Summary
여기에서 우리는 세포기관의 세포내 수송 및 뮤린 성상 세포에 있는 혈장 막 단백질의 인신 매매를 구상하는 시험관 내 살아있는 화상 진찰 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 또한 화물 운송 일정 및 역학을 결정하는 이미지 분석 방법론을 제시합니다.
Abstract
성상 세포는 성인 두뇌에 있는 가장 풍부한 세포 모형 중 입니다, 기능의 복합성에서 중요한 역할을 하는 곳에. 뇌 항상성의 중심 플레이어로서, 성상 세포는 중요한 대사 산물과 세포 외 물, 이온, 및 글루타민산염과 뉴런을 공급합니다. "삼중 분" 시냅스의 필수적인 구성 요소인 성상 세포는 시냅스의 형성, 가지 치기, 유지 보수 및 변조에도 중요합니다. 이러한 고도의 상호 작용 기능을 가능하게하기 위해, 성상 세포는 자신과 다른 신경교 세포와 통신, 뉴런, 뇌 혈관, 세포 세포를 포함하는 전문 막 단백질의 무리를 통해 세포 외 환경 접착 분자, 아쿠아포린, 이온 채널, 신경 전달 물질 수송기 및 갭 접합 분자. 이 동적 플럭스를 지원하기 위해, 성상 세포, 뉴런처럼, 밀접하게 조정하고 효율적인 세포 내 수송에 의존. 세포 내 인신 매매가 광범위하게 묘사 된 뉴런과 는 달리, 성상 세포에서 미세 관 기반 의 수송은 덜 연구되었습니다. 그럼에도 불구하고, 세포막 단백질과 세포내 세포기관 수송의 엑소좀 및 내분비 인신 매매는 성상 세포의 정상적인 생물학을 조율하고, 이 프로세스는 수시로 질병에서 또는 상해에 응하여 영향을 받습니다. 여기에서 우리는 고품질 뮤린 점성체를 배양하고, 형광성 성상 세포 단백질 및 관심 있는 세포기관에 표시하고, 시간 경과 공초점 현미경 을 사용하여 세포내 수송 역학을 기록하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다. 또한 사용 가능한 이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ/FIJI) 플러그인을 사용하여 획득한 영화에서 관련 전송 매개 변수를 추출하고 정량화하는 방법을 시연합니다.
Introduction
성상 세포는 성인 중추 신경계에서 가장 풍부한 세포로 독특한 발달 및적시 성 기능을 수행합니다 1. 성상 세포는 시냅스 형성을 용이하게 하는 신경 전달 물질 수용체, 수송기 및 세포 접착 분자를 포함하는 트라이 파르트 족속 시냅스의 일환으로 전과 후 발착 단자와직접 접촉을 통해 시냅스 발달을 조절합니다. 및 뉴런-성상세포 통신2. 또한, 성상세포는 시냅스 전달을 능동적으로 제어하고 시냅스 갈라진 자로부터 흥분성 신경 전달 물질을 신속하게 제거하고 신경 전달 물질을 재활용하며 시냅스 가지치기에 참여함으로써 신경 흥분성 물질을 방지합니다3 , 4개 , 5개 , 6. 이러한 고도로 상호 작용 기능을 가능하게하기 위해 성상 세포는 다른 신경교 세포와 세포 접착 분자, 아쿠아 포린, 이온 채널을 포함한 특수 막 단백질을 통해 뉴런과 통신합니다. 신경 전달 물질 수송기, 및 갭 접합 분자. 성상 세포는 적극적으로 그들의 세포 내 및 세포 외 환경에서 변동에 응하여이 단백질의 표면 수준을 변경합니다 7. 또한, 미토콘드리아, 지질 방울, 분해 및 재활용 소기관의 수준 과 분포의 변화는 성상 세포 기능에 필수적인 에너지 공급, 대사 산물 가용성 및 세포 정화 과정을 조절하고, 생존.
막 단백질 및 세포세포 인신 매매 및 성상 세포에서의 위치의 동적 변화는 화물 운동성을 촉진하는 모터 단백질및 어댑터의 공동 기능에 의해 촉진된다 8,9. 유사하게, 막 단백질의 표면 수준은 내재화 및 재활용 이벤트10을통해 변조된다. 이 화물은 액틴, 미세 관 및 아마도 중간 필라멘트 트랙8의복잡한 네트워크를 통해 수송됩니다. 성장하는 미세소관 플러스 끝에 축적되는 말단 결합 단백질 1 (EB1)의 면역 형광 염색에 기초한 연구 결과는, 미세소관의 성상 세포 번들이 회중에서 방사하고 그들의 플러스 끝을 향해 확장한다는 것을 건의합니다 주변11. 그러나, 살아있는 세포 화상 진찰을 사용하여 microtubules 및 그밖 cytoskeletal 요소의 조직 그리고 극성의 포괄적인 검사는 아직도 부족합니다. 세포기관과 막 단백질의 역학의 근본적인 기계장치의 많은 것이 신경세포 및 그밖 세포 모형에서 광범위하게 공부되는 동안, 성상 세포에 있는 화물 운동성은 보다 적게 잘 이해됩니다. 성상 세포에서 단백질 과 세포세포 분포의 변화에 대한 우리의 현재 지식의 대부분은화물 역학의 정확한 공간 및 시간 적 검사를 배제 고정 제제의 전통적인 항체 기반 라벨링에 기초7, 12.
여기서, 우리는 고순도 원발성 마우스 성상 세포 배양에서 살아있는 이미징을 위한 막 단백질 및 소기관표지 방법을 기술한다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 갭 접합 단백질 코넥신 43 (Cx43-GFP) 및 흥분성 아미노산을 포함하여 형질 감염 된 성상 세포에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그 막 단백질의 동적 국소화를 추적하는 예를 제공합니다. 수송기 1 (EAAT1-GFP). 우리는 또한 산성 세포기관을 시각화하고 살아있는 성상 세포에서 그들의 인신 매매 역학을 따르기 위해 형광 산성 종자 프로브의 사용을 설명합니다. 마지막으로, 시간 경과 데이터를 분석하여 개별 화물에 대한 운송 매개 변수를 추출하고 평가하는 방법을 설명합니다.
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Protocol
모든 동물 절차는 채플 힐 동물 관리 및 사용위원회에서 노스 캐롤라이나 대학의 승인으로 수행되었다 (IACUC).
1. 뇌 해부 및 기본 마우스 성상 세포의 문화
참고 : 다음 프로토콜은 맥카시와 deVellis13,14,15에의해 개발 된 원래 절차를 다음과 출판 된 방법에서 적응되었다 . 맥카시/데벨리스(MD) 성상세포의 혼합 세포 배양은 산후 2-4(P2−P4) 마우스 코르티케, 반유사성 인자로 처리되고, 최종 농축 성상세포 배양을 산출하도록 정제된다. 어느 성별의 마우스 새끼로부터4개의 코르티케는 하나의 T75 조직 배양 플라스크 배양액을 생성하기에 충분하다.
- T75 플라스크 바닥(100% 각진 목 접근, 0.22 μm 소수성 환기 필터 캡)을 폴리-D-리신(0.1 M Tris 완충제의 1 mg/mL, pH 8.5)으로 코팅하고 해부를 시작하기 전에 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
- 해부 절차를 시작하기 전에, 성상 세포 배양 배지의 30 mL (덜베코의 수정 된 독수리의 배지 [DMEM] 높은 포도당, 10 % 열 불활성화 태아 소 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙 토마이신) 37 °C에서 5 mL aliquots 2.5 % 트립신 얼음에 해동. Ca2+ 또는 Mg2+없이 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)의 6 mL로 채워진 얼음에 두 개의 해부 요리 (직경 60mm)를 준비하십시오.
- 모든 수술 도구 (미세 팁 핀셋, 해부 가위, 반나스 가위 직선, 곡선 팁이있는 Graefe 집게)를 각 해부 전과 해부 사이에 70 % 에탄올로 소독하십시오.
- P2−P4 마우스 새끼의 머리와 목에 70% 에탄올을 뿌린 후 수술용 가위로 빠르게 안락사시합니다. 두개골을 노출하는 두피를 따라 전방 중간 선 절개에 후방을 수행합니다. 조심스럽게 목에서 코로 두개골을 잘라.
- 눈에 우수한 두 개의 추가 측면 절개를 수행합니다. 미세 한 팁 핀셋을 사용하여 부드럽게 옆으로 두개골 플랩을 뒤집습니다. 뇌를 제거하고 Ca2 + 또는 Mg 2 +없이 얼음 차가운 HBSS로채워진 첫 번째 해부 접시에 놓습니다. 얼음에 접시를 유지하고 뇌의 나머지 부분을 수확 계속.
참고: 해부 절차의 나머지 부분을 해부 범위에서 수행합니다. - Vannas 가위 또는 미세 핀셋을 사용하여 후각 전구를 제거합니다(그림1Ai). 횡방향 및 간반구 균열의 교차점에 있는 곡선 팁 집게를 사용하여 피질과 디엔팔론 사이에 두 번째 곡선 팁 집게를 부드럽게 삽입하고 집게를 천천히 열어 대뇌 반구를 나머지 부분과 분리합니다. 뇌 (그림1Aii,Aiii). 원치 않는 조직을 제거합니다(그림1Aiv).
- 각 피질 반구에 대해 미세 한 팁 핀셋으로 수막을 조심스럽게 제거하십시오. 선택적으로, 코르티에서 해마를 제거하십시오. 해부된 마우스 피질 은 Ca2 + 또는 Mg2 + 없이 얼음 차가운 HBSS로 채워진 두 번째 접시에 옮기고 남은 뇌를 해부하는 동안 얼음에 보관하십시오.
참고: 층류 후드의 무균 조건에서 다음 단계를 수행합니다. - 멸균 된 날카로운 수술 가위 또는 메스를 사용하여 해부 된 코르티코를 작은 조각 (약 2−4mm)으로 자릅니다. 해부된 조직을 효소 용액을 함유하는 50 mL 원추형 튜브로 옮니다(Ca2+ 또는 Mg2+없이 22.5 mL HBSS, 2.5 mL 2.5% 트립신). 37 °C에서 30분 동안 인큐베이션하고 10분마다 부드러운 반전을 가합니다.
- 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리하여 소화 된 조직을 수집하고 데내레이션으로 효소 용액을 제거하십시오 (진공 흡입기를 사용하지 마십시오). 10 mL의 성상 세포 배양 배지를 추가하고 10 mL 혈청학적 파이펫을 사용하여 용액을 20-30x 피펫하여 단일 세포로 조직을 해리합니다.
- 세포 덩어리와 소화되지 않은 조직을 최소화하기 위해 70 μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다. 깨끗한 50 mL 원엽 튜브에서 여과액을 수집하고 성상 세포 배양 매체로 총 부피를 20 mL로 조정합니다. 이 시점에서, 10 μL의 트립판 블루와 셀의 10 μL을 혼합하여 피질 해리의 효율을 평가하고 혈세포계로 셀을 계수한다.
참고 : 4 개의 P2−P4 마우스 코르티프에서 한 번의 준비는 10-15 x 106 단일 세포를 생성합니다. - T75 배양 플라스크에서 폴리-D-리신 코팅 용액을 흡인하고 멸균수로 2회 세척합니다. 20 mL 세포 현탁액을 플레이트하고 37°C및 5% CO2에서 배양한다.
2. 성상 세포 배양정화 및 유지 보수
참고: 37°C로 데운 멸균 여과(0.22 μm 필터 멤브레인) 성상 매계를 사용하여 층류 후드에서 무균 조건하에서 모든 매분 변화를 수행합니다.
- 도금 후 세포 매체 48h를 교체한다(질내 2일, DIV2).
- DIV5에서, 10 μM 시토신 아라비노시드(AraC)로 보충된 신선한 성상 세포 배양 매체로 미디어를 교체한다.
참고 : 이 단계는 섬유 아세포 및 기타 신경 교세포를 포함한 오염 세포의 제거를 용이하게합니다. 더 이상 배양 시간이 성상 세포 생존을 감소시킬 것이다 더 이상 48 시간 아라C와 배양을 치료하는 것이중요하다. - DIV7에서는 AraC없이 성상 문화 매체로 미디어를 변경하고 매일 문화 적 동조를 확인하기 시작합니다. 일단 세포가 80% 합류에 도달하면, 폴리-D-리신을 가진 각 비정제 성상 세포 배양 플라스크에 대해 2-T75 플라스크를 코팅하고 적어도 8시간에서 하룻밤 동안 37°C에서 배양한다.
- 다음날, 37°C 궤도 흔들림 인큐베이터에서 30분 동안 180 rpm에서 배양 플라스크를 흔들어 성상세포 정화를 시작한다. 미디어를 제거하고 신선한 성상 세포 배양 매체로 교체하십시오. 37°C 궤도 흔들림 인큐베이터에서 6시간 동안 240 rpm에서 세포를 흔들어. 프리웜 1x 인산완충식염수(PBS), 성상세포 배양 배지, 및 0.25% 트립신-EDTA 내지 37°C 20-30분 전에 흔들림 주기가 종료된다.
참고: 흔들리는 단계 동안 CO2배양은 필요하지 않습니다. 원하는 경우, 30분 및 6-h 의 흔들림 단계 후에 수집된 배지는 각각 마이크로글리아 및 올리고덴드로시트를 배양하는데 사용될 수 있다. 혼합 배양의 AraC 처리는, 그러나, 다른 신경교 세포의 풍부를 감소시킬 것이다. - 셰이커에서 배양 플라스크를 제거하고 즉시 플라스크당 10mL의 따뜻한 PBS로 미디어를 교체합니다. PBS를 제거하고 플라스크 당 0.25 % 트립신 -EDTA의 3 mL을 추가합니다. 37 °C 및 5% CO2에서 배양하고 5분마다 분리를 확인합니다.
- 세포가 플라스크에서 분리되면, 성상 세포 배양 배지의 10 mL를 추가하여 트립시니화를 중지하십시오. 분리된 성상 세포를 50mL 원유관 및 펠릿 세포로 500 x g에서 원심분리하여 5분 동안 상수구 배양 배지의 40 mL에서 세포를 다시 현탁시한다.
- 폴리-D-리신 코팅 T75 플라스크를 멸균수와 20 mL의 정제된 성상 세포 현탁액으로 두 번 세척합니다. 37°C 및 5%CO2 인큐베이터로 되돌아갑니다. 성상 세포가 성숙 할 때까지 추가 10 일 동안 2 일마다 성상 세포 배양 매체를 변경합니다.
참고 : 정제 된 성상 세포의 각 T75 플라스크는 도금시 각각 3 x 105 셀이있는 2 개의 새로운 T75 플라스크를 생산하기에 충분해야합니다. - 후속 패스 또는 현미경 검사법용 성상 세포 플레이트에 대해 2.5-2.7 단계를 반복합니다.
참고 : AraC를 첨가하고 다음 정제 후 성상 세포 배양물의 순도는 밝은 필드 현미경 검사를 통해 질적으로 평가될 수 있으며, 또는 신경교 세동 성 단백질 (GFAP)의 비율을 정량화하여 보다 정확하게 평가 할 수 있습니다- 양성 형광 이미지의 시야당 셀(그림1B,C).
3. 형광 태그 플라스미드의 형질 감염
- 형질전환 또는 라벨링 전날, 종자 성상세포는 이미징을 위해 원하는 밀도로 24−48h 후형질화. 24 웰 플레이트 또는 14mm 유리 바닥 웰의 권장 밀도는 2 x 104 셀/ 웰입니다.
참고: 이 프로토콜은 24웰 플레이트의 12mm 유리 커버슬립 또는 14mm 유리 바닥 웰에서 lipofection 기반 방법을 사용하여 도금된 성상 세포의 형질 감염에 최적화되어 있습니다. 시약은 성상 세포가 성장하는 배양 접시의 크기에 따라 크기를 조정해야합니다. - 감소 된 혈청 매체(재료표)에 지질 시약 (재료 표)을 희석하십시오. DNA에 대한 지방 흡입 시약의 비율을 최적화하기 위해 적절한 희석 범위를 테스트하십시오. 예를 들어, 본 프로토콜에 사용되는 시약을 사용하는 경우(재료표), 50 μL의 환원혈성 매질에서 2, 3, 4 및 5 μL의 지방시약의 희석한다.
- 250 μL의 환원 혈청 매체에 고순도 DNA 5 μg를 희석합니다. 5 μL의 지방 흡입 증강 시약 (재료표)를추가합니다. 지질 시약을 함유한 튜브를 DNA-지방 흡입 증강인자 혼합물의 동일한 부피와 결합한다. 파이펫팅하여 혼합하고 실온(RT)에서 15분 동안 배양합니다.
- 성상 세포 배양 배지를 제거하고 세포에 형질 감염 혼합 (단계 3.3)을 드롭 와이즈로 추가하십시오. 37°C 및 5% CO2에서 6-h배양 후, 형질전환 복합체를 적절한 부피의 성상 세포 배양 배지로 대체한다(14 mm 유리 바닥 접시에 대한 2 mL). 이미지 수집을 진행하기 전에 추가로 24-72 시간 동안 인큐베이팅합니다. 단백질 발현과 세포 생존력 사이의 최상의 균형을 달성하기 위해 인큐베이션 단계의 지속 시간을 면밀히 모니터링합니다.
4. 형광 프로브를 사용하여 늦은 내인성 /리소좀 의 라벨링
참고: 일부 화물은 화물 별 단백질에 대한 친화성이 높은 형광 염료를 사용하여 라벨을 붙일 수 있습니다. 다음 예는 형광 acidotropic 프로브와 늦은 내인성 /리소좀의 라벨링을 허용합니다.
- 상체 세포 배양 배지의 200 μL에서 리소좀 라벨링 프로브(물자 표)를 1 μM의 작업 농도로 희석하고 2 x 104 세포/웰의 밀도에서 3.1단계에서 성상 세포에 적용한다. 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 따뜻한 성상 세포 배양 매체로 세포를 한 번세척하고 이미징 매체로 대체하십시오 (재료 표). 즉시 라이브 이미징을 진행합니다.
5. 타임랩스 이미징 시스템을 이용한 이미지 수집
참고: 타임랩스 라이브 이미징은 고속 카메라, 명확한 초점, 인큐베이션 챔버 및 높은 숫자 조리개가 있는 40x 오일 목표(예: Plan-Apochromat 1.4NA)가 장착된 형광 현미경을 사용하여 수행해야 합니다. 타임랩스 이미징에는 다양한 수집 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 현미경 시스템 및 취득 소프트웨어의 선택은 특정 연구의 목표에 대한 가용성과 적합성을 기반으로해야합니다. 몇 가지 일반적인 지침은 아래에 제공됩니다.
- 배양 챔버 또는 접시를 현미경 단계에 적절한 어댑터에 놓습니다. 에피플루오레시온 광을 사용하여 형광 단백질을 발현하는 세포를 선택하거나 기록할 프로브를 선택합니다. 형광 샘플 조명을 조정하여 디지털 카메라를 사용하여 선택한 셀을 시각화합니다. 광표백 및 광독성을 유발할 수 있는 높은 조명을 사용하지 마십시오. 초점과 확대/축소를 조정합니다.
- 줌 및 명확한 초점 기능을 사용하여 300초에서 500초 사이의 시간 간격동안 2프레임마다 1프레임씩 단일 Z 스택 타임랩스 시리즈를 획득할 수 있습니다.
참고: 트래피킹 역학(속도, 동작 빈도 등)은 관심 단백질에 따라 달라지므로 수집 시간 조정이 필요할 수 있습니다. 예를 들면, 미토콘드리아는 리소좀보다는 더 적은 운동성이고 빈번한 일시 정지를 전시합니다. 이 경우 수집 매개 변수를 800초마다 5초마다 1프레임으로 조정하는 것이 더 적합합니다. - 시간 경과 이미지를 저장하고 AVI 또는 TIFF 스택 파일로 내보낼 수 있습니다.
6. 이미지 분석
참고 : 이미지 분석은 ImageJ / 피지16에대한 KymoToolBox 플러그인을 사용하여 수행되었다 . 자세한 단계별 서면 지침은 온라인17에서확인할 수 있습니다. 다음 축약된 단계는 kymographs를 만들고 파티클 전송 매개변수를 추출하기에 충분해야 합니다.
- ImageJ/피지 소프트웨어에서 시간 경과 이미지 시퀀스를 엽니다. 파일 메뉴에서 이미지를 AVI 또는 TIFF 스택 파일로 가져옵니다. 이미지 메뉴에서 유형 도구를 사용하여 이러한 이미지 유형 중 하나를 선택하여 이미지를 8비트 또는 16비트로 변환합니다. RGB 파일로 작업하는 경우 이미지 메뉴의 색상 기능에서 사용할 수 있는 분할 채널 도구를 사용하여 채널을 분할합니다.
- 큐모그래프(파티클 궤적의 위치와 시간에 대한 표현)를 생성하려면 분할된 선 도구를 사용하여 파티클의 궤적을 따라 선을 추적하여 파티클이 이동하는 각 트랙을 그립니다. 무브먼트의 방향성을 올바르게 지정하려면 모든 동영상에 대해 동일한 방향 규칙을 사용하여 폴리선을 그려 서 연구중인 모든 셀 내에서 및 전체에서 극성이 일관되도록 합니다. 예를 들어 셀 중앙에서 주변쪽으로 폴리선을 그리거나 그 반대로 그립니다. 선 도구를 두 번 클릭하여 선 너비를 트랙 두께와 일치하도록 조정합니다.
- 10의 선 너비를 사용하여 KymoToolBox 플러그인의 그리기 Kymo 매크로를 실행합니다. 시간에 따라 이미지를 보정하라는 프롬프트(프레임 수, 프레임 속도) 및 공간(x,y 해상도)이 나타납니다. 보정되면 kymographs가 생성되며 데이터 프레젠테이션 또는 추가 입자 분석을 위해 TIFF 파일로 저장할 수 있습니다.
- 획득의 전체 기간 동안 분할된 선 도구를 사용하여 kymograph의 각 입자를 수동으로 추적하여 파티클 궤적을 할당합니다. 분석/도구 메뉴에 있는 ROI 관리자 도구를 사용하여 각 파티클 궤적을 관심 영역(ROI)으로 기록합니다. 추가 분석을 위해 매 시간 경과 비디오당 모든 ROI를 저장합니다.
참고: 전송 매개변수의 가장 정확한 계산을 위해 kymograph의 개별 파티클에 대해 올바른 궤적을 할당하는 것이 중요합니다.- KymoToolBox 플러그인의 Kymo 매크로 분석 실행. 드롭다운 메뉴에서 파티클 모션의 "바깥쪽" 방향(왼쪽에서 오른쪽으로 또는 그 반대)을 정의하도록 요청하는 창이 열립니다. 이러한 선택은 6.2단계에서 확립된 바와 같이 핵 또는 세포 주변을 기준으로 이미지화된 형광화물의 위치에 의존한다. 예를 들어, 핵이 화물의 왼쪽에 위치하고 6.2단계의 폴리선이 핵에서 멀어지면 바깥쪽 입자 모션을 "왼쪽에서 오른쪽으로"로 정의합니다.
- Kymo 분석 창에서 제한 속도(화물이 변조로 간주되는 최소 속도)를 정의합니다. 빠른 세포 내 운송 속도로 이동하는 화물의 경우 0.1 μm/second가 적절한 선택입니다. 이 값을 수정하여 관심 있는 각 화물에 대한 소프트웨어의 민감도를 조정합니다. 각 파티클 궤적의 두께와 일치하도록 선 폭을 조정합니다.
- kymo 분석 창에서 모든 데이터 로그 및 추정좌표 로그 옵션을 선택합니다. 이것은 평균 속도, 내부 속도, 외부 속도, 누적 거리, 안쪽 또는 바깥쪽 방향으로 이동 한 거리, 각 입자에 대한 스위치 수, 시간 비율을 포함한 다양한화물 운송 매개 변수를 계산합니다. 각 방향으로 이동하거나 일시 중지 등 그런 다음 개별 트랙에 대해 계산된 데이터는 kymograph별로 풀화되고 각 이미지에 특정한 텍스트 파일에 저장됩니다.
참고: Kymo 매크로 분석의 컬러 Kymo 표시 옵션은 원래 kymograph 위에 경로의 색상 코드 오버레이를 생성합니다. 바깥쪽으로 이동하는 파티클은 녹색, 안쪽은 빨간색, 고정된 입자는 파란색으로 표시됩니다. Kymo 매크로 분석의 원본 스택에 대한 보고서 좌표는 원래 타임랩스 비디오 및 kymograph에서 외삽된 개체의 위치를 색상으로 구분하여 오버레이를 생성합니다.
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Representative Results
위에서 설명한 기본 마우스 MD 성상 세포를 확립하기 위한 프로토콜은 재현 가능한 고품질 문화를 생성해야 합니다. 배양체는 처음에 성상세포, 섬유아세포 및 마이크로글리아 및 올리고엔드로시트를 포함한 다른 신경교 세포의 혼합을 포함하지만(그림1Bi, Biv;적색 화살촉), DIV5-DIV7 사이의 혼합 배양에 AraC를 첨가하는 것은 최소화한다. 이러한 오염 세포의 증식. 병용 아라C 처리 및 쉐이킹 계 정제 전략은 정제 단계만을 포함하는 전통적인 프로토콜에 비해 성상 세포 배양체(도1Bii)의순도를 풍부하게 한다(도1Bv;blue; blue; 화살촉)13. AraC 또는 좌측 치료되지 않은 채 처리된 정제된 성상세포 배양물의 예상 형태(GFAP 및 4',6-디아미디노-2-페니린돌[DAPI] 염색)는 도 1Biii,Bvi에나타내고 있다. 시야당 GFAP+ 셀의 백분율을 정량화(GFAP 염색을 가진 세포의 수와 DAPI 염색으로 확인된 총 세포 수의 비율)는 AraC 보충을 통해 순도가 27% 이상 증가한 것을 나타낸다(그림1) C). 이러한 고순도 마우스 성상 세포 배양은 RNA 및 단백질 발현, 세포 형태학 및 기타 기능성 세포의 평가에 적합하다.
우리는 뮤린 성상 세포에서 갭 접합 단백질 Cx43 및 EAAT1 수송기의 GFP 태그 버전을 표현하기 위해 lipofection 기반 형질 감염을 사용했습니다. 이 방법론은 독성을 일으키거나 성상 세포 생존에 영향을 미치지 않고 살아있는 세포 이미징에 최적인 수준에서 단백질을 일시적으로 발현할 수 있게 합니다(그림2A,E). 유사하게, 형광 프로브의 사용은 성상 세포에서 그들의 역학을 추적하기 위해 산성 내균 세포기관 (도2I)의 신속하고 효율적인 라벨링을 허용했다.
그림 2는 EAAT1-GFP, Cx43-GFP로 일시적으로 형질 전환되거나 산성 내인성 소포를 인식하는 선택적 염료로 표지된 성상 세포에서 화물 역학의 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다. 이들 화물의 각각은 성상세포의 핵 영역, 시토졸 및 공정을 장식하는 형광 천공으로 나타났다(그림2A, E,I, 좌측 패널). 타임랩스 데이터는 시간과 공간에서 화물 모션을 추적하는 kymographs를 생성하는 데 사용되었습니다(그림2A, E, 오른쪽패널). 이러한 척추 그래프에서 표시된 화물의 전방 및 역행 이동은 각각 음수(녹색 선) 및 양수(빨간색 선) 경사가 있는 궤적으로 표시됩니다. 고정 소포는 수직 궤적(파란색 선)으로 표시됩니다. Kymograph 분석에 따르면 분석된 3가지 유형의 화물은 양방향으로 빠르고 처리가 가능한 양방향 운송을 거치게 됩니다. 더욱이, 성상 세포 (빨간 상자)의 영역을 통해화물의 플럭스의 정량화는화물 중 운동입자의 비율에 있는 다름을 밝혔습니다. 예를 들어, EAAT1-GFP 풍절의 70%가 고정되어 있는 반면(그림2B),Cx43-GFP의 20% 미만 (그림2F)및 프로브 표지 된 내골화물의 45 %(그림2J)는 비 운동성입니다. 화물 간의 운동성에서 이러한 차이는 영화가 획득 된 성상 세포 부위의 정상, 기준선 운동성을 나타냅니다.
kymograph에서 얻은 각 입자에 대한 풀 타임 스케일을 따라 X-Y 위치의 변화를 정밀하게 매핑하여 화물 속도 (그림2C, G,K) 및 실행 길이 (거리)와 같은 다른 모션 매개 변수를 평가할 수도 있습니다. (그림2D, H,L). 모션 파라미터는 개별 화물에 대해 추가로 분석하여 움직임의 방향성 변화(전방 및 역행 운동)뿐만 아니라 입자 모션 방향의 반전, 일시 정지 횟수 등을 결정할 수 있습니다. 이러한 유형의 분석의 결과는 세포 내 및 세포 외의 기저 또는 비정상적인 조건 하에서 성상 세포에서 세포기관과 막 단백질의 세포 분포변화에 관한 의미 있는 정량적 정보를 제공할 수 있습니다. 환경.
그림 1: 기본 마우스 성상 세포 문화의 설립.
(A) P2−P4 마우스 뇌의 해부에 필요한 단계. (B) (i,iv)혼합 신경교 배양체 (i) 및 비처리 (iv)의 브라이트필드 이미지 아라C를. 빨간색 화살촉은 오염물질 마이크로글리아를 나타냅니다. (ii,v) 정제된 성상 세포 배양체의이미지 처리 (ii) 및 비처리 (v) 아라C를. 파란색 화살촉은 오염물질 올리고엔드로시트를 나타냅니다. (iii,vi) 정제된 성상 세포 배양체의 공초점 이미지는 AraC와 함께 처리된 (iii) 및 비처리(vi)를 갖는다. 녹색은 GFAP 염색 및 DAPI(청색) 라벨이 모든 핵을 나타낸다. (C) GFAP 양성 세포의 백분율. 데이터는 평균 ± SEM. ***p < 0.001, 페어링되지 않은 t 검정을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 성상 세포의 화물 역학의 정량적 분석.
(A, E,I) 좌측 패널: EAAT1-GFP(A), Cx43-GFP(E)를발현하거나 늦은 내인성 및 리소좀(I)을라벨링하는 프로브로 처리된 성상세포. 빨간색 상자는 파티클 역학을 분석하는 데 사용되는 영역을 나타냅니다. 오른쪽 패널: 표시된 화물의 궤적을 보여주는 원본 및 색상으로 구분된 kymograph. 빨간색 선은 역행 이동 화물, 녹색 선 전도행 화물 및 파란색 선 비 운동화물을 나타냅니다. (B, F,J) 고정 및 운동성 입자의 백분율입니다. (C, G,K) ) 전위 및 역행 속도 및(D, H,L) 실행 길이의 정량화. 데이터는 평균 ± SEM을 나타냅니다.
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Discussion
여기에서, 우리는 고순도 1 차적인 마우스 피질 MD 성상 세포에 있는 시간 경과 비디오 현미경 검사법을 사용하여 관심있는 형광성 으로 표를 붙인 세포기관 및 막 단백질을 표현하고, 구상하고, 추적하는 실험적인 접근을 기술합니다. 또한 입자 역학을 측정하는 방법론도 간략하게 설명합니다. 1 차 적인 성상 세포에 있는 단백질과 세포기관 역학의 직접적인 시각화는 시험관내 이 세포에 있는 세포내 수송의 규정을 공부하는 강력한 공구를 제공합니다.
위에서 설명한 마우스 MD 성상 세포 배양법을 확립하는 방법은 다른 출판 된 프로토콜13,14,15의단계를 결합하여 더 간단한 방법과 더 높은 순도 및 품질을 제공합니다. 문화. AraC15 처리 및 동요계 정제13,14의 조합은 98%(GFAP+ 세포 총 세포의 비율로 평가됨)의 순도를 가진 성상 세포 배양을 산출할 수 있으며, 이 경우 본예에서는 정제 단계만을 실시한 배양물에 비해 순도가 27% 증가하였다(도1B,C). 이 방법으로 수득된 마우스 성상세포의 고순도 배양물은 McCarthy 및 deVellis14에의해 쥐 성상세포 배양(효소 세포 및 전자 현미경검사법에 의해 평가됨)에 대해 보고된 값과 유사하다. 그러나, 아라C 치료를 포함하지 않는 맥카시/데벨리스 방법은, 더 긴 흔들림 단계(15−18 h)와 2개의 추가 적인 정제14라운드가 필요하다.
이 예에서, 우리는 이 프로토콜이 그들의 개별적인 세포내 여정 및 세포내 여행일정 및 셀룰러의 가능성이 대표하는 성상 세포에 있는 각종 막 단백질 그리고 세포기관 사이 운동성에 있는 다름을 붙잡기 위하여 충분히 과민하다는 것을 보여줍니다 함수. 우리의 예는 기초 조건에서이 프로토콜의 유용성을 보여 주지만,이 방법론은 연구 질문의 넓은 범위 내에서 전송 매개 변수를 측정하기 위해 쉽게 적응 할 수 있습니다. 예를 들어, 사소한 변형을 가진 유사한 프로토콜은 세포 손상, 독성, 병원성 돌연변이, 시냅스 활성( 뉴런과 성상 세포의 혼합 배양), 기타. 마찬가지로, 여러 화물 또는 소기관의 공동 표현 및 시각화, 각각개별적으로 서로 다른 형광으로 태그, 또한 공동 지역화 및 복잡한 형성의 동적 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다, 소기관 사이의 일시적인 상호 작용 , 내분비 및 멤브레인 재활용 운송 이벤트.
여기에 제시 된 방법론의 성공은 주로 고품질의 성상 세포 문화를 얻을 수있는 능력과 관심화물의 효율적인 라벨링에 의존한다. 살아있는 화상 진찰을 위해 이 절차를 이용할 때, 최적 후 형질감염 배양 시간을 결정하기 위하여 형광 발현을 면밀히 감시하는 것이 중요합니다. 평균적으로, 우리는 화물에 대해 24-h 잠복기를 분석하여 라이브 이미징 수집을 위한 양호한 신호 강도를 초래한다는 것을 발견했습니다. 형질 감염 된 성상 세포의 장기간 된 배양 형질 전환 단백질 응집을 유도할 수 있는 형광 태그 단백질의 높은 발현귀착 될 수 있습니다., 따라서 화물 국소화 및 역학 변경, 그리고 문화의 건강을 감소. 성상 세포는 물리적 인 손상과 문화 환경의 변화에 매우 취약하며, 이는 반응성을 포함한 전사 및 세포 반응의 유도로 이어질 수 있습니다. 따라서, 세척 단계 사이의 시간 간격을 줄이고, 공기에 대한 배양물의 노출을 최소화하고 인큐베이션 및 수집 기간 동안 온도 또는 광강도의 상당한 변화를 최소화하는 것이 중요하다.
요약하면, 여기에 제시된 방법은 성상 세포에서 단백질 및 세포자 국소화의 동적 변화를 평가하고 정량화하는 데 사용될 수 있다. 그들은 생리적 및 병리학적 조건하에서 성상 세포 반응의 변화를 검사 할 수있는 귀중한 도구를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
DNL은 채플 힐 (UNC) 의학 대학에서 시몬스 학자로 노스 캐롤라이나 대학에 의해 지원되었다. TWR은 UNC 준비 그랜트 R25 GM089569에 의해 지원되었다. UNC 신경과학 센터 현미경 코어 시설을 이용한 작업은 NIH-NINDS 신경과학 센터 지원 보조금 P30 NS045892 및 NIH-NICHD 지적 발달 장애 연구 센터 지원 보조금 U54의 자금 지원으로 부분적으로 지원되었습니다. HD079124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
| Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
| Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
| Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
| Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
| Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
| Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
| Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
| Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
| Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |
References
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