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Chemistry

Fase sólida 11C-metilação, purificação e formulação para a produção de traçadores PET

Published: October 24, 2019 doi: 10.3791/60237
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1,2
1McConnell Brain Imaging Centre, Montreal Neurological Institute, McGill University, 2Department of Neurology and Neurosurgery, McGill University
* These authors contributed equally

Summary

Relatamos uma técnica eficiente de radiorotulagem de carbono-11 para produzir traçadores clinicamente relevantes para tomografia por emissão de pósitrons (PET) usando cartuchos de extração de fase sólida. 11 O agente c-metilante é passado através de um cartucho pré-carregado com precursor e a elução sucessiva com etanol aquoso fornece traçadores quimicamente e radioquimly puros do PET em rendimentos radioquímicos elevados.

Abstract

A produção rotineira de radiotracers utilizados na tomografia por emissão de pósitrons (PET) depende principalmente da química úmida, onde o synthon radioativo reage com um precursor não radioativo na solução. Essa abordagem exige a purificação do traçador por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), seguida de reformulação em um solvente biocompatível para administração humana. Recentemente desenvolvemos uma nova abordagem de metilação C 11para a síntese altamente eficiente de radiofármacos PET rotulados por carbono-11, aproveitando os cartuchos de fase sólida como unidades descartáveis "3-em-1" para a síntese, purificação e reformulação dos traçadores. Essa abordagem evita o uso do preparative HPLC e reduz as perdas do traçador nas linhas de transferência e devido à decaimento radioativo. Além disso, a técnica baseada em cartuchomelhor a confiabilidade da síntese, simplifica o processo de automação e facilita o cumprimento dos requisitos de Boas Práticas de Fabricação (GMP). Aqui, demonstramos esta técnica no exemplo da produção de um traçador PET Pittsburgh composto B([11C]PiB), um padrão ouro in vivo agente de imagem para placas amilóides no cérebro humano.

Introduction

A tomografia por emissão de pósitrons (PET) é uma modalidade de imagem molecular que depende da detecção do decaimento radioativo de um isótopo ligado a uma molécula biologicamente ativa para permitir a visualização in vivo de processos bioquímicos, sinais e transformações . Carbono-11 (t1/2 = 20.3 min) é um dos radioisótopos mais comumente usados no PET por causa de sua abundância em moléculas orgânicas e meia-vida curta que permite várias administrações traçadoras no mesmo dia para o mesmo sujeito humano ou animal e reduz a carga de radiação sobre os pacientes. Muitos traçadores rotulados com este isótopo são usados em estudos clínicos e em pesquisas básicas de saúde para imagens pet in vivo de alvos clássicos e emergentes biologicamente relevantes - [11C] raclopride para receptores D2/D3, [11C] PiB para placas amilóides, [11C]PBR28 para proteína translocator - para citar apenas alguns.

Os traçadores PET rotulados em carbono-11 são predominantemente produzidos através de 11c-metilação de precursores não radioativos contendo -OH (álcool, fenol e ácido carboxílico), -NH (amina e amida) ou -SH (thiol) grupos. Resumidamente, o isótopo é gerado no alvo de gás de um ciclotron através de uma reação nuclear de 14N (p,α)11C na forma química de [11C]CO2. Este último é então convertido em [11C] iodeto metilo([11C]CH3I) através de química molhada (redução para [11C]CH3OH com LiAlH4 seguido por saciar com HI)1 ou seco química (redução catalítica para [11C]CH4 seguido de iodenação radical com molecular I2)2. [11C] CH3Eu posso então ser convertido para o triflate mais reativo 11C-metil ([11 C]CH3OTf), passando-o sobre uma coluna triflate prata3. O 11C-metilação é então realizada por qualquer borbulhante do gás radioativo em uma solução de precursor não-radioativo em solvente orgânico ou através do mais elegante solvente em cativeiro "loop" método4,5. O 11C-tracer é então purificado por meio de HPLC, reformulado em um solvente biocompatível, e passou por um filtro estéril antes de ser administrado a seres humanos. Todas essas manipulações devem ser rápidas e confiáveis, dada a curta meia-vida do carbono-11. No entanto, o uso de um sistema HPLC aumenta significativamente as perdas do traçador e do tempo de produção, muitas vezes necessita do uso de solventes tóxicos, complica a automação e, ocasionalmente, leva a sínteses falhadas. Além disso, a limpeza necessária dos reatores e da coluna HPLC prolonga os atrasos entre as sínteses dos lotes traçadores subsequentes e aumenta a exposição do pessoal à radiação.

A radioquímica da flúor-18 (t1/2 = 109,7 min), o outro isótopo PET amplamente utilizado, foi recentemente avançada através do desenvolvimento de kits à base de que evitam a necessidade de purificação de HPLC. Ao empregar cartuchos de extração de fase sólida (SPE), esses kits totalmente descartáveis permitem a produção de rotina confiável de 18traçadores F, incluindo [18F]FDG, [18F]FMISO, [18F]FMC e outros, com síntese mais curta tempos, redução do envolvimento pessoal e manutenção mínima do equipamento. Uma das razões pelas quais o carbono-11 continua a ser um isótopo menos popular na imagem pet é a falta de kits semelhantes para a produção de rotina de 11c-traçadores. Seu desenvolvimento melhoraria significativamente a confiabilidade sintética, aumentaria os rendimentos radioquímicos e simplificaria a automação e a manutenção preventiva dos módulos de produção.

Kits de produção atualmente disponíveis aproveitam os cartuchos de SPE baratos, descartáveis, em vez de colunas HPLC para a separação do radiotracer de isótopos radioativos não reajados, precursores e outros subprodutos radioativos e não radioativos. Idealmente, a reação de rotulagem de rádio também prossegue no mesmo cartucho; por exemplo, a fluorometilaçãodedimetiloetanol com gasoso [18F]CH2BrF na produção de rastreamento pet de imagem de câncer de próstata [18F]fluorometilcolina ocorre em um cartucho de resina de troca de cation 6.Embora procedimentos semelhantes para a rotulagem de vários 11C-traçadores em cartuchos tenham sido relatados7,8 e se tornaram especialmente poderosos para a radiossíntese de [11C]colina9 e [11C]methionine10, estes exemplos permanecem limitados aos traçadores oncológicos do PET onde a separação do precursor não é exigida frequentemente. Recentemente, relatou o desenvolvimento de"[11C] kits" para a produção de [11C]CH3I11 e subseqüente 11C-metilação, bem como a síntese contínua fase suportada12 em nossos esforços para simplificar a produção de rotina de 11C-traçadores. Aqui, queremos demonstrar o nosso progresso usando o exemplo da radiossíntese suportada em fase sólida de [11C]PiB, um radiotracer para imagens de Aβ que revolucionou o campo da imagem da doença de Alzheimer (DA) quando foi desenvolvido pela primeira vez em 2003 ( Figura 1) 13,14. Neste método, volátil [11C]CH3OTf (bp 100 °C) é passado sobre 6-OH-BTA-0 precursor depositado na resina de um cartucho descartável. Pet tracer [11C]PiB é então separado das impurezas precursoras e radioativas por elução do cartucho com etanol aquoso biocompatível. Além disso, automatizamos este método de radiossíntese [11C]PiB usando um módulo de síntese de radioquímica operado remotamente e kits de descartáveis. Especificamente, implementamos essa radiosíntese em um módulo de radioquímica de 20 válvulas, equipado com acionamento de seringas (dispensador) que se encaixa seringa plástica descartável padrão de 20 mL, controlador de fluxo de gás, bomba de vácuo e medidor. Devido à simplicidade deste método, estamos confiantes de que ele pode ser modificado para a maioria dos sintetizadores automatizados disponíveis comercialmente, seja à base de ou aqueles equipados com válvulas estacionárias. Esta técnica suportada por fase sólida facilita a conformidade com a produção de11C]PiB com os regulamentos da Good Manufacturing Practice (GMP) e melhora a confiabilidade da síntese. A técnica descrita aqui também reduz a quantidade de precursor necessária para a radiossíntese, usa apenas solventes biocompatíveis "verdes" e diminui o tempo entre lotes consecutivos de produção.

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Protocol

1. Preparação de amortecedores e eluentes

  1. Dissolva 2,72 g de trato de acetato de sódio em 100 mL de água para preparar a solução de acetato de sódio de 0,2 M (solução A).
  2. Dissolva 11,4 mL de ácido acético glacial em 1 L de água para preparar solução de ácido acético de 0,2 M (solução B).
  3. Combine 50 mL de solução A com 450 mL de solução B para preparar o tampão de acetato em pH 3.7 (buffer 1) de acordo com o centro de referência tampão15. Verifique o pH do buffer com tiras de pH ou um medidor de pH.
  4. Combine 12,5 mL de etanol absoluto com 87,5 mL de buffer 1 para fazer 12,5% solução EtOH aquosa (lavagem 1) em uma garrafa de 100 mL.
  5. Combine 15 mL de etanol absoluto com 85 mL de buffer 1 para fazer 15% de solução EtOH aquosa (lavagem 2) em uma garrafa de 100 mL.
  6. Combine 5 mL de etanol absoluto com 5 mL de buffer 1 para fazer 50% de solução EtOH aquosa (eluente final) e desenhe 2,5 mL desta solução em uma seringa de 10 mL.

2. Aplicação do precursor do cartucho

  1. Passe 10 mL de água seguido por 5 mL de acetona através do cartucho tC18 para pré-condicionar isso.
  2. Seque o cartucho com um fluxo de nitrogênio a 50 mL/min por 1 min.
  3. Dissolva 2 mg do precursor 6-OH-BTA-0 em 1 mL de acetona de anidro.
  4. Segurando uma seringa de vidro de precisão Luer-ponta 250 μL para baixo, retire 100 μL da solução precursora e 50 μL de almofada de ar em cima do líquido. Retire a agulha e aplique a solução precursora no cartucho tC18 do final feminino, empurrando lentamente o desentupidor todo o caminho. Não empurre a solução mais!

3. Configurando o múltipla para síntese automatizada

  1. Proteja o material descartável padrão de 5 porções no módulo de síntese e monte-o de acordo com a Figura 2 e os passos 3.2 - 3.5 abaixo.
    NOTA: Recomendamos o uso de múltiplas resistentes à acetona (ver Tabela de Materiais).
  2. Porto 1 tem duas posições. Conecte a entrada horizontal ao dispensador automatizado equipado com uma seringa de 20 mL. Conecte a entrada vertical à garrafa com a lavagem 1.
  3. Conecte a saída do módulo que produz [11C]CH3OTf ao porto 2 do reprodutor.
  4. Instale o cartucho tC18 carregado com precursor 6-OH-BTA-0 entre as portas 3 e 4.
  5. O Porto 5 tem duas posições. Conecte a tomada horizontal à garrafa de resíduos que deve conter pelo menos 200 mL. Conecte a tomada vertical ao frasco estéril para a coleção do traçador através do filtro estéril.

4. Radiossíntese de [11C]PiB

CUIDADO: Todas as manipulações envolvendo isótopos radioativos devem ser realizadas em uma célula quente protegida por chumbo por pessoal com treinamento adequado para trabalhar com materiais radioativos.
NOTA: Este protocolo não abrange os detalhes da produção de [11C]CO2 no ciclotron e sua conversão em [11C]CH3OTf usando o módulo de radioquímica. Esses procedimentos dependerão do equipamento individual do laboratório de radioquímica e estão fora do escopo desse protocolo. Nosso centro PET está equipado com um ciclotron IBA, que produz carbono-11 na forma química de [11C]CO2através da reação nuclear 14N (p,α)11C com uma mistura de gás N2/O2 (99,5:0.5) no gás alvo, e um módulo comercialmente disponível para a produção de [11C]CH3I através do "método seco" (redução catalítica para [11C]CH4 seguido por iodenação radical). [11C] CH3OTf é produzido passando [11C]CH3I sobre uma coluna triflate prata aquecida a 175 °C em 20 mL/min.

  1. Entregar [11C]CH3OTf no coletor através do porto 2 e passá-lo através do cartucho tC18 carregado em 20 mL/ min fluxo de saída regulada pelo [11C]CH3OTf módulo, através das portas 3 e 4 e para o frasco de resíduos, como mostrado em Figura 2A.
  2. Uma vez que toda a radioatividade foi transferida e presa no cartucho tC18, conforme monitorado pelo detector de radioatividade atrás do suporte do cartucho, pare o fluxo de gás fechando o porto 2. Deixe o cartucho sentar-se por 2 min para completar a reação.
  3. Retire 19 mL de lavagem 1 solução (ver passo 1.4) da garrafa de 100 mL na seringa distribuidor através do porto 1 a 100 mL/min, como mostrado na Figura 2B.
  4. Dispensar 18,5 mL de lavagem 1 solução do dispensador através do cartucho tC18 através dos portos 3 e 4 e para a garrafa de resíduos em 50 mL/min, como mostrado na Figura 2C. Assegure a ausência de bolhas de ar no ressoqueiro, pois eles podem diminuir a eficiência da separação.
  5. Repita os passos 4,3 e 4,4 quatro vezes, retirando e dispensando 18,5 mL de lavagem 1 solução de cada vez. O volume total de solução de lavagem 1 passado pelo tC18 é de 92,5 mL; no entanto, pode variar dentro da faixa de 90 a 100 mL, dependendo do módulo de síntese específico usado.
  6. Mude a linha de entrada na porta 1 da lavagem 1 para lavar a solução 2 (ver passo 1.5).
  7. Repita os passos 4,3 e 4,4 três vezes, retirando e dispensando 18,5 mL de lavagem 2 solução de cada vez. O volume total de solução de lavagem 2 passado pelo tC18 é de 55,5 mL. No entanto, pode variar dentro da faixa de 50 a 60 mL, dependendo do módulo de síntese específico usado.
  8. Válvula de alternância 5 para o frasco final, como mostrado na Figura 2D. Desconecte a linha do dispensador e conecte-a à seringa de 10 mL contendo 2,5 mL da solução eluent final (50% aquosa EtOH, ver passo 1.6) e 7,5 mL de ar.
  9. Segurando a seringa para baixo, empurre manualmente a solução eluente final (2,5 mL), seguida de ar (7,5 mL) através do cartucho tC18 através das portas 3 e 4 e para o frasco estéril para coleta de rastreadores através do filtro estéril, como mostrado na Figura 2D.
  10. Desligue a seringa vazia, conecte a seringa de 10 mL contendo 10 mL do tampão de fosfato estéril (receita não incluída, pois pode variar) e empurre todo o volume através do cartucho tC18 no frasco estéril, conforme descrito acima (Figura 2D ). Desligue a seringa e lave a linha com 10 mL de ar usando a mesma seringa.
  11. Retire 0,7 mL da formulação final do traçador e colete amostras para procedimentos de controle de qualidade (0,1 mL), teste de endotoxina bacteriana (0,1 mL) e esterilidade (0,5 mL).

5. Procedimentos de controle de qualidade

CUIDADO: Cada lote do radiotracer deve ser submetido aos procedimentos apropriados do controle de qualidade (QC) antes da liberação ao local da imagem latente do PET para a administração em assuntos humanos ou animais. Os autores deste manuscrito não são responsáveis pela conformidade do radiotracer produzido em outros centros com os regulamentos das autoridades de saúde locais.

  1. Realizar procedimentos qc pré-lançamento, que devem incluir testes para identidade radioquímica (RCI), pureza radioquímica (RCP), pureza química e atividade molar do traçador, bem como conteúdo solvente residual e pH da formulação.
  2. Determine o RCI, RCP, pureza química e atividade molar por meio do sistema hplc analítico equipado com UV (monitoramento de 350 nm) e detectores de radioatividade, e uma coluna de fase invertida. Determine os tempos de retenção de 6-OH-BTA-0 e 6-OH-BTA-1 e calibrar o instrumento para quantificar o conteúdo de cada composto.
  3. Determine o conteúdo solvente residual por meio do sistema de cromatografia analítica de gás equipado com uma coluna capilar. Determinar os tempos de retenção de acetona e etanol e calibrar o instrumento para quantificar o conteúdo de cada solvente.
  4. Realize o teste bacteriano das endotoxinas usando um leitor do cartucho equipado com os cartuchos apropriados.
  5. Realize a análise esterilidade da amostra pelo menos 14 dias após a síntese para garantir a ausência de crescimento bacteriano ou enviar a amostra de esterilidade para um laboratório credenciado pela autoridade de saúde local.

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Representative Results

Para resumir uma radiossíntese típica de [11C]PiB, gasoso [11C]CH3OTf é passado pela primeira vez através de um cartucho tC18 pré-carregado com uma solução de precursor (Figura 1). A separação da mistura de reação é então alcançada por sucessivas eluções com soluções de etanol aquoso da seguinte forma. Primeiro, 12,5% EtOH elutes a maioria dos não reagidos [11C]CH3OTf e 6-OH-BTA-0, em seguida, 15% EtOH lava as impurezas residuais, e, finalmente, uma solução de etanol 50% elutes o desejado [11C] PiB em um frasco estéril. O traçador é então diluído com tampão de fosfato estéril e passa por procedimentos qc rigorosos antes da liberação para o local de imagem PET. Os cromatogramas analíticos típicos de HPLC UV e radioatividade do lote[11C]PiB adequado para administração são representados na Figura 3.

O tempo total de radiosíntese é de 10 min a partir da entrega de [11C]CH3OTf, o RCY de [11C]PiB usando 0,2 mg de precursor é de 22% (a partir de [11C]CH3OTf, não corrigido para decadência) e a atividade molar é 190 GBq/μmol. O traçador deve cumprir todas as especificações qc do multicêntricos dominantemente herdados Alzheimer Network Trials Unit (DIAN-TU) para ensaios clínicos: a pureza radioquímica deve estar acima de 95%; o conteúdo de impurezas não radioativas deve estar abaixo de 1,3 μg por dose de 10 mL; o pH deve estar dentro da faixa 4-8; e o teor de etanol e acetona deve estar abaixo de 10% e 3000 ppm, respectivamente. As amostras também devem ser estéreis e livres de endotoxina. Os resultados de quatro corridas típicas de radiossíntese são resumidos na Tabela 1.

Para que a técnica relatada funcione corretamente, o cuidado deve ser tomado durante diversas etapas críticas descritas acima. Para aplicar o precursor no cartucho tC18 (passo 2.4) a solução não deve ser empurrada para a saída, de modo a não encurtar o caminho eficaz para a separação do [11C]PiB dos materiais de partida não reagidos e possíveis produtos colaterais. O fluxo de [11C]CH3OTf através de um cartucho durante a transferência não deve exceder 20 mL/min (passo 4.1). Uma vez que a elução começa (passo 4.4), é muito importante manter o cartucho molhado e não deixar passar o ar para evitar a canalização de efeitos que podem resultar em menor pureza do traçador ou Menor RCY devido às perdas de [11C] PiB nos resíduos. Se o material de 5 porções usado na radiossíntese (passo 3.1) não for resistente à acetona, como um material de policarbonato padrão como ACC-101, a quantidade de acetona não deve exceder 100 μL, pois volumes maiores podem danificar o múltipla durante a transferência de atividade e resultar em síntese fracassada. Caso o pH não atenda às especificações, o cartucho tC18 pode, opcionalmente, ser lavado com 10 mL de água estéril entre os passos 4,7 e 4,8 na garrafa de resíduos.

Figure 1
Figura 1: Radiosíntese de [11C]PiB por 11C-metilação de 6-OH-BTA-0 precursor com [11C]CH3OTf. [11C]PiB é um dos radiotracers mais utilizados para imagens de placas amilóides associadas com a DA e outras condições neurodegenerativas por PET. Este traçador é comumente sintetizado através de 11C-metilação do precursor de aniline chamado 6-OH-BTA-0 usando [11C] triflate metilo ([11 C]CH3OTf) em solução ou no loop de injeção hplc seco (solvente técnica cativa). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Síntese passo a passo e purificação de [11C]PiB em um cartucho tC18. (A) Gasoso [11C]CH3OTf é passado através do cartucho carregado com 6-OH-BTA-0. Como descrito nos passos 4.1 e 4.2, [11C]CH3OTf está preso no cartucho contendo o precursor e reage com o precursor à temperatura ambiente por 2 min. (B) Lavar 1 ou lavar 2 solução é retirada para a seringa do dispensador. Conforme descrito na etapa 4.3, a bomba de seringa do módulo puxa o desentupidor da seringa cortada para cima, retirando uma solução de qualquer eluente através de uma linha conectada ao porto 1 do recanto. Asimpurezas são lavadas em uma garrafa de lixo. Conforme descrito na etapa 4.4, a bomba de seringa do módulo move o desentupidor da seringa cortada para baixo, empurrando a solução de lavagem retirada através do cartucho tC18 através dos portos 1, 3 e 4 do coletor em uma garrafa de resíduos. As etapas representadas nos diagramas B e C são repetidas em um ciclo diversas vezes para lavar para fora todos os materiais não reagiu do cartucho, como descrito nas etapas 4.5 - 4.7. (D)[11C]PiB é eluted com o eluent final em um frasco estéril através de um filtro estéril. Conforme descrito nos passos 4,8 e 4,9, a seringa cortada em uma bomba de seringa é desconectada da linha e substituída primeiro por uma seringa de 10 mL contendo 2,5 mL de 50% de etanol aquoso. Porto 5 do refogado é então alternado em direção ao frasco estéril e [11C]PiB é eluted do tC18 manualmente. A seringa vazia é então substituída por outra seringa contendo 10 mL de tampão de fosfato estéril e todo o conteúdo é empurrado através do tC18 para enxaguar as linhas, conforme descrito na etapa 4.10. O frasco estéril agora contém [11C]PiB em uma solução de etanol aquoso amortecida de 12,5 mL 10%. Este número foi modificado a partir de Boudjemeline et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: HPLC analítico de controle de qualidade de [11C]PiB. (A) Os tempos de retenção de [11C]CH3OH (de hidrolíse de [11C]CH3OTf), não reagiu [11C]CH3OTf, e tracer [11C]PiB no cromatograma de radioatividade são 2,1, 4,0 e 6,6 min, Respectivamente. A análise do rastreamento de radioatividade mostra que o RCP de [11C]PiB é de 98,0%. (B) Os tempos de retenção de 6-OH-BTA-0 (precursor) e 6-OH-BTA-1 (pico de traçador) no cromatograma UV são 3,6 e 5,9 min, respectivamente. A análise do traço UV mostra concentração precursora residual abaixo do limite aceitável (1,3 μg) e a ausência de outras impurezas não radioativas. Assim, a pureza radioquímica e química do traçador é aceitável para estudos clínicos pet. Condições hplc - coluna (Tabela de Materiais):5 μm, 100 x 4,0 mm; fase móvel: 40:60 acetonitrile/água taxa de fluxo: 0,7 mL/min. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 4
Figura 4: Otimização da quantidade precursora 6-OH-BTA-0. A menor quantidade (0,1 mg) fornece [11C]PiB em um rendimento radioquímico moderado (RCY) de 18,1±3,8%. A radiossíntese a partir de 0,2 mg fornece [11C]PiB um RCY de 22,0 ±3,1%, enquanto o aumento da quantidade para 0,3 mg melhora ainda mais o RCY para 32,1±3,7%, à custa de uma quantidade ligeiramente maior do precursor no produto final. Todos os RCY's não são corrigidos para decadência (tempo de radiosíntese de 10 min) a partir da radioatividade do [11C]CH3OTf preso no cartucho tC18. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 5
Figura 5: HPLC analítico de controle de qualidade de [11C]ABP688. (A) Cromatograma de radioatividade mostra RCP de combinado (E)- e (Z)-[11C]ABP688 de 98,1%. (B) Cromatograma UV mostra concentração precursora residual acima de 10 μg. Embora a pureza química possa ser aceitável para estudos clínicos pet, a atividade molar eficaz relativamente baixa (Am < 37 GBq/μmol) requer maior otimização de purificação. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Lote Corrida 1 Corrida 2 Corrida 3 Corrida 4
[11C] CH 3 OTf, GBq CH3OTf, GBq 9.21 11.25 7.84 6.44
[11C] PiB 2.26 2.37 2.11 1.41
RCY, %* RCY, %* 24.5 21.1 26.9 21.8
RCP, % 98 97.2 97.8 99.2
Atividade molar, GBq/μmol 154.6 322.6 121.1 162.1
Precursor residual, μg 0.32 0.55 0.58 0.87
Ph 5 5 5 5
Conteúdo etoh, % 9.4 8.8 7.7 8.1
Teor de acetona, ppm 33 38 46 33
Teste BET N/A N/A <10 UE/mL <10 UE/mL <10 UE/mL
Teste de esterilidade N/A N/A Sem crescimento Sem crescimento Sem crescimento
* Nota de rodapé: De [11C]CH3OTf, não corrigido para a decadência

Tabela 1. Os resultados representativos da produção de [11C]PiB são executados em condições otimizadas. Todos os lotes estão em conformidade com os requisitos para traçadores destinados a estudos clínicos PET.

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Discussion

Apesar do recente surgimento e aprovação da FDA de vários 18 traçadores PET rotulados por F,como florbetapir, florbetaben e flutemetamol, [11C]PiB continua a ser um traçador padrão ouro para imagens amilóides devido à rápida captação cerebral e baixa não específica Ligação. Atualmente, este traçador é sintetizado através de química molhada16 ou usando um "loop seco" abordagem4,17. Ambos os métodos exigem purificação hplc seguido de reformulação no etanol aquoso, que leva cerca de 20 - 30 min a partir de [11C]CH3OTf. Inspirados por alguns dos relatórios anteriores sobre a fase sólida apoiaram 11técnicas de metilação C e a importância clínica de [11C]PiB, visamos desenvolver uma radiossíntese deste traçador usando extração de fase sólida descartável barata ( Cartuchos SPE) como uma entidade "3-em-1" para reação, purificação e formulação.

Os passos mais críticos para a produção bem-sucedida de traçadores PET para imagens in vivo em seres humanos são: 1) incorporação do isótopo radioativo em uma molécula traçadora; 2) separação do traçador de espécies radioativas e não radioativas não reagiu; 3) reformulação do traçador em um solvente biologicamente compatível; 4) cumprimento dos procedimentos de controle de qualidade. Com base no método cativo solvente previamente relatado, esperávamos que a técnica suportada por SPE exigiria uma quantidade menor de precursor em comparação com 11C-metilação em solução. Em particular, os procedimentos cativos solventes previamente relatados para a radiossíntese de [11C]PiB exigem 0.5 - 1.0 mg do precursor4,17. Assim, investigamos não corrigido s rendimentos radioquímicos de decadência de [11C]PiB a partir de [11C]CH3OTf em três quantidades diferentes de 6-OH-BTA-0: 0,1, 0,2 e 0,3 mg. Mesmo a menor quantidade (0,1 mg) fornece uma quantidade moderada de [11C]PiB, embora em RCY relativamente baixo e menos confiável (18,1±3,8%). A radiossíntese a partir de 0,2 mg fornece um RCY de [11C]PiB (22,0±3,1%), enquanto o aumento da quantidade para 0,3 mg melhora ainda mais o RCY (32,1±3,7%), à custa de uma quantidade ligeiramente maior do precursor no produto final. Em todos os casos, a radiossíntese foi concluída em 10 min. Assim, a quantidade ideal precursor depende do RCY desejado e pureza de [11C]PiB em centros PET particulares. Os resultados dos experimentos de otimização de rendimento radioquímico baseados na quantidade precursora são resumidos na Figura 4. Notavelmente, a radiossíntese tenta usar [11C]CH3I como um agente metilante ou etanol como um solvente de reação não produziu o desejado [11C]PiB (dados não mostrados).

A separação quantitativa da mistura de reação à radiossíntese em um cartucho curto de SPE foi a parte mais desafiadora da técnica descrita. Nós supor que amines aromáticos 6-OH-BTA-0 e 6-OH-BTA-1 existem predominantemente em suas formas protonadas em mídia ácida e, portanto, teria perfis de elução mais nítidas da fase sólida de fase invertida. Assim, todas as soluções de etanol aquoso foram preparadas usando o buffer de acetato de 0,2 M no pH 3.7. Em seguida, determinamos que as soluções de etanol aquoso com concentração de EtOH até 15% gradualmente elute precursor a reagir 6-OH-BTA-0 e [11C]CH3OTf, enquanto radiolabeled [11C]PiB permanece preso no cartucho tC18. A fim de evitar o rejeito dessas impurezas em uma formulação traçador final, a concentração de etanol aumentou de 12,5% para 15% em uma elução de gradiente. Depois que todas as impurezas tinham sido lavadas fora do cartucho, a lusão do traçador foi conseguida usando uma quantidade mínima (2.5 mL) da solução concentrada do etanol (50%). A fim de manter o teor de etanol abaixo do limite de 10% e trazer o pH do traçador formulado dentro da faixa aceitável para injeção humana (4- 8), o traçador foi diluído com tampão de fosfato estéril.

Seguindo a otimização das condições, a radiossíntese de [11C]PiB foi automatizada usando uma unidade de síntese automatizada (ASU) comercialmente disponível, equipada com seringa de dispensador e coletor descartável. A configuração múltipla para esta ASU particular é simples, como descrito nos passos 3.1 - 3.5. Notavelmente, esta metodologia pode ser facilmente implementada na maioria dos outros ASU disponíveis seguindo as receitas descritas acima. Em condições otimizadas, lotes de [11C]PiB adequados para aplicação clínica são sintetizados com atividades finais que variam de 1,4 a 2,4 GBq (38 - 61 mCi).

Mais recentemente, aplicamos a técnica "3-em-1" para a rotulagem de radiolabelagem de [11C]ABP688, um traçador PET para a imagem de receptores de glutamato metabotrópico tipo 5 (mGlu5)18,19. A radiossíntese deste traçador depende da metilação C 11do grupo -OH no oxima; Portanto, a adição de base é necessária para deprotonar o precursor desmetilo. O hidróxido de Tetrabutylammonium (como uma solução de 1 M em MeOH) foi selecionado como base porque é solúvel na maioria dos solventes orgânicos polares. Em um experimento preliminar de radiorotulagem, uma solução de precursor (0,5 mg) no DMSO (100 μL) foi misturada com 1 M TBAOH em MeOH (20 μL) e a mistura foi cuidadosamente aplicada no cartucho tC18, conforme descrito acima (ver passo 2,4). Gasoso [11C]CH3Eu fui passado pelo cartucho como descrito nos passos 4.1 - 4.2 e a reação foi autorizada a prosseguir à temperatura ambiente por 5 min. Elução sequencial com soluções de etanol diluído em 0,2 M tampão de bicarbonato de sódio (pH 8,5 - 9.0) - 92 mL de 15% EtOH seguido por 92 mL de 20% EtOH - lavado para fora o não reagido [11C]CH3I e precursor residual. Radioquimicamente puro [11C]ABP688 (RCY = 18,2%, RCP >98,0%) foi então eluted com 50% solução EtOH no mesmo tampão através de um filtro estéril, como descrito nos passos 4,9 - 4,11. Apesar de mais de 98% do precursor ser removido com lavagens de etanol diluído, a presença de algum precursor não reagido no traçador final (até 20 μg) requer maior otimização do procedimento de radiossíntese. Essa otimização está em andamento e os resultados deste projeto serão publicados no devido tempo. Os cromatogramas analíticos representativos de HPLC UV e de radioatividade do lote[11C]ABP688 são mostrados na Figura 5.

Em conclusão, desenvolvemos uma fase sólida eficiente suportada por carbono-11 procedimento de radiorotulagem usando cartuchos spe baratos prontamente disponíveis como "3-em-1" entidades para radiosíntese, purificação e formulação de traçadores PET utilizados para Imaging. Os traçadores adequados para injeção humana são produzidos dentro de 10 minutos a partir daadição de 11agente c-metilato([11C]CH 3 OTf ou [11C]CH3I) em alta atividade de RCY e molar. Nós automatizamos totalmente essa técnica para torná-la compatível com os regulamentos de Boas Práticas de Fabricação (GMP) impostos pelas autoridades de saúde e segurança por radiação. A radiossíntese suportada por fase sólida requer uma baixa quantidade de precursor, evita o uso de solventes tóxicos, diminui o tempo de síntese e a dose de radiação sustentada pelo pessoal. Além disso, evitar falhas relacionadas ao HPLC melhora a confiabilidade da radiossíntese e permite o desenvolvimento de kits descartáveis para a produção de traçadordes de rotina.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este estudo foi parcialmente apoiado por uma subvenção 18-05 da Alzheimer's Society of Canada (para A. K.) e Brain Canada Foundation com o apoio da Health Canada. Os autores gostariam de reconhecer a Faculdade de Medicina da Universidade McGill, o Instituto Neurológico de Montreal e o McConnell Brain Imaging Centre para apoiar este trabalho. Agradecemos também à Sra. Monica Lacatus-Samoila por ajuda com procedimentos de controle de qualidade e drs. Jean-Paul Soucy e Gassan Massarweh pelo acesso a radioisótopos e à instalação de radioquímica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-OH-BTA-0 ABX advanced biochemical compounds 5101 Non-radioactive precursor of [11C]PiB
6-OH-BTA-1 ABX advanced biochemical compounds 5140 Non-radioactive standard of [11C]PiB
Agilent 1200 HPLC system Agilent Agilent 1200 Analytical HPLC system
Ethanol absolute Commercial alcohols 432526
Hamilton syringe (luer-tip, 250 µL) Hamilton HAM80701
MZ Analytical PerfectSil 120 MZ-Analysentechik GmbH MZ1440-100040 Analytical HPLC column
Perkin Elmer Clarus 480 GC system Perkin Elmer Clarus 480 Gas chromotograph
polycarbonate manifold Scintomics ACC-101 Synthesis manifold
Restek MTX-Wax column (30 m, 0.53 mm) Restek 70625-273 Analytical GC column
Scintomics GRP module Scintomics Scintomics GRP Automated synthesis unit
Sep-Pak tC18 Plus Waters WAT020515 Solid phase extraction cartridge
solvent-resistant manifold Scintomics ACC-201 Synthesis manifold
Spinal needle BD 405181
Sterile extension line B. Braun 8255059
Sterile filter Millipore SLLG013SL
Sterile vial (20mL) Huayi SVV-20A
Sterile water Baxter JF7623
Synthra MeIplus Research Synthra MeIplus Research [11C]CH3I/[11C]CH3OTf module
Syringe (10 mL) BD 309604
Syringe (1mL) BD 309659
Syringe (20 mL) B. Braun 4617207V Dispenser syringe
Vent filter Millipore TEFG02525

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References

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Singleton, T. A., Boudjemeline, M., Hopewell, R., Jolly, D., Bdair, H., Kostikov, A. Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers. J. Vis. Exp. (152), e60237, doi:10.3791/60237 (2019).

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