhöhung der Reinheit um 27 % gegenüber Kulturen, die nur den Reinigungsschritten unterworfen sind (Abbildung 1B,C). Die hochreinen Kulturen von Mausastrozyten, die mit dieser Methode gewonnen wurden, ähneln den Werten, die von McCarthy und deVellis¹⁴für Ratten-Astrozytenkulturen (bewertet durch enzymatische Assays und Elektronenmikroskopie) gemeldet wurden. Die McCarthy/deVellis-Methode, die keine AraC-Behandlung beinhaltet, erfordert jedoch einen längeren Schüttelschritt (15-18 h) und zwei zusätzliche Reinigungsrunden¹⁴.

In unserem Beispiel zeigen wir, dass dieses Protokoll ausreichend empfindlich ist, um Unterschiede in der Beweglichkeit zwischen verschiedenen Membranproteinen und Organellen in Astrozyten zu erfassen, die wahrscheinlich repräsentativ für ihre individuellen intrazellulären funktion. Obwohl unser Beispiel die Nützlichkeit dieses Protokolls unter basalen Bedingungen demonstriert, kann diese Methode leicht angepasst werden, um Transportparameter in einem breiten Spektrum von Forschungsfragen zu messen. Beispielsweise könnten ähnliche Protokolle mit geringfügigen Modifikationen verwendet werden, um Transportereignisse in Astrozyten in vitro als Reaktion auf intra- oder extrazelluläre Umgebungen zu charakterisieren, wie z. B. Zellschäden, Toxizität, pathogene Mutationen, synaptische gemischte Kulturen von Neuronen und Astrozyten), etc. Ebenso können Ko-Expression und Visualisierung von mehreren Ladungen oder Organellen, die jeweils einzeln mit verschiedenen Fluorophoren markiert sind, auch verwendet werden, um dynamische Veränderungen in der Kolokalisierung und komplexen Bildung, transiente Wechselwirkungen zwischen Organellen zu bewerten. , und endozytische und Membran-Recycling-Transport-Events.

Der Erfolg der hier vorgestellten Methodik beruht in erster Linie auf der Fähigkeit, qualitativ hochwertige Astrozytenkulturen zu erhalten, und von der effizienten Kennzeichnung von Gütern von Interesse. Bei der Verwendung dieses Verfahrens für die Live-Bildgebung ist es wichtig, die fluoreszierende Expression genau zu überwachen, um die optimale Inkubationszeit nach der Transfektion zu bestimmen. Im Durchschnitt fanden wir heraus, dass für die analysierten Ladungen eine 24-stunden-Inkubationszeit zu einer guten Signalintensität für die Live-Bildaufnahme führt. Eine längere Inkubation transfizierter Astrozyten kann zu einer hohen Expression fluoreszierender Proteine führen, die eine Proteinaggregation induzieren können, wodurch die Lokalisierung und Dynamik der Ladung verändert und die Gesundheit der Kulturen beeinträchtigt wird. Astrozyten sind sehr anfällig für physische Schäden und Veränderungen in der Kulturumgebung, die zur Induktion von transkriptionellen und zellulären Reaktionen, einschließlich Reaktivität, führen können. Daher ist es wichtig, die Zeitintervalle zwischen den Waschschritten zu reduzieren und die Exposition der Kulturen gegenüber Luft und signifikanten Temperatur- oder Lichtintensitätsänderungen während der Inkubations- und Erfassungsperioden zu minimieren.

Zusammenfassend können die hier vorgestellten Methoden verwendet werden, um dynamische Veränderungen in der Protein- und Organellenlokalisierung in Astrozyten zu bewerten und zu quantifizieren. Sie bieten wertvolle Werkzeuge, die die Untersuchung von Veränderungen der astrozytischen Reaktionen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen ermöglichen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046
Benchtop Centrifuge	Thermo Scientific	75-203-637	Sorvall ST8 Centrifuge
Cell Culture Grade Water	Gen Clone	25-511
Cell Culture Microscope	Zeiss	WSN-AXIOVERT A1	Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities
Cytosine Arabinoside	Sigma	C1768-100MG	(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage
DAPI	Sigma	D9542-5MG	Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.
Dissecting Microscope	Zeiss		Stemi 305
Dissecting Scissors	F.S.T	14558-09
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal Bovine Serum	Gemini	100-106	Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J)	NIH	Version 1.52i
Fine Tip Tweezers	F.S.T	11254-20	Style #5
Fluorescence light source	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
GFAP antibody	Cell Signaling	3670S	GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom Dishes	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated
Graefe Forceps	F.S.T	11054-10	Graefe Iris Forceps with curved tips
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.
Hank's Balanced Salt Solution (10x)	Gibco	14065-056	Magnesium and calcium free
Imaging Media	Life Technologies	A14291DJ	Live Cell Imaging Solution
Inverted Confocal Microscope	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent	Life Technologies	11514015	Plus Reagent
Lipofection Reagent	Life Technologies	15338100	Lipofectamine LTX reagent
Orbital shaking incubator	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control
Penicillin/Strepomycin solution (100x)	Gen Clone	25-512
Phosphate Buffered Saline (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide	Sigma	P7405	Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing
Reduced serum medium	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Tissue Culture Flasks	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap
Tissue culture incubator	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control
Tris-Base	Sigma	T1503	8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200072
Vacuum-Driven Filter Systems	Olympus Plastics	25-227	500 ml, PES membrane, 0.22 µm
Vannas scissors straight	Roboz	RS-5620