Visualizzazione e analisi del trasporto intracellulare di organelli e di altri carichi in Astrociti

Summary

Qui descriviamo un metodo in vitro di imaging dal vivo per visualizzare il trasporto intracellulare di organelli e il traffico di proteine della membrana plasmatica negli astrociti murini. Questo protocollo presenta anche una metodologia di analisi delle immagini per determinare gli itinerari e la cinetica nel trasporto merci.

Abstract

Gli astrociti sono tra i tipi di cellule più abbondanti nel cervello adulto, dove svolgono ruoli chiave in una molteplicità di funzioni. Come un giocatore centrale nell'omeostasi del cervello, gli astrociti forniscono ai neuroni metaboliti vitali e tamponamento di acqua extracellulare, ioni e glutammato. Componente integrante della sinapsi "tri-partite", gli astrociti sono anche critici nella formazione, potatura, manutenzione e modulazione delle sinapsi. Per consentire queste funzioni altamente interattive, gli astrociti comunicano tra di loro e con altre cellule gliali, neuroni, la vascolatura cerebrale e l'ambiente extracellulare attraverso una moltitudine di proteine della membrana specializzate che includono cellule molecole di aderenza, acquaporine, canali ionici, trasportatori di neurotrasmettitori e molecole di giunzione gap. Per supportare questo flusso dinamico, gli astrociti, come i neuroni, si basano su un trasporto intracellulare strettamente coordinato ed efficiente. A differenza dei neuroni, dove il traffico intracellulare è stato ampiamente delineato, il trasporto basato su microtubuli negli astrociti è stato meno studiato. Tuttavia, il traffico eso- ed endocitico delle proteine della membrana cellulare e del trasporto di organelli intracellulari orchestra la biologia normale degli astrociti, e questi processi sono spesso colpiti dalla malattia o in risposta a lesioni. Qui presentiamo un protocollo semplice alla coltura astrociti murini di alta qualità, per etichettare fluorescentmente proteine astrociti e organelli di interesse, e per registrare la loro dinamica di trasporto intracellulare utilizzando la microscopia con time-lapse. Dimostriamo anche come estrarre e quantificare i parametri di trasporto rilevanti dai film acquisiti utilizzando i plug-in disponibili per il software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ/FIJI).

Introduction

Gli astrociti sono le cellule più abbondanti nel sistema nervoso centrale adulto, dove svolgono funzioni uniche di sviluppo e omeostatiche¹. Gli astrociti modulano lo sviluppo sinaptico attraverso il contatto diretto con terminali pre e post-sinaptici come parte della sinapsi tri-partita, che contiene recettori del neurotrasmettitore, trasportatori e molecole di adesione cellulare che facilitano la formazione di sinapsi e comunicazione neurona-astrocito². Inoltre, gli astrociti controllano attivamente la trasmissione sinaptica e prevengono l'eccitotossicità neuronale rimuovendo rapidamente i neurotrasmettitori eccitatori dalla fessura sinaptica, riciclando i neurotrasmettitori e partecipando alla potatura sinaptica^{3 , 4 DEL psu' , 5} Del numero 3( ^{, 6.}Per consentire queste funzioni altamente interattive, gli astrociti comunicano tra loro, con altre cellule gliali, e con neuroni attraverso proteine di membrana specializzate, tra cui molecole di adesione cellulare, acquaporine, canali ionici, trasportatori di neurotrasmettitori e molecole di giunzione gap. Gli astrociti cambiano attivamente i livelli superficiali di queste proteine in risposta alle fluttuazioni nel loro ambiente intra- ed extracellulare⁷. Inoltre, i cambiamenti nei livelli e nella distribuzione dei mitocondri, delle goccioline lipidiche e degli organelli degradanti e di riciclaggio modulano l'approvvigionamento energetico, la disponibilità di metaboliti e i processi di compensazione cellulare essenziali per la funzione astrocite e sopravvivenza.

I cambiamenti dinamici nel traffico di proteine della membrana e degli organelli e nel posizionamento negli astrociti sono facilitati dalla funzione concertata di proteine motorie e adattatori che promuovono la motilità del carico^8,9. Allo stesso modo, i livelli superficiali delle proteine della membrana sono modulati attraverso eventi di internalizzazione e riciclaggio¹⁰. Questi carichi vengono trasportati attraverso un'intricata rete di actin, microtubuli, e possibilmente filamenti intermedi tracce⁸. Studi basati sull'colorazione immunofluorescenza della proteina di legame finale 1 (EB1), che si accumula al crescente microtubulo più estremità, suggeriscono che nei fasci di astrocicli di microtubuli si irradiano dal perinucleo ed estendono il loro periferia¹¹. Tuttavia, manca ancora un esame completo dell'organizzazione e della polarità dei microtubuli e di altri elementi citoscheletrici che utilizzano l'imaging a cellule vive. Mentre molti dei meccanismi alla base della dinamica degli organelli e delle proteine della membrana sono stati ampiamente studiati nei neuroni e in altri tipi di cellule, la motilità del carico negli astrociti è meno ben compresa. La maggior parte delle nostre attuali conoscenze sui cambiamenti nella distribuzione di proteine e organelli negli astrociti si basa sull'etichettatura tradizionale basata sugli anticorpi della preparazione fissa, che preclude un preciso esame spaziale e temporale delle dinamiche del carico^{7, 12}.

Qui, descriviamo un metodo per etichettare proteine e organelli di membrana per l'imaging dal vivo in colture di astrociti primari ad alta purezza. Utilizzando questo protocollo, forniamo esempi in cui monitoriamo la localizzazione dinamica delle proteine della membrana con etichettatura delle proteine fluorescenti verdi (GFP) negli astrociti trafetti, tra cui la proteina di giunzione gap connexin 43 (Cx43-GFP) e l'amminoacido eccitatorio trasporto 1 (EAAT1-GFP). Descriviamo anche l'uso di una sonda acidotropica fluorescente per visualizzare organelli acidi e seguire le loro dinamiche di traffico in astrociti vivi. Infine, dimostriamo come analizzare i dati time-lapse per estrarre e valutare i parametri di trasporto per i singoli carichi.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite con l'approvazione dell'Università della Carolina del Nord presso il Chapel Hill Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Dissezione cerebrale e cultura dei principali astrociti del topo

NOTA: il seguente protocollo è stato adattato dai metodi pubblicati, che segue la procedura originale sviluppata da McCarthy e deVellis^13,14,15. Le colture cellulari miste di mcCarthy/deVellis (MD) sono preparate dal giorno postnatale 2-4 (P2-P4), trattate con un fattore anti-mitotico, e purificate per produrre la cultura finale artrito arricchente. Quattro cortice da cuccioli di topo di entrambi i sessi sono sufficienti per generare una coltura di coltura del tessuto T75.

1. Mantello del fondo dei flaconi T75 (100% di accesso al collo angolato, 0,22 m hydrophobic collo fappo di filtro filfo) con poli-D-lysina (1 mg/mL in 0,1 M Tris buffer, pH 8,5) e incubare a 37 gradi centigradi per 24 h prima dell'inizio della dissezione.
2. Prima di iniziare la procedura di dissezione, riscaldare 30 mL di mezzi di coltura astrocite (il mezzo di Aquila di Dulbecco modificato [DMEM] alto glucosio, 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore, 1% penicillina /streptomicina) a 37 sché congelare un'aliquota 5 mL del 2,5% di trippsina sul ghiaccio. Preparare due piatti sezionati (60 mm di diametro) sul ghiaccio riempito con 6 mL di soluzione di sale equilibrato di Hank (HBSS) senza Ca^{2 o} Mg².
3. Disinfettare tutti gli strumenti chirurgici (pinzette di punta fine, forbici dissettive, forbici Vannas dritte, pinze Graefe con punte curve) nel 70% di etanolo prima e tra ogni dissezione.
4. Spruzzare la testa e il collo dei cuccioli di topo P2-P4 con 70% di etanolo prima di eutanasia rapidamente decapitandoli con forbici chirurgiche. Eseguire una posteriore all'incisione centrale anteriore lungo il cuoio capelluto per esporre il cranio. Tagliare con cura il cranio dal collo al naso.
5. Eseguire due incisioni laterali aggiuntive superiori agli occhi. Utilizzando pinzette punta fine capovolgere delicatamente i lembi del cranio di lato. Togliere il cervello e metterlo nel primo piatto di dissezione riempito con HBSS ghiacciato senza Ca^{2 o} Mg². Mantenere il piatto sul ghiaccio e continuare la raccolta del resto del cervello.
   NOTA: Eseguire il resto della procedura di dissezione in un ambito di dissezione.
6. Rimuovere i bulbi olfattivi utilizzando forbici Vannas o pinzette fini (Figura 1Ai). Con le pinze di punta curva all'intersezione delle fessure trasversali e interhemispheric, inserire delicatamente una seconda coppia di pinze di punta curva tra la corteccia e il diencefalo, aprendo lentamente le pinze per separare gli emisferi cerebrali dal resto del il cervello (Figura 1Aii,Aiii). Rimuovere il tessuto indesiderato (Figura 1Aiv).
7. Per ogni emisfero corticale, rimuovere con cura le meningi con una pinzetta di punta fine. Facoltativamente, rimuovere l'ippocampo dalle cortice. Trasferire le cortici di topo sezionato in un secondo piatto pieno di HBSS ghiacciato senza Ca^{2 o} Mg² e tenerlo sul ghiaccio mentre sezionare i cervelli rimanenti.
   NOTA: condurre i passaggi successivi in condizioni asettiche in una cappa a flusso laminare.
8. Tagliare le cortice sezionate in piccoli pezzi (circa 2x4 mm) usando forbici chirurgiche sterili e affilate o un bisturi. Trasferire il tessuto sezionato in un tubo conico da 50 mL contenente una soluzione enzimatica (HBSS da 22,5 ml senza Ca^{2 o} Mg^2,2,5 mL 2,5% di prova). Incubare a 37 gradi centigradi per 30 min con inversione delicata ogni 10 min.
9. Raccogliere il tessuto digerito con centrifugazione a 300 x g per 5 min e rimuovere la soluzione enzimatica per decantazione (non utilizzare un aspiratore di vuoto). Aggiungi 10 mL di mezzi di coltura astrociti e dissocia il tessuto in singole cellule tubondo la soluzione 20-30volte utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL.
10. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare di 70 m per ridurre al minimo gli ammassamenti delle cellule e il tessuto non digerito. Raccogliere il filtrato in un tubo conico pulito da 50 mL e regolare il volume totale a 20 mL con supporti di coltura astrociti. A questo punto, valutare l'efficienza della dissociazione corticale mescolando 10 -L della sospensione cellulare con 10 l di celle di trypan blu e contando le cellule con un emocitometro.
    NOTA: Una preparazione da quattro cortici del topo P2-P4 produce 10-15 x 10 6^celle singole.
11. Aspirare la soluzione di rivestimento poli-D-lysina dai flaconi di coltura T75 e lavare due volte con acqua sterile. Piastra recellare le sospensioni cellulari da 20 mL e incubare a 37 gradi centigradi e 5% di CO₂.

2. Purificazione e manutenzione delle culture astrocite

NOTA: Eseguire tutte le modifiche dei supporti in condizioni asettiche in una cappa di flusso laminare utilizzando la membrana astrocitica sterile (0,22 m) riscaldata a 37 gradi centigradi.

1. Sostituire il supporto cellulare 48 h dopo la placcatura (giorno in vitro 2, DIV2).
2. A DIV5, sostituire i media con supporti di coltura astrocite freschi integrati con 10 x M cytosine arabinoside (AraC).
   NOTA: Questo passaggio facilita la rimozione delle cellule contaminanti, compresi i fibroblasti e altre cellule gliali. È importante trattare le culture con AraC non più di 48 h poiché tempi di incubazione più lunghi ridurranno la vitalità degli astrociti.
3. In DIV7, cambiare i media in media di cultura astrocita senza AraC e iniziare a controllare la confluenza culturale quotidiana. Una volta che le cellule hanno raggiunto l'80% di confluenza, mantello due-T75 flaconi per ogni fiaschetta di coltura astrocitica non purificata con poli-D-lisina e incubare a 37 gradi per almeno 8 h per una notte.
4. Il giorno seguente, iniziare la purificazione degli astrociti agitando i flaconi della coltura a 180 giri per 30 min in un incubatore di scosse orbitali di 37 gradi centigradi. Rimuovere i supporti e sostituirli con nuovi mezzi di coltura astrocitati. Agitare le cellule a 240 giri/min per 6 h in un incubatore orbitale di 37 gradi centigradi. La salina precalda 1x buffered fosfato (PBS), i mezzi di coltura degli astrociti e lo 0,25% trypsin-EDTA a 37 gradi centigradi e 20 gradi prima della fine del periodo di agitazione.
   NOTA: l'incubazione di CO₂non è necessaria durante le fasidi agitazione. Se lo si desidera, i media raccolti dopo i gradini di 30 e 6-h possono essere utilizzati per coltivare microglia e oligodendrociti, rispettivamente. Il trattamento araC della coltura mista, tuttavia, ridurrà l'abbondanza delle altre cellule gliali.
5. Rimuovere i flaconi di coltura dallo shaker e sostituire immediatamente il supporto con 10 mL di caldo 1x PBS per fiaschetta. Rimuovere PBS e aggiungere 3 mL di 0,25% trypsin-EDTA per fiaschetta. Incubare a 37 gradi centigradi e 5% CO_2,controllando ogni 5 min per il distacco.
6. Una volta che le cellule si sono staccate dal flacone, smettere di provare aggiungendo 10 mL di mezzi di coltura astrociti. Trasferire gli astrociti staccati in un tubo conico da 50 mL e le cellule di pellet con una centrifuga a 300 x g per 5 min. Aspirate supernatant e ri-sospendere le cellule in 40 mL di mezzi di coltura astrocitati.
7. Lavare due volte i flaconi T75 rivestiti in poli-D-lysina con acqua sterile e piastra 20 mL della sospensione astrocite purificata. Ritornate all'incubatore di CO₂ del 37 gradi e del 5%. Cambiare i media di coltura astrocite ogni due giorni per altri 10 giorni fino a quando gli astrociti maturano.
   NOTA: Ogni flacone T75 di astrociti purificati dovrebbe essere sufficiente a produrre 2 nuovi flaconi T75 con 3 x 10⁵ cellule ciascuna a placcatura.
8. Ripetere i passaggi di 2,5 x 2,7 per le passate successive o per placcare gli astrociti per la microscopia.
   NOTA: La purezza delle colture astrocite dopo l'aggiunta di AraC e la successiva purificazione possono essere valutate qualitativamente attraverso la microscopia del campo luminoso, o più precisamente quantificando la percentuale di proteine dell'acido fibrillale gliale (GFAP)-positivo cellule per campo visivo in immagini fluorescenti (Figura 1B,C).

3. Trasfezione di plasmidi fluorescenti

1. Il giorno prima della trasfezione o dell'etichettatura, gli astrociti dei semi alla densità desiderata per l'imaging 24-48 h dopo la trasfezione. Una densità consigliata per piastre di 24 pozzetti o 14 mm pozzi inferiori in vetro è 2 x 10⁴ celle / bene.
   NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per la trasfezione di astrociti placcati su copriocchiali in vetro da 12 mm su piastre da 24 pozzetti o pozzi di fondo in vetro da 14 mm utilizzando un metodo a base di lipofection. I reagenti devono essere scalati a seconda delle dimensioni del piatto di coltura in cui crescono gli astrociti.
2. Diluire il reagente di lipofezione (Tabella dei materiali) in supporti a siero ridotto ( Tabella deimateriali). Per ottimizzare il rapporto tra reagente lipofection e DNA, testare una serie di diluizioni adeguate. Ad esempio, se si utilizza il reagente impiegato in questo protocollo (Tabella dei materiali), diluire 2, 3, 4 e 5 - L del reagente di lipofezione in 50 : L di supporti a siero ridotto.
3. Diluire 5 g di DNA ad alta purezza in 250 litri di supporti a siero ridotto. Aggiungete 5 - L di reagente potenziatore di lipofezione (Tabella dei materiali). Combinare il tubo contenente il reagente di lipofezione con un volume uguale del mix di esaltatore DNA-lipofezione. Mescolare con pipettaggio e incubare a temperatura ambiente (RT) per 15 min.
4. Rimuovere i supporti di coltura degli astrociti e aggiungere il mix di trasfezione (passaggio 3.3) alle cellule dropwise. Dopo un'incubazione di 6 ore a37 e 5% di CO 2, sostituire il complesso di trasfezione con un volume appropriato di mezzi di coltura astrociti (2 mL per piatti di fondo in vetro 14 mm). Incubare per altri 24-72 h prima di procedere all'acquisizione dell'immagine. Monitorare attentamente la durata della fase di incubazione per ottenere il miglior equilibrio tra espressione proteica e vitalità cellulare.

4. Etichettatura di endosomi tardivi/lisomi con sonde fluorescenti

NOTA: Alcuni carichi possono essere etichettati utilizzando coloranti fluorescenti con un'elevata affinità per le proteine specifiche del carico. L'esempio seguente consente l'etichettatura di endososomi tardivi con una sonda acidotropica fluorescente.

1. Diluire la sonda di etichettatura lisosomica (Tabella dei materiali) in 200 - L di mezzi di coltura astrociti ad una concentrazione di lavoro di 1 M e applicare agli astrociti dal passo 3.1 ad una densità di 2 x 10⁴ cellule/ pozzo. Incubare per 30 min a 37 .
2. Lavare le cellule una volta con i mezzi di coltura astrociti caldi e sostituirli con supporti di imaging (Tabella dei materiali). Procedere immediatamente all'imaging dal vivo.

5. Acquisizione di immagini mediante un sistema di imaging time-lapse

NOTA: l'imaging live time-lapse deve essere fatto utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di una telecamera ad alta velocità, messa a fuoco definita, camera di incubazione e un obiettivo di olio 40x con un'alta apertura numerica (ad esempio, Plan-Apochromat 1.4NA). È disponibile una varietà di software di acquisizione per l'imaging time-lapse. La scelta del sistema di microscopia e del software di acquisizione dovrebbe basarsi sulla loro disponibilità e idoneità per gli obiettivi dello studio particolare. Di seguito sono riportate alcune linee guida generali.

1. Posizionare la camera di coltura o il piatto nell'adattatore appropriato sullo stadio del microscopio. Utilizzando la luce dell'epiorescenza, selezionare le cellule che esprimono le proteine fluorescenti o la sonda per registrare. Regolare l'illuminazione del campione fluorescente per visualizzare le celle selezionate utilizzando la fotocamera digitale. Evitate di usare un'illuminazione elevata che potrebbe causare fotosbiancamento e fototossicità. Regolare la messa a fuoco e lo zoom.
2. Acquisire singole serie time-lapse stack a una frequenza di 1 fotogramma ogni 2 s per intervalli di tempo che vanno tra 300 s e 500 s utilizzando le funzioni di zoom e messa a fuoco definita.
   NOTA: La dinamica del traffico (velocità, frequenza di movimento, ecc.) varia a seconda della proteina di interesse, quindi, il percorso temporale di acquisizione può richiedere un adeguamento. Per esempio, i mitocondri sono meno motili dei lisosomi e presentano frequenti pause. In questo caso, è più appropriato regolare i parametri di acquisizione a 1 fotogramma ogni 5 s per 800 s.
3. Salva le immagini time-lapse ed esportale come file di stack AVI o TIFF.

6. Analisi dell'immagine

NOTA: l'analisi dell'immagine è stata eseguita utilizzando il plug-in KymoToolBox per ImageJ/Fiji¹⁶. Istruzioni scritte dettagliate passo-passo sono disponibili online¹⁷. I seguenti passaggi abbreviati dovrebbero essere sufficienti per creare i kymografi ed estrarre i parametri di trasporto delle particelle.

1. Aprire la sequenza di immagini time-lapse nel software ImageJ/Fiji. Importare immagini dal menu File come file di stack AVI o TIFF. Convertite le immagini a 8 o 16 bit selezionando uno di questi tipi di immagine con lo strumento testo dal menu Immagine. Se lavorate con file RGB, dividete i canali con lo strumento Dividi canale disponibile nella funzione Colore del menu Immagine.
2. Per generare un kymografo (rappresentazione nella posizione e nel tempo delle traiettorie delle particelle), disegnare ogni traccia in cui le particelle si muovono tracciando una linea lungo le traiettorie delle particelle utilizzando lo strumento linea segmentata. Per assegnare correttamente la direzionalità del movimento, disegnare la polilinea utilizzando la stessa convenzione direzionale desiderata per tutti i filmati in modo che la polarità sia coerente all'interno e tra tutte le cellule studiate. Ad esempio, disegnare la polilinea dal centro della cella verso la periferia o viceversa. Regolare lo spessore della linea in modo che corrisponda allo spessore della traccia facendo doppio clic sullo strumento Linea.
3. Eseguire la macro Disegna Kymo del plug-in KymoToolBox utilizzando una larghezza di linea di 10. Verrà visualizzato un messaggio che richiede di calibrare l'immagine nel tempo (numero di fotogrammi, frequenza fotogrammi) e spazio (risoluzione x,y). Una volta calibrati, i kymografi vengono generati e possono essere salvati come file TIFF per la presentazione dei dati o un'ulteriore analisi delle particelle.
4. Assegna le traiettorie delle particelle tracciando manualmente ogni particella nel kymografo utilizzando lo strumento linea segmentata per l'intera durata dell'acquisizione. Registrare ogni traiettoria di particelle come regione di interesse (ROI) utilizzando lo strumento di gestione del ROI disponibile nel menu Analizza/Strumenti. Salva tutti i ROI per ogni video time-lapse per un'ulteriore analisi.
   NOTA: È fondamentale assegnare la traiettoria corretta per le singole particelle sul kymograph per ottenere il calcolo più accurato dei parametri di trasporto.
   1. Eseguire la macro Analizza Kymo del plug-in KymoToolBox. Si aprirà una finestra che chiede di definire la direzione "verso l'esterno" del movimento delle particelle (da sinistra a destra o viceversa) dal menu a discesa. Questa selezione dipende dalla posizione dei carichi fluorescenti immagine rispetto al nucleo o alla periferia cellulare, come stabilito al punto 6.2. Ad esempio, se il nucleo è posizionato a sinistra dei carichi e la polilinea nel passaggio 6.2 è stata allontanata dal nucleo, definire il movimento della particella verso l'esterno come "da sinistra a destra".
   2. Definire la velocità limite (velocità minima alla quale un carico è considerato motile) nella finestra Analizza Kymo. Per i carichi che si muovono a velocità di trasporto intracellulare veloci, 0,1 m al secondo è una scelta appropriata. Modificare questo valore per regolare la sensibilità del software a ogni carico di interesse. Regolare lo spessore della linea in modo che corrisponda allo spessore di ogni traiettoria delle particelle.
   3. Selezionare le opzioni Registra tutti i dati e Registra coordinate estrapolate nella finestra Analizza kymo. Questo calcolerà vari parametri di trasporto del carico, tra cui la velocità media, la velocità verso l'interno, la velocità verso l'esterno, la distanza cumulativa percorsa, la distanza percorsa verso l'interno o verso l'esterno, il numero di interruttori per ogni particella, la percentuale di tempo muovendosi in ogni direzione o in pausa, ecc. I dati calcolati per le singole tracce vengono quindi raggruppati per kymograph e salvati in file di testo specifici per ogni immagine.
      NOTA: l'opzione Mostra Kymo colorato della macro Analizza Kymo genera una sovrapposizione codificata a colori del percorso sul kymograph originale. Le particelle che viaggiano verso l'esterno sono colorate in verde, verso l'interno in rosso e particelle stazionarie in blu. L'opzione Segnala coordinate sulla pila originale della macro Analizza Kymo genera una sovrapposizione codificata a colori della posizione dell'oggetto estrapolato sul video time-lapse originale e sul kymograph.

Representative Results

Il protocollo per la creazione di astrociti MD topi sopra descritti dovrebbe produrre culture riproducibili e di alta qualità. Sebbene le colture contengano inizialmente un mix di astrociti, fibroblasti e altre cellule gliali, tra cui microglia e oligodendrociti (Figura1Bi,Biv; punte di freccia rosse), l'aggiunta di AraC alla coltura mista tra DIV5-DIV7 riduce al minimo la proliferazione di queste cellule contaminanti. Il trattamento combinato AraC e la strategia di purificazione basata sulle agitazioni arricchiscono la purezza delle culture astrocite (Figura 1Bii) rispetto ai protocolli tradizionali che includono solo le fasi di purificazione ( Figura1Bv; blu punte di freccia)¹³. La morfologia e la composizione previste (valutate da GFAP e 4',6-diamidino-2-fenylindole [DAPI] colorazione) delle colture di astrociti purificate trattate con AraC o non trattate è illustrata nella Figura 1Biii,Bvi. La quantificazione della percentuale delle cellule GFAP^per campo visivo (rapporto tra il numero di celle con la colorazione GFAP e il numero totale di cellule identificate dalla colorazione DAPI) mostra un aumento di oltre il 27% della purezza con il completamento dell'AraC (Figura1 C). Questa coltura astrocitica murina ad alta purezza è adatta per la valutazione dell'espressione di RNA e proteina, morfologia cellulare e altri saggi funzionali.

Abbiamo usato la trasfezione a base di lipofezione per esprimere le versioni con etichettatura GFP della proteina di giunzione gap Cx43 e il trasportatore EAAT1 negli astrociti murini. Questa metodologia consente l'espressione transitoria delle proteine a livelli ottimali per l'imaging di cellule vive senza causare tossicità o compromettere la vitalità degli astrociti (Figura 2A,E). Allo stesso modo, l'uso di una sonda fluorescente ha permesso l'etichettatura rapida ed efficiente degli organelli endososomici acidi (Figura 2I) per monitorare le loro dinamiche negli astrociti.

La figura 2 mostra risultati rappresentativi delle analisi delle dinamiche del carico negli astrociti trascate transitoriamente con EAAT1-GFP, Cx43-GFP o etichettate con un colorante selettivo che riconosce le vesciche endolysosomiche acidiche acidiche. Ognuno di questi carichi è apparso come un punctum fluorescente che decorava la regione perinucleare, il citosol e i processi di astrociti (Figura2A,E,I, pannelli di sinistra). I dati time-lapse sono stati utilizzati per generare kymografi che tracciano il movimento del carico nel tempo e nello spazio (Figura 2A,E,I, pannelli di destra). In questi kymographs, il movimento anterogrado e retrogrado del carico indicato è rappresentato da traiettorie con pendenze negative (linee verdi) e positive (linee rosse), rispettivamente. Le vesciche stazionarie sono mostrate come traiettorie verticali (linee blu). L'analisi del kymograph ha rivelato che i tre tipi di carico analizzati subiscono un trasporto bidirezionale con corse veloci e processari occasionali in entrambe le direzioni. Inoltre, la quantificazione del flusso di un carico attraverso un'area dell'astrocite (scatola rossa) ha rivelato differenze nella percentuale di particelle motili tra i carichi. Ad esempio, mentre il 70% dei puncta EAAT1-GFP sono stazionari (Figura 2B), meno del 20% di Cx43-GFP (Figura2F) e 45% dei carichi endolisomici con etichetta sonda (Figura 2J) non sono motile. Queste differenze di motilità tra i carichi sono probabilmente rappresentative della loro normale motilità di base nella regione dell'astrocito in cui sono stati acquisiti i film.

La mappatura precisa del cambiamento della posizione X-Y lungo la scala temporale intera per ogni particella ottenuta dal kymografo può essere utilizzata anche per valutare altri parametri di movimento, come la velocità del carico (Figura 2C,G,K) e la lunghezza di corsa (distanza (Figura 2D,H,L). I parametri di movimento possono essere ulteriormente analizzati per i singoli carichi per determinare i cambiamenti nella direzione del movimento (movimento anterogrado vs retrogrado) così come le inversioni nella direzione delle particelle di movimento, il numero di pause, ecc. I risultati di questi tipi di analisi possono fornire informazioni quantitative significative sui cambiamenti nella distribuzione cellulare di organelli e proteine della membrana negli astrociti in condizioni basali o anormali nell'intra ed extracellulare l'ambiente.

Figura 1: Istituzione delle principali culture degli astrociti del topo.
(A) Passi necessari per la dissezione del cervello del topo P2-P4. (B) (i,iv) Immagini di campi luminosi di colture gliali miste trattate (i) e non trattate (iv) con AraC. Le punte di freccia rossa indicano microglia contaminante. (ii,v) Immagini di colture astrocite purificate trattate (ii) e non trattate (v) con AraC. Le punte di freccia blu indicano oligodendrociti contaminanti. (iii,vi) Immagini confocali di colture astrociti purificate trattate (iii) e non trattate (vi) con AraC. Il verde mostra la colorazione GFAP e LA DAPI (blu) etichetta tutti i nuclei. (C) Percentuale di cellule GFAP-positive. I dati rappresentano la media : SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi quantitative delle dinamiche del carico negli astrociti.
(A,E,I) Pannelli a sinistra: Astrociti che esprimono EAAT1-GFP (A), Cx43-GFP (E) o trattati con una sonda che etichetta endosomi tardivi e lisosomi (I). Le caselle rosse indicano le regioni utilizzate per analizzare la dinamica delle particelle. Pannelli a destra: kymografi originali e codificati a colori che mostrano le traiettorie per i carichi indicati. Le linee rosse rappresentano carichi retrogradi, linee verdi carichi in movimento anterogrado e linee blu carichi non motili. (B, F, J) Percentuale di particelle stazionarie e motili. (C,G,K) Quantificazione della velocità anterograda e retrograda e lunghezza di esecuzione (D,H,L). I dati rappresentano media - SEM. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Qui, descriviamo un approccio sperimentale per esprimere, visualizzare e monitorare gli organelli etichettati fluorescentmente e le proteine della membrana di interesse utilizzando la microscopia video time-lapse in astrociclici corticali corticali di topo ad alta purezza. Illustreremo anche una metodologia per misurare la dinamica delle particelle. La visualizzazione diretta delle dinamiche di proteine e organelli negli astrociti primari fornisce un potente strumento per studiare la regolazione del trasporto intracellulare in queste cellule in vitro.

La metodologia per stabilire le culture astrocite del Mouse MD descritta in precedenza combina passi da altri protocolli pubblicati^13,14,15, che si traduce sia in un metodo più semplice che in una maggiore purezza e qualità Culture. La combinazione del trattamento AraC¹⁵ e della purificazione a base di agitazione^13,14 può produrre colture astrociti con una purezza fino al 98% (valutata dal rapporto di GFAP^- cellule totali), che nel nostro esempio un aumento del 27% della purezza sulle culture sottoposto solo ai gradi di purificazione (Figura1B,C). Le colture ad alta purezza degli astrociti murini ottenuti con questo metodo è simile ai valori riportati per le colture di astrociti del ratto (valutate da saggi esfene escopiative) da McCarthy e deVellis¹⁴. Tuttavia, il metodo McCarthy/deVellis, che non include il trattamento AraC, richiede una fase di agitazione più lunga (15-18 h) e due ulteriori cicli di purificazione¹⁴.

Nel nostro esempio, mostriamo che questo protocollo è sufficientemente sensibile per cogliere le differenze di motilità tra varie proteine della membrana e organelli negli astrociti, che sono probabilmente rappresentativi dei loro itinerari intracellulari individuali e cellulari funzione. Anche se il nostro esempio dimostra l'utilità di questo protocollo a condizioni basali, questa metodologia può essere facilmente adattata per misurare i parametri di trasporto all'interno di un'ampia gamma di domande di ricerca. Ad esempio, protocolli simili con piccole modifiche potrebbero essere utilizzati per caratterizzare gli eventi di trasporto in astrociti in vitro in risposta all'ambiente intra o extracellulare, come danni cellulari, tossicità, mutazioni patogene patogene, attività sinaptica (in colture miste di neuroni e astrociti), ecc. Allo stesso modo, la co-espressione e la visualizzazione di più carichi o organelli, ciascuno contrassegnato individualmente con fluorofori diversi, può anche essere utilizzata per valutare i cambiamenti dinamici nella co-localizzazione e nella formazione complessa, interazioni transitorie tra organelli , e gli eventi di trasporto del riciclaggio endocitico e della membrana.

Il successo della metodologia qui presentata si basa principalmente sulla capacità di ottenere culture astrocite di alta qualità e sull'etichettatura efficiente dei carichi di interesse. Quando si utilizza questa procedura per l'imaging dal vivo, è importante monitorare attentamente l'espressione fluorescente per determinare il tempo ottimale di incubazione post-trasfezione. In media, abbiamo scoperto che per i cargo analizzati un periodo di incubazione di 24 ore si traduce in una buona intensità del segnale per l'acquisizione di immagini dal vivo. L'incubazione prolungata di astrociti trasfettati può provocare un'alta espressione di proteine fluorescenti, che possono indurre l'aggregazione delle proteine, cambiando così la localizzazione e la dinamica del carico e diminuendo la salute delle colture. Gli astrociti sono molto vulnerabili ai danni fisici e ai cambiamenti nell'ambiente culturale, che possono portare all'induzione di risposte trascrizionali e cellulari, compresa la reattività. Pertanto, è fondamentale ridurre gli intervalli di tempo tra le fasi di lavaggio e ridurre al minimo l'esposizione delle colture all'aria e a variazioni significative della temperatura o dell'intensità della luce nei periodi di incubazione e acquisizione.

In sintesi, i metodi qui presentati possono essere utilizzati per valutare e quantificare i cambiamenti dinamici nella localizzazione di proteine e organelli negli astrociti. Forniscono strumenti preziosi che consentono l'esame dei cambiamenti nelle risposte astrocitiche in condizioni fisiologiche e patologiche.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046
Benchtop Centrifuge	Thermo Scientific	75-203-637	Sorvall ST8 Centrifuge
Cell Culture Grade Water	Gen Clone	25-511
Cell Culture Microscope	Zeiss	WSN-AXIOVERT A1	Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities
Cytosine Arabinoside	Sigma	C1768-100MG	(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage
DAPI	Sigma	D9542-5MG	Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.
Dissecting Microscope	Zeiss		Stemi 305
Dissecting Scissors	F.S.T	14558-09
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal Bovine Serum	Gemini	100-106	Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J)	NIH	Version 1.52i
Fine Tip Tweezers	F.S.T	11254-20	Style #5
Fluorescence light source	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
GFAP antibody	Cell Signaling	3670S	GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom Dishes	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated
Graefe Forceps	F.S.T	11054-10	Graefe Iris Forceps with curved tips
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.
Hank's Balanced Salt Solution (10x)	Gibco	14065-056	Magnesium and calcium free
Imaging Media	Life Technologies	A14291DJ	Live Cell Imaging Solution
Inverted Confocal Microscope	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent	Life Technologies	11514015	Plus Reagent
Lipofection Reagent	Life Technologies	15338100	Lipofectamine LTX reagent
Orbital shaking incubator	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control
Penicillin/Strepomycin solution (100x)	Gen Clone	25-512
Phosphate Buffered Saline (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide	Sigma	P7405	Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing
Reduced serum medium	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Tissue Culture Flasks	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap
Tissue culture incubator	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control
Tris-Base	Sigma	T1503	8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200072
Vacuum-Driven Filter Systems	Olympus Plastics	25-227	500 ml, PES membrane, 0.22 µm
Vannas scissors straight	Roboz	RS-5620