Summary
Здесь мы описываем метод живой визуализации in vitro для визуализации внутриклеточного переноса органелл и оборота плазменных мембранных белков в murine astrocytes. В этом протоколе также представлена методология анализа изображений для определения маршрутов грузовых перевозок и кинетики.
Abstract
Астроциты являются одними из наиболее распространенных типов клеток во взрослом мозге, где они играют ключевую роль в множественности функций. Как центральный игрок в гомеостаз мозга, астроциты питания нейронов с жизненно важными метаболитами и буфервой внеклеточной воды, ионов и глутамата. Неотъемлемый компонент синапса «трипартита», астроциты также имеют решающее значение в формировании, обрезке, обслуживании и модуляции синапсов. Для того чтобы позволить эти высоки взаимодействуюные функции, астроциты связывают между собой и с другими глиальными клетками, невронами, сосудом мозга, и внеклеточной окружающей средой через множество специализированных протеинов мембраны которые включают клетки молекулы адгезии, аквапорины, ионные каналы, нейромедиаторные транспортеры и молекулы разрывных узлов. Для поддержки этого динамического потока астроциты, как и нейроны, полагаются на тесно скоординированный и эффективный внутриклеточный транспорт. В отличие от нейронов, где внутриклеточный оборот был широко разграничен, микротубулы на основе транспорта в астроцитах были менее изучены. Тем не менее, экзо- и эндоцитарный оборот клеточных мембранных белков и внутриклеточного транспортировки органеллы организует нормальную биологию астроцитов, и эти процессы часто страдают при болезни или в ответ на травму. Здесь мы представляем простой протокол для культуры высокого качества муринааааа, чтобы флуоресцентно маркировать астроцитические белки и органеллы, представляющие интерес, и записывать их внутриклеточной динамики транспорта с помощью замедленной конфокальной микроскопии. Мы также демонстрируем, как извлечь и количественно определить соответствующие параметры транспортировки из приобретенных фильмов с помощью доступных плагинов анализа изображений (т.е. ImageJ/FIJI).
Introduction
Астроциты являются наиболее распространенными клетками в центральной нервной системе взрослого человека, где они выполняют уникальные функции развития и гомеостатических1. Астроциты модулируют синаптической развитие через прямой контакт с до- и постсинаптическими терминалами как часть трехпартитного синапса, который содержит нейромедиаторные рецепторы, транспортеры и молекулы клеточной адгезии, которые способствуют формированию синапса и нейрон-астроцитов связи2. Кроме того, астроциты активно контролируют синаптической передачи и предотвратить возневнищее экситотоксичность путем быстрого удаления возбуждающих нейротрансмиттеров из синаптической расщелины, рециркуляции нейротрансмиттеров, и участие в синаптической обрезкой3 , 4 , 5 , 6. Для того чтобы включить эти высоки взаимодействуючие функции, астроциты связывают между собой, с другими глиальными клетками, и с нейронами через специализированные протеины мембраны, включая молекулы стегезии клетки, aquaporins, каналы иона, нейромедиатор транспортеров, и разрыв узел молекул. Астроциты активно меняют поверхностные уровни этих белков в ответ на колебанияих внутри- и внеклеточной среды 7. Кроме того, изменения в уровнях и распределении митохондрий, липидных капель, а также деградативных и рециркуляционных органелл модулировать энергоснабжение, наличие метаболита и клеточных процессов очистки, которые имеют важное значение для астроцитов функции и Выживания.
Динамические изменения в мембранном белке и торговле органеллами и позиционировании в астроцитах способствуют согласованной функции моторных белков и адаптеров, которые способствуют подвижности грузов8,9. Аналогичным образом, поверхностные уровни мембранных белков модулируются через интернализацию и переработку событий10. Эти грузы перевозятся через сложную сеть актина, микротрубочки и, возможно, промежуточные нити треков8. Исследования, основанные на иммунофлуоресценции окрашивания конечной связывания белка 1 (EB1), который накапливается на растущей микротрубочки плюс концы, показывают, что в астроцитах пучки микротрубок излучают из периноклея и расширяют их плюс конец к периферии11. Тем не менее, комплексное изучение организации и полярности микротрубок и других цитоскелетных элементов с использованием живой клетки изображения по-прежнему отсутствует. В то время как многие из механизмов, лежащих в основе динамики органелл и мембранных белков, были широко изучены в нейронах и других типах клеток, подвижность груза в астроцитах менее хорошо понята. Большинство наших современных знаний об изменениях в распределении белков и органелл в астроцитах основано на традиционной маркировке фиксированной препаратом на основе антител, что исключает точное пространственное и временное изучение динамики груза7, 12.
Здесь мы описываем метод маркировки мембранных белков и органелл для живой визуализации в культурах астроцитов высокой чистоты. Используя этот протокол, мы приведиваем примеры, в которых мы отслеживаем динамическую локализацию зеленого флуоресцентного белка (GFP) помеченных мембранных белков в трансинфицированных астроцитах, включая разрыв соединения белка connexin 43 (Cx43-GFP) и возбуждающей аминокислоты транспортер 1 (EAAT1-GFP). Мы также описываем использование флуоресцентного ацидотропного зонда для визуализации кислых органелл и следованизаих их динамике торговли живыми астроцитами. Наконец, мы демонстрируем, как анализировать данные замедленного управления для извлечения и оценки транспортных параметров для отдельных грузов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных были выполнены с одобрения Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл комитет по уходу за животными и использованию (IACUC).
1. Рассечение мозга и культура первичных астроцитов мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол был адаптирован из опубликованных методов, который следует первоначальной процедуре, разработанной Маккарти и deVellis13,14,15. Смешанные клеточные культуры астроцитов Маккарти/ДеВеллиса (MD) готовятся из послеродового дня 2х4 (P2-P4) мышонки, обрабатываются антимитотический фактор, и очищаются, чтобы дать окончательный обогащенный астроцит культуры. Четыре кортики от мышей щенков обоих полов достаточно, чтобы генерировать один T75 культуры культуры колбы культуры культуры культуры культуры культуры культуры культуры.
- Пальто нижней части T75 колбы (100% угловой доступ шеи, 0,22 мкм гидрофобных вентилируемых фильтр крышка) с поли-D-лизина (1 мг/мл в 0,1 М Tris буфер, рН 8,5) и инкубировать при 37 кв кв 24 ч до начала вскрытия.
- Перед началом процедуры вскрытия, теплые 30 мл астроцитов культуры средств (Dulbecco в модифицированных Eagle в среднем "DMEM" высокой глюкозы, 10% тепло-инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода, 1% пенициллин / стрептомицин) на 37 градусов по Цельсию и оттепель 5 мл аликут 2,5% трипсин льда. Приготовьте две рассекающие блюда (60 мм в диаметре) на льду, наполненном 6 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) без Ca2 или Mg2 .
- Дезинфицировать все хирургические инструменты (тонкий наконечник пинцета, вскрытие ножницы, Ваннас ножницы прямо, Graefe щипцы с изогнутыми наконечниками) в 70% этанола до и между каждым вскрытием.
- Спрей головы и шеи p2-P4 мыши щенки с 70% этанола, прежде чем быстро эвтаназии их путем обезглавливания хирургическими ножницами. Выполните задний передний разрез средней линии вдоль головы, чтобы разоблачить череп. Аккуратно вырежьте череп от шеи до носа.
- Выполните два дополнительных боковых разреза, превосходящих глаза. Используя тонкие пинцеты кончика нежно переверните заслонки черепа в сторону. Удалите мозг и поместите его в первую рассекающую тарелку, наполненную ледяной HBSS без Ca2 "или Mg2". Держите блюдо на льду и продолжать собирать остальную часть мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните оставшуюся часть процедуры вскрытия под рассекающим объемом. - Удалите обонятельные луковицы с помощью ножниц Vannas или тонкой пинцетом(рисунок 1Ай). С изогнутыми щипцы наконечникна на пересечении поперечных и межгемисферных трещин, осторожно вставьте вторую пару изогнутых щипцы кончик между корой и диэнцефалоном, медленно открывая щипцы, чтобы отделить полушария головного мозга от остальной части мозг(Рисунок 1Айи,Aiii). Удалить нежелательные ткани(Рисунок 1Айв).
- Для каждого коркового полушария, тщательно удалить оленя с тонкой наконечником пинцета. Дополнительно, удалить гиппокампа из кортиков. Перенесите расчлененные кортики мыши во второе блюдо, наполненное ледяным HBSS без Ca2 или Mg2 и держите его на льду, вскрывая оставшиеся мозги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проведение следующих шагов в асептических условиях в ламинарном капоте потока. - Разрежьте расчлененные кортики на мелкие кусочки (примерно 2,4 мм) с помощью стерильных острых хирургических ножниц или скальпеля. Перенесите расчлененные ткани в коническую трубку 50 мл, содержащую ферментный раствор (22,5 мл HBSS без Ca2' или Mg2 ,2,5 мл 2,5% трипсина). Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут с нежной инверсией каждые 10 минут.
- Соберите переваренные ткани центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин и удалите ферментный раствор путем декантации (не используйте вакуумный аспиратор). Добавьте 10 мл астроцитов культуры средств массовой информации и разъединить ткани в одиночные клетки путем pipetting раствор 20'30x с помощью 10 мл серологический пипетка.
- Фильтр клеточной подвески через 70 мкм ячейки ситечко, чтобы свести к минимуму ячейки сгустки и непереваренной ткани. Соберите фильтрат в чистой конической трубке 50 мл и отрегулируйте общий объем до 20 мл с помощью носителей культуры астроцитов. На этом этапе оцените эффективность корковой диссоциации путем смешивания 10 злицовой суспензии клетки с 10 злипан синий и подсчета клеток с гемоцитометром.
ПРИМЕЧАНИЕ: Один препарат из четырех кортиков мыши P2-P4 дает 10-15 х 106 одиночных ячеек. - Аспирировать поли-D-лизиновый покрытие раствор из T75 культуры колбы и мыть дважды стерильной водой. Плита 20 мл клеточной подвески и инкубировать при 37 КС и 5% CO2.
2. Очищение и поддержание культур астроцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все изменения мультимедиа в асептических условиях в ламинарном капоте потока с помощью стерильной фильтровальной мембраны (0,22 мкм) астроцитов, разогретых до 37 градусов по Цельсию.
- Замените клеточный носитель 48 ч после покрытия (день в пробирке 2, DIV2).
- В DIV5, заменить средства массовой информации со свежими астроцитами культуры средств массовой информации дополнены 10 мкм цитозин арабиносид (AraC).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг облегчает удаление загрязняющих клеток, в том числе фибробластов и других глиальных клеток. Важно относиться к культурам с AraC не более 48 ч, как больше времени инкубации позволит снизить жизнеспособность астроцитов. - В DIV7, изменить средства массовой информации астроцитов культуры средств массовой информации без AraC и начать проверять культуры confluency ежедневно. После того, как клетки достигли 80% слияния, пальто два-T75 колбы для каждого неочищенного астроцита культуры колбу с поли-D-лизин и инкубировать при 37 кС, по крайней мере 8 ч до ночи.
- На следующий день, начать очистку астроцитов, встряхивая культуры фляги на 180 об/мин в течение 30 минут в 37 КК орбитального встряхивания инкубатора. Удалите средства массовой информации и заменить его свежими астроцитами культуры средств массовой информации. Встряхните клетки при 240 об/мин в течение 6 ч в орбитальном встряхивании 37 градусов по Цельсию. Prewarm 1x фосфат-буферный солен (PBS), астроцитов культуры средств массовой информации, и 0,25% трипсин-EDTA до 37 градусов по Цельсию 20-30 мин до конца периода встряхивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация CO2не требуется во время встряхивания шагов. При желании средства массовой информации, собранные после 30-мин и 6-х тряски шаги могут быть использованы для культуры микроглии и олигодендроцитов, соответственно. AraC лечения смешанной культуры, однако, уменьшить обилие других глиальных клеток. - Удалите культурную колбы из шейкера и немедленно замените носитель 10 мл теплого 1x PBS на колбу. Удалить PBS и добавить 3 мл 0,25% трипсин-EDTA на колбу. Инкубировать при 37 градусахПо кв. м и 5% CO 2, проверяя каждые 5 мин на отслоение.
- После того, как клетки отделились от колбы, остановить трипсинизации, добавив 10 мл астроцитов культуры средств массовой информации. Передача отдельных астроцитов в коническую трубку 50 мл и клетки гранул центругирование при 300 х г в течение 5 мин. Аспир супернатант и повторно приостановить клетки в 40 мл астроцитов культуры средств массовой информации.
- Вымойте поли-D-лизин покрытием T75 фляги дважды стерильной водой и пластины 20 мл очищенной астроцитной подвески. Вернитесь к инкубатору 37 и 5% CO2. Изменение астроцитов культуры средств массовой информации каждые два дня в течение дополнительных 10 дней, пока астроциты созреют.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая колба T75 очищенных астроцитов должна быть достаточной для производства 2 новых колб T75 с 3 х 105 ячейками каждый на покрытие. - Повторите шаги 2,5–2,7 для последующих проходов или для микроэлементов для микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чистота культур астроцитов после добавления AraC и после очистки может быть оценена качественно с помощью яркой микроскопии поля, или, точнее, путем количественной оценки процента глиально-фибриллярного кислотного белка (GFAP)-положительного клетки на поле зрения в флуоресцентных изображениях(Рисунок 1B, C).
3. Трансфекция флуоресцентно помеченных плазмидов
- За день до трансфекции или маркировки, семена астроцитов при желаемой плотности для визуализации 24-48 h после трансфекции. Рекомендуемая плотность для 24-нуколой или 14 мм стеклянных нижних колодцев составляет 2 х 104 ячейки/хорошо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для трансфекции астроцитов, покрытых 12-мм стеклянными крышками на 24-ну колодцах или 14-мм стеклянных нижних колодцах с использованием метода, основанного на липотеке. Реагенты должны масштабироваться в зависимости от размера блюда культуры, в котором растут астроциты. - Разбавить липотекционный реагент(Таблица материалов) в сывороточных носителях (Таблица материалов). Чтобы оптимизировать соотношение липотекции реагента к ДНК, проверить диапазон адекватных разбавления. Например, при использовании реагента, используемого в этом протоколе(Таблицаматериалов), разбавить 2, 3, 4 и 5 л липофеоционного реагента в 50 qL пониженных сывороточных носителей.
- Разбавить 5 мкг ДНК высокой чистоты в 250 л сокращенных сывороточных носителей. Добавить 5 зл липотекции усилитель усилитель(Таблица материалов). Объедините трубку, содержащую реагент липотекции, с равным объемом смеси усилителя усилителя ДНК-липотекции. Смешайте трубачом и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 15 мин.
- Удалите среду астроцитов и добавьте трансфекционную смесь (шаг 3.3) в клетки. После инкубации 6-h при 37 градусах Поцельсии и 5% CO2замените трансфекционный комплекс соответствующим объемом носителей культуры астроцитов (2 мл для 14 мм стеклянных донных посуды). Инкубировать еще 24-72 ч, прежде чем приступить к приобретению изображения. Внимательно следите за продолжительностью инкубационного шага, чтобы достичь наилучшего баланса между экспрессией белка и жизнеспособностью клеток.
4. Маркировка поздних эндосом/лисосомы с использованием флуоресцентных зондов
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые грузы могут быть помечены с использованием флуоресцентных красителей с высоким сродством к грузовым белкам. Следующий пример позволяет маркировать поздние эндосомы/лисосомы флуоресцентным ацидотропным зондом.
- Разбавить лисосомально-маркировки зонда (Таблица материалов) в 200 Л астроцитов культуры средств массовой информации для рабочей концентрации 1 ММ и применять к астроцитов от шага 3.1 при плотности 2 х 104 клеток / хорошо. Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия.
- Вымойте клетки один раз с теплой астроцитной культуры средств массовой информации и заменить изображения средств массовой информации (Таблица материалов). Приступайке к живой визуализации немедленно.
5. Приобретение изображений с помощью системы визуализации замедленного времени
ПРИМЕЧАНИЕ: Time-lapse живой визуализации должно быть сделано с помощью флуоресценционного микроскопа оснащен высокоскоростной камерой, определенный фокус, инкубационная камера, и 40x цель масла с высокой численной диафрагмы (например, план-апохрома1.4NA). Разнообразие приобретения программного обеспечения доступно для замедленного изображения. Выбор системы микроскопии и программного обеспечения для приобретения должны основываться на их доступности и пригодности для целей конкретного исследования. Ниже приведены некоторые общие руководящие принципы.
- Поместите культурную камеру или блюдо в надлежащий адаптер на сцене микроскопа. Используя свет эпифлюоресценции, выберите клетки (ы), которые выражают флуоресцентные белки или зонд для записи. Отрегулируйте флуоресцентное освещение образца, чтобы визуализировать выбранную ячейку (ы) с помощью цифровой камеры. Избегайте использования высокой освещенности, которая может привести к фотоотбелению и фототоксичности. Отрегулируйте фокус и масштабирование.
- Приобретайте одну серию тайм-лап стека с частотой 1 кадр каждые 2 с для временных интервалов в диапазоне от 300 с до 500 с с с использованием зума и определенных функций фокусировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Динамика торговли людьми (скорость, частота движения и т.д.) будет варьироваться в зависимости от белка, интересующего, таким образом, время приобретения может потребовать корректировки. Например, митохондрии менее метительны, чем лисосомы, и проявляют частые паузы. В этом случае целесообразнее настроить параметры приобретения до 1 кадра каждые 5 с на 800 с. - Экономьте замедленное изображение и экспортируйте их в виде файлов стеков AVI или TIFF.
6. Анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ изображений был проведен с помощью плагина KymoToolBox для ImageJ/Fiji16. Подробные пошаговые письменные инструкции доступны онлайн17. Следующие сокращенные шаги должны быть достаточными для создания kymographs и извлечения параметров транспортировки частиц.
- Откройте последовательность изображений замедленного времени в программном обеспечении ImageJ/Fiji. Импортируйте изображения из меню файлов файлов файлов файлов файлов AVI или TIFF. Преобразуйте изображения в 8-битные или 16-битные, выбрав один из этих типов изображений с помощью инструмента Type из меню изображения. При работе с файлами RGB разделите каналы с помощью инструмента Split Channel, доступного под функцией Color в меню изображения.
- Для создания kymograph (представление в положении и времени траекторий частиц) нарисуйте каждый трек, в котором частицы движутся, отслеживая линию вдоль траекторий частиц с помощью сегментированного инструмента линии. Чтобы правильно назначить направленность движения, нарисуйте полилин, используя одинаковую желаемую направленную конвенцию для всех фильмов, чтобы полярность была последовательной внутри и во всех исследуемых клетках. Например, нарисуйте полилин от центра клетки к периферии или наоборот. Отрегулируйте ширину линии, чтобы соответствовать толщине трека, нажав на инструмент Line.
- Выполнить Draw Kymo макрос плагина KymoToolBox с использованием ширины линии 10. Появится запрос с просьбой откалибровать изображение во времени (количество кадров, частота кадров) и пространство (x,y разрешение). После калибровки, kymographs генерируются и могут быть сохранены как TIFF файлы для представления данных или дальнейшего анализа частиц.
- Назначайте траектории частиц, вручную отслеживая каждую частицу в kymograph с помощью сегментированного инструмента линии в течение всего срока приобретения. Запись каждой траектории частиц как области интереса (ROI) с помощью инструмента менеджера roI, найденного в меню Analyse/Tools. Сохранить все ROIs за каждый промежуток времени видео для дальнейшего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно назначить правильную траекторию для отдельных частиц на kymograph для достижения наиболее точного расчета транспортных параметров.- Выполнить анализ Kymo макрос плагина KymoToolBox. Откроется окно с просьбой определить "внешнее" направление движения частиц (слева направо или наоборот) из выпадающего меню. Этот выбор зависит от положения флуоресцентных грузов, изображенных относительно ядра или периферии клетки, как это установлено в шаге 6.2. Например, если ядро расположено слева от грузов, а полилин в шаге 6.2 оттягивается от ядра, определяем движение наружной частицы как "слева направо".
- Определите предельную скорость (минимальная скорость, с которой груз считается motile) в окне Анализа Kymo. Для грузов, которые движутся со скоростью внутриклеточного транспорта, 0,1 мкм в секунду является подходящим выбором. Измените это значение, чтобы настроить чувствительность программного обеспечения к каждому интересуемому грузу. Отрегулируйте ширину линии, чтобы соответствовать толщине каждой траектории частицы.
- Выберите журнал все данные и экстраполированные параметры координат в окне Analyse kymo. Это позволит рассчитать различные параметры грузового транспорта, включая средней скорости, внутреннюю скорость, внешнюю скорость, кумулятивное пройденное расстояние, пройденное расстояние в направлении внутрь или наружу, количество переключателей для каждой частицы, процент времени двигаясь в каждом направлении или приодя, и т.д. Данные, рассчитанные для отдельных треков, затем объединяются в kymograph и сохраняются в текстовых файлах, характерных для каждого изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Показать Цветные Kymo вариант анализ Ировать Kymo макро генерирует цветной наложения пути над оригинальным kymograph. Частицы, перемещающиеся наружу, окрашены в зеленый цвет, внутрь красным цветом и неподвижными частицами в синий цвет. Координаторы отчета по варианту Original Stack макроса Analyse Kymo создают цветную накладку позиции экстраполированного объекта на исходное видео и kymograph.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол для создания первичной мыши MD астроцитов, изложенных выше должны дать воспроизводимые, высокое качество культур. Хотя культуры первоначально содержат смесь астроцитов, фибробластов и других глиальных клеток, включая микроглии и олигодендроциты(рисунок 1Bi,Biv; красные наконечники стрел), добавление AraC к смешанной культуре между DIV5-DIV7 сводит к минимуму распространение этих загрязняющих клеток. Комбинированная обработка AraC и стратегия очищения на основе тряски обогащает чистоту культур астроцитов(рисунок 1Bii) по сравнению с традиционными протоколами, которые включают только шаги очищения (Рисунок1Bv;синий наконечники стрел)13. Ожидаемая морфология и состав (оценка GFAP и 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) очищенных культур астроцитов, обработанных AraC или оставленных без лечения, показана на рисунке 1Biii, Bvi. Количественная оценка процентной доли клеток GFAPна поле зрения (отношение количества клеток с окрашиванием GFAP к общему числу клеток, выявленных DAPI, показывает увеличение более чем на 27% чистоты с помощью добавок AraC (Рисунок 1 C). Эта высокочистичная культура астроцитов мыши подходит для оценки экспрессии РНК и белка, клеточной морфологии и других функциональных анализов.
Мы использовали трансфекцию на основе липофектации для выражения GFP-тегами версий белка разрыв соединения Cx43 и EAAT1 транспортер в murine астроцитов. Эта методология позволяет переходное выражение белков на уровнях, которые являются оптимальными для визуализации живых клеток, не вызывая токсичности или влияющих на жизнеспособность астроцитов (Рисунок 2A, E). Аналогичным образом, использование флуоресцентного зонда позволило быстрой и эффективной маркировки кислых эндо-лисосомальных органелл(рисунок 2I)для отслеживания их динамики в астроцитах.
На рисунке 2 показаны репрезентативные результаты анализа динамики груза у астроцитов, преходящих трансфицированных с EAAT1-GFP, Cx43-GFP, или помеченных селективным красителем, распознающим кислые эндоссомальные пузырьки. Каждый из этих грузов появился как флуоресцентный пунктум, украшающий перинуклеарную область, цитозол и процессы астроцитов(рисунок 2A,E,I, левые панели). Данные замедленного времени использовались для генерации кимографов, отслеживающие движение груза во времени и пространстве(рисунок 2A,E,I,правые панели). В этих kymographs антероградное и ретроградное движение указанного груза представлено траекториями с отрицательными (зелеными линиями) и положительными (красными линиями) склонами соответственно. Стационарные пузырьки показаны как вертикальные траектории (синие линии). Анализ kymograph показал, что три типа анализируемых грузов подвергаются двунаправленному транспорту с редкими быстрыми, процессивными движениями в обоих направлениях. Кроме того, количественная оценка потока груза через область астроцитов (красная коробка) выявила различия в процентном соотношении частиц подвижного потока между грузами. Например, в то время как 70% EAAT1-GFP пунктуявляются стационарные(рисунок 2B), менее 20% Cx43-GFP (рисунок2F) и 45% эндолисомных грузов с маркировкой зонда (рисунок2J) неподвижны. Эти различия в подвижности среди грузов, вероятно, являются репрезентативными для их нормальной, базовой подвижности в районе астроцитов, где были приобретены фильмы.
Точное отображение изменения положения X-Y по всей временной шкале для каждой частицы, полученной из кимографа, также может быть использовано для оценки других параметров движения, таких как скорость груза(рисунок 2C,G,K)и длина бега (расстояние путешествовал) (Рисунок 2D,H,L). Параметры движения могут быть дополнительно проанализированы для отдельных грузов для определения изменений в направленности движения (антероградное против ретроградного движения), а также разворотов в направлении движения частиц, количества пауз и т.д. Результаты этих типов анализов могут обеспечить значимую количественную информацию об изменениях в клеточном распределении органелл и мембранных белков в астроцитах в базальных или аномальных условиях во внутри- и внеклеточных Среды.
Рисунок 1: Создание первичных культур астроцитов мыши.
(A) Шаги, необходимые для вскрытия мозга мыши P2-P4. (B) (i,iv) Брайтфилд изображения смешанных глиальных культур лечение (i) и без лечения (iv) с AraC. Красные наконечники стрел указывают на загрязняемую микроглию. (ii,v) Изображения очищенных культур астроцитов, обработанных (ii) и необработанных (v ) с помощью AraC. Синие наконечники стрел указывают на загрязняющие олигодендроциты. (iii,vi) Конфокальные изображения очищенных культурастроцитов, обработанных (iii) и необработанных (vi) с помощью AraC. Зеленый цвет показывает окрашивание GFAP, а DAPI (синий) маркирует все ядра. (C) Процент GFAP-положительных клеток. Данные представляют собой среднее индекс SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Количественный анализ динамики груза в астроцитах.
(A,E,I) Левые панели: Астроциты, выражающие EAAT1-GFP (A), Cx43-GFP(E) или обработанные зондом, который маркирует поздние эндосомы и лисосомы (I). Красные ящики указывают области, используемые для анализа динамики частиц. Правые панели: оригинальные и цветные kymographs, показывающие траектории для указанных грузов. Красные линии представляют собой ретроградно-движущиеся грузы, зеленые линии антероград-движущихся грузов и синие линии, неподвижные грузы. (B,F,J) Процент стационарных и подвижных частиц. (C,G,K) Количественная оценка антероградной и ретроградной скорости и(D,H,L) длина выполнения. Данные представляют собой среднее количество SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем экспериментальный подход к выражению, визуализации и отслеживанию флуоресцентно помеченных органелл и мембранных белков, представляющих интерес, используя видеомикроскопию замедленного времени в высокой чистоте первичных корковых астроцитов MD мыши. Мы также излагаем методологию измерения динамики частиц. Прямая визуализация белковой и органеллной динамики в первичных астроцитах обеспечивает мощный инструмент для изучения регуляции внутриклеточного переноса в этих клетках в пробирке.
Методология создания мыши MD культур астроцитов, описанных выше, сочетает в себе шаги от других опубликованных протоколов13,14,15, что приводит как к более простому методу и в более высокой чистоте и качестве Культур. Сочетание лечения AraC15 и встряхивания на основе очистки13,14 может дать астроцитов культур с чистотой выше, чем 98% (оценивается по соотношению GFAPи клеток общей клетки), что в нашем примере приводит к 27% увеличение чистоты над культурами, подвергаемыми только шагам очищения(рисунок 1B, C). Высокая чистота культур мыши астроцитов, полученных с помощью этого метода похож на значения сообщили для крыс астроцитов культур (оценивается ферментативных анализов и электронной микроскопии) Маккарти и deVellis14. Тем не менее, метод Маккарти /deVellis, который не включает лечение AraC, требует более длительного шага встряхивания (15–18 ч) и двух дополнительных раундов очистки14.
В нашем примере мы показываем, что этот протокол достаточно чувствителен, чтобы фиксировать различия в подвижности между различными мембранными белками и органеллами в астроцитах, которые, вероятно, отражают их индивидуальные внутриклеточные маршруты и клеточные Функции. Хотя наш пример демонстрирует полезность этого протокола в базальных условиях, эта методология может быть легко адаптирована для измерения транспортных параметров в широком диапазоне вопросов исследования. Например, аналогичные протоколы с незначительными изменениями могут быть использованы для характеристики транспортных событий в астроцитах in vitro в ответ на внутриклеточные или внеклеточные среды, такие как повреждение клеток, токсичность, патогенные мутации, синаптическая активность (в смешанных культур нейронов и астроцитов) и т.д. Аналогичным образом, совместное выражение и визуализация нескольких грузов или органелл, каждый из которых индивидуально помечены различными флюорофорами, также может быть использован для оценки динамических изменений в совместной локализации и сложного образования, переходных взаимодействий между органеллами , и эндоцитарной и мембранной переработки транспортных событий.
Успех представленной здесь методологии в первую очередь зависит от способности получить высококачественные культуры астроцитов и на эффективную маркировку грузов (ы) интереса. При использовании этой процедуры для живой визуализации, важно внимательно следить за флуоресцентным выражением, чтобы определить оптимальное время инкубации после трансфекции. В среднем, мы обнаружили, что для грузов проанализированы 24-h инкубационный период приводит к хорошей интенсивности сигнала для живого приобретения изображений. Длительная инкубация трансинфицированных астроцитов может привести к высокой экспрессии флуоресцентно отмеченных белков, которые могут вызвать агрегацию белка, тем самым изменяя локализацию и динамику груза и ухудшая здоровье культур. Астроциты очень уязвимы к физическому повреждению и изменениям в культурной среде, что может привести к индукции транскрипционных и клеточных реакций, включая реактивность. Поэтому крайне важно сократить временные интервалы между шагами мытья и свести к минимуму воздействие культур на воздух и значительные изменения температуры или интенсивности света в периоды инкубации и приобретения.
Таким образом, методы, представленные здесь, могут быть использованы для оценки и количественной оценки динамических изменений в локализации белка и органелл в астроцитах. Они предоставляют ценные инструменты, позволяющие изучить изменения астроцитарных реакций в физиологических и патологических условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
DNL была поддержана Университетом Северной Каролины в Чапел-Хилл (UNC) Школа медицины в качестве стипендиата Симмонса. TWR была поддержана КООН PREP Грант R25 GM089569. Работа с использованием КООН Центр нейронауки Центр Микроскоп Микроскоп Основные фонд был поддержан, в частности, за счет финансирования со стороны NIH-NINDS Неврология центр поддержки Грант P30 NS045892 и NIH-NICHD интеллектуальных и развития инвалидов научно-исследовательский центр Поддержка Грант U54 HD079124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
| Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
| Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
| Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
| Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
| Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
| Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
| Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
| Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
| Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).
- Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).
- Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).
- Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).
- Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).
- Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61 (6), 917-928 (2013).
- Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60 (4), 594-604 (2012).
- Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).
- Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).
- Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152 (3), 479-491 (2013).
- Cordelières, F. P. IJ KymoToolBox. , Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016).
