Visualisera och analysera intracellulär transport av organeller och andra laster i astrocyter

Summary

Här beskriver vi en in vitro Live-Imaging metod för att visualisera intracellulär transport av organeller och handel med plasmamembran proteiner i murina astrocyter. Detta protokoll innehåller också en bildanalys metod för att bestämma transport resvägar och kinetik.

Abstract

Astrocyter är bland de vanligast förekommande celltyperna i den vuxna hjärnan, där de spelar nyckelroller i en mångfald av funktioner. Som en central aktör i hjärnan homeostas, astrocyter leverera nervceller med vitala metaboliter och buffert extracellulära vatten, joner, och glutamat. En integrerad del av "Tri-parts" synapsen, astrocyter är också kritiska i bildandet, beskärning, underhåll, och modulering av synapser. För att möjliggöra dessa mycket interaktiva funktioner, astrocyter kommunicera sinsemellan och med andra gliaceller celler, nervceller, hjärnan vasculature, och den extracellulära miljön genom en mängd specialiserade membranproteiner som innehåller cell adhesionsmolekyler, aquaporiner, jonkanaler, signalsubstans transportörer och gap Junction molekyler. För att stödja denna dynamiska Flux, astrocyter, som nervceller, förlita sig på tätt samordnade och effektiva intracellulära transport. Till skillnad från neuroner, där intracellulär människohandel har omfattande avgränsas, har mikrotubule-baserade transporter i astrocyter varit mindre studerade. Icke desto mindre iscengör EXO-och endocytisk handel med cellmembran proteiner och intracellulär organell transport astrocyter normala biologi, och dessa processer är ofta drabbade av sjukdom eller som svar på skada. Här presenterar vi ett enkelt protokoll för att odla hög kvalitet murina astrocyter, att överföras etikett astrocytic proteiner och organeller av intresse, och att spela in sina intracellulära transportdynamik med hjälp av tidsförlopp konfokal mikroskopi. Vi visar också hur man extraherar och kvantifiera relevanta transportparametrar från de förvärvade filmerna med hjälp av tillgängliga bildanalysprogram (dvs ImageJ/FIJI) plugins.

Introduction

Astrocyter är de vanligast förekommande cellerna i den vuxna centralanervsystemet, där de utför unika utvecklings-och homeostatiska funktioner¹. Astrocyter modulera synaptisk utveckling genom direkt kontakt med pre-och postsynaptiska terminaler som en del av Tri-partssynapsen, som innehåller signalsubstansen receptorer, transportörer, och cell adhesionsmolekyler som underlättar synapsen bildas och neuron-astrocyte kommunikation². Dessutom, astrocyter aktivt kontroll synaptisk transmission och förhindra neuronala excitotoxicitet genom att snabbt ta bort excitatoriska neurotransmittorer från den synaptiska spalten, återvinning neurotransmittorer, och deltar i Synaptic beskärning^{3 , 4 , ,5 , 6}. för att möjliggöra dessa mycket interaktiva funktioner, astrocyter kommunicera sinsemellan, med andra gliaceller celler, och med nervceller genom specialiserade membranproteiner, inklusive cell adhesionsmolekyler, aquaporins, jonkanaler, signalsubstansen transportörer och gap Junction molekyler. Astrocyter förändrar aktivt ytnivåerna av dessa proteiner som svar på fluktuationer i deras intraoch extracellulära miljö⁷. Dessutom, förändringar i nivåer och distribution av mitokonsamerna, lipiddroppar, och nedbrytande och återvinning organeller modulera energiförsörjning, metabolit tillgänglighet, och cellulära Clearing processer som är viktiga för astrocytmodell funktion och Överlevnad.

De dynamiska förändringarna i membranprotein och organell handel och positionering i astrocyter underlättas av den samordnade funktionen av motorproteiner och adaptrar som främjar Last motilitet^8,9. På liknande sätt är ytskikt av membranproteiner modulerade genom internalisering och återvinningshändelser¹⁰. Dessa laster transporteras via ett intrikat nätverk av Actin, microtubules, och möjligen mellanliggande glödtrådar spår⁸. Studier baserade på immunofluorescens färgning av slutbindande protein 1 (EB1), som ackumuleras vid den växande mikrotubuli plus ändar, tyder på att i astrocyter buntar av mikrotubuli utstrålar ut från perinucleus och förlänga deras plus änden mot peripheryen¹¹. Emellertid, en omfattande undersökning av organisationen och polaritet av mikrotubuli och andra cytoskeletala element med hjälp av levande cell avbildning saknas fortfarande. Medan många av de mekanismer som ligger bakom dynamiken i organeller och membranproteiner har studerats i stor utsträckning i nervceller och andra celltyper, är Last motilitet i astrocyter mindre väl förstådd. De flesta av våra nuvarande kunskaper om förändringar i protein och organell distribution i astrocyter är baserad på traditionell antikroppsbaserad märkning av fasta preparat, vilket utesluter noggrann rumslig och tidsmässig undersökning av lastdynamik^{7, 12}.

Här beskriver vi en metod för att märka membranproteiner och organeller för levande avbildning i hög renhet primära mus astrocytkulturer. Med hjälp av detta protokoll ger vi exempel där vi spårar den dynamiska lokaliseringen av grönt fluorescerande protein (GFP)-märkta membranproteiner i transfekterade astrocyter, inklusive gap Junction protein Connexin 43 (Cx43-GFP) och den excitatoriska aminosyran transportör 1 (EAAT1-GFP). Vi beskriver också användningen av en fluorescerande sur-tropisk sond för att visualisera sura organeller och följa deras människohandel dynamik i levande astrocyter. Slutligen visar vi hur man analyserar tids fördröjnings data för att extrahera och utvärdera transportparametrar för enskilda laster.

Protocol

Alla djurförsök utfördes med godkännande av University of North Carolina på Chapel Hill Animal Care och use Committee (IACUC).

1. hjärn dissektion och kultur av primära mus astrocyter

Anmärkning: följande protokoll anpassades från publicerade metoder, som följer den ursprungliga proceduren som utvecklats av McCarthy och devellis^13,14,15. Blandade cellkulturer av McCarthy/deVellis (MD) astrocyter är beredda från postnatal dag 2 − 4 (P2 − P4) mus cortices, behandlas med en anti-mitotisk faktor, och renas för att ge den slutliga berikade astrocytkulturen. Fyra cortices från mus valpar av endera könsbestämmer är tillräckliga för att frambringa en T75 silkesodling kol kultur.

1. Coat botten av T75 kolvar (100% vinklad hals tillgång, 0,22 μm hydrofob ventilerade filterlocket) med Poly-D-lysin (1 mg/mL i 0,1 M Tris buffert, pH 8,5) och inkubera vid 37 ° c för 24 h före start av dissektion.
2. Innan du påbörjar dissektion förfarande, varm 30 mL astrocyt kultur media (Dulbecco modifierade Eagle ' s medium [DMEM] hög glukos, 10% Värmeinaktiverade foster bovint serum, 1% penicillin/streptomycin) vid 37 ° c och Tina en 5 mL alikvot på 2,5% trypsin på is. Förbered två dissekera rätter (60 mm diameter) på is fylld med 6 mL av Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS) utan ca^{2 +} eller mg^{2 +}.
3. Desinficera alla kirurgiska verktyg (fin spets pincett, dissekera sax, Vannas sax raka, Graefe tång med böjda spetsar) i 70% etanol före och mellan varje dissektion.
4. Spraya huvudet och halsen på P2 − P4-musens pups med 70% etanol innan du snabbt euthanizing dem genom halshuggning med kirurgisk sax. Utför en posterior till främre mittlinjen snitt längs hårbotten för att exponera skallen. Försiktigt skära skallen från halsen till näsan.
5. Utför ytterligare två laterala snitt överlägsen ögonen. Använda Fine Tip pincett försiktigt knäppa skalle klaffar åt sidan. Ta bort hjärnan och placera den i den första dissekera skålen fylld med iskall HBSS utan ca^{2 +} eller mg^{2 +}. Håll skålen på isen och fortsätta skörda resten av hjärnor.
   ANMÄRKNINGAR: utför resten av dissekera proceduren under en dissekera omfång.
6. Ta bort lukt lökar med Vannas sax eller fin pincett (figur 1AI). Med böjda spetsen tång i skärningspunkten mellan den tvärgående och interhemisfäriska sprickor, försiktigt in ett andra par böjda spetsen tång mellan cortex och diencephalon, långsamt öppna Tånga för att separera hjärnhalvorna från resten av hjärnan (figur 1AII, AIII). Ta bort oönskad vävnad (figur 1AIV).
7. För varje kortikal halvklotet, försiktigt bort hjärnhinnorna med fin spets pincett. Alternativt, ta bort Hippocampus från cortices. Överför dissekerade musen cortices till en andra skålen fylld med iskalla HBSS utan ca^{2 +} eller mg^{2 +} och hålla den på isen medan dissekera de återstående hjärnor.
   Anmärkning: utför nästa steg under aseptiska förhållanden i ett laminärt flödes skydd.
8. Skär dissekerade cortices i små bitar (ca 2 − 4 mm) med hjälp av steril skarp kirurgisk sax eller en skalpell. Överför den dissekerade vävnaden till ett 50 mL koniskt rör som innehåller enzymlösning (22,5 mL HBSS utan ca^{2 +} eller mg^{2 +}, 2,5 ml 2,5% trypsin). Inkubera vid 37 ° c i 30 min med mild inversion var 10 min.
9. Samla upp den smälta vävnaden genom centrifugering vid 300 x g i 5 min och ta bort enzym lösningen genom dekantering (Använd inte en vakuum aspirator). Tillsätt 10 ml astrocytkulturmedia och separera vävnaden i enskilda celler genom att Pipettera lösningen 20 − 30x med en 10 ml serologiska pipett.
10. Filtrera cellsuspensionen genom en 70 μm cell sil för att minimera cell klumpar och osmält vävnad. Samla upp filtratet i ett rent 50 mL koniskt rör och justera den totala volymen till 20 mL med astrocytkulturmedia. Vid denna punkt, utvärdera effektiviteten i kortikala dissociation genom att blanda 10 μL av cellsuspensionen med 10 μL av trypan blå och räkna celler med en hemocytometer.
    Anmärkning: en beredning från fyra P2 − P4 mus cortices ger 10 − 15 x 10⁶ enskilda celler.
11. Aspirera Poly-D-lysin beläggning lösning från T75 kulturen kolvar och tvätta två gånger med sterilt vatten. Platta den 20 mL cellsuspensionen och inkubera vid 37 ° c och 5% CO₂.

2. rening och underhåll av astrocytkulturer

Anmärkning: utför alla medie byten under aseptiska förhållanden i en laminärt flödeshuv med hjälp av sterilt filtrerat (0,22 μm filtermembran) astrocytmedia värmts till 37 ° c.

1. Byt ut cellmedia 48 h efter plätering (dag in vitro 2, DIV2).
2. Vid DIV5, ersätta media med färska astrocyt kultur Media kompletteras med 10 μM cytosin arabinoside (AraC).
   Anmärkning: detta steg underlättar avlägsnande av främmande celler, inklusive fibroblaster och andra gliaceller. Det är viktigt att behandla kulturer med AraC inte längre än 48 h som längre inkubationstider kommer att minska astrocyt lönsamhet.
3. Vid DIV7, ändra media till astrocytmodell kultur media utan AraC och börja kontrollera kulturen confluency dagligen. När cellerna har uppnått 80% Confluence, Coat två-T75 flaskor för varje orenad astrocyt kultur kolv med Poly-D-lysin och inkubera vid 37 ° c för minst 8 h till natten.
4. Följande dag, börja astrocytrening genom att skaka kulturen kolvar vid 180 RPM för 30 min i en 37 ° c orbital skaka inkubator. Ta bort media och ersätta den med färska astrocytmodell kultur media. Skaka celler vid 240 RPM för 6 h i en 37 ° c orbital skaka inkubator. Förvärvarm 1x fosfat-buffrad saltlösning (PBS), astrocytkulturmedia, och 0,25% trypsin-EDTA till 37 ° c 20 − 30 min före slutet av skaknings perioden.
   Obs: Co₂-inkubering krävs inte under skaknings stegen. Om så önskas, de medier som samlats in efter 30 min och 6-h skakar steg kan användas för att odla mikroglia och oligodendrocyter, respektive. AraC behandling av blandad kultur kommer dock att minska överflödet av de andra gliaceller.
5. Ta bort odlings kolvarna från skakapparaten och Byt omedelbart ut mediet med 10 mL varm 1x PBS per kolv. Ta bort PBS och tillsätt 3 mL 0,25% trypsin-EDTA per kolv. Inkubera vid 37 ° c och 5% CO₂, kontrollera var 5 min för avlossning.
6. När cellerna har lossnat från kolven, stoppa trypsinization genom att lägga till 10 mL av astrocyt kultur media. Överför lossna astrocyter till en 50 mL koniskt rör och pellets celler genom centrifugering på 300 x g för 5 min. Aspirera supernatanten och åter suspendera cellerna i 40 ml av astrocytkulturmedia.
7. Tvätta Poly-D-Lysine-belagda T75 kolvar två gånger med sterilt vatten och tallrik 20 mL av den renade astrocytsus pensionen. Återgå till 37 ° c och 5% CO₂ inkubator. Ändra astrocytmodell kultur Media varannan dag i ytterligare 10 dagar tills astrocyter mogna.
   Anmärkning: varje T75 kolv av renade astrocyter bör vara tillräckligt för att producera 2 nya T75 flaskor med 3 x 10⁵ celler vardera vid plätering.
8. Upprepa steg 2.5 − 2.7 för efterföljande passeringar eller för att platta astrocyter för mikroskopi.
   Anmärkning: den renhet av astrocytkulturerna efter tillsats av AraC och efter rening kan bedömas kvalitativt genom brightfield mikroskopi, eller mer exakt genom att kvantifiera andelen gliaceller fibrillsyra protein (GFAP)-positiva celler per synfält i fluorescerande bilder (figur 1B, C).

3. transfektion av Fluorescent taggade plasmider

1. Dagen före transfektion eller märkning, utsäde astrocyter på önskad densitet för avbildning 24 − 48 h post-transfektion. En rekommenderad densitet för 24-borrplattor eller 14 mm glasbotten brunnar är 2 x 10⁴ celler/brunn.
   Anmärkning: detta protokoll är optimerat för transfektion av astrocyter pläterade på 12 mm glas täckplåtar på 24-brunnar plattor eller 14 mm glasbotten brunnarna med hjälp av en lipofektion-baserad metod. Reagenser bör skalas beroende på storleken på den kultur maträtt där astrocyterna växer.
2. Späd lipofektionsreagens (tabell över material) i reducerade serum medier (tabell över material). För att optimera förhållandet mellan lipofektionsreagens och DNA, testa en rad lämpliga spädningar. Om du till exempel använder den reagens som används i detta protokoll (tabell över material), späd 2, 3, 4 och 5 μl av lipofektionsreagenset i 50 μl reducerat serum medium.
3. Späd ut 5 μg hög renhet DNA i 250 μL av reducerat serum medium. Tillsätt 5 μL lipofektionshöjande reagens (tabell över material). Kombinera röret som innehåller lipofection reagens med en lika volym av DNA-lipofection Enhancer mix. Blanda genom att Pipettera och inkubera i rumstemperatur (RT) i 15 min.
4. Ta bort astrocyt kultur media och tillsätt transfektion mix (steg 3,3) till celler dropwise. Efter en 6-h inkubering vid 37 ° c och 5% CO₂, Ersätt transfection Complex med en lämplig volym av astrocytodlings medier (2 ml för 14 mm glasbotten rätter). Inkubera i ytterligare 24 − 72 timmar innan du fortsätter till bild förvärvet. Noga övervaka varaktigheten av inkubations steget för att uppnå den bästa balansen mellan proteinuttryck och cellernas lönsamhet.

4. märkning av sena endosomes/lysosomer med fluorescerande sonder

Obs: vissa laster kan märkas med hjälp av fluorescerande färgämnen med hög affinitet för lastspecifika proteiner. Följande exempel medger märkning av sena endosomer/lysosomer med en fluorescerande, sur-tropisk sond.

1. Späd den lysosomala-märkning sond (tabell över material) i 200 μl av astrocyt kultur media till en arbets koncentration av 1 μm och tillämpas på astrocyter från steg 3,1 vid en densitet av 2 x 10⁴ celler/brunn. Inkubera i 30 min vid 37 ° c.
2. Tvätta cellerna en gång med varma astrocytkulturmedia och Ersätt med Imaging media (tabell över material). Fortsätt direkt till Live Imaging.

5. bild anskaffning med hjälp av ett bildsystem med tidsfördröjning

Obs: Time-lapse Live Imaging bör göras med ett fluorescensmikroskop utrustat med en höghastighetskamera, bestämd fokusering, inkubations kammare och ett 40x-oljeobjektiv med hög numerisk bländare (t. ex. plan-Apochromat 1.4 NA). En mängd olika förvärv programvara finns tillgänglig för Time-lapse Imaging. Urvalet av mikroskopi systemet och förvärvs programvara bör baseras på deras tillgänglighet och lämplighet för målen för den specifika studien. Nedan finns några allmänna riktlinjer.

1. Placera kultur kammaren eller skålen i rätt adapter på Mikroskop stadiet. Använd epifluorescensljus och välj den eller de celler som uttrycker fluorescerande proteiner eller sond som ska registreras. Justera den fluorescerande prov belysningen för att visualisera den valda cellen (erna) med hjälp av digitalkameran. Undvik att använda hög belysning som kan orsaka foto blekning och fototoxicitet. Justera fokus och zooma.
2. Förvärva enstaka Z-stack Time-lapse serie med en frekvens av 1 bildruta varje 2 s för tidsintervall mellan 300 s och 500 s med zoom och bestämda fokus funktioner.
   Notera: trafficking dynamik (hastighet, frekvens av rörelse, etc.) kommer att variera beroende på protein av intresse, således kan tiden för förvärvet kräva justering. Till exempel, mitokona är mindre rörliga än lysosomer och uppvisar täta pauser. I detta fall är det lämpligare att justera förvärvs parametrarna till 1 bildruta var 5: or för 800 s.
3. Spara tids fördröjnings bilder och exportera dem som AVI-eller TIFF-stackfiler.

6. bildanalys

Obs: bildanalys utfördes med hjälp av KymoToolBox plugin för ImageJ/Fiji¹⁶. Detaljerade steg-för-steg skriftliga instruktioner finns online¹⁷. Följande förkortade steg bör räcka för att skapa kymographs och extrahera partikel transport parametrarna.

1. Öppna Time-lapse bildsekvens i ImageJ/Fiji programvara. Importera bilder från Arkiv -menyn som AVI-eller TIFF-stackfiler. Konvertera bilderna till 8-bitars eller 16-bitars genom att välja en av dessa bildtyper med hjälp av text verktyget på bild -menyn. Om du arbetar med RGB-filer kan du dela kanaler med hjälp av verktyget dela kanal som finns under färg funktionen på bild -menyn.
2. För att generera en kymograph (representation i position och tid av partikel banor), Rita varje spår där partiklar rör sig genom att spåra en linje längs banor av partiklarna med hjälp av segmenterade linje verktyget. För att korrekt tilldela riktningen av rörelsen, rita polylinjen med samma önskade riktnings konvention för alla filmer så att polariteten är konsekvent inom och över alla celler som studeras. Till exempel rita polylinje från mitten av cellen mot periferin eller vice versa. Justera linjebredden så att den matchar spår tjockleken genom att dubbelklicka på linje verktyget.
3. Kör den Rita KYMO makro av KymoToolBox plugin med en linjebredd på 10. En uppmaning om att kalibrera bilden i tid (antal bildrutor, bildrutehastighet) och mellanslag (x, y-upplösning) visas. När kalibrerad, kymographs genereras och kan sparas som TIFF-filer för datapresentation eller ytterligare Partikelanalys.
4. Tilldela partikel banor genom att manuellt spåra varje partikel i kymograph med hjälp av det segmenterade linje verktyget under anskaffningens hela varaktighet. Registrera varje partikel bana som en intresse region (ROI) med hjälp av ROI Manager -verktyget som finns i menyn analysera/verktyg . Spara alla ROIs per Time-lapse video för vidare analys.
   Anmärkning: det är viktigt att tilldela rätt bana för enskilda partiklar på kymograph för att uppnå den mest exakta beräkningen av transportparametrar.
   1. Kör makrot analysera KYMO på KymoToolBox-insticksprogrammet. Ett fönster öppnas som ber att definiera "utåt" riktning partikelrörelse (från vänster till höger eller tvärtom) från rullgardinsmenyn. Detta val beror på positionen för den fluorescerande Cargos avbildad i förhållande till kärnan eller cell periferin, som fastställs i steg 6,2. Till exempel, om kärnan är placerad till vänster om Cargos, och polylinje i steg 6,2 drogs bort från kärnan, definiera utåt partikelrörelse som "från vänster till höger".
   2. Definiera den Gränshastighet (minsta hastighet vid vilken lasten anses vara motila) i fönstret analysera KYMO . För laster som rör sig vid snabba intracellulära transporthastigheter är 0,1 μm/sekund ett lämpligt val. Ändra det här värdet om du vill justera programvarans känslighet för varje last av intresse. Justera linjebredden så att den matchar tjockleken på varje partikel bana.
   3. Markera alternativen Logga alla data och Logga extrapolerade koordinater i fönstret analysera KYMO . Detta kommer att beräkna olika Last transportparametrar, inklusive medelhastighet, inåtgående hastighet, utåtgående hastighet, kumulativ tillryggalagd sträcka, tillryggalagt avstånd i antingen inåt eller utåt riktning, antal brytare för varje partikel, procentuell andel av tiden flytta i varje riktning eller paus, etc. Data som beräknas för enskilda spår slås sedan per kymograph och sparas i textfiler som är specifika för varje bild.
      ANMÄRKNINGAR: den Visa färgade KYMO alternativet analysera KYMO makro genererar en färgkodad överlägg av banan över den ursprungliga kymograph. Partiklar som färdas utåt är färgade i grönt, inåt i rött och stillastående partiklar i blått. Alternativet rapportera koordinater för ursprunglig stapel i makrot analysera KYMO genererar en färgkodad överlagring av det extrapolerade objektets position på den ursprungliga tids fördröjnings videon och kymograph.

Representative Results

Protokollet för fastställande av primär mus MD astrocyter som beskrivs ovan bör ge reproducerbara, hög kvalitet kulturer. Även om kulturer inledningsvis innehåller en blandning av astrocyter, fibroblaster och andra gliaceller, inklusive mikroglia och oligodendrocyter (figur 1bi, BIV; röda pilspetsar), tillägg av Arac till blandad kultur mellan DIV5-DIV7 minimerar spridningen av dessa kontaminantceller. Den kombinerade AraC-behandlingen och skakbaserad renings strategi berikar renheten hos astrocytkulturerna (figur 1BII) över traditionella protokoll som endast omfattar reningsstegen (figur 1BV; blå pilspetsar)¹³. Den förväntade morfologin och sammansättningen (bedömt av GFAP och 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] färgning) av de renade astrocytkulturerna som behandlats med AraC eller lämnas obehandlade visas i figur 1BIII, BVI. Kvantifiering av den procentuella andelen GFAP⁺ -celler per synfält (förhållandet mellan antal celler med gfap-färgning till det totala antalet celler som identifierats av DAPI-färgning) visar en ökning med mer än 27% i renhet med Arac-tillskott (figur 1 C). denna hög renhet mus astrocytmodell kultur är lämplig för utvärdering av RNA och proteinuttryck, cellmorfologi, och andra funktionella analyser.

Vi använde lipofection-baserade transfection att uttrycka GFP-märkta versioner av gap Junction protein Cx43 och EAAT1 transportör i murina astrocyter. Denna metod möjliggör övergående uttryck av proteiner på nivåer som är optimala för levande cell avbildning utan att orsaka toxicitet eller som påverkar astrocytlivsdugligheten (figur 2A, E). På samma sätt får användningen av en fluorescerande sond snabb och effektiv märkning av sura endo-lysosomala organeller (figur 2I) för att spåra deras dynamik i astrocyter.

Figur 2 visar representativa resultat av analyserna av lastdynamik i astrocyter transitivt transfekterade med EAAT1-GFP, Cx43-GFP, eller märkt med en selektiv färg som erkänner sura endolysosomal blåsor. Var och en av dessa Cargos dök upp som en fluorescerande punktM dekorera perinukleära regionen, Cytosol och processer av astrocyter (figur 2a, E, I, vänster paneler). Tids fördröjnings data användes för att generera kymographs som spårar Last rörelser i tid och rum (figur 2a, E, i, högra paneler). I dessa kymographs, anterograd och retrograd rörelse av den angivna lasten representeras av banor med negativa (gröna linjer) och positiva (röda linjer) sluttningar, respektive. Stationära vesikler visas som vertikala banor (blå linjer). Kymograph analys avslöjade att de tre typer av Last analyseras genomgå dubbelriktad transport med enstaka snabba, processiva körningar i båda riktningarna. Dessutom visade kvantifiering av flödet av en last genom ett område av astrocyt (röd ruta) skillnader i procentandelen rörliga partiklar bland Cargos. Till exempel, medan 70% av EAAT1-GFP Auktor är stillastående (figur 2B), mindre än 20% av Cx43-GFP (figur 2F) och 45% av sond-märkt endolysosomal Cargos (figur 2J) är icke-motila. Dessa skillnader i motilitet bland Cargos är sannolikt representativa för deras normala, baslinje motilitet i regionen av astrocyt där filmerna förvärvades.

Den exakta mappningen av förändringen i X-Y position längs hela tidsskalan för varje partikel som erhålls från kymograph kan också användas för att utvärdera andra rörelse parametrar, såsom Last hastighet (figur 2C, G, K) och kör längd (avstånd (figur 2D, H, L). Rörelse parametrar kan analyseras ytterligare för enskilda laster för att bestämma förändringar i riktning rörelse (Anterograde vs retrograd rörelse) samt återföringar i partikeln rörelseriktning, antal pauser, etc. Resultaten från dessa typer av analyser kan ge meningsfull kvantitativ information om förändringar i den cellulära distributionen av organeller och membranproteiner i astrocyter under basala eller onormala förhållanden i intraoch extracellulära Miljö.

Figur 1: inrättande av primära mus astrocytkulturer.
(A) steg som krävs för dissektion av P2 − P4 mus hjärnor. Bi, IV) brightfield-bilder av blandade glialkulturer behandladeioch ej behandlade (IV) med Arac. Röda pilspetsar indikerar förorenande mikroglia. (II, v) Bilder av renade astrocytkulturer behandlade (II) och ej behandlade (v) med Arac. Blå pilspetsar indikerar förorenande oligodendrocyter. (III, vi) Konfokala bilder av renade astrocytkulturer behandlade (III) och ej behandlade (vi) med Arac. Grön visar GFAP färgning och DAPI (blå) Etiketter alla kärnor. C) procentandel av gfap-positiva celler. Data representerar medelvärdet ± SEM. * * * p < 0,001, ej ihopparad t-test. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: kvantitativa analyser av lastdynamik i astrocyter.
(a, E, I) Vänster paneler: astrocyter uttrycker EAAT1-GFP (a), Cx43-GFP (E) eller behandlas med en sond som etiketter sena hos och lysosomer (I). Röda rutor anger vilka regioner som används för att analysera partikel dynamiken. Högra paneler: original och färgkodade kymografer som visar banor för de angivna Cargos. Röda linjer representerar Retrograde-Moving Cargos, gröna linjer Anterograde-Moving Cargos, och blå linjer icke-motila Cargos. (B, F, J) Procent av stillastående och rörliga partiklar. (C, G, K) Kvantifiering av anterograd och retrograd hastighet och (D, H, L) kör längd. Data representerar medelvärdet ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här beskriver vi en experimentell metod för att uttrycka, visualisera och spåra Fluorescent taggade organeller och membranproteiner av intresse med hjälp av Time-lapse video mikroskopi i hög renhet primära mus kortikala MD astrocyter. Vi beskriver också en metod för att mäta partikel dynamiken. Direkt visualisering av protein och organell dynamik i primära astrocyter ger ett kraftfullt verktyg för att studera regleringen av intracellulär transport i dessa celler in vitro-.

Metoden för att upprätta mus MD astrocytkulturer som beskrivs ovan kombinerar steg från andra publicerade protokoll^13,14,15, vilket resulterar i både en enklare metod och i högre renhet och kvalitet Kulturer. Kombinationen av Arac¹⁵ behandling och skakbaserad rening^13,14 kan ge astrocytkulturer med en renhet så hög som 98% (bedömt av förhållandet mellan gfap⁺ celler totala celler), som i vårt exempel resulterar i en 27% ökning av renhet över kulturer som utsätts för reningssteg endast (figur 1B, C). Den höga renhet kulturer mus astrocyter erhållits med denna metod liknar de värden som rapporteras för råtta astrocytkulturer (bedömas genom enzymatiska analyser och elektronmikroskopi) av McCarthy och deVellis¹⁴. McCarthys/deVellis-metoden, som inte inbegriper AraC-behandling, kräver dock ett längre skaknings steg (15 − 18 h) och ytterligare två omgångar av rening¹⁴.

I vårt exempel visar vi att detta protokoll är tillräckligt känsligt för att fånga skillnader i motilitet mellan olika membranproteiner och organeller i astrocyter, som sannolikt är representativa för deras individuella intracellulära resvägar och cellulära Funktion. Även om vårt exempel visar nyttan av detta protokoll på grundläggande villkor, kan denna metod enkelt anpassas för att mäta transportparametrar inom ett brett spektrum av forskningsfrågor. Till exempel kan liknande protokoll med smärre ändringar användas för att karakterisera transport händelser i astrocyter in vitro som svar på intraeller extracellulär miljö, såsom cellulära skador, toxicitet, patogena mutationer, synaptisk aktivitet (i blandade kulturer av nervceller och astrocyter), etc. Likaså, Co-uttryck och visualisering av flera Cargos eller organeller, varje individuellt märkta med olika fluoroforer, kan också användas för att bedöma dynamiska förändringar i Co-lokalisering och komplex formation, övergående interaktioner mellan organeller , rutt och membran återvinnings transport händelser.

Framgången för den metodik som presenteras här främst förlitar sig på förmågan att få högkvalitativa astrocytkulturer och i effektiv märkning av Last (s) av intresse. Vid användning av denna procedur för Live Imaging, är det viktigt att noga övervaka fluorescerande uttryck för att avgöra den optimala efter transfektion inkubationstid. I genomsnitt fann vi att för Cargos analyseras en 24-h inkubationstid resulterar i god signalintensitet för Live Imaging förvärv. Långvarig inkubation av transfekterade astrocyter kan resultera i högt uttryck av fluorescerande märkta proteiner, som kan inducera protein aggregering, vilket förändrar Last lokalisering och dynamik, och minskar hälsan hos kulturerna. Astrocyter är mycket sårbara för fysiska skador och förändringar i kulturmiljön, vilket kan leda till induktion av transkriptionella och cellulära svar, inklusive reaktivitet. Därför är det viktigt att minska tidsintervall mellan tvättsteg, och att minimera exponeringen av kulturer till luft och till betydande förändringar i temperatur eller ljusintensitet över inkubation och förvärvs perioder.

Sammanfattnings, de metoder som presenteras här kan användas för att utvärdera och kvantifiera dynamiska förändringar i protein och organell lokalisering i astrocyter. De ger värdefulla verktyg som möjliggör undersökning av förändringar i astrocytiska reaktioner under fysiologiska och patologiska förhållanden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046
Benchtop Centrifuge	Thermo Scientific	75-203-637	Sorvall ST8 Centrifuge
Cell Culture Grade Water	Gen Clone	25-511
Cell Culture Microscope	Zeiss	WSN-AXIOVERT A1	Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities
Cytosine Arabinoside	Sigma	C1768-100MG	(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage
DAPI	Sigma	D9542-5MG	Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.
Dissecting Microscope	Zeiss		Stemi 305
Dissecting Scissors	F.S.T	14558-09
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal Bovine Serum	Gemini	100-106	Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J)	NIH	Version 1.52i
Fine Tip Tweezers	F.S.T	11254-20	Style #5
Fluorescence light source	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
GFAP antibody	Cell Signaling	3670S	GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom Dishes	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated
Graefe Forceps	F.S.T	11054-10	Graefe Iris Forceps with curved tips
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.
Hank's Balanced Salt Solution (10x)	Gibco	14065-056	Magnesium and calcium free
Imaging Media	Life Technologies	A14291DJ	Live Cell Imaging Solution
Inverted Confocal Microscope	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent	Life Technologies	11514015	Plus Reagent
Lipofection Reagent	Life Technologies	15338100	Lipofectamine LTX reagent
Orbital shaking incubator	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control
Penicillin/Strepomycin solution (100x)	Gen Clone	25-512
Phosphate Buffered Saline (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide	Sigma	P7405	Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing
Reduced serum medium	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Tissue Culture Flasks	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap
Tissue culture incubator	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control
Tris-Base	Sigma	T1503	8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200072
Vacuum-Driven Filter Systems	Olympus Plastics	25-227	500 ml, PES membrane, 0.22 µm
Vannas scissors straight	Roboz	RS-5620