Summary
血液脳関門の完全性は、神経系の機能のために重要です。ショウジョウバエメラノガスターでは、血液脳関門は後期胚形成時にグリア細胞によって形成される。このプロトコルは、D.メラノガスター胚および第3の恒星幼虫における血液脳関門形成および維持に関するアッセイ方法について説明する。
Abstract
適切な神経系の発達は、血液脳関門の形成、神経系へのアクセスを厳密に調節し、毒素や病原体から神経組織を保護する拡散障壁を含む。この障壁の形成の欠陥は神経障害と相関しており、この障壁の内訳は多くの神経変性疾患で観察されている。したがって、潜在的な治療標的を同定するためには、血液脳関門の形成と維持を調節する遺伝子を同定することが重要である。これらの遺伝子が神経発達において果たす正確な役割を理解するためには、改変された遺伝子発現が血液脳関門の完全性に及ぼす影響をアッセイする必要がある。血液脳関門の確立に機能する分子の多くは、フルーツフライ、ショウジョウバエメラノガスターを含む真核生物種全体で保存されていることが判明している。フルーツハエは、神経系の発達と機能を調節する分子機構を調べる優れたモデルシステムであることが証明されています。このプロトコルは、D.メラノガスター発達の胚および幼虫期における血液脳関門の完全性をアッセイするための段階的な手順を説明する。
Introduction
発達中、細胞間のコミュニケーションと相互作用は、組織および臓器の構造と機能の確立に重要である。いくつかのケースでは、これらの細胞と細胞の相互作用は、適切な臓器機能を確保するために、周囲の環境から臓器を遮断します。これは、血液脳関門(BBB)によって絶縁される神経系の場合です。ヒトにおけるBBBの機能不全はてんかんを含む神経疾患と関連しており、多発性硬化症および筋萎縮性側索硬化症を含む神経変性疾患においてバリアの破壊が観察されている1。哺乳動物において、BBBは内皮細胞2、3との間の緊密な接合によって形成される。フルーツフライを含む他の動物、ショウジョウバエメラノガスターは、グリア細胞からなるBBBを持っています。これらのグリア細胞は、神経系4に出入りする栄養素、廃棄物、毒素、および大きな分子の移動を制御するための選択的に透過性の障壁を形成する。これにより、アクションポテンシャルを発射するために必要な電気化学勾配の維持が可能になり、モビリティとコーディネーション4が可能になります。D. メラノガスターでは、グリアはカリウムが豊富な血液のような血球体5から神経系を保護する。
D.メラノガスターの中枢神経系(CNS)および末梢神経系(PNS)において、2つの外グリア層、下グリアおよび陰グリア、ならびに細胞外マトリックスの外ネットワーク、神経ラメラ、を形成する。ヘモリンパ脳およびヘモリンパ神経関門6は、この記事全体を通してBBBと呼ばれる。発達中に陰皮グリアはポリプロイドになり、神経系を囲むように拡大する 5,6,7,8,9, 10,11.皮下グリアは、血友リンパと神経系5、6、12との間の主な拡散障壁を提供する分離接合部を形成する。これらの接合部は、脊椎動物の骨髄グリアのパラノードで見つかった閉体状接合部と分子的に類似しており、哺乳類13、14のBBBにおけるタイトジャンクションと同じ機能を果たします。15歳,16歳,17.陰腸グリア分裂、成長、および代謝産物および大分子の拡散を調節するために、皮下グリアの周りに包む6,10,18,19.BBB形成は、25 °C 5、8で卵を産んだ後 (AEL)18.5h で完了します。これまでの研究では、BBB形成20、21、22の重要な調節因子である遺伝子を同定した。これらの遺伝子の正確な役割をよりよく理解するためには、これらの潜在的な調節因子の変異がBBBの完全性に及ぼす影響を調べることが重要である。これまでの研究では、胚および幼虫におけるBBBの完全性をアッセイするアプローチを概説してきたが、このアッセイのための包括的なプロトコルは、まだ5、7を説明していない。このステップバイステッププロトコルは、D.メラノガスター胚および第3のスター幼虫期におけるBBB整合性をアッセイする方法について説明する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. サンプルの収集
- 胚コレクション
- 各胚コレクションケージでは、コレクションに20-25オスの最低50人の処女女性を使用します。これらのハエをコーンミール寒天食品(材料の表)でボトルに入れ、コレクション23を始める前に1−2日間インキュベートする。
注:より多くのハエを使用することができますが、女性と男性の比率は2:1に保つ必要があります。 - 一晩25°Cで、あらかじめ温まったりんごジュース寒天プレート(表1)。
注:これは、胚の適切なステージングのために必要です。プレートがすぐに乾燥している場合は、室内温器に水を入れたボウルを追加して、チャンバーの湿度を高めます。 - ステップ1.1.1からCO2でハエを麻酔し、ハエを回収ケージに移します。あらかじめ温めたリンゴジュース寒天プレートを開いた端にイーストペーストの小さなスミアを置き、赤いスリーブ(材料の表)でケージに固定します。古い胚をクリアするために、ハエが25°Cで1時間リンゴジュース寒天プレートに胚/卵を置くことを許可します。
- インキュベーターからコレクションケージを取り外します。ケージメッシュ側を下に反転し、タップするとケージの下部まで飛びます。リンゴジュース寒天を、新しい温めたリンゴジュース寒天プレートを酵母ペーストの小さなスミアに置き換えます。最初のプレートを破棄します。
- ハエが新しいリンゴジュース寒天プレートに胚/卵を25°Cで1時間置くことを許可します。1時間のコレクションに続いてこのプレートを廃棄し、注射のための胚を収集するために次のステップに進みます。
- 後期段階17胚(20−21 h AEL)を収集するには、ステップ1.1.1−1.1.5から所望の遺伝子型のハエを、25°Cのインキュバーで19時間の年齢プレートを25°Cで25°Cで酵母ペーストの小さなスミアで新しい予温めのリンゴジュース寒天プレートに置くことを可能にします。したがって、胚はイメージング時の年齢の20−21hになります。
注:このステップは、サンプル収集、注入、およびイメージングの複数のラウンドで必要に応じて繰り返すことができます。 - 0.1%のニオニオン界面活性剤(PBTx)でリン酸緩衝生理食べ物(PBS)を加えることによって、70 μmナイロンメッシュを持つ細胞ストレーナーにプレートから胚を集集める。表 1)プレートの表面を覆い、ペイントブラシを使用して表面から胚を緩めます。
- 細胞ストレーナーに集めた胚を50%漂白液(表1)で100mmペトリ皿に入れ、室温で時折攪拌して5分間採取する。胚を3倍のリンス化し、毎回PBTxの新鮮な皿を用いてPBTxでセルストレーナーをペトリ皿に旋回させる。
- すべての胚が正しい遺伝子型である場合は、ステップ1.1.10に直接進みます。正しい遺伝子型の胚の生成がハエと十字を必要とする場合は、蛍光色のバランサー染色体の有無を使用して正しい遺伝子型の胚を選択する。遺伝子型選択には蛍光機能を備えた立体顕微鏡を使用します。
注:変形-黄色蛍光タンパク質でマークされたバランサー染色体;クルッペル-Gal4, UAS-緑色蛍光タンパク質 (GFP);とねじれ-Gal4, UAS-GFP は後期胚形成における遺伝子型の選択に適しています (表 2)24,25,26. - ガラスピペットを用いて、PBTxの胚を2%のアガロースゲルスラブに移す(表1)。フィルターペーパーで余分な液体を取り除きます。2%のアガロースゲルスラブに~6−8の胚を右後部、背面を上向きに整列させる(図1B)。
注:精子が卵に入る小さな穴である微細パイルは、胚の前端に位置する。後端はより丸みを帯びています。気管は白く見え、胚の背部に位置し、胚の背側と腹部側の区別を可能にする(図1B)。 - 両面テープ1枚でスライドを準備します。胚の上のスライドをしっかりと押して両面テープに移します。
- 室温でインキュベーションして胚を25分間乾燥させる(乾燥剤は使用しない)。乾燥後、胚をハロカーボンオイルで覆う。
注:乾燥期間は、部屋の温度、湿度、換気によって異なる場合があります。インキュベーション期間は、このプロトコルのセクション2および3に記載されているように、注射用の装置およびイメージング用共焦点顕微鏡をセットアップするために使用されるべきである。
- 各胚コレクションケージでは、コレクションに20-25オスの最低50人の処女女性を使用します。これらのハエをコーンミール寒天食品(材料の表)でボトルに入れ、コレクション23を始める前に1−2日間インキュベートする。
- 幼虫コレクション
- 所望の遺伝子型の5−10処女雌のハエと、コーンミール寒天食品を含むバイアルで所望の遺伝子型の半分の男性と十字架を設定し、25 °C23でインキュベートします。
- 5−7日後、遺伝子型に応じて、鉗子で軽くバイアルから第3の星幼虫をさまよう。幼虫に付き詰まった食物を取り除くために1x PBSで幼虫をすすいでくる。必要に応じて、手順 1.1.9 に記載されているジェノタイピング用のリンゴジュース寒天プレートに幼虫を移します。
- 幼虫をペイントブラシで組織に転がし、乾かします。鉗子を使用して両面テープで準備されたスライドに6−8幼虫を移す。
2. 針および試料注入の調製
- このプロトコルの開始前にマイクロピペットプーラーに針を引っ張ります。針の引き出しに毛細管を固定し、D.メラノガスター注射のための標準的な針の形および変数に従って引く(表3)27。注射に使用するまで粘土に固定することにより、ペトリ皿に針を格納します。
- 胚の25分間の乾燥期間中に20μLゲルローディングピペットチップを使用して、スルフォルホダミン101酸塩化物(材料の表)に結合した10 kDaデキストランの5 μLを持つ針をロードします(ステップ1.1.12)、または転送直後スライドに幼虫を付ける(ステップ1.2.3)。
- 針を針ホルダーにロードし、スチールベース(材料の表)に固定されたマイクロマニピュレータの位置。
注:針は胚注射の顕微鏡段階とほぼ平行で、幼虫注射ではわずかに下方に角度を付ける必要があります。 - 射出装置(材料の表)を50 psi、5−10ミリ秒の範囲で10に設定します。
注:使用する特定の注入装置に対してこれらの設定を変更する必要がある場合があります。 - 針のステージとブラシの端にスライドを45°の角度で両面テープの端に対して置き、斜めの壊れた先端を作成します。
注:胚の場合は、10 kDaデキストランの流れを可能にするのに十分な先端を壊す必要があります。完璧な針は、わずかに角度の先端を持っており、染料の小さな滴は、各注射で出てくるでしょう。幼虫の場合は、先端をもっと壊す必要がありますが、幼虫の体壁を貫通するために斜めの先端を持つ必要があります。より大きな染料が出てくるでしょう。 - 染料が針の先端になるまで、フットペダルをポンプします。
- 針を胚と平行にするか、幼虫に向かってわずかに下方に傾けるように針を合わせます。
- 針を動かして標本の後端を穿刺し、フットペダルをポンピングして試料を注入する。胚に染料を~2nL、幼虫に約220nLの染料を注入する。
注:注射が成功した場合、胚または幼虫は色素であふれるべきです。 - インキュベーションの目的での注射時間に注意してください。胚を室温で10分間インキュベートする。室温で幼虫を30分間インキュベートする。
- スライドを下に進み、各標本の注入時間に注意して、追加の標本を注入します。
注:その後の解剖およびイメージングステップを実行できる速度に応じて、4-8の標本を一度に注入することができる。
3. イメージング用サンプルの調製
-
胚のイメージング
- 注射後、イメージング用の胚を調記する。カバースリップの配置時に胚の損傷を防ぐためにスペーサーとしてスライド上のサンプルの左右に綿の先端のアプリケーターで石油ゼリーを適用します。
- 20倍の目的を持つ胚の深部全体の共焦点顕微鏡を使用して画像サンプル。次の式を使用して、心室神経コード(VNC)で観察された色素を持つ総サンプルの割合を計算します: BBB = VNC/総サンプル数に色素が蓄積されたサンプルの数。
-
幼虫の解剖とイメージング
- 幼虫サンプルのスライドを事前に準備します。2つのカバースリップを取り付け、マニキュアでスライドに約0.5cm離れた間隔をあけます。
注:カバースリップは脳のスペーサーとして機能するので、取り付けプロセス中に損傷を受けません。 - 30分のインキュベーションに続いて、イメージングに使用されるスライド上で1x PBSで幼虫を直接解剖する。まず、1組の鉗子を使用して幼虫の体の途中で幼虫をつかみ、2組の鉗子を使用して幼虫の前半分と後部半分を分離する。
- 次に、1組の鉗子を使用して口のフックで前の領域をつかみ、2組の鉗子を使用して、口のフックをつかむ鉗子の先端の上にボディウォールを反転させる。脳とVNCが暴露される
- 神経を切断して脳とVNCを体壁から分離し、スライドから体壁を取り除く(図1C,D)。必要に応じて、想像ディスクを削除します。
- 80%グリセロールの10 μLでサンプルをカバーし、イメージングのためにサンプルの上にカバースリップを置きます。
- 20倍の目的を用いた神経系組織の深部を通した画像。VNCで観察された色素を持つサンプル全体の割合を計算します。
- 幼虫サンプルのスライドを事前に準備します。2つのカバースリップを取り付け、マニキュアでスライドに約0.5cm離れた間隔をあけます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ここで説明する方法は、D.メラノガスター胚および幼虫におけるCNS全体のBBBの完全性の可視化を可能にする(図1)。後期胚発生におけるBBB形成の完了時に、BBBは脳およびVNC5から大きな分子を除外する機能を有する。このプロトコルは、この関数を利用してBBB形成をアッセイする。野生型(オレゴンR)後期17(20−21h齢)胚をスルフォルホダミン101酸塩化物蛍光色素に共役10kDaデキストランを注入した場合、大きなデキストラン分子をVNCから除外し、期待通り(図2A)。BBBの完全性に対する遺伝子変異の効果を実証するために、生遺伝子に変異を有する胚が利用された。以前は、生の遺伝子は胚発生時に胚バンドの引き込みを調節することが実証されており、さらに最近では、発達28の間にVNCの形態変化を調節するためにグリアで機能することが示されている。ヘテロ接頭性生1個の変異胚は、野生型対照胚で観察された結果と同様に、無傷のBBBを示した(図2B)。対照的に、ホモ接合性生1変異胚はBBBの完全性に欠陥を示し、10kDaデキストラン色素がVNCにフラッディングし、BBBが形成できなかったことを示す(図2C)。これらの結果は、胚期におけるBBB形成をアッセイするこの技術の能力を示す。
これまでの研究では、皮下グリアポリプロイド化の欠陥が、第3の星幼虫期7、9段階で観察できるBBBの破壊をもたらすことが実証されている。したがって、BBB形成および/またはメンテナンスの欠陥は、開発の後期段階でBBBが損なわれる可能性があり、第3のスター幼虫期における障壁の完全性をアッセイすることが望ましい。したがって、胚期におけるBBB完全性をアッセイするために利用されるプロトコルは、幼虫での使用のためにも最適化されている。オレゴンR対照サンプルでは、10 kDaデキストランはBBBに浸透できず、脳およびVNCから除外される(図2D,E)。染料はBBBの周辺に蓄積する。
図1:ステージ17胚および第3の恒星幼虫の神経系。(A)ステージ17胚性中枢神経系(CNS)の腹部図の概略図。CNSは、脳(Br)と心室神経コード(VNC)で構成され、これは、背筋チャネル(ch)を有する。前端のマイクロパイル(mp;矢印)を使用して胚の向きを作ることができます。右後。(B)ステージ17の胚は、ステップ1.1.10で推奨されているように、後側を上に、右に後方を向ける。矢印が気管を指している。矢印は MP を示します。右後。(C)第3の幼虫における神経系の概略図。脳(Br)とVNCはCNSを構成し、VNCシナプスから体壁の筋肉に伸びる神経はPNSの一部である。右後。(D)第3の幼虫脳とVNCを解剖した。右後。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:血液脳関門(BBB)形成に関するアッセイ。(A-C)後期17個の胚(20−21h old)を後部に10kDaスルフォルホダミン101酸塩化物デキトランで注入した。後部ダウン。スケールバー = 20 μm.コントロールに見られるドットは、心室神経コード(VNC)にまたがる背房チャネルです。(A)オレゴンRコントロール。サンプルの6.25%、n =16で染料取り込み。(B)生の 1/+兄弟コントロール。サンプルの6.67%、n =15で染料取り込み。(C)ホモ接性生1/1変異体。サンプルの100%、n=22で染料取り込み。(D)オレゴンRは第3の幼虫脳を制御する。染料はBBBで蓄積しますが、CNS、n =7に浸透しません。スケールバー = 50 μm.(E)オレゴンRコントロール第3のインスター幼虫VNC。染料はBBBで蓄積しますが、CNS、n=11に浸透しません。破線はVNCの概要を説明します。スケールバー = 50 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:後期胚発生における中腸形態学。ステージ13−17胚の透過光画像は、腸の形態(胚の後半分の暗い灰色領域)の視覚化を可能にする。中腸の形態は、胚の発達の段階を決定するために使用することができ、これは胚が注射のために適切に老化しているかどうかを決定する際に役立ちます。スケールバー = 100 μm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ソリューション | レシピ |
| 2% アガロースゲル | アガロースの0.8gを40mLの二重蒸留H2O(ddH2O)にエルレンマイヤーフラスコと電子レンジで加え、寒天を溶かします。ゲル鋳造トレイに注ぎ、ゲルが室温で30分間固化できるようにします。 |
| アップルジュース寒天プレート | 寒天の45gとddH2Oの1.5Lを4Lフラスコに測定します。121 °Cで40-45分のオートクレーブ。砂糖50gとリンゴジュース0.5Lを1Lビーカーに測定し、砂糖を溶かすために弱火(設定3)をかき混ぜ、それを燃やさないのに注意してください。オートクレーブに続いて、寒天と水に予熱した砂糖とリンゴジュースを追加します。熱をオフにして弱くかき混ぜ、触れるまで冷まします。70%のテゴセプトの15 mLを追加し、分散させるために攪拌します。0.5Lビーカーに注ぎます。エタノールをスプレーして、ブンゼンバーナーで泡や炎を取り除きます。60mmのペトリ皿に注ぎます。少なくとも24時間、またはペトリ皿の蓋に最小限の結露があるまで設定し、4 °Cで保存することができます。 |
| 50% 漂白剤 | ddH2O の 15 mL と 15 mL の家庭用漂白剤を円錐形のチューブに追加します。 |
| 80% グリセロール | 10 mL の場合、15 mL 円錐管に 8 mL のオートクレーブ ddH2O と 2 mL のグリセロールを追加します。溶液が均質になるまでロッカーでインキュベートします。 |
| 1x PBS | 1Lの場合、ddH2Oの900mLで10x PBSの100mLを希釈する。 |
| 10x PBS | 2Lの場合、ddH2 Oの1,600 mLで以下を溶解する:NaClの160g、KClの4g、Na2 HPO4の28.8g、およびKH2PO4の4.8gである。HCl で pH を 7.5 に調整します。 |
| PBTx (PBS + 0.1% ニオニオン界面活性剤) | 1Lの場合は、10x PBSの100mL、10%のニオニオン界面活性剤の10mL、ddH2Oの890 mLを組み合わせます。 |
| 70% テゴセプト | p-ヒドロキシ安息香酸の1g、100%エタノールの10mL毎にメチルエステルを混合する。-20 °C.で保存します。 |
| 10% ニオニオニック界面活性剤 | 50 mL の場合、45 mL のオートクレーブ ddH2O と 5 mL のニオニオン界面活性剤を円錐形チューブに加えます。溶液が均質になるまでロッカーで回転させます。 |
| 酵母ペースト | 乾燥した活性酵母をddH2Oと50mLのプラスチックビーカーで滑らかになるまで混ぜます。 |
表 1: このプロトコル全体で使用される試薬およびバッファー。
| 遺伝子 | 株式 |
| w[1118];ln(2LR)グラ、wg[Gla-1]/CyO、P{w[+mC]=GAL4-twi.G}2.2、P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH2.2 | ブルーミントン#6662 |
| w{*];sna[スコ]/CyO, P{w[+mC]=Dfd-EYFP}2 | ブルーミントン#8578 |
| w{*];L[2] ピン[1]/CyO、P{w[+mC]=GAL4-Kr.C}DC3、P{w[+mC]=UAS=GFP。S65T}DC7 | ブルーミントン#5194 |
| DF(1)JA27/FM7c、P{w[+mC]=GAL4-Kr.C}DC1、P{w[+mC]=UAS-GFP。S65T}DC5, sn[+] | ブルーミントン#5193 |
| w[*];ry[506] Dr[1]/TM6B, P{w[+mc]=Dfd-EYFP}3, Sb[1] Tb[1] ca[1] | ブルーミントン#8704 |
| y[1] w[*];D[*] gl[3]/TM3、P{w[+mC]=GAL4-Kr.C}DC2、P{w[+mC]=UAS-GFP。S65T}DC10, Sb[1] | ブルーミントン#5195 |
| オレゴン R | 利用可能な複数の株 |
| raw[1] cn[1] bw[1] sp[1]/CyO | ブルーミントン#2749 |
| P{w[+mW.hs]=GawB}elav[C155] | ブルーミントン#458 |
| w[1118];P{w[+m*]=GAL4}レポ/TM3、Sb[1] | ブルーミントン#7415 |
| P{UAS-GFP} | 利用できる複数の株 |
表2:フライ株。このプロトコル全体で議論されるフライ株。ブルーミントン・ショウジョウバエ・ストック・センターの在庫番号は、該当する場合に提供されます。
| サイクル | 熱 | プル | 速度 | 時間 | 圧力 | ランプ |
| 1 | 590 | 115 | 15 | 250 | 600 | X |
| 2 | 575 | 130 | 60 | 250 | 600 | X |
表 3: マイクロピペット プーラーの設定。このプロトコルで注射のための針を生成するために使用されるマイクロピペットの引き出し装置の設定。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルは、D.メラノガスター発達の後期胚および第3の星幼虫期におけるBBB完全性のアッセイに必要なステップの包括的な説明を提供する。同様のアプローチは、開発中のBBBの完全性をアッセイするために他の場所で説明されているだけでなく、成人段階5、7、29、30.しかし、材料や方法のセクションの手順の説明は、多くの場合、本質的に広く、簡単な実装のための十分な詳細を欠いているため、研究者に代わって重要なトラブルシューティングを必要としています。このプロトコルは、胚および幼虫期のBBB完全性をアッセイするために必要なステップの包括的な説明を提供する。各段階では、開発の正しい段階が検討され、組織アーキテクチャが中断されていないことを確認するために従う重要なステップがあり、BBBを危険にさらす可能性があります。これらのアプローチで成功を収めるためには、正確な結果を得るためにプロトコルの複数のステップをトラブルシューティングする必要がありました。胚および幼虫プロトコルにおける重要なステップを以下に説明する。
以前の研究は、18.5 h AEL5によって BBB の確立を報告しています。.正確な発達のタイミングを確保するためには、加齢時に一定の温度でサンプルを維持することが重要です。胚を採取する場合は、リンゴジュース寒天プレートを回収前に25°Cに持ち込む必要があります。事前に温められていないリンゴジュースプレートを使用すると、開発が遅くなり、まだBBBを確立していないサンプルを得ることができ、したがって、神経系に10 kDaデキストランの蓄積を示します。そのため、18.5hより古いサンプルを注入していることを確認することが重要です。BBBの後の設立。潜在的な発達遅延を考慮して、サンプルは報告されたBBB形成のわずかに後に20−21h AELでアッセイされた。他の組織の形態、特に現像中腸を用いて、アッセイされる胚の正しい発達段階の確立を助けることができる(図3)。逆に、不適切な実験タイミングは、既にモチルであり、ハッチングプロセスを開始しているサンプルにつながる可能性があります。既に孵化を開始している幼虫の数を減らすためには、注射のために胚を採取する前に、雌から古い胚を取り除くために最低2つの1時間のコレクションを実行することが重要です。最初の幼虫におけるBBBの分析が望ましい場合、氷上の9ウェル皿の1x PBSにおける幼虫の短いインキュベーションは、注射前の運動性を減らすために使用することができる。スライドはまた、運動性を減らすために注入手順中にアイスパックに保持することができます。
胚におけるBBBの確立に関する品質の画像と正確な結果を確保するためには、手順全体を通して追加の手順に注意深く従う必要があります。寒天スラブに胚を並べる場合、これは胚の後側であるので、気管は上を向く必要があります(図1B)。胚が両面テープでスライドに移されると、胚の腹部側が上を向き、プロトコルの後半で共焦点イメージング中に神経コードを最適に視覚化することができます。胚はまた、注射中の動きを阻害するために両面テープにしっかりと付着する必要があります。平らな2%のアガロースパッドの使用は、研究者が胚への損傷の危険なしに転送プロセス中にしっかりと胚に両面テープでスライドをプッシュすることができます。スライドへの転移後、色素注射時に胚が破裂するのを防ぐために乾燥が必要である。あまりにも多くの色素の注入はまた、胚を破裂させる可能性があります。染料を注入するのに十分なほど胚に針を挿入することが重要ですが、針が潜在的に神経系を穿刺するほどではなく、偽陽性の結果を与えます。刺し傷の大きさが大きすぎると、胚から出血や染料があふれ、実験に失敗する可能性があります。これらの潜在的な落とし穴を念頭に置いて、注射は、慎重に胚を穿刺する小さなポイントがあるような先端にわずかな角度を有する針で最も成功しています。
BBBの完全性のために幼虫をアッセイする場合、試料の運動性のために課題が生じることがある。高品質の両面テープの使用は、注射のための幼虫を固定化するのに有効であるべきであるので、重要です。幼虫が動かなくなった場合は、テープにロールバックし、穏やかに押し下げて再び固定することができます。注射のために幼虫を輸送する場合、幼虫が動けなくなる場合に備えて、ペトリ皿にスライドを運ぶことが役立ちます。注射後のステップは、BBBの中断を避けるために最も注意を必要とします。サンプルへの潜在的な損傷を最小限に抑えるために、イメージングに使用されるスライド上でサンプルを直接解剖するのが最も簡単です。解剖のためにサンプルを移す際に幼虫がテープに強く付着している場合、1x PBSの滴をテープに加えて接着を緩め、解剖のためにスライドに移すことができる。解剖後、誤検知の結果を避けるためにサンプルを十分に平坦化することが重要ですが、サンプルの完全性が損なわれるほどではありません。スペーサーが損傷を受けないように、カバースリップとスライドの間に幼虫を挟むことで、脳が損傷するのを防ぎながら、サンプルを固定化して効果的なイメージングを行います。
胚と幼虫の両方のプロトコルで成功を収めるためには、サンプル処理を開始する前に注射装置と共焦点顕微鏡を設置することが重要です。これにより、サンプルのイメージングに正確なタイミングが得られており、サンプル比較に必要です。他のアプローチは、より高度な注射セットアップを利用しており、胚注射用に設置された反転顕微鏡を必要としている。このプロトコルは圧力調整器が付いている標準的な解剖顕微鏡およびマイクロマニピュレータを利用する。この場合、ゼブラフィッシュ注射は、ハエ胚および幼虫の注射に単に適応された。このプロトコルは、注射用の注射器を備えたマイクロマニピュレータを利用するためにさらに簡素化することができる。これらのツールの多くは、生物学部門で容易に利用でき、教室の実験室の設定でも利用できるため、プロトコルの実装を最大限に容易にすることができます。
イメージング手順の間に、神経系の細胞に標識を付けて、イメージングのために所望の領域をより容易に識別するのに役立ちます。具体的には、GAL4/UASシステムを使用して、elav-Gal4またはrepo-Gal4株を用いて、ニューロンまたはグリアのいずれかでGFPを発現させることができる(表2)31、32、33。このような標識は、神経系の完全性を可視化するスルフォルホダミン101酸塩化物デキストランと対照的であろう。
この方法は、D.メラノガスターの開発中にBBBの完全性をアッセイすることに焦点を当てていますが、このアプローチは、様々な生物や組織にわたる他の障壁の完全性を調べるために適応させることができる。例えば、マウス34においてBBBをアッセイするための同様のプロトコルが公表されている。加えて、D.メラノガスターにおける精子形成時の生殖細胞を取り巻く血液眼関障壁および体性障壁の透過性は、同様のアプローチ29,35を利用する。プロトコルはまた、腸を含む透過性をテストするために他の組織での使用のために適応することができる。このプロトコルを他の組織や種に適応させる場合、10 kDaデキストランがいくつかの障壁に浸透するのに十分小さい可能性があるため、バリアを貫通できる分子の大きさを考慮する必要があります。全体的に、このプロトコルは、他の設定での使用に容易に適合させることができるD.メラノガスター開発中のBBB整合性をアッセイするためのステップバイステップの手順を提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、注射用機器の使用に関して、F.ブライアン・ピケット博士とロドニー・デール博士に感謝しています。この研究は、ロヨラ大学シカゴからM.D.、D.T.、およびJ.J.への研究資金によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
References
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
- Hindle, S. J., Bainton, R. J. Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier. Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).
- Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
- Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
- Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
- von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
- Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
- Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
- Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
- Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
- Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
- Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
- Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
- von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
- Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
- DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
- BDSC Cornmeal Food. , Bloomington Drosophila Stock Center. Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017).
- Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).
- Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
- Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
- Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
- Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
- Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
- Love, C. R., Dauwalder, B. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. , Humana Press. New York, NY. 175-185 (2019).
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
- Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).
