Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

تصور وتحليل النقل داخل الخلايا من العضيات وغيرها من الشحنات في الخلايا النجمية

doi: 10.3791/60230 Published: August 28, 2019
* These authors contributed equally

Summary

هنا نقوم بوصف طريقة التصوير الحي في المختبر لتصور النقل داخل الخلايا من العضيات والاتجار ببروتينات غشاء البلازما في الخلايا النجمية المورين. ويقدم هذا البروتوكول أيضا منهجية لتحليل الصور لتحديد مسارات نقل البضائع وحركيتها.

Abstract

الخلايا النجمية هي من بين أنواع الخلايا الأكثر وفرة في الدماغ الكبار، حيث أنها تلعب أدوارا رئيسية في تعدد الوظائف. كلاعب مركزي في التوازن الدماغي، توفر الخلايا النجمية الخلايا العصبية مع الأيض الحيوي والمياه العازلة خارج الخلية، والأيونات، والغلوتامات. جزء لا يتجزأ من متشابك "ثلاثي الأطراف"، والخلايا النجمية هي أيضا حاسمة في تشكيل، وتقليم، والصيانة، وتعديل نقاط الاشتباك العصبي. لتمكين هذه الوظائف التفاعلية للغاية، والخلايا النجمية التواصل فيما بينها ومع الخلايا الدبقية الأخرى، والخلايا العصبية، والأوعية الدموية الدماغ، والبيئة خارج الخلية من خلال العديد من البروتينات غشاء المتخصصة التي تشمل الخلية جزيئات التصاق، aquaporins، قنوات أيون، الناقلالعصبي، وجزيئات تقاطع الفجوة. لدعم هذا التدفق الديناميكي، تعتمد الخلايا النجمية، مثل الخلايا العصبية، على النقل داخل الخلايا المنسق والصارم. وعلى عكس الخلايا العصبية، حيث تم تحديد الاتجار داخل الخلايا على نطاق واسع، فإن النقل القائم على الأنابيب الدقيقة في الخلايا النجمية كان أقل دراسة. ومع ذلك، فإن الاتجار الخارجي والداخلي لبروتينات غشاء الخلية ونقل الأعضاء داخل الخلايا ينظم البيولوجيا الطبيعية للخلايا النجمية، وغالبا ً ما تتأثر هذه العمليات بالمرض أو استجابة للإصابة. هنا نقدم بروتوكول اعلام يُقدم مباشرة للثقافة ذات جودة عالية من الخلايا النجمية، لتسمية البروتينات الفلكية والعضيات ذات الأهمية، وتسجيل ديناميات النقل داخل الخلايا باستخدام الفحص المجهري البؤري الفاصل زمنياً. كما نبين كيفية استخراج وتحديد معايير النقل ذات الصلة من الأفلام المكتسبة باستخدام برامج تحليل الصور المتاحة (أي ImageJ /FIJI) الإضافات.

Introduction

الخلايا النجمية هي الخلايا الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي للبالغين، حيث أنها تؤدي وظائف تنموية ومنزلية فريدةمننوعها 1. Astrocytes تحوير تطوير متشابك من خلال الاتصال المباشر مع محطات ما قبل وpostsynaptic كجزء من متشابك ثلاثي الأطراف، والذي يحتوي على مستقبلات الناقل العصبي، وناقلات، وجزيئات التصاق الخلايا التي تسهل تشكيل متشابك والخلايا العصبية-astrocyte الاتصالات2. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا النجمية تتحكم بنشاط في انتقال متشابك ومنع السمية الطاردة للخلايا العصبية عن طريق إزالة الناقلات العصبية المحفزة بسرعة من المشقوق متشابك، وإعادة تدوير الناقلات العصبية، والمشاركة في تقليم متشابك3 , 4 , 5 , 6.لتمكين هذه الوظائف التفاعلية للغاية، والخلايا النجمية التواصل فيما بينها، مع الخلايا الدبقية الأخرى، ومع الخلايا العصبية من خلال بروتينات الغشاء المتخصصة، بما في ذلك جزيئات التصاق الخلية، aquaporins، قنوات أيون، الناقل العصبي، وجزيئات تقاطع الفجوة. الخلايا النجمية تغير بنشاط مستويات سطح هذه البروتينات استجابة للتقلبات في بيئتها داخل الخلايا وغير الخلوية7. وعلاوة على ذلك، فإن التغيرات في مستويات وتوزيع الميتوكوندريا، قطرات الدهون، والعضيات المهينة وإعادة التدوير تحوير إمدادات الطاقة، وتوافر المستقلب، وعمليات المقاصة الخلوية التي تعتبر ضرورية لوظيفة الخلايا النجمية و بقاء.

يتم تسهيل التغيرات الديناميكية في الاتجار ببروتين الغشاء وorganelle وتحديد المواقع في الخلايا النجمية من خلال وظيفة منسقة من البروتينات الحركية ومحولات التي تعزز حركة البضائع8،9. وبالمثل، يتم تعديل مستويات السطح من بروتينات الغشاء من خلال الاستيعاب وإعادة التدوير الأحداث10. يتم نقل هذه الشحنات عن طريق شبكة معقدة من الأكتين، microtubules، وربما خيوط وسيطة المسارات8. تشير الدراسات المستندة إلى تلطيخ الفلورة المناعية للبروتين النهائي الملزم 1 (EB1)، الذي يتراكم في الأنابيب الدقيقة المتنامية بالإضافة إلى النهايات، إلى أنه في حزم الخلايا النجمية من الأنابيب الدقيقة تشع من النوى المحيطية وتمتد نهايتها الزائدة نحو محيط11. ومع ذلك، لا يزال هناك نقص في الفحص الشامل لتنظيم وقطبية الأنابيب الدقيقة وغيرها من العناصر الخلوية الهيكلية باستخدام التصوير بالخلايا الحية. في حين أن العديد من الآليات الكامنة وراء ديناميات العضيات والبروتينات الغشاء قد درست على نطاق واسع في الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى، وحركة البضائع في الخلايا النجمية هو أقل فهما جيدا. ويستند معظم معرفتنا الحالية حول التغيرات في توزيع البروتين والجهاز في الخلايا النجمية على وضع العلامات التقليدية المستندة إلى الأجسام المضادة من إعداد ثابت، مما يحول دون الفحص المكاني والزمني الدقيق لديناميات البضائع 12.

هنا، ونحن نصف طريقة لتسمية البروتينات غشاء والعضيات للتصوير الحي في الثقافات الماوس التبويض ة الأولية عالية النقاء. باستخدام هذا البروتوكول، نقدم أمثلة نتتبع فيها التوطين الديناميكي للبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) - البروتينات الغشاء الموسومة في الخلايا النجمية المنقولة، بما في ذلك تقاطع الفجوة البروتين connexin 43 (Cx43-GFP) والأحماض الأمينية المحفزة الناقل 1 (EAAT1-GFP). كما نوصف استخدام مسبار حمضي فلورسنت لتصور العضيات الحمضية واتباع ديناميات الاتجار بها في الخلايا النجمية الحية. وأخيرا، نبين كيفية تحليل بيانات الفاصل الزمني لاستخراج وتقييم بارامترات النقل لفرادى الشحنات.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموافقة جامعة كارولينا الشمالية في لجنة تشابل هيل للعناية بالحيوان واستخدامه (IACUC).

1. تشريح الدماغ وثقافة الخلايا النجمية الماوس الأولية

ملاحظة: تم تكييف البروتوكول التالي من الأساليب المنشورة، والذي يتبع الإجراء الأصلي الذي وضعه مكارثي وديفيليس13،14،15. يتم إعداد ثقافات الخلايا المختلطة من الخلايا النجمية McCarthy/deVellis (MD) من القشريات الماوس بعد الولادة 2−4 (P2−P4)، وتعامل مع عامل مضاد للميثوتيك، ويتم تنقيتها لتسفر عن ثقافة الخلايا النجمية الغنية النهائية. أربعة القشريات من الجرو الماوس من أي من الجنسين كافية لتوليد ثقافة واحدة T75 ثقافة الأنسجة قارورة.

  1. معطف الجزء السفلي من قوارير T75 (100٪ الوصول إلى الرقبة الزاوية، 0.22 ميكرومتر غطاء مرشح تنفيس للماء) مع بولي-D-يسين (1 ملغ / مل في 0.1 M تريس العازلة، درجة الحموضة 8.5) وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل بدء تشريح.
  2. قبل البدء في إجراء التشريح، دافئ 30 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية (دولبيكو تعديل النسر المتوسطة [DMEM] الجلوكوز عالية، 10٪ الحرارة المعطلة مصل البقر الجنيني، 1٪ البنسلين / العقديات) في 37 درجة مئوية وذوبان aliquot 5 مل من 2.5٪ تريبسين على الجليد. إعداد اثنين من أطباق تشريح (60 ملم قطرها) على الجليد مليئة 6 مل من محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) دون Ca2+ أو ملغ2 +.
  3. تطهير جميع الأدوات الجراحية (ملاقط طرف غرامة، مقص تشريح، مقص Vannas على التوالي، ملقط Graefe مع نصائح منحنية) في 70٪ الإيثانول قبل وبين كل تشريح.
  4. رش رأس ورقبة الجراء الماوس P2−P4 مع الإيثانول 70٪ قبل قتلها بسرعة عن طريق قطع الرأس مع مقص الجراحية. إجراء شق خلفي إلى خط الوسط الأمامي على طول فروة الرأس لفضح الجمجمة. قطع الجمجمة بعناية من الرقبة إلى الأنف.
  5. قم بإجراء شقين جانبيين إضافيين متفوقين على العينين. باستخدام ملاقط طرف غرامة الوجه بلطف اللوحات الجمجمة إلى الجانب. إزالة الدماغ ووضعها في أول طبق تشريح مليئة HBSS الجليد الباردة دون كاليفورنيا2 + أو ملغ2 +. الحفاظ على الطبق على الجليد ومواصلة حصاد بقية العقول.
    ملاحظة: تنفيذ باقي إجراء تشريح ضمن نطاق تشريح.
  6. إزالة المصابيح الشمباستخدام مقص Vannas أو ملاقط غرامة (الشكل1منظمة المؤتمرالدولي). مع ملقط طرف منحني عند تقاطع الشقوق العرضية وداخل الغلاف الغربي، أدخل بلطف زوج ثان من ملقط طرف منحني بين القشرة وثنائي الدماغ، وفتح ببطء ملقط لفصل نصف الكرة الدماغية عن بقية الدماغ (الشكل1AII، Aiii). إزالة الأنسجة غير المرغوب فيها (الشكل1Aiv).
  7. لكل نصف الكرة القشرية، وإزالة بعناية السحايا مع ملاقط طرف غرامة. اختياريا، إزالة الحصين من القشرية. نقل القشرية الماوس تشريح في طبق ثان مليئة HBSS الجليد الباردة دون كاليفورنيا2 + أو ملغ2 + والحفاظ عليه على الجليد أثناء تشريح العقول المتبقية.
    ملاحظة: إجراء الخطوات التالية في ظل ظروف العقيم في غطاء محرك السيارة تدفق laminar.
  8. قطع القشرية المعقمة إلى قطع صغيرة (حوالي 2-4 مم) باستخدام مقص جراحي حاد معقم أو مشرط. نقل الأنسجة تشريح إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على محلول إنزيم (22.5 مل HBSS دون كاليفورنيا2 + أو ملغ2 +، 2.5 مل 2.5٪ تريبسين). الحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع انعكاس لطيف كل 10 دقيقة.
  9. جمع الأنسجة المهضومة عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق وإزالة محلول الإنزيم عن طريق decantation (لا تستخدم الأسبرين فراغ). أضف 10 مل من وسائط زراعة الخلايا النجمية وفصل الأنسجة إلى خلايا مفردة عن طريق توجيه محلول 20-30x باستخدام ماصة مصلية تبلغ 10 مل.
  10. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلايا بـ 70 ميكرومتر لتقليل كتل الخلايا والأنسجة غير المهضومة. جمع filtrate في أنبوب مخروطي 50 مل نظيفة وضبط حجم إجمالي إلى 20 مل مع وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية. عند هذه النقطة، تقييم كفاءة التفكك القشري عن طريق خلط 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من الأزرق التربان وخلايا العد مع مقياس الهيموكيتومي.
    ملاحظة: ينتج عن إعداد واحد من أربعة من القشريات الماوس P2−P4 10−15 × 106 خلايا مفردة.
  11. قم بإستنشق محلول طلاء البولي د-ليسين من قوارير الثقافة T75 واغسلمرتين بالماء المعقم. لوحة تعليق الخلية 20 مل وحضانة في 37 درجةمئوية و 5٪ CO 2.

2- تنقية الثقافات النجمية والحفاظ عليها

ملاحظة: إجراء جميع التغييرات وسائل الإعلام في ظل ظروف العقيم في غطاء محرك السيارة تدفق laminar باستخدام معقمة تصفية (0.22 ميكرومتر غشاء فلتر) وسائل الإعلام astrocyte ارتفعت درجة حرارة إلى 37 درجة مئوية.

  1. استبدال وسائل الإعلام الخلية 48 ساعة بعد الطلاء (يوم في المختبر 2، DIV2).
  2. في DIV5، استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية الطازجة تكملها 10 μm السيتوسين أرابينوسيد (AraC).
    ملاحظة: تسهل هذه الخطوة إزالة الخلايا الملوثة، بما في ذلك الخلايا الليفية وغيرها من الخلايا الدبقية. من المهم التعامل مع الثقافات مع AraC لا يزيد عن 48 ساعة كما أطول أوقات الحضانة سوف تقلل من قابلية الخلاياالنجمية.
  3. في DIV7، تغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية دون AraC والبدء في التحقق من الملاءمة الثقافة يوميا. مرة واحدة وقد وصلت الخلايا 80٪ التقاء، معطف اثنين-T75 قارورة لكل قارورة ثقافة الخلايا النجمية غير المنقية مع بولي د-يسين وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 8 ساعة على الأقل إلى بين عشية وضحاها.
  4. في اليوم التالي، تبدأ تنقية الخلايا النجمية عن طريق هز قوارير الثقافة في 180 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في حاضنة الهز المداري37 درجة مئوية. إزالة وسائل الإعلام واستبدالها مع وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية جديدة. هز الخلايا في 240 دورة في الدقيقة لمدة 6 ساعة في حاضنة اهتزاز مدارية 37 درجة مئوية. قبل الدفء 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS)، وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية، و 0.25٪ تريبسين-EDTA إلى 37 درجة مئوية 20-30 دقيقة قبل نهاية فترة الهز.
    ملاحظة: الحضانة CO2غير مطلوب أثناءخطوات الاهتزاز. إذا رغبت في ذلك، يمكن استخدام وسائل الإعلام التي تم جمعها بعد خطوات الهز 30 دقيقة و 6-ح لثقافة microglia وoligodendrocytes، على التوالي. ومع ذلك، فإن معالجة AraC للثقافة المختلطة سوف تقلل من وفرة الخلايا الغليفية الأخرى.
  5. إزالة قوارير الثقافة من شاكر واستبدال وسائل الإعلام على الفور مع 10 مل من PBS 1X الدافئة لكل قارورة. إزالة PBS وإضافة 3 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA لكل قارورة. حضانة في 37 درجة مئوية و5٪ CO 2، والتحقق من كل 5 دقائق للمفرزة.
  6. مرة واحدة وقد فصلت الخلايا من قارورة، ووقف trypsinization عن طريق إضافة 10 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية. نقل الخلايا النجمية منفصلة إلى أنبوب مخروطي 50 مل وخلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق.
  7. اغسل القوارير T75 المغلفة بالبولي-د-ليسين مرتين بالماء المعقم واللوحة 20 مل من تعليق الخلايا النجمية النقية. العودة إلى حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. تغيير وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية كل يومين لمدة 10 أيام إضافية حتى تنضج الخلايا النجمية.
    ملاحظة: يجب أن تكون كل قارورة T75 من الخلايا النجمية النقية كافية لإنتاج 2 قوارير T75 جديدة مع 3 × 105 خلايا لكل منها في الطلاء.
  8. كرر الخطوات 2.5−2.7 للتمريرات اللاحقة أو للخلايا النجمية لللوحة للتنظير المجهري.
    ملاحظة: يمكن تقييم نقاء الثقافات النجمية بعد إضافة AraC وتنقية التالية نوعيا من خلال الفحص المجهري brightfield، أو على وجه التحديد عن طريق تحديد النسبة المئوية للبروتين حمض الرجفان الغليفي (GFAP) إيجابية الخلايا لكل مجال من مجالات الرؤية في الصور الفلورية (الشكل1B,C).

3. Transfection من بلازميدات ذات علامات فلورية

  1. في اليوم السابق للانقبة أو وضع العلامات، تُعد الخلايا النجمية للبذور بالكثافة المطلوبة للتصوير 24-48 ساعة بعد الانعطاف. الكثافة الموصى بها للوحات 24 جيدا أو 14 ملم الآبار الزجاجية أسفل هو 2 × 104 خلايا / جيدا.
    ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول لتبديل الخلايا النجمية مطلية على الأغطية الزجاجية 12 مم على لوحات 24 جيدا أو 14 ملم الآبار الزجاجية القاع باستخدام طريقة المستندة إلى lipofection. وينبغي قياس الكواشف اعتمادا على حجم طبق الثقافة التي تنمو فيها الخلايا النجمية.
  2. تخفيف كاشف lipofection(جدولالمواد) في وسائل الإعلام ذات المصل المنخفض (جدولالمواد). لتحسين نسبة كاشف lipofection إلى الحمض النووي، اختبار مجموعة من التخفيفات كافية. على سبيل المثال، إذا كان استخدامالكاشف المستخدم في هذا البروتوكول (جدول المواد)، تمييع 2، 3، 4، و 5 ميكرولتر من كاشف lipofection في 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام ذات المصل المنخفض.
  3. تمييع 5 ميكروغرام من الحمض النووي عالي النقاء في 250 درجة مئوية من وسائل الإعلام ذات المصل المنخفض. إضافة 5 ميكرولتر من كاشف محسن lipofection (جدولالمواد). الجمع بين الأنبوب الذي يحتوي على كاشف lipofection مع حجم متساو من مزيج محسن الحمض النووي lipofection. يُمزج المزيج بواسطة الأنابيب والحضانة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة.
  4. إزالة وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية وإضافة مزيج التغوط (الخطوة 3.3) إلى الخلايا إسقاط. بعد حضانة 6-h في 37 درجة مئويةو 5٪ CO 2، استبدال مجمع التغوط مع حجم مناسب من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية (2 مل ل14 ملم الأطباق الزجاجية القاع). احتضان لمدة 24-72 ساعة إضافية قبل الشروع في الحصول على الصورة. مراقبة عن كثب مدة خطوة الحضانة لتحقيق أفضل توازن بين التعبير البروتين وبقاء الخلية.

4. وضع العلامات من بطانة في وقت متأخر / lysosomes باستخدام تحقيقات الفلورسنت

ملاحظة: يمكن تسمية بعض الشحنات باستخدام الأصباغ الفلورية مع تقارب عالية للبروتينات الخاصة بالبضائع. يسمح المثال التالي بوضع العلامات على البطانة/الليسوسوم المتأخرة مع مسبار حمضي فلورسنت.

  1. تمييع مسبار وضع العلامات الليسوسومال (جدولالمواد)في 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية إلى تركيز عمل قدره 1 ميكرومتر وتنطبق على الخلايا النجمية من الخطوة 3.1 في كثافة 2 × 104 خلايا / جيدا. حضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  2. غسل الخلايا مرة واحدة مع وسائل الإعلام ثقافة الخلاياالنجمية الدافئة واستبدالها مع وسائل الإعلام التصوير (جدول المواد). انتقل إلى التصوير الحي على الفور.

5. الحصول على الصور باستخدام نظام التصوير الفاصل الزمني

ملاحظة: يجب أن يتم التصوير الحي بفاصل زمني باستخدام مجهر الفلورة المجهز بكاميرا عالية السرعة، وتركيز محدد، وغرفة حضانة، وهدف زيت 40x مع فتحة رقمية عالية (على سبيل المثال، Plan-Apochromat 1.4NA). تتوفر مجموعة متنوعة من برامج الاقتناء للتصوير بالفاصل الزمني. وينبغي أن يستند اختيار نظام الفحص المجهري وبرامجيات الاقتناء إلى توافرها وملاءمتها لأهداف الدراسة المعنية. وترد أدناه بعض المبادئ التوجيهية العامة.

  1. وضع غرفة الثقافة أو طبق في محول السليم على مرحلة المجهر. باستخدام ضوء الظهارة، حدد الخلية (الخلايا) التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت أو التحقيق لتسجيلها. اضبط إضاءة عينة الفلورسنت لتصور الخلية (الخلايا) المحددة باستخدام الكاميرا الرقمية. تجنب استخدام الإضاءة العالية التي قد تسبب تبييض الصور والسمية الضوئية. ضبط التركيز والتكبير/ التصغير.
  2. الحصول على واحد Z-كومة سلسلة الفاصل الزمني في تردد 1 الإطار كل 2 s لفترات زمنية تتراوح بين 300 s و 500 s باستخدام التكبير ووظائف التركيز محددة.
    ملاحظة: تختلف ديناميات الاتجار (السرعة، وتواتر الحركة، وما إلى ذلك) تبعاً لبروتين الفائدة، وبالتالي، فإن مسار الاكتساب الزمني قد يتطلب تعديلاً. على سبيل المثال، الميتوكوندريا هي أقل motile من lysosomes وتظهر توقفات متكررة. في هذه الحالة، يكون من الأنسب ضبط معلمات الاكتساب إلى إطار واحد كل 5 ثوان لـ 800 s.
  3. حفظ الصور الفاصل الزمني وتصديرها كملفات مكدس AVI أو TIFF.

6. تحليل الصور

ملاحظة: تم إجراء تحليل الصورة باستخدام البرنامج المساعد KymoToolBox لImageJ / فيجي16. تعليمات مكتوبة مفصلة خطوة بخطوة متاحة على الانترنت17. وينبغي أن تكون الخطوات المختصرة التالية كافية لإنشاء kymographs واستخراج معلمات نقل الجسيمات.

  1. فتح تسلسل صورة الفاصل الزمني في برنامج ImageJ/Fiji. استيراد الصور من القائمة ملف كملفات مكدس AVI أو TIFF. تحويل الصور إلى 8 بت أو 16 بت عن طريق تحديد أحد أنواع الصور هذه باستخدام أداة الكتابة من القائمة صورة. في حالة العمل مع ملفات RGB، قم بتقسيم القنوات باستخدام أداة تقسيم القناة المتوفرة ضمن ميزة اللون في قائمة الصور.
  2. لتوليد kymograph (تمثيل في موقف ووقت مسارات الجسيمات)، رسم كل مسار الذي تتحرك الجسيمات عن طريق تتبع خط على طول مسارات الجسيمات باستخدام أداة خط مجزأة. لتعيين اتجاه الحركة بشكل صحيح، ارسم الخط المتعدد باستخدام نفس الاتفاقية الاتجاهية المطلوبة لجميع الأفلام بحيث تكون القطبية متناسقة داخل جميع الخلايا التي يتم دراستها وعبرها. على سبيل المثال، رسم خط متعدد من وسط الخلية نحو محيط أو العكس بالعكس. اضبط عرض الخط لمطابقة سمك المسار بالنقر المزدوج فوق أداة الخط.
  3. تشغيل الماكرو رسم كيمو من البرنامج المساعد KymoToolBox باستخدام عرض خط من 10. ستظهر مطالبة تطلب معايرة الصورة في الوقت المناسب (عدد الإطارات ومعدل الإطارات) والمساحة (x,y الدقة). بمجرد معايرة، يتم إنشاء kymographs ويمكن حفظها كملفات TIFF لعرض البيانات أو مزيد من تحليل الجسيمات.
  4. تعيين مسارات الجسيمات عن طريق تتبع يدويا كل الجسيمات في kymograph باستخدام أداة خط مجزأة لمدة كاملة من الاقتناء. سجل كل مسار للجسيمات كمنطقة اهتمام (ROI) باستخدام أداة مدير عائد الاستثمار الموجودة في القائمة تحليل/أدوات. حفظ جميع الـ ROIs لكل فيديو بفاصل زمني لمزيد من التحليل.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان تعيين المسار الصحيح للجسيمات الفردية على kymograph لتحقيق الحساب الأكثر دقة لمعلمات النقل.
    1. تشغيل الماكرو تحليل كيمو من البرنامج المساعد KymoToolBox. ستفتح نافذة تطلب تعريف الاتجاه "الخارجي" لحركة الجسيمات (من اليسار إلى اليمين أو العكس بالعكس) من القائمة المنسدلة. يعتمد هذا الاختيار على موضع الشحنات الفلورية المصورة بالنسبة للنواة أو محيط الخلية، كما هو ثابت في الخطوة 6.2. فعلى سبيل المثال، إذا تم وضع النواة على يسار الشحنات، وتم سحب الخط المتعدد الخط في الخطوة 6-2 بعيداً عن النواة، فعرّف حركة الجسيمات الخارجية بأنها "من اليسار إلى اليمين".
    2. حدد الحد الأقصى للسرعة (الحد الأدنى للسرعة التي تعتبر بها البضائع موتيلي) في نافذة تحليل كيمو. بالنسبة للشحنات التي تتحرك بسرعة النقل داخل الخلايا، 0.1 ميكرومتر / ثانية هو الخيار المناسب. تعديل هذه القيمة لضبط حساسية البرنامج لكل شحنة من الفائدة. ضبط عرض الخط لمطابقة سمك كل مسار الجسيمات.
    3. حدد خيارات تسجيل كافة البيانات وإحداثيات Log استقراء في إطار تحليل kymo. وهذا سوف يحسب مختلف بارامترات نقل البضائع، بما في ذلك متوسط السرعة، والسرعة الداخلية، والسرعة إلى الخارج، والمسافة التراكمية التي تقطعها، والمسافة التي تقطع إما في الاتجاه الداخلي أو الخارجي، وعدد المفاتيح لكل جسيم، والنسبة المئوية للوقت تتحرك في كل اتجاه أو توقف، الخ. ثم يتم تجميع البيانات المحسوبة للمسارات الفردية لكل kymograph وحفظها في ملفات نصية خاصة بكل صورة.
      ملاحظة: الخيار إظهار Kymo الملونة من تحليل ماكرو Kymo بإنشاء تراكب مرمزة ملونة من المسار عبر kymograph الأصلي. الجسيمات التي تسافر إلى الخارج ملونة باللون الأخضر، والداخل باللون الأحمر، والجسيمات الثابتة باللون الأزرق. ينشئ الخيار إحداثيات التقرير على المكدس الأصلي للماكرو "تحليل كيمو" تراكب مرمز بالألوان من موضع الكائن الاستقراء على الفيديو الأصلي الفاصل الزمني وkymograph.

Representative Results

بروتوكول لإنشاء الماوس الأولية MD astrocytes المبينة أعلاه ينبغي أن تسفر عن استنساخ، والثقافات ذات جودة عالية. على الرغم من أن الثقافات تحتوي في البداية على مزيج من الخلايا النجمية، والخلايا الليفية، وغيرها من الخلايا الغلية، بما في ذلك microglia وoligodendrocytes (الشكل1ثنائية، بيف؛ رؤوس الأسهم الحمراء)، فإن إضافة AraC إلى الثقافة المختلطة بين DIV5-DIV7 يقلل انتشار هذه الخلايا الملوثة. إن استراتيجية المعالجة المشتركة لـ AraC والاهتزاز تثري نقاء الثقافات النجمية (الشكل1بيي)على البروتوكولات التقليدية التي تشمل فقط خطوات التنقية (الشكل1Bv; الأزرق رؤوس الأسهم)13. يظهر في الشكل 1Biii,Bvi.المورفولوجيا المتوقعة والتركيب (التي تم تقييمها من قبل GFAP و 4',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] تلطيخ) من الثقافات الاستروقراطية النقية المعالجة مع AraC أو اليسار دون علاج. القياس الكمي للنسبة المئوية لGFAP+ الخلايا لكل مجال من مجالات الرؤية (نسبة عدد الخلايا مع تلطيخ GFAP إلى العدد الإجمالي للخلايا التي تم تحديدها من قبل DAPI تلطيخ) يظهر زيادة أكثر من 27٪ في النقاء مع مكملات AraC (الشكل1 C).هذه الثقافة الماوس astrocyte عالية النقاء هو مناسبة لتقييم RNA والتعبير البروتين، مورفولوجيا الخلية، وغيرها من الاختبارات الوظيفية.

استخدمنا الانعترا بـ lipofection للتعبير عن إصدارات ذات علامات GFP من بروتين تقاطع الفجوة Cx43 وناقل EAAT1 في الخلايا النجمية المورين. تسمح هذه المنهجية بالتعبير العابر للبروتينات عند مستويات مثالية لتصوير الخلايا الحية دون التسبب في سمية أو التأثير على صلاحية الخلايا النجمية (الشكل2A,E). وبالمثل، سمح استخدام مسبار الفلورسنت بوضع العلامات السريعة والفعالة للأعضاء الحمضية اللامعية (الشكل2I) لتتبع دينامياتها في الخلايا النجمية.

ويبين الشكل 2 النتائج التمثيلية لتحليلات ديناميات البضائع في الخلايا النجمية التي يتم نقلها بشكل عابر مع EAAT1-GFP، Cx43-GFP، أو وصفت بصبغة انتقائية تعترف بالحويصلات الحويصلة الانساء الحمضية. ظهرت كل من هذه الشحنات على أنها الملتحم الفلورسنت تزيين المنطقة المحيطة بالنووية، سيتوسول، وعمليات الخلايا النجمية (الشكل2A، E، I، لوحات اليسار). تم استخدام بيانات الفاصل الزمني لتوليد kymographs التي تتبع حركة البضائع في الزمان والمكان (الشكل2A، E، I، لوحاتالحق). في هذه الكيوموغرافيا، يتم تمثيل الحركة اللامعية والرجعية للبضائع المشار إليها بمسارات ذات خطوط سلبية (خطوط خضراء) ومنحدرات إيجابية (خطوط حمراء)، على التوالي. وتظهر الحويصلات الثابتة كمسارات عمودية (خطوط زرقاء). كشف تحليل Kymograph أن الأنواع الثلاثة من البضائع التي تم تحليلها تخضع للنقل ثنائي الاتجاه مع تشغيل سريع وجراحي في كلا الاتجاهين. وعلاوة على ذلك، كشف التحديد الكمي لتدفق البضائع عبر منطقة من الخلايا النجمية (الصندوق الأحمر) عن وجود اختلافات في النسبة المئوية للجسيمات الموتيلية بين الشحنات. على سبيل المثال، في حين أن 70٪ من الملتحمة EAAT1-GFP ثابتة (الشكل2B)، وأقل من 20٪ من Cx43-GFP (الشكل2F) و 45٪ من الشحنات endolysosomal التي تحمل علامة التحقيق (الشكل2J) هي غير motile. هذه الاختلافات في الحركة بين الشحنات من المرجح أن تمثل الحركة العادية، خط الأساس في منطقة الخلايا النجمية حيث تم الحصول على الأفلام.

ويمكن أيضا استخدام رسم الخرائط الدقيقة للتغيير في موقف X-Y على طول مقياس الوقت الكامل لكل جسيم تم الحصول عليها من kymograph لتقييم معلمات الحركة الأخرى، مثل سرعة البضائع (الشكل2C، G،K) وطول التشغيل (المسافة سافر) (الشكل2D، H،L). ويمكن تحليل معلمات الحركة بشكل أكبر للشحنات الفردية لتحديد التغيرات في اتجاه الحركة (الحركة اللاإتجاهية مقابل الحركة الرجعية) وكذلك الانتكاسات في اتجاه الجسيمات في الحركة، وعدد التوقفات، وما إلى ذلك. يمكن أن توفر نتائج هذه الأنواع من التحليلات معلومات كمية ذات مغزى فيما يتعلق بالتغيرات في التوزيع الخلوي للأعضاء وبروتينات الغشاء في الخلايا النجمية في ظل ظروف القاعدية أو غير الطبيعية في داخل الخلايا وغير الخلوية البيئه.

Figure 1
الشكل 1: إنشاء الثقافات الأولية للخلايا النجمية للماوس.
(أ) الخطوات المطلوبة لتشريح أدمغة الماوس P2−P4. (ب)(i,iv)صور برايتفيلد للثقافات الغلية المختلطة المعالجة (ط) وغير المعالجة (4) مع AraC. رؤوس الأسهم الحمراء تشير إلى ميكروغليا الملوثات. (ii,v) صور من الثقافات التشيّاقة المعوّقة المعالجة (2) وغير المعالجة (v) مع AraC. رؤوس الأسهم الزرقاء تشير إلى الملوثات oligodendrocytes. (iii,vi) الصور البؤرية للثقافات النجمية النقية المعالجة (3) وغير المعالجة (6) مع AraC. الأخضر يظهر GFAP تلطيخ وDAPI (الأزرق) تسميات جميع النوى. (C) النسبة المئوية للخلايا الإيجابية GFAP. البيانات تمثل متوسط ± SEM. *** p < 0.001، غير المقترنة t-اختبار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التحليلات الكمية لديناميات البضائع في الخلايا النجمية.
(ألف، هاء،I) الألواح اليسرى: الخلايا النجمية التي تعبر عن EAAT1-GFP (A)، Cx43-GFP (E) أو تعامل مع التحقيق الذي تسميات البطانة المتأخرة والليسوسوم (أنا). تشير المربعات الحمراء إلى المناطق المستخدمة لتحليل ديناميات الجسيمات. اللوحات اليمنى: kymographs الأصلي والملونة التي تبين مسارات للبضائع المشار إليها. تمثل الخطوط الحمراء الشحنات المتحركة إلى الوراء، والخطوط الخضراء الشحنات المتحركة، والخطوط الزرقاء غير motile الشحنات. (ب، واو،ي) النسبة المئوية للجسيمات الثابتة والمولية. (C، G،K) القياس الكمي للسرعة اللاتيروية والرجعية و(D، H،L) طول التشغيل. البيانات تمثل يعني ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هنا، ونحن نصف نهج تجريبي للتعبير عن، تصور، وتتبع الفلورسنت الموسومة العضيات والبروتينات غشاء ذات أهمية باستخدام مجهريالفيديو الفاصل الزمني في عالية النقاء الأولية الماوس القشرية MD astrocytes. كما نحدد منهجية لقياس ديناميات الجسيمات. التصور المباشر للبروتين وديناميات الجهاز ية في الخلايا النجمية الأولية يوفر أداة قوية لدراسة تنظيم النقل داخل الخلايا في هذه الخلايا في المختبر.

منهجية إنشاء الماوس MD الثقافات النجمية المذكورة أعلاه يجمع بين خطوات من البروتوكولات الأخرى المنشورة13،14،15، مما يؤدي إلى كل من طريقة أبسط وفي أعلى نقاء وجودة الثقافات. الجمع بين العلاج AraC15 وتنقية الهز القائمعلى 13،14 يمكن أن تسفر عن ثقافات الخلايا النجمية مع نقاء يصل إلى 98 ٪ (تقييمها بنسبة GFAP+ الخلايا مجموع الخلايا) ، والتي في مثالنا يؤدي إلى زيادة بنسبة 27٪ في النقاء على الثقافات التي تخضع لخطوات تنقية فقط (الشكل1C). الثقافات عالية النقاء من الخلايا النجمية الماوس التي تم الحصول عليها مع هذا الأسلوب يشبه القيم المبلغ عنها لثقافات الخلايا النجمية الفئران (تقييمها من قبل الاختبارات الأنزيمية والمجهر الإلكتروني) من قبل مكارثي وديفيليس14. ومع ذلك، فإن طريقة مكارثي/ديفيليس، التي لا تشمل علاج أراك، تتطلب خطوة اهتزاز أطول (15-18 ساعة) وجولتين إضافيتين من تنقية14.

في مثالنا، نبين أن هذا البروتوكول حساس بما فيه الكفاية لالتقاط الاختلافات في الحركة بين مختلف بروتينات الغشاء والعضيات في الخلايا النجمية، والتي من المرجح أن تمثل مساراتها داخل الخلايا الفردية والخلوية وظيفه. وعلى الرغم من أن مثالنا يبين فائدة هذا البروتوكول في الظروف القاعدية، فإن هذه المنهجية يمكن تكييفها بسهولة لقياس بارامترات النقل ضمن مجموعة واسعة من المسائل البحثية. على سبيل المثال، يمكن استخدام بروتوكولات مماثلة مع تعديلات طفيفة لتوصيف أحداث النقل في الخلايا النجمية في المختبر استجابة للبيئة داخل أو خارج الخلية، مثل الضرر الخلوي، والسمية، والطفرات المسببة للأمراض، والنشاط متشابك (في الثقافات المختلطة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية)، الخ. وبالمثل، يمكن أيضا استخدام التعبير المشترك والتصور للشحنات أو العضيات المتعددة، التي تحمل كل منها علامات فردية ذات فلوروفور مختلفة، لتقييم التغيرات الدينامية في التوطين المشترك والتكوين المعقد، والتفاعلات العابرة بين العضيات ، وأحداث النقل إعادة تدوير الغشاء وبطانة الرحم.

يعتمد نجاح المنهجية المعروضة هنا في المقام الأول على القدرة على الحصول على ثقافات عالية الجودة في الخلايا النجمية وفي وضع العلامات الفعالة للبضائع ذات الأهمية. عند استخدام هذا الإجراء للتصوير الحي، من المهم مراقبة التعبير الفلورسنت عن كثب لتحديد الوقت الأمثل لحضانة ما بعد الانتراب. في المتوسط، وجدنا أن للبضائع تحليل فترة حضانة 24 ساعة يؤدي إلى كثافة إشارة جيدة للحصول على التصوير الحي. يمكن أن يؤدي الحضانة المطولة للخلايا النجمية المنقولة إلى التعبير العالي عن البروتينات ذات العلامات الفلورية، والتي يمكن أن تحفز على تجميع البروتين، وبالتالي تغيير توطين البضائع ودينامياتها، وإلى تقليل صحة الثقافات. الخلايا النجمية هي عرضة جدا للأضرار المادية والتغيرات في بيئة الثقافة، والتي يمكن أن تؤدي إلى تحريض الاستجابات النسخي والخلوي، بما في ذلك التفاعل. ولذلك، من الأهمية بمكان تقليل الفترات الزمنية بين خطوات الغسيل، وتقليل تعرض الثقافات للهواء وإلى تغيرات كبيرة في درجة الحرارة أو شدة الضوء على مدى فترات الحضانة والاكتساب.

وباختصار، يمكن استخدام الأساليب المعروضة هنا لتقييم وقياس التغيرات الديناميكية في توطين البروتين والأعضاء في الخلايا النجمية. وهي توفر أدوات قيمة تسمح بدراسة التغيرات في الاستجابات الفلكية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

[دينل] كان ساندت بالجامعة [نورث كرولينا] في كنيسة صغيرة تل ([أونك]) مدرسة الطبّ كسيمونز طالبة. وحظيت هذه الاستجابة بدعم من المنحة المقدمة من لجنة الأمم المتحدة للاستجابة إلى البيئة R25 GM089569. تم دعم العمل باستخدام المرفق الأساسي للميكروسكوب مركز علم الأعصاب التابع لقيادة الأمم المتحدة، جزئياً، بتمويل من منحة دعم مركز العلوم العصبية التابع للمعهد الوطني للصحة الوطنية - NINDS P30 NS045892، ومنحة دعم مركز أبحاث الإعاقة الفكرية والتنموية التابع للمعهد الوطني للصحة الوطنية التابع للمعهد الوطني للصحة الوطنية HD079124.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5% Trypsin (10x) Gibco 15090-046
Benchtop Centrifuge Thermo Scientific 75-203-637 Sorvall ST8 Centrifuge
Cell Culture Grade Water Gen Clone 25-511
Cell Culture Microscope Zeiss WSN-AXIOVERT A1 Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities
Cytosine Arabinoside Sigma C1768-100MG (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage
DAPI Sigma D9542-5MG Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.
Dissecting Microscope Zeiss Stemi 305
Dissecting Scissors F.S.T 14558-09
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gen Clone 25-500
Fetal Bovine Serum Gemini 100-106 Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J) NIH Version 1.52i
Fine Tip Tweezers F.S.T 11254-20 Style #5
Fluorescence light source Excelitas 012-63000 X-Cite 120Q
GFAP antibody Cell Signaling 3670S GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom Dishes Mattek corporation P35G-1.5-14-C 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated
Graefe Forceps F.S.T 11054-10 Graefe Iris Forceps with curved tips
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) Life Technologies L7526 LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.
Hank's Balanced Salt Solution (10x) Gibco 14065-056 Magnesium and calcium free
Imaging Media Life Technologies A14291DJ Live Cell Imaging Solution
Inverted Confocal Microscope Zeiss LSM 780
KymoToolBox https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent Life Technologies 11514015 Plus Reagent
Lipofection Reagent Life Technologies 15338100 Lipofectamine LTX reagent
Orbital shaking incubator New Brunswick Scientific 8261-30-1008 Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control
Penicillin/Strepomycin solution (100x) Gen Clone 25-512
Phosphate Buffered Saline (10x) Gen Clone 25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide Sigma P7405 Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing
Reduced serum medium Gibco 31985-062 OPTI-MEM
Tissue Culture Flasks Olympus Plastics 25-209 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap
Tissue culture incubator Thermo Scientific 51030285 HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control
Tris-Base Sigma T1503 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl Sigma T3253 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200072
Vacuum-Driven Filter Systems Olympus Plastics 25-227 500 ml, PES membrane, 0.22 µm
Vannas scissors straight Roboz RS-5620

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, (3), 430-440 (2008).
  2. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22, (5), 208-215 (1999).
  3. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142, (22), 3805-3809 (2015).
  4. Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34, (2), 76-87 (2011).
  5. Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22, (3), 438-445 (2012).
  6. Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (9), 020370 (2015).
  7. Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34, (10), 1758-1766 (2009).
  8. Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8, (1), 12-20 (2007).
  9. Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61, (6), 917-928 (2013).
  10. Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60, (4), 594-604 (2012).
  11. Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10, (5), 0126217 (2015).
  12. Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292, (36), 14747-14763 (2017).
  13. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).
  14. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85, (3), 890-902 (1980).
  15. Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102, (6), 2244-2253 (1986).
  16. Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152, (3), 479-491 (2013).
  17. Cordelières, F. P. IJ KymoToolBox. Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016).
تصور وتحليل النقل داخل الخلايا من العضيات وغيرها من الشحنات في الخلايا النجمية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Creighton, B. A., Ruffins, T. W., Lorenzo, D. N. Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes. J. Vis. Exp. (150), e60230, doi:10.3791/60230 (2019).More

Creighton, B. A., Ruffins, T. W., Lorenzo, D. N. Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes. J. Vis. Exp. (150), e60230, doi:10.3791/60230 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter