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Neuroscience

एस्ट्रोसाइट्स में ऑर्गेनेल्स और अन्य कार्गो के इंट्रासेल्यूलर ट्रांसपोर्ट का दृश्य और विश्लेषण करना

doi: 10.3791/60230 Published: August 28, 2019
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम organelles के intracellular परिवहन और murine astrocytes में प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की तस्करी कल्पना करने के लिए एक इन विट्रो लाइव-इमेजिंग विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल भी कार्गो परिवहन itineraries और गतिकी का निर्धारण करने के लिए एक छवि विश्लेषण पद्धति प्रस्तुत करता है।

Abstract

Astrocytes वयस्क मस्तिष्क में सबसे प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार के बीच हैं, जहां वे कार्यों की एक बहुतायत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. मस्तिष्क homeostasis में एक केंद्रीय खिलाड़ी के रूप में, astrocytes महत्वपूर्ण चयापचयों और बफर extracellular पानी, आयनों, और ग्लूटामेट के साथ न्यूरॉन्स की आपूर्ति. "त्रि-पक्षीय" synapse का एक अभिन्न घटक, astrocytes भी गठन में महत्वपूर्ण हैं, pruning, रखरखाव, और synapses के मॉडुलन. इन अत्यधिक इंटरैक्टिव कार्यों को सक्षम करने के लिए, astrocytes आपस में और अन्य glial कोशिकाओं के साथ संवाद, न्यूरॉन्स, मस्तिष्क vascuature, और विशेष झिल्ली प्रोटीन की एक भीड़ के माध्यम से extracellular पर्यावरण है कि सेल शामिल आसंजन अणुओं, एक्वापोरिन, आयन चैनल, न्यूरोट्रांसमीटर ट्रांसपोर्टर, और अंतराल जंक्शन अणुओं. इस गतिशील प्रवाह का समर्थन करने के लिए, astrocytes, न्यूरॉन्स की तरह, कसकर समन्वित और कुशल intracellular परिवहन पर भरोसा करते हैं. न्यूरॉन्स के विपरीत, जहां intracellular तस्करी बड़े पैमाने पर रेखांकित किया गया है, astrocytes में microtubule आधारित परिवहन कम अध्ययन किया गया है. फिर भी, कोशिका झिल्ली प्रोटीन और इंट्रासेल्यूलर आर्गेनेल ट्रांसपोर्ट के एक्सो और एंडोसाइटिक तस्करी एस्ट्रोसाइट्स के सामान्य जीव विज्ञान का आयोजन करती है, और ये प्रक्रियाएं अक्सर बीमारी में या चोट के जवाब में प्रभावित होती हैं। यहाँ हम संस्कृति उच्च गुणवत्ता murine astrocytes के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल प्रस्तुत, फ्लोरोसेंट लेबल astrocytic प्रोटीन और ब्याज के organelles के लिए, और समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर उनके intracellular परिवहन गतिशीलता रिकॉर्ड करने के लिए. हम यह भी प्रदर्शित कैसे निकालने के लिए और उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (यानी, ImageJ/FIJI) plugins का उपयोग कर प्राप्त फिल्मों से प्रासंगिक परिवहन मापदंडों की मात्रा निर्धारित करने के लिए.

Introduction

Astrocytes वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिकाओं, जहां वे अद्वितीय विकास और homeostatic कार्यों 1प्रदर्शन कर रहे हैं. एस्ट्रोसाइट्स त्रि-पक्षीय synapse के भाग के रूप में पूर्व और पदों के साथ सीधे संपर्क के माध्यम से synaptic विकास modulate, जो न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स, ट्रांसपोर्टरों, और सेल आसंजन अणुओं है कि synapse गठन की सुविधा शामिल और न्यूरॉन-एस्ट्रोसाइट संचार2| इसके अलावा, astrocytes सक्रिय रूप से synaptic संचरण को नियंत्रित करने और तेजी से synaptic फांक से उत्तेजक न्यूरोट्रांसमीटर को हटाने के द्वारा न्यूरॉन excitotoxicity को रोकने, रीसाइक्लिंग न्यूरोट्रांसमीटर, और synaptic pruning में भाग लेने3 , 4 , 5 , 6. इन अत्यधिक इंटरैक्टिव कार्यों को सक्षम करने के लिए, एस्ट्रोसाइट्स अन्य ग्लिल कोशिकाओं के साथ, और कोशिका आसंजन अणुओं, एक्वापोरिन, आयन चैनलों सहित विशेष झिल्ली प्रोटीन के माध्यम से न्यूरॉन्स के साथ आपस में संवाद करते हैं, न्यूरोट्रांसमीटर ट्रांसपोर्टर, और अंतराल जंक्शन अणुओं. एस्ट्रोसाइट्स अपने अंतर और बाह्यवातावरण7 में उतार-चढ़ाव के जवाब में इन प्रोटीनों के सतह के स्तर को सक्रिय रूप से बदल ते हैं। इसके अलावा, mitochondria के स्तर और वितरण में परिवर्तन, लिपिड बूंदों, और अपमानजनक और रीसाइक्लिंग organelles modulate ऊर्जा की आपूर्ति, चयापचय उपलब्धता, और सेलुलर समाशोधन प्रक्रियाओं है कि एस्ट्रोसाइट समारोह के लिए आवश्यक हैं और अस्तित्व बचाना.

झिल्ली प्रोटीन और ऑर्गेनेल तस्करी और एस्ट्रोसाइट्स में स्थिति में गतिशील परिवर्तन मोटर प्रोटीन और अनुकूलकों के सम्मिलित कार्य द्वारा मदद करते हैं जो कार्गो गतिशीलताकोबढ़ावा देते हैं8 ,9. इसी प्रकार, झिल्ली प्रोटीन की सतह के स्तर internalization और रीसाइक्लिंग घटनाओं10के माध्यम से संग्राहक रहे हैं. इन कार्गोओं को actin, microtubules, और संभवतः मध्यवर्ती फिलामेंट पटरियों8के एक जटिल नेटवर्क के माध्यम से ले जाया जाता है। अंत बाध्यकारी प्रोटीन 1 (EB1) के इम्यूनोफ्लोरेस धुंधला पर आधारित अध्ययन, जो बढ़ते माइक्रोट्युबल प्लस सिरों पर जमा होता है, सुझाव है कि माइक्रोट्यूबेट्स के बंडलों में पेरिनुक्लियस से बाहर निकलने और उनके प्लस अंत का विस्तार करने के लिए परिधि11| हालांकि, संगठन की एक व्यापक परीक्षा और microtubules और अन्य cytoskeletal तत्वों की ध्रुवता लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग कर अभी भी कमी है. जबकि organelles और झिल्ली प्रोटीन की गतिशीलता अंतर्निहित तंत्र के कई बड़े पैमाने पर न्यूरॉन्स और अन्य कोशिका प्रकार में अध्ययन किया गया है, astrocytes में कार्गो गतिशीलता कम अच्छी तरह से समझा जाता है. एस्ट्रोसाइट्स में प्रोटीन और ऑर्गेनेल वितरण में परिवर्तन के बारे में हमारे वर्तमान ज्ञान के अधिकांश निश्चित तैयारी के पारंपरिक एंटीबॉडी आधारित लेबलिंग पर आधारित है, जो कार्गो गतिशीलता7के सटीक स्थानिक और लौकिक परीक्षा precludes, 12.

यहाँ, हम उच्च शुद्धता प्राथमिक माउस एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों में लाइव इमेजिंग के लिए झिल्ली प्रोटीन और organelles लेबल करने के लिए एक विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम उदाहरण प्रदान करते हैं जिसमें हम ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) टैग किए गए झिल्ली प्रोटीन के गतिशील स्थानीयकरण को ट्रांसफेक्टेड एस्ट्रोसाइट्स में ट्रैक करते हैं, जिसमें अंतराल जंक्शन प्रोटीन कोनेसिन 43 (Cx43-GFP) और उत्तेजक एमिनो एसिड शामिल हैं ट्रांसपोर्टर 1 (EAAT1-GFP). हम अम्लीय organelles कल्पना और लाइव एस्ट्रोसाइट्स में उनकी तस्करी गतिशीलता का पालन करने के लिए एक फ्लोरोसेंट acidotropic जांच के उपयोग का भी वर्णन. अंत में, हम अलग-अलग कार्गो के लिए परिवहन मापदंडों को निकालने और मूल्यांकन करने के लिए समय चूक डेटा का विश्लेषण करने का तरीका प्रदर्शित करते हैं।

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं चैपल हिल पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) में उत्तरी केरोलिना विश्वविद्यालय के अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया.

1. मस्तिष्क विच्छेदन और प्राथमिक माउस एस्ट्रोसाइट्स की संस्कृति

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल प्रकाशित विधियों से अनुकूलित किया गया था, जो मैकार्थी और डेवेलिस13,14,15द्वारा विकसित मूल प्रक्रिया का अनुसरण करता है। मैकार्थी/डेवेलिस (एमडी) एस्ट्रोसाइट्स की मिश्रित कोशिका संस्कृतियों को प्रसव के बाद के दिन 2 डिग्री 4 (पी 2-पी 4) माउस कॉर्टिस से तैयार किया जाता है, जो एंटी-माइटिक कारक के साथ इलाज किया जाता है, और अंतिम समृद्ध एस्ट्रोसाइट संस्कृति को प्राप्त करने के लिए शुद्ध होता है। या तो सेक्स के माउस पिल्ले से चार cortices एक T75 ऊतक संस्कृति फ्लास्क संस्कृति उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त हैं.

  1. टी 75 फ्लास्क के नीचे कोट करें (100% कोण गर्दन का उपयोग, 0.22 मीटर हाइड्रोफोबिक वेंटेड फिल्टर कैप) के साथ पाली-डी-लाइसिन (1 मिलीग्राम/एमएल में 0.1 एम ट्राइस बफर, पीएच 8.5) और धारा के शुरू होने से पहले 24 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  2. विच्छेदन प्रक्रिया शुरू करने से पहले, एस्ट्रोसाइट संस्कृति मीडिया के गर्म 30 एमएल (Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम [डीएमईएम] उच्च ग्लूकोज, 10% गर्मी-inactivated भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन / दो विच्छेदन व्यंजन (60 मिमी व्यास) हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) Ca2 + या Mg 2+के बिना 6 एमएल से भरा बर्फ पर तैयार करें।
  3. सभी शल्य चिकित्सा उपकरण (ठीक टिप tweezers, विच्छेदन कैंची, Vannas कैंची सीधे, घुमावदार सुझावों के साथ Graefe संदंश) 70% इथेनॉल से पहले और प्रत्येक विच्छेदन के बीच में संक्रमित.
  4. जल्दी से शल्य कैंची के साथ decapitation द्वारा उन्हें ethanizing से पहले 70% इथेनॉल के साथ P2-P4 माउस पिल्ले के सिर और गर्दन स्प्रे. खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए खोपड़ी के साथ पूर्वकाल मिडलाइन चीरा करने के लिए एक पीछे की ओर प्रदर्शन करें। ध्यान से गर्दन से नाक के लिए खोपड़ी में कटौती.
  5. आंखों से बेहतर दो अतिरिक्त पार्श्व चीरों प्रदर्शन. ठीक टिप tweezers का उपयोग धीरे पक्ष के लिए खोपड़ी फ्लैप फ्लिप. मस्तिष्क निकालें और Ca2 + या Mg2 +बिना बर्फ ठंडा HBSS से भरा पहले विच्छेदन पकवान में जगह है। बर्फ पर पकवान रखें और दिमाग के बाकी कटाई जारी है.
    नोट: एक विच्छेदन क्षेत्र के अंतर्गत विच्छेदन प्रक्रिया के शेष निष्पादित करें।
  6. वनास कैंची या ठीक छटट्का का प्रयोग करते हुए घ्राण बल्बों को हटा दें (चित्र 1) अनुप्रस्थ और अंतरहेमीगोलिक विदर के चौराहे पर घुमावदार टिप संदंश के साथ, धीरे से प्रांतस्था और डाइनसेफेलन के बीच घुमावदार टिप संदंश की एक दूसरी जोड़ी डालें, धीरे-धीरे मस्तिष्क गोलार्द्धों को बाकी से अलग करने के लिए बल को खोलने मस्तिष्क (चित्र 1Aii, Aiii)। अवांछित ऊतक निकालें (चित्र 1Aiv)
  7. प्रत्येक cortical गोलार्द्ध के लिए, ध्यान से ठीक टिप tweezers के साथ meninges हटा दें. वैकल्पिक रूप से, कॉर्टिस से हिप्पोकैम्पस को हटा दें। का 2+ या Mg2+ के बिना बर्फ-ठंडा HBSS से भरा एक दूसरा पकवान में विच्छेदन माउस cortices स्थानांतरण और शेष दिमाग विच्छेदन करते समय बर्फ पर रखने के लिए।
    नोट: एक laminar प्रवाह हुड में aseptic शर्तों के तहत अगले कदम का संचालन.
  8. बाँझ तेज शल्य कैंची या एक स्केलपेल का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में विच्छेदन cortices कट (लगभग 2 डिग्री 4 मिमी)। एक 50 एमएल शंकु ट्यूब एंजाइम समाधान युक्त करने के लिए विच्छेदन ऊतक स्थानांतरण (22.5 एमएल HBSS बिना Ca2 + या Mg2 +, 2.5 एमएल 2.5% trypsin). कोमल व्युत्क्रम हर 10 मिनट के साथ 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  9. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर centrifugation द्वारा पचा ऊतक ले लीजिए और decantation द्वारा एंजाइम समाधान को दूर (एक वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग नहीं करते). एस्ट्रोसाइट संस्कृति मीडिया के 10 एमएल जोड़ें और एक 10 एमएल सीरियोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके समाधान 20-30x को पाइप ेट करके ऊतक को एकल कोशिकाओं में अलग करें।
  10. कोशिका क्लंप और अपाच्य ऊतक को कम करने के लिए 70 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें। एक साफ 50 एमएल शंकु ट्यूब में छानना ले लीजिए और एस्ट्रोसाइट संस्कृति मीडिया के साथ 20 एमएल के लिए कुल मात्रा को समायोजित। इस बिंदु पर, एक हेमोसाइटोमीटर के साथ trypan नीले और गिनती कोशिकाओं के 10 डिग्री एल के साथ सेल निलंबन के 10 डिग्री सेल्सियस मिश्रण द्वारा cortical वियोजन की दक्षता का मूल्यांकन.
    नोट: चार P2 से एक तैयारी P2-P4 माउस cortices पैदावार 10 "15 x 106 एकल कोशिकाओं.
  11. T75 संस्कृति फ्लास्क से पाली-डी-lysine कोटिंग समाधान aspirate और बाँझ पानी के साथ दो बार धो लो. प्लेट 20 एमएल सेल निलंबन और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट .

2. एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों का शुद्धिकरण और रखरखाव

नोट: बाँझ फ़िल्टर्ड (0.22 डिग्री मीटर फिल्टर झिल्ली) एस्ट्रोसाइट मीडिया 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म का उपयोग कर एक laminar प्रवाह हुड में aseptic शर्तों के तहत सभी मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन।

  1. चढ़ाना के बाद सेल मीडिया 48 एच बदलें (विट्रो 2, DIV2 में दिन)।
  2. DIV5 में, ताजा एस्ट्रोसाइट संस्कृति मीडिया के साथ मीडिया की जगह 10 डिग्री सेल्सियस साइटोसाइन arabinoside (AraC) के साथ पूरक.
    नोट: यह चरण फाइब्रोब्लास्ट्स और अन्य ग्लिल कोशिकाओं सहित संदूषक कोशिकाओं को हटाने की सुविधा प्रदान करता है। आराक के साथ संस्कृतियों का व्यवहार करना महत्वपूर्ण है क्योंकि अब 48 एच से अधिक नहीं है क्योंकि लंबे समय तक ऊष्मायन समय एस्ट्रोसाइट व्यवहार्यता को कम करेगा.
  3. DIV7 में, AraC के बिना astrocyte संस्कृति मीडिया के लिए मीडिया बदलने के लिए और संस्कृति संगम दैनिक की जांच शुरू करते हैं. एक बार कोशिकाओं 80% संगम तक पहुँच चुके हैं, कोट दो-T75 फ्लास्क के लिए प्रत्येक unpurified एस्ट्रोसाइट संस्कृति फ्लास्क के साथ पाली-डी-lysine और इनक्यूबेट 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 8 एच से रात भर के लिए.
  4. अगले दिन, 37 डिग्री सेल्सियस कक्षीय मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए 180 आरपीएम पर संस्कृति फ्लास्क मिलाते हुए एस्ट्रोसाइट शुद्धि शुरू करें। मीडिया निकालें और यह ताजा astrocyte संस्कृति मीडिया के साथ बदलें. 37 डिग्री सेल्सियस कक्षीय मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 6 एच के लिए 240 आरपीएम पर कोशिकाओं को हिलाएं। प्रीवार्म 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस), एस्ट्रोसाइट संस्कृति मीडिया, और 0.25% ट्रिप्सिन-EDTA को 37 डिग्री सेल्सियस 20 डिग्री 30 मिनट झटकों की अवधि के अंत से पहले।
    नोट: सीओ2ऊष्मायन मिलाते हुए चरणों के दौरान आवश्यक नहीं है। यदि वांछित, मीडिया 30-मिनट और 6-h मिलाते कदम के बाद एकत्र क्रमशः microglia और oligodendrocytes संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मिश्रित संस्कृति के AraC उपचार, तथापि, अन्य glial कोशिकाओं की बहुतायत कम हो जाएगा.
  5. शेकर से संस्कृति फ्लास्क निकालें और तुरंत 10 एमएल गर्म 1x पीबीएस प्रति फ्लास्क के साथ मीडिया की जगह लें। पीबीएस निकालें और 0.25% trypsin-EDTA प्रति फ्लास्क के 3 एमएल जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट , टुकड़ी के लिए हर 5 मिनट की जाँच।
  6. एक बार कोशिकाओं को फ्लास्क से अलग कर दिया है, एस्ट्रोसाइट संस्कृति मीडिया के 10 एमएल जोड़कर trypsinization बंद करो. स्थानांतरण अलग एस्ट्रोसाइट्स एक 50 एमएल शंकु ट्यूब और गोली कोशिकाओं के लिए 300 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा और एस्ट्रोसाइट संस्कृति मीडिया के 40 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित.
  7. पाली-डी-lysine लेपित T75 फ्लास्क को बाँझ पानी और शुद्ध एस्ट्रोसाइट निलंबन की प्लेट 20 एमएल के साथ दो बार धोएं। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर पर लौटें। एस्ट्रोसाइट संस्कृति मीडिया हर दो दिनों में एक अतिरिक्त 10 दिनों के लिए बदलें जब तक astrocytes परिपक्व.
    नोट: शुद्ध एस्ट्रोसाइट्स के प्रत्येक T75 फ्लास्क चढ़ाना में प्रत्येक 3 x 105 कोशिकाओं के साथ 2 नए T75 फ्लास्क का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।
  8. बाद में पास के लिए या माइक्रोस्कोपी के लिए एस्ट्रोसाइट्स प्लेट करने के लिए चरणों को दोहराएँ 2.5 डिग्री 2.7।
    नोट: AraC के अलावा और निम्नलिखित शुद्धि के बाद एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों की शुद्धता brightfield माइक्रोस्कोपी के माध्यम से गुणात्मक मूल्यांकन किया जा सकता है, या अधिक ठीक glial तंतुक एसिड प्रोटीन (GFAP) के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित करके सकारात्मक फ्लोरोसेंट छवियों में देखने के क्षेत्र प्रति कोशिकाओं (चित्र 1B, C) .

3. फ्लोरोसेंट टैग किए गए प्लाज्मिड का संक्रमण

  1. transfection या लेबलिंग से पहले दिन, इमेजिंग के लिए वांछित घनत्व पर बीज astrocytes 24 डिग्री 48 एच के बाद transfection. 24-वेल प्लेट्स या 14 मिमी ग्लास बॉटम कुओं के लिए एक अनुशंसित घनत्व 2 x 104 कोशिकाओं /
    नोट: इस प्रोटोकॉल एक lipofection आधारित विधि का उपयोग कर 24 अच्छी तरह से प्लेटों या 14 मिमी ग्लास नीचे कुओं पर 12 मिमी ग्लास coverslips पर चढ़ाया astrocytes के transfection के लिए अनुकूलित है। अभिकर्मकों को उस संस्कृति व्यंजन के आकार के आधार पर बढ़ाया जाना चाहिए जिसमें एस्ट्रोसाइट्स बढ़ रहे हैं।
  2. कम सीरम मीडिया ( सामग्री कीतालिका) में लिपोफेक्शन अभिकर्मक (सामग्री की तालिका) को विलेन करें। डीएनए के लिए lipofection अभिकर्मक के अनुपात को अनुकूलित करने के लिए, पर्याप्त कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला का परीक्षण. उदाहरण के लिए, यदि इस प्रोटोकॉल में कार्यरत अभिकर्मक का उपयोग करते हुए (सामग्रीकीसारणी), कम सीरम मीडिया के 50 डिग्री एल में लिपोफेक्शन अभिकर्मक के 2, 3, 4, और 5 डिग्री सेल्सियस को पतला किया गया है।
  3. कम सीरम मीडिया के 250 डिग्री एल में उच्च शुद्धता डीएनए के 5 डिग्री ग्राम को पतला करें। लिपोफेक्शन बढ़ाने वाला अभिकर्मक (सामग्री की सारणी) का 5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। डीएनए lipofection बढ़ाने मिश्रण के एक बराबर मात्रा के साथ lipofection अभिकर्मक युक्त ट्यूब का मिश्रण. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर पाइपटिंग और इनक्यूबेट द्वारा मिक्स करें।
  4. एस्ट्रोसाइट संस्कृति मीडिया निकालें और कोशिकाओं ड्रॉपवार करने के लिए transfection मिश्रण (चरण 3.3) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर 6-एच ऊष्मायन के बाद, एस्ट्रोसाइट संस्कृति मीडिया (2 एमएल 14 मिमी ग्लास बॉटम डिश के लिए) की एक उचित मात्रा के साथ ट्रांसफेक्शन कॉम्प्लेक्स की जगह लें। छवि अधिग्रहण करने के लिए आगे बढ़ने से पहले एक अतिरिक्त 24 "72 एच के लिए इनक्यूबेट। प्रोटीन अभिव्यक्ति और सेल व्यवहार्यता के बीच सबसे अच्छा संतुलन प्राप्त करने के लिए ऊष्मायन चरण की अवधि की बारीकी से निगरानी करें।

4. फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग कर देर endosomes/lysosomes की लेबलिंग

नोट: कुछ कार्गो कार्गो-विशिष्ट प्रोटीन के लिए उच्च आत्मीयता के साथ फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग कर लेबल किया जा सकता है। निम्नलिखित उदाहरण एक फ्लोरोसेंट acidotropic जांच के साथ देर endosomes /lysosomes के लेबलिंग की अनुमति देता है.

  1. लाइसोसोमल-लेबलिंग जांच (सामग्री की तालिका) को एस्ट्रोसाइट कल्चर मीडिया के 200 डिग्री एल में 1 डिग्री सेल्सियस की कार्य एकाग्रता के लिए और 2 x 104 कोशिकाओं के घनत्व पर चरण 3.1 से एस्ट्रोसाइट्स पर लागू करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  2. कोशिकाओं को एक बार गर्म एस्ट्रोसाइट कल्चर मीडिया से धो लें और इमेजिंग मीडिया (सामग्रीकी तालिका) से बदलें। तुरंत इमेजिंग रहने के लिए आगे बढ़ें।

5. छवि अधिग्रहण एक समय चूक इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर

नोट: समय चूक लाइव इमेजिंग एक उच्च गति कैमरा, निश्चित ध्यान, ऊष्मायन कक्ष, और एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 40x तेल उद्देश्य (उदा., योजना-Apochromat 1.4NA) के साथ सुसज्जित एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाना चाहिए। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर की एक किस्म समय चूक इमेजिंग के लिए उपलब्ध है. माइक्रोस्कोपी प्रणाली और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का चयन विशेष अध्ययन के लक्ष्यों के लिए उनकी उपलब्धता और उपयुक्तता पर आधारित होना चाहिए। कुछ सामान्य दिशानिर्देश नीचे दिए गए हैं.

  1. माइक्रोस्कोप चरण पर उचित अनुकूलक में संस्कृति कक्ष या पकवान रखें। एपिफ्लोरेसेंटी प्रकाश का उपयोग करके, उस सेल (ओं) का चयन करें जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करती है या रिकॉर्ड करने के लिए जांच करती है। डिजिटल कैमरे का उपयोग कर चयनित सेल (ओं) कल्पना करने के लिए फ्लोरोसेंट नमूना रोशनी समायोजित करें। उच्च रोशनी का उपयोग करने से बचें जो फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी का कारण बन सकता है। फोकस और ज़ूम समायोजित करें।
  2. ज़ूम और निश्चित फोकस कार्यों का उपयोग कर 300 s और 500 s के बीच लेकर समय अंतराल के लिए हर 2 एस फ्रेम की एक आवृत्ति पर एकल जेड-स्टैक समय चूक श्रृंखला प्राप्त करें।
    नोट: तस्करी गतिशीलता (वेग, गति की आवृत्ति, आदि) ब्याज के प्रोटीन के आधार पर अलग अलग होंगे, इस प्रकार, अधिग्रहण के समय पाठ्यक्रम समायोजन की आवश्यकता हो सकती है. उदाहरण के लिए, माइटोकोंड्रिया लाइसोसोम की तुलना में कम गतिशील होते हैं और लगातार ठहराव प्रदर्शित करते हैं। इस उदाहरण में, यह 800 s के लिए हर 5 s 1 फ़्रेम करने के लिए अधिग्रहण पैरामीटर समायोजित करने के लिए अधिक उपयुक्त है।
  3. समय चूक छवियों को बचाने और AVI या TIFF स्टैक फ़ाइलों के रूप में उन्हें निर्यात।

6. छवि विश्लेषण

नोट: छवि विश्लेषण ImageJ/Fifi16के लिए KymoToolBox प्लगइन का उपयोग किया गया था. विस्तृत कदम दर कदम लिखित निर्देश ऑनलाइन उपलब्ध हैं17| निम्नलिखित संक्षिप्त कदम kymographs बनाने के लिए और कण परिवहन मापदंडों को निकालने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।

  1. ImageJ/Fizi सॉफ्टवेयर में खुला समय चूक छवि अनुक्रम. AVI या TIFF स्टैक फ़ाइलों के रूप में फ़ाइल मेनू से छवियाँ आयात करें। छवि मेनू से प्रकार उपकरण का उपयोग कर इन छवि प्रकारों में से एक का चयन करके छवियों को 8-बिट या 16-बिट में कनवर्ट करें। आरजीबी फ़ाइलों के साथ काम करते हैं, छवि मेनू में रंग सुविधा के तहत उपलब्ध विभाजित चैनल उपकरण का उपयोग कर चैनल विभाजित करें।
  2. एक kymograph उत्पन्न करने के लिए (स्थिति और कण tracectories के समय में प्रतिनिधित्व), प्रत्येक ट्रैक जिसमें कणों खंडित लाइन उपकरण का उपयोग कणों के tracectories के साथ एक लाइन अनुरेखण द्वारा आगे बढ़ रहे हैं आकर्षित. आंदोलन की दिशात्मकता को सही ढंग से असाइन करने के लिए, सभी फिल्मों के लिए एक ही वांछित दिशात्मक सम्मेलन का उपयोग करके पॉलीलाइन को आकर्षित करें ताकि ध्रुवता सभी कोशिकाओं के भीतर और सभी कोशिकाओं के भीतर सुसंगत हो। उदाहरण के लिए, कोशिका के केंद्र से पाली या इसके विपरीत की ओर पॉलीलाइन खींचो। रेखा उपकरण पर डबल क्लिक करके ट्रैक की मोटाई से मेल करने के लिए लाइन चौड़ाई समायोजित करें।
  3. 10 की एक लाइन चौड़ाई का उपयोग KymoToolBox प्लगइन के ड्रा Kymo मैक्रो चलाएँ. समय में छवि जांचना करने के लिए पूछ एक संकेत (फ्रेम की संख्या, फ्रेम दर) और अंतरिक्ष (x,y संकल्प) दिखाई देगा. एक बार calibrated, kymographs उत्पन्न कर रहे हैं और डेटा प्रस्तुति या आगे कण विश्लेषण के लिए झगड़ा फ़ाइलों के रूप में बचाया जा सकता है.
  4. मैन्युअल रूप से अधिग्रहण की पूरी अवधि के लिए खंडित लाइन उपकरण का उपयोग कर kymograph में प्रत्येक कण पर नज़र रखने के द्वारा कण tracectories असाइन करें। विश्लेषण/उपकरण मेनू में पाए जाने वाले ROI प्रबंधक उपकरण का उपयोग करके प्रत्येक कण प्रक्षेप पथ को रुचि (ROI) के क्षेत्र के रूप में रिकॉर्ड करें. आगे के विश्लेषण के लिए हर समय चूक वीडियो प्रति सभी ROIs सहेजें.
    नोट: यह परिवहन मापदंडों का सबसे सटीक गणना को प्राप्त करने के लिए kymograph पर अलग-अलग कणों के लिए सही प्रक्षेप वक्र आवंटित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    1. KymoToolBox प्लगइन का विश्लेषण Kymo मैक्रो चलाएँ. एक खिड़की ड्रॉप-डाउन मेनू से कण गति (बाएं से दाएं या इसके विपरीत) की "बाहरी" दिशा को परिभाषित करने के लिए पूछ खुल जाएगा। यह चयन नाभिक या सेल परिधि के सापेक्ष छवि वाले फ्लोरोसेंट कार्गो की स्थिति पर निर्भर करता है, जैसा कि चरण 6-2 में स्थापित किया गया है। उदाहरण के लिए, यदि नाभिक कार्गो के बाईं ओर स्थित है, और चरण 6-2 में पॉलीलाइन नाभिक से दूर खींची गई थी, तो बाह्य कण गति को "बाएं से दाएं" के रूप में परिभाषित करें।
    2. सीमा की गति को परिभाषित करें (न्यूनतम गति जिस पर एक कार्गो गतिशील माना जाता है) विश्लेषण Kymo विंडो में. कार्गो के लिए जो तेजी से इंट्रासेल्यूलर परिवहन गति पर चलते हैं, 0.1 डिग्री मीटर प्रति सेकंड एक उपयुक्त विकल्प है। ब्याज की प्रत्येक कार्गो के लिए सॉफ्टवेयर की संवेदनशीलता को समायोजित करने के लिए इस मान को संशोधित करें। प्रत्येक कण प्रक्षेप पथ की मोटाई मैच के लिए लाइन चौड़ाई समायोजित करें।
    3. सभी डेटा लॉग करें का चयन करें और लॉग extrapolated निर्देशांक विकल्प विश्लेषण kymo विंडो में. यह मतलब गति, आवक गति, जावक गति, संचयी दूरी की यात्रा, या तो आवक या जावक दिशा में कूच दूरी, प्रत्येक कण के लिए स्विच की संख्या, समय का प्रतिशत सहित विभिन्न कार्गो परिवहन मापदंडों की गणना करेगा प्रत्येक दिशा में चल रहा है या रोका, आदि अलग-अलग पटरियों के लिए गणना डेटा तो kymograph प्रति जमा और प्रत्येक छवि के लिए विशिष्ट पाठ फ़ाइलों में सहेजा जाता है।
      नोट: विश्लेषण Kymo मैक्रो के दिखाएँ रंगीन Kymo विकल्प मूल kymograph पर पथ का एक रंग कोडित ओवरले उत्पन्न करता है. बाहर की ओर यात्रा करने वाले कण हरे, लाल रंग में आवक और नीले रंग में स्थिर कणों में रंगे हुए हैं। रिपोर्ट विश्लेषण Kymo मैक्रो के मूल ढेर विकल्प पर निर्देशांक मूल समय चूक वीडियो और kymograph पर extrapolated वस्तु की स्थिति का एक रंग कोडित ओवरले उत्पन्न करता है.

Representative Results

ऊपर उल्लिखित प्राथमिक माउस एमडी एस्ट्रोसाइट्स की स्थापना के लिए प्रोटोकॉल reproduible, उच्च गुणवत्ता संस्कृतियों उपज चाहिए. हालांकि संस्कृतियों में शुरू में एस्ट्रोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स, और अन्य ग्लिल कोशिकाओं का मिश्रण होता है, जिसमें माइक्रोग्लिया और ओलिगोडेनड्रोसाइट्स शामिल होते हैं (चित्र1द्वि, बीव; लाल ऐरोहेड्स), DIV5-DIV7 के बीच मिश्रित संस्कृति में AraC का जोड़, कम से कम इन संदूषक कोशिकाओं का प्रसार. संयुक्त आराक उपचार और मिलाते-मिलाते आधारित शुद्धिकरण कार्यनीति पारंपरिक प्रोटोकॉलों पर एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों की शुद्धता को समृद्ध करती है (चित्र 1बीआई) जिसमें केवल शुद्धिकरण चरण शामिल हैं (चित्र 1Bv; नीला ऐरोहेड्स)13| अपेक्षित आकृति विज्ञान और संरचना (GFAP और 4',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] धुंधला द्वारा मूल्यांकन) AraC के साथ इलाज शुद्ध एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों के या छोड़ दिया अनुपचारित चित्र 1Biii, बीवीमें दिखाया गया है। देखने के क्षेत्र के प्रति GFAP+ कोशिकाओं के प्रतिशत का परिमाण (DAPI धुंधला द्वारा पहचान की कोशिकाओं की कुल संख्या के लिए GFAP धुंधला के साथ कोशिकाओं की संख्या का अनुपात) AraC पूरकता के साथ शुद्धता में 27% से अधिक की वृद्धि से पता चलता है (चित्र 1 सी. यह उच्च शुद्धता माउस एस्ट्रोसाइट संस्कृति आरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति, सेल आकारिकी, और अन्य कार्यात्मक परख के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है।

हम lipofection आधारित transfection का इस्तेमाल किया अंतराल जंक्शन प्रोटीन Cx43 और Murine एस्ट्रोसाइट्स में EAAT1 ट्रांसपोर्टर के GFP टैग संस्करणों को व्यक्त करने के लिए. इस पद्धति के स्तर पर प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति की अनुमति देता है कि विषाक्तता के कारण या astrocyte व्यवहार्यता को प्रभावित करने के बिना लाइव सेल इमेजिंग के लिए इष्टतम हैं (चित्र 2ए, ई). इसी प्रकार, फ्लोरोसेंट जांच के उपयोग ने एस्ट्रोसाइट्स में अपनी गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए अम्लीय एंडो-लाइसोमल आर्गेनेल्स के तीव्र और कुशल लेबलिंग की अनुमति दी (चित्र 2I)

चित्रा 2 एस्ट्रोसाइट्स में कार्गो गतिशीलता के विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है क्षणिक EAAT1-GFP, Cx43-GFP, या एक चयनात्मक डाई है कि अम्लीय endolysomal vesicles पहचानता के साथ लेबल के साथ transfected. इन कार्गो में से प्रत्येक एक फ्लोरोसेंट punctum के रूप में दिखाई दिया perinuclear क्षेत्र, cytosol, और astrocytes की प्रक्रियाओं को सजाने (चित्र 2ए, ई, मैं, बाएँ पैनल). समय चूक डेटा का उपयोग समय और स्थान में कार्गो गति को ट्रैक करने वाले किमोग्राफ़ उत्पन्न करने के लिए किया गया था (चित्र 2ए, ई, मैं, दाएं पैनल)। इन काइमोग्राफों में, संकेतित कार्गो के एंट्रोग्रेड और प्रतिगामी संचलन को क्रमशः ऋणात्मक (हरी रेखाओं) और धनात्मक (लाल रेखाओं) ढलानों के साथ त्रासदियों द्वारा दर्शाया जाता है। स्टेशनरी vesicles ऊर्ध्वाधर tractories (नीली लाइनों) के रूप में दिखाए जाते हैं. Kymograph विश्लेषण से पता चला है कि माल के तीन प्रकार का विश्लेषण कभी कभी तेजी से, दोनों दिशाओं में प्रक्रियात्मक रन के साथ द्विदिश परिवहन से गुजरना. इसके अलावा, एस्ट्रोसाइट (लाल बॉक्स) के एक क्षेत्र के माध्यम से एक माल के प्रवाह के परिमाणकार्गो के बीच गतिशील कणों के प्रतिशत में अंतर से पता चला। उदाहरण के लिए, जबकि EAAT1-GFP puncta के 70% स्थिर हैं (चित्र 2B), Cx43-GFP के 20% से कम (चित्र 2F) और जांच के 45%-लेबल endolysomal कार्गो (चित्र 2J) गैर-गतिशील हैं। कार्गो के बीच गतिशीलता में इन मतभेदों की संभावना एस्ट्रोसाइट के क्षेत्र में अपने सामान्य, आधारभूत गतिशीलता के प्रतिनिधि हैं जहां फिल्मों का अधिग्रहण किया गया.

Kymograph से प्राप्त प्रत्येक कण के लिए पूर्ण समय पैमाने के साथ X-Y स्थिति में परिवर्तन की सटीक मानचित्रण भी इस तरह के कार्गो वेग के रूप में अन्य गति मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्र 2ब्, जी, कश्मीर) और चलाने की लंबाई (दूरी) कूच) (चित्र 2D,H,L) . गति मापदंडों आगे अलग-अलग कार्गो के लिए विश्लेषण किया जा सकता है आंदोलन की दिशा में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए (एंटीरोग्रेड बनाम प्रतिगामी गति) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गति के कण दिशा में reversals, ठहराव की संख्या, आदि. विश्लेषण के इन प्रकार के परिणाम अंतर और extracellular में बेसल या असामान्य स्थितियों के तहत एस्ट्रोसाइट्स में organelles और झिल्ली प्रोटीन के सेलुलर वितरण में परिवर्तन के बारे में सार्थक मात्रात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं वातावरण.

Figure 1
चित्र 1: प्राथमिक माउस एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों की स्थापना.
() प2$P4 माउस दिमाग के विच्छेदन के लिए आवश्यक चरण. (इ,प)) मिश्रित ग्लिल संस्कृतियों के ब्राइटफील्ड चित्र (i) और आराC के साथ गैर-उपचारित (iv) । लाल ऐरोहेड्स संदूषक माइक्रोग्लिया को इंगित करते हैं। (ii,v) शुद्ध एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों की छवियाँ इलाज (ii) और गैर इलाज (v) AraC के साथ. नीला ऐरोहेड्स संदूषक ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स को इंगित करते हैं। (पपप,वि ) शुद्ध एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों के Confocal छवियों का इलाज (iii) और गैर इलाज (vi) AraC के साथ. ग्रीन GFAP धुंधला और DAPI (नीले) लेबल सभी नाभिक से पता चलता है. (C) GFAP-सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत. डेटा मतलब का प्रतिनिधित्व करता है - SEM. * * पी और lt; 0.001, unpaired टी परीक्षण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एस्ट्रोसाइट्स में कार्गो गतिशीलता का मात्रात्मक विश्लेषण।
(ए, ई, मैं) बाएँ पैनल: Astrocytes EAAT1-GFP व्यक्त (ए), Cx43-GFP () या एक जांच है कि देर endosomes और lysosomes लेबल के साथ इलाज किया (मैं). लाल बक्से कण गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल क्षेत्रों से संकेत मिलता है। दाएँ पैनल: संकेत कार्गो के लिए tracectories दिखा मूल और रंग कोडित kymographs. लाल रेखाएं प्रतिगामी-चल वाले कार्गो, हरी लाइनें एंट्रोग्रेड-चल वाले कार्गो, और नीली रेखाएं गैर-गतिशील कार्गो का प्रतिनिधित्व करती हैं। (बी, एफ, जे) स्थिर और गतिशील कणों का प्रतिशत। (सी, जी, के) अग्रग्रेड और प्रतिगामी वेग और(डी, एच, एल) रन लंबाई का परिमाणीकरण। डेटा मतलब का प्रतिनिधित्व करता है - SEM. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहाँ, हम व्यक्त करने के लिए एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन, कल्पना, और ट्रैक फ्लोरोसेंट टैग organelles और ब्याज की झिल्ली प्रोटीन उच्च शुद्धता प्राथमिक माउस cortical एमडी astrocytes में समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर. हम भी कण गतिशीलता को मापने के लिए एक पद्धति रूपरेखा. प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स में प्रोटीन और आर्गेनेल गतिशीलता का प्रत्यक्ष दृश्य इन इन कोशिकाओं में इन कोशिकाओं में इंट्रासेल्यूलर परिवहन के विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।

ऊपर वर्णित माउस एमडी एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों की स्थापना की पद्धति अन्य प्रकाशित प्रोटोकॉल13,14,15से चरणों को जोड़ती है , जिसका परिणाम सरल विधि और उच्च शुद्धता और गुणवत्ता दोनों में होता है संस्कृतियों. AraC15 उपचार और मिलाते आधारित शुद्धि13केसंयोजन,14 98% के रूप में उच्च के रूप में एक शुद्धता के साथ एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों उपज कर सकते हैं (GFAP+ कोशिकाओं कुल कोशिकाओं के अनुपात द्वारा मूल्यांकन), जो हमारे उदाहरण में परिणाम में केवल शुद्धि चरणों के अधीन संस्कृतियों पर शुद्धता में 27% की वृद्धि (चित्र1ब, ब्)। इस विधि के साथ प्राप्त माउस एस्ट्रोसाइट्स की उच्च शुद्धता संस्कृतियों मैकार्थी और डेवेलिस14द्वारा चूहे एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों (एंजाइमी परख और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन) के लिए रिपोर्ट किए गए मूल्यों के समान है। हालांकि, McCarthy/deVellis विधि, जिसमें AraC उपचार शामिल नहीं है, एक लंबे समय तक मिलाते हुए कदम (15 डिग्री 18 ज) और शुद्धि के दो अतिरिक्त दौर की आवश्यकता14.

हमारे उदाहरण में, हम बताते हैं कि इस प्रोटोकॉल पर्याप्त एस्ट्रोसाइट्स में विभिन्न झिल्ली प्रोटीन और organelles के बीच गतिशीलता में अंतर पर कब्जा करने के लिए संवेदनशील है, जो उनके व्यक्तिगत intracellular itineraries और सेलुलर के संभावित प्रतिनिधि हैं समारोह. हालांकि हमारे उदाहरण बेसल स्थितियों में इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता को दर्शाता है, इस पद्धति को आसानी से अनुसंधान सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला के भीतर परिवहन मापदंडों को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, मामूली संशोधनों के साथ इसी तरह के प्रोटोकॉल का उपयोग इंट्रा- या एक्स्ट्राकोल्यूलर पर्यावरण के जवाब में इन विट्रो में एस्ट्रोसाइट्स में परिवहन घटनाओं की विशेषता के लिए किया जा सकता है, जैसे सेलुलर क्षति, विषाक्तता, रोगजनक उत्परिवर्तन, synaptic गतिविधि (में न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स की मिश्रित संस्कृतियों), आदि इसी तरह, सह-अभिव्यक्ति और एकाधिक कार्गो या organelles के दृश्य, प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से अलग फ्लोरोफोर्स के साथ टैग, भी सह स्थानीयकरण और जटिल गठन में गतिशील परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, organelles के बीच क्षणिक बातचीत , और endocytic और झिल्ली रीसाइक्लिंग परिवहन घटनाओं.

यहाँ प्रस्तुत पद्धति की सफलता मुख्य रूप से उच्च गुणवत्ता वाले एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों को प्राप्त करने की क्षमता पर निर्भर करती है और ब्याज के कार्गो (ओं) के कुशल लेबलिंग में। लाइव इमेजिंग के लिए इस प्रक्रिया का उपयोग करते समय, इष्टतम पोस्ट-ट्रांसफेक्शन ऊष्मायन समय निर्धारित करने के लिए फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति की बारीकी से निगरानी करना महत्वपूर्ण है। औसत पर, हमने पाया कि कार्गो के लिए लाइव इमेजिंग अधिग्रहण के लिए अच्छा संकेत तीव्रता में एक 24-h ऊष्मायन अवधि परिणाम का विश्लेषण किया। transfected एस्ट्रोसाइट्स के लंबे समय तक ऊष्मायन फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन की उच्च अभिव्यक्ति में परिणाम कर सकते हैं, जो प्रोटीन एकत्रीकरण प्रेरित कर सकते हैं, इस प्रकार कार्गो स्थानीयकरण और गतिशीलता बदल रहा है, और संस्कृतियों के स्वास्थ्य को कम. Astrocytes शारीरिक क्षति और संस्कृति के माहौल में परिवर्तन के लिए बहुत कमजोर हैं, जो प्रतिक्रिया सहित ट्रांसक्रिप्शनल और सेलुलर प्रतिक्रियाओं को शामिल करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसलिए, यह धोने के कदम के बीच समय अंतराल को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, और हवा के लिए संस्कृतियों के जोखिम को कम करने के लिए और ऊष्मायन और अधिग्रहण अवधि पर तापमान या प्रकाश तीव्रता में महत्वपूर्ण परिवर्तन करने के लिए।

संक्षेप में, यहाँ प्रस्तुत तरीकों का मूल्यांकन और एस्ट्रोसाइट्स में प्रोटीन और organelle स्थानीयकरण में गतिशील परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वे मूल्यवान उपकरण है कि शारीरिक और रोग की स्थिति के तहत astrocytic प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन की परीक्षा की अनुमति प्रदान करते हैं.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

DNL एक Simmons विद्वान के रूप में चैपल हिल (यूएनसी) चिकित्सा के स्कूल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था. TWR UNC PREP अनुदान R25 GM089569 द्वारा समर्थित किया गया था. UNC तंत्रिका विज्ञान केंद्र माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा का उपयोग कर काम का समर्थन किया गया था, भाग में, NIH-NINDS तंत्रिका विज्ञान केंद्र सहायता अनुदान P30 NS045892 और NIH-NICHD बौद्धिक और विकासात्मक विकलांगता अनुसंधान केंद्र सहायता अनुदान U54 से वित्त पोषण द्वारा HD079124.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5% Trypsin (10x) Gibco 15090-046
Benchtop Centrifuge Thermo Scientific 75-203-637 Sorvall ST8 Centrifuge
Cell Culture Grade Water Gen Clone 25-511
Cell Culture Microscope Zeiss WSN-AXIOVERT A1 Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities
Cytosine Arabinoside Sigma C1768-100MG (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage
DAPI Sigma D9542-5MG Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.
Dissecting Microscope Zeiss Stemi 305
Dissecting Scissors F.S.T 14558-09
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gen Clone 25-500
Fetal Bovine Serum Gemini 100-106 Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J) NIH Version 1.52i
Fine Tip Tweezers F.S.T 11254-20 Style #5
Fluorescence light source Excelitas 012-63000 X-Cite 120Q
GFAP antibody Cell Signaling 3670S GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom Dishes Mattek corporation P35G-1.5-14-C 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated
Graefe Forceps F.S.T 11054-10 Graefe Iris Forceps with curved tips
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) Life Technologies L7526 LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.
Hank's Balanced Salt Solution (10x) Gibco 14065-056 Magnesium and calcium free
Imaging Media Life Technologies A14291DJ Live Cell Imaging Solution
Inverted Confocal Microscope Zeiss LSM 780
KymoToolBox https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent Life Technologies 11514015 Plus Reagent
Lipofection Reagent Life Technologies 15338100 Lipofectamine LTX reagent
Orbital shaking incubator New Brunswick Scientific 8261-30-1008 Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control
Penicillin/Strepomycin solution (100x) Gen Clone 25-512
Phosphate Buffered Saline (10x) Gen Clone 25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide Sigma P7405 Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing
Reduced serum medium Gibco 31985-062 OPTI-MEM
Tissue Culture Flasks Olympus Plastics 25-209 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap
Tissue culture incubator Thermo Scientific 51030285 HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control
Tris-Base Sigma T1503 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl Sigma T3253 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200072
Vacuum-Driven Filter Systems Olympus Plastics 25-227 500 ml, PES membrane, 0.22 µm
Vannas scissors straight Roboz RS-5620

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References

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एस्ट्रोसाइट्स में ऑर्गेनेल्स और अन्य कार्गो के इंट्रासेल्यूलर ट्रांसपोर्ट का दृश्य और विश्लेषण करना
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Creighton, B. A., Ruffins, T. W., Lorenzo, D. N. Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes. J. Vis. Exp. (150), e60230, doi:10.3791/60230 (2019).More

Creighton, B. A., Ruffins, T. W., Lorenzo, D. N. Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes. J. Vis. Exp. (150), e60230, doi:10.3791/60230 (2019).

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