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Chemistry

Feste Phase 11C-Methylierung, Reinigung und Formulierung für die Herstellung von PET Tracern

Published: October 24, 2019 doi: 10.3791/60237
* These authors contributed equally

Summary

Wir berichten über eine effiziente Carbon-11-Radiolabeling-Technik zur Herstellung klinisch relevanter Tracer für die Positronen-Emissionstomographie (PET) mit Festphasen-Extraktionspatronen. 11 C-Methylierungsmittel wird durch eine Patrone mit Vorläufer vorinstalliert und aufeinanderfolgende Elution mit wässrim Ethanol liefert chemisch und radiochemisch reine PET-Tracer in hohen radiochemischen Erträgen.

Abstract

Die routinemäßige Produktion von Radiotracern, die in der Positronenemissionstomographie (PET) verwendet werden, beruht hauptsächlich auf nasser Chemie, bei der das radioaktive Synthon mit einem nicht-radioaktiven Vorläufer in Lösung reagiert. Dieser Ansatz erfordert die Reinigung des Tracers durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gefolgt von einer Neuformulierung in einem biokompatiblen Lösungsmittel für die menschliche Verabreichung. Wir haben vor kurzem einen neuartigen 11C-Methylierungsansatz für die hocheffiziente Synthese von Kohlenstoff-11-gekennzeichneten PET-Radiopharmazeutika entwickelt, wobei wir festaktige Phasenkartuschen als Einweg-"3-in-1"-Einheiten für die Synthese, Reinigung und Neuformulierung der Tracer. Dieser Ansatz versagt den Einsatz von präparativem HPLC und reduziert die Verluste des Tracers in Transferleitungen und durch radioaktiven Zerfall. Darüber hinaus verbessert die auf Patronen basierende Technik die Synthesezuverlässigkeit, vereinfacht den Automatisierungsprozess und erleichtert die Einhaltung der GMP-Anforderungen (Good Manufacturing Practice). Hier zeigen wir diese Technik am Beispiel der Produktion eines PET Tracer Pittsburgh-Verbindung B ([11C]PiB), einem Goldstandard-In-vivo-Bildgebungsmittel für Amyloid-Plaques im menschlichen Gehirn.

Introduction

Die Positronen-Emissionstomographie (PET) ist eine molekulare bildgebende Modalität, die auf dem Nachweis des radioaktiven Zerfalls eines Isotops beruht, das an einem biologisch aktiven Molekül befestigt ist, um die In-vivo-Visualisierung biochemischer Prozesse, Signale und Transformationen zu ermöglichen. . Carbon-11 (t1/2 = 20,3 min) ist eines der am häufigsten verwendeten Radioisotope in PET wegen seiner Fülle an organischen Molekülen und der kurzen Halbwertszeit, die mehrere Tracer-Verabreichungen am selben Tag für dasselbe menschliche oder tierische Subjekt und die Strahlenbelastung der Patienten reduziert. Viele mit diesem Isotop gekennzeichnete Tracer werden in klinischen Studien und in der medizinischen Grundlagenforschung für die in vivo PET-Bildgebung klassischer und neu entstehender biologisch relevanter Targets verwendet - [11C]raclopride für D2/D3-Rezeptoren, [11C] PiB für Amyloid-Plaques, [11C]PBR28 für Translocator-Protein - um nur einige zu nennen.

Carbon-11-markierte PET-Tracer werden überwiegend durch 11C-Methylierung von nicht-radioaktiven Vorläufern hergestellt, die -OH (Alkohol, Phenol und Carbonsäure), -NH (Amin und Amid) oder -SH (Thiol) Gruppen enthalten. Kurz gesagt, das Isotop wird im Gasziel eines Zyklotrons über eine 14N(p,))11C Kernreaktion in chemischer Form von [11C]CO2 erzeugt. Letzteres wird dann in [11C]methyliodid ([11C]CH3I) entweder über Nasschemie (Reduktion auf [11C]CH3OH mit LiAlH4 gefolgt von Abschreckung mit HI)1 oder Chemie (katalytische Reduktion auf [11C]CH4 gefolgt von radikaler Iodination mit molekularem I2)2. [11C] CH3I kann dann weiter in das reaktivere 11C-Methyltriflate ([11C]CH3OTf) umgewandelt werden, indem es über eine silberne Triflatesäule3übergeben wird. Die 11-C-Methylierungerfolgt dann entweder durch Blasen des radioaktiven Gases in eine Lösung des nicht-radioaktiven Vorläufers in organischem Lösungsmittel oder über das elegantere Lösungsmittel "Loop"-Verfahren4,5. Der 11C-Tracer wird dann mit Hilfe von HPLC gereinigt, in einem biokompatiblen Lösungsmittel umformuliert und durch einen sterilen Filter geleitet, bevor er menschlichen Probanden verabreicht wird. Alle diese Manipulationen müssen schnell und zuverlässig sein, angesichts der kurzen Halbwertszeit von Kohlenstoff-11. Der Einsatz eines HPLC-Systems erhöht jedoch signifikant die Verluste des Tracers und die Produktionszeit, erfordert oft den Einsatz toxischer Lösungsmittel, erschwert die Automatisierung und führt gelegentlich zu fehlgeschlagenen Synthesen. Darüber hinaus verlängert die erforderliche Reinigung der Reaktoren und der HPLC-Säule Verzögerungen zwischen den Synthesen nachfolgender Tracerchargen und erhöht die Strahlenexposition des Personals.

Die Radiochemie von Fluor-18 (t1/2 = 109,7 min), dem anderen weit verbreiteten PET-Isotop, wurde vor kurzem durch die Entwicklung von Kassetten-basierten Kits vorangetrieben, die die Notwendigkeit einer HPLC-Reinigung ausdemivieren. Durch den Einsatz von Solid-Phase-Extraktions-Kartuschen (SPE) ermöglichen diese Volleinweg-Kits die zuverlässige Routineproduktion von 18F-Tracern, einschließlich [18F]FDG, [18F]FMISO, [18F]FMC und anderen, mit kürzerer Synthese reduzierter Personaleinsatz und minimale Wartung der Geräte. Einer der Gründe, warum Carbon-11 ein weniger beliebtes Isotop in der PET-Bildgebung bleibt, ist das Fehlen ähnlicher Kits für die Routinemäßigproduktion von 11C-Tracern. Ihre Entwicklung würde die synthetische Zuverlässigkeit deutlich verbessern, die radiochemischen Erträge erhöhen und die Automatisierung und vorbeugende Wartung der Produktionsmodule vereinfachen.

Derzeit verfügbare Produktionskits nutzen preiswerte, EINweg-SPE-Kartuschen anstelle von HPLC-Säulen für die Trennung des Radiotracers von unreagiertem radioaktiven Isotop, Vorläufer und anderen radioaktiven und nicht-radioaktiven Nebenprodukten. Im Idealfall verläuft die Radiolabel-Reaktion auch auf der gleichen Patrone; z. B. die [18F]Fluormethylierung von Dimethylaminoethanol mit gasförmigem [18F]CH2BrF bei der Herstellung von Prostatakrebs-Bildgebung PET Tracer [18F]fluoromethylcholin tritt auf einer Kation-Austausch-Harzkartusche auf 6. Obwohl ähnliche Verfahren für die Radiobeschriftung von mehreren 11C-Tracern auf Patronen berichtet wurden7,8 und wurde besonders leistungsfähig für die Radiosynthese von [11C]cholin9 und [11C]Methionin10, diese Beispiele bleiben auf onkologische PET-Tracer beschränkt, bei denen die Trennung vom Vorläufer oft nicht erforderlich ist. Kürzlich berichteten wir über die Entwicklung von "[11C]kits" für die Herstellung von [11C]CH3I11 und nachfolgender 11C-Methylierung sowie fester phasengestützter Synthese12 in unseren Bemühungen, die routinemäßige Produktion von 11C-Tracern zu vereinfachen. Hier möchten wir unsere Fortschritte am Beispiel der soliden Phase unterstützten Radiosynthese von [11C]PiB, einem Radiotracer für die Bildgebung von Aa, demonstrieren, der das Feld der Alzheimer-Krankheit (AD) Revolutioniert hat, als es 2003 zum ersten Mal entwickelt wurde ( Abbildung 1) 13,14. Bei dieser Methode wird flüchtige [11C]CH3OTf (bp 100 °C) über 6-OH-BTA-0 Vorläufer auf dem Harz einer Einwegpatrone abgelagert. PET Tracer [11C]PiB wird dann durch Elution aus der Kartusche mit biokompatiblem wässrigem Ethanol von der Vorstufe und radioaktiven Verunreinigungen getrennt. Darüber hinaus haben wir diese Methode der[11C]PiB Radiosynthese mit einem ferngesteuerten Radiochemie-Synthesemodul und Einwegkassettenkits automatisiert. Insbesondere haben wir diese Radiosynthese auf einem 20-Ventil-Radiochemiemodul implementiert, das mit Spritzenantrieb (Dispenser) ausgestattet ist, der standardmäßig 20 ml Einweg-Kunststoffspritze, Gasdurchflussregler, Vakuumpumpe und Messgerät passt. Aufgrund der Einfachheit dieser Methode sind wir zuversichtlich, dass sie auf die meisten kommerziell erhältlichen automatisierten Synthesizer umgestellt werden kann, entweder auf Kassettenbasis oder mit stationären Ventilen ausgestattet. Diese solide Phasenunterstützte Technik erleichtert [11C]PiB-Produktion, die den GMP-Vorschriften (Good Manufacturing Practice) entspricht, und verbessert die Synthesezuverlässigkeit. Die hier beschriebene Technik reduziert auch die Für die Radiosynthese erforderliche Vorläufermenge, verwendet nur "grüne" biokompatible Lösungsmittel und verringert die Zeit zwischen aufeinanderfolgenden Produktionschargen.

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Protocol

1. Herstellung von Puffern und Eluenten

  1. 2,72 g Natriumacetattrihydrat in 100 ml Wasser auflösen, um 0,2 m Natriumacetatlösung (Lösung A) herzustellen.
  2. 11,4 ml Eisessigsäure in 1 L Wasser auflösen, um 0,2 M Essigsäurelösung (Lösung B) zuzubereiten.
  3. Kombinieren Sie 50 ml Lösung A mit 450 ml Lösung B, um den Acetatpuffer bei pH 3,7 (Puffer 1) gemäß pufferreferenzzentrum15vorzubereiten. Überprüfen Sie den pH-Wert des Puffers mit pH-Streifen oder einem pH-Messgerät.
  4. Kombinieren Sie 12,5 ml absolutes Ethanol mit 87,5 ml Puffer 1 zu 12,5% wässriger EtOH-Lösung (Wasch1) in einer 100 ml Flasche.
  5. Kombinieren Sie 15 ml absolutes Ethanol mit 85 ml Puffer 1, um 15% wässrige EtOH-Lösung (Wasch2) in einer 100 ml Flasche herzustellen.
  6. Kombinieren Sie 5 ml absolutes Ethanol mit 5 ml Puffer 1 zu einer 50% wässrigen EtOH-Lösung (Endeluent) und ziehen Sie 2,5 ml dieser Lösung in eine 10 ml Spritze.

2. Anwendung des Vorläufers der Patrone

  1. 10 ml Wasser gefolgt von 5 ml Aceton durch die tC18-Patrone passieren, um sie vorzukonditionen.
  2. Trocknen Sie die Kartusche mit einem Stickstoffstrom bei 50 ml/min für 1 min.
  3. 2 mg des Vorläufers 6-OH-BTA-0 in 1 ml wasserfreiem Aceton auflösen.
  4. Halten Sie eine Luer-Spitze 250 L Präzisionsglasspritze nach unten, ziehen Sie 100 l der Vorläuferlösung und 50 l Luftkissen auf der Flüssigkeit ab. Entfernen Sie die Nadel und tragen Sie die Vorläuferlösung auf die tC18-Patrone vom weiblichen Ende auf, indem Sie den Kolben langsam ganz nach unten drücken. Schieben Sie die Lösung nicht weiter!

3. Einrichten des Verteilers für die automatisierte Synthese

  1. Sichern Sie den standardmäßigen 5-Port-Einwegkrümmer am Synthesemodul und montieren Sie ihn gemäß Abbildung 2 und den Schritten 3.2 - 3.5 unten.
    HINWEIS: Wir empfehlen die Verwendung von acetonresistenten Verteilern (siehe Materialtabelle).
  2. Port 1 hat zwei Positionen. Schließen Sie den horizontalen Einlass an den automatisierten Spender an, der mit einer 20 ml Spritze ausgestattet ist. Verbinden Sie den vertikalen Einlass mit der Flasche mit Waschen 1.
  3. Schließen Sie den Ausgang des Moduls an, das [11C]CH3OTf erzeugt, an Port 2 des Verteilers.
  4. Installieren Sie die tC18-Patrone, die mit dem Vorläufer 6-OH-BTA-0 zwischen den Ports 3 und 4 geladen ist.
  5. Port 5 hat zwei Positionen. Schließen Sie den horizontalen Auslass an die Abfallflasche an, die mindestens 200 ml fassen muss. Verbinden Sie den vertikalen Auslass mit der sterilen Durchstechflasche zur Tracer-Sammlung über den sterilen Filter.

4. Radiosynthese von [11C]PiB

VORSICHT: Alle Manipulationen mit radioaktiven Isotopen müssen in einer bleigeschützten Heißzelle von Personal durchgeführt werden, das über eine angemessene Ausbildung verfügt, um mit radioaktiven Stoffen zu arbeiten.
HINWEIS: Dieses Protokoll deckt nicht die Einzelheiten der Produktion von [11C]CO2 im Zyklotron und seine Umwandlung in [11C]CH3OTf mit dem Radiochemiemodul ab. Diese Verfahren hängen von der individuellen Ausstattung des Radiochemielabors ab und fallen nicht in den Anwendungsbereich dieses Protokolls. Unser PET-Zentrum ist mit einem IBA-Cyclotron ausgestattet, das Kohlenstoff-11 in chemischer Form von [11C]CO2über die 14N(p,))11C Kernreaktion mit einemN2/O2-Gasgemisch (99.5:0.5) im Gas erzeugt. und ein handelsübliches Modul zur Herstellung von [11C]CH3I über die "Trockenmethode" (katalytische Reduktion auf [11C]CH4 gefolgt von radikaler Iodination). [11C] CH3OTf wird durch Passieren [11C]CH3 Iüber eine silberne Triflate-Säule hergestellt, die bei 20 ml/min auf 175 °C erhitzt wird.

  1. Liefern Sie [11C]CH3OTf über Port 2 in den Verteiler und leiten Sie ihn durch die geladene tC18-Patrone bei 20 ml/min Ausgangsstrom, der durch das [11C]CH3OTf-Modul geregelt wird, über die Ports 3 und 4 und in die Abfallflasche, wie auf Abbildung 2A.
  2. Sobald die gesamte Radioaktivität übertragen und auf der tC18-Patrone eingeschlossen wurde, wie sie vom Radioaktivitätsdetektor hinter dem Patronenhalter überwacht wird, stoppen Sie den Gasfluss, indem Sie Den Anschluss 2 schließen. Lassen Sie die Patrone für 2 min sitzen, um die Reaktion abzuschließen.
  3. 19 ml Waschlösung (siehe Schritt 1.4) aus der 100 ml Flasche in die Spenderspritze durch Port 1 bei 100 ml/min zurückziehen, wie in Abbildung 2Bdargestellt.
  4. 18,5 ml Waschlösung 1 vom Spender über die tC18-Patrone über die Ports 3 und 4 und in die Abfallflasche bei 50 ml/min geben, wie in Abbildung 2Cdargestellt. Stellen Sie sicher, dass Luftblasen im Verteiler fehlen, da sie die Trenneffizienz verringern könnten.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 4.3 und 4.4 viermal, ziehen Sie jeweils 18,5 ml Waschlösung ab und verzichten Sie sie. Das Gesamtvolumen der Wasch-1-Lösung, die durch tC18 geleitet wird, beträgt 92,5 ml; Es kann jedoch innerhalb des 90 - 100 ml-Bereichs variieren, abhängig von dem verwendeten Synthesemodul.
  6. Schalten Sie die Eingangsleitung an Port 1 von Wash 1 auf 2 Lösung zu waschen (siehe Schritt 1.5).
  7. Wiederholen Sie die Schritte 4.3 und 4.4 dreimal, indem Sie jeweils 18,5 ml Waschlösung zurückziehen und dosieren. Das Gesamtvolumen der Wasch-2-Lösung, die durch tC18 geleitet wird, beträgt 55,5 ml. Es kann jedoch innerhalb des 50 - 60 ml Bereichs variieren, abhängig von dem verwendeten Synthesemodul.
  8. Klappen Sie 5 in Richtung der endletzten Durchstechflasche, wie in Abbildung 2Ddargestellt. Trennen Sie die Leitung vom Spender und schließen Sie sie an die 10 ml Spritze an, die 2,5 ml der endgelösten Lösung (50% wässrige EtOH, siehe Schritt 1,6) und 7,5 ml Luft enthält.
  9. Halten Sie die Spritze nach unten, schieben Sie die endgültige Eluentenlösung (2,5 ml) gefolgt von Luft (7,5 ml) über die tC18-Patrone über die Ports 3 und 4 und manuell in die sterile Durchstechflasche zur Tracer-Sammlung über den sterilen Filter, wie in Abbildung dargestellt 2D.
  10. Trennen Sie die leere Spritze, schließen Sie die 10 ml Spritze mit 10 ml des sterilen Phosphatpuffers (Rezept nicht enthalten, da sie variieren kann) und drücken Sie das gesamte Volumen durch die tC18-Patrone in die sterile Durchstechflasche, wie oben beschrieben(Abbildung 2D ). Trennen Sie die Spritze und spülen Sie die Linie mit 10 ml Luft mit derselben Spritze.
  11. 0,7 ml der endgültigen Tracer-Formulierung zurückziehen und Proben für Qualitätskontrollverfahren (0,1 ml), bakteriellen Endotoxintest (0,1 ml) und Sterilität (0,5 ml) sammeln.

5. Qualitätskontrollverfahren

VORSICHT: Jede Charge des Radiotracers muss den entsprechenden Qualitätskontrollverfahren (QC) unterzogen werden, bevor sie zur Verabreichung an menschliche oder tierische Personen an die PET-Bildstelle freigegeben wird. Die Autoren dieses Manuskripts sind nicht verantwortlich für die Einhaltung des radiotracer in anderen Zentren mit lokalen Gesundheitsbehörden Vorschriften produziert.

  1. Führen Sie QC-Verfahren vor der Freisetzung durch, die Tests auf radiochemische Identität (RCI), radiochemische Reinheit (RCP), chemische Reinheit und Molaktivität des Tracers sowie Restlösungsmittelgehalt und pH-Wert der Formulierung umfassen müssen.
  2. Bestimmen Sie die RCI, RCP, chemische Reinheit und Molaktivität mittels analytischem HPLC-System mit UV-Strahlung (Überwachung bei 350 nm) und Radioaktivitätsdetektoren und einer umgedrehten Phase-Säule. Bestimmen Sie die Retentionszeiten von 6-OH-BTA-0 und 6-OH-BTA-1 und kalibrieren Sie das Gerät, um den Inhalt jeder Verbindung zu quantifizieren.
  3. Bestimmen Sie den Restlösungsmittelgehalt mittels analytischer Gaschromatographie, die mit einer Kapillarsäule ausgestattet sind. Bestimmen Sie die Retentionszeiten von Aceton und Ethanol und kalibrieren Sie das Gerät, um den Gehalt jedes Lösungsmittels zu quantifizieren.
  4. Führen Sie den bakteriellen Endotoxintest mit einem Patronenleser durch, der mit geeigneten Patronen ausgestattet ist.
  5. Führen Sie die Sterilitätsanalyse der Probe mindestens 14 Tage nach der Synthese durch, um das Fehlen von Bakterienwachstum zu gewährleisten, oder senden Sie die Sterilitätsprobe an ein von der örtlichen Gesundheitsbehörde akkreditiertes Labor.

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Representative Results

Um eine typische Radiosynthese von [11C]PiB zusammenzufassen, wird gasförmiges [11C]CH3OTf zuerst durch eine tC18-Patrone geleitet, die mit einer Vorstufevorstufe vorinstalliert ist (Abbildung 1). Die Trennung des Reaktionsgemisches erfolgt dann durch sukzessive Elution mit wässrigen Ethanollösungen wie folgt. Zuerst elutiert 12,5% EtOH die Mehrheit der unreagierten [11C]CH3OTf und 6-OH-BTA-0, dann wärst 15% EtOH die Restunreinheiten aus, und schließlich elutiert eine 50% Ethanollösung die gewünschte [11C]PiB in eine sterile Durchstechflasche. Der Tracer wird dann mit sterilem Phosphatpuffer verdünnt und unterliegt strengen QC-Verfahren, bevor er an die PET-Bildstelle freigegeben wird. Typische analytische HPLC-UV- und Radioaktivitätschromatogramme der für die Verabreichung geeigneten [11C]PiB-Charge sind in Abbildung 3dargestellt.

Die Gesamtradiosynthesezeit beträgt 10 min ab der Lieferung von [11C]CH3OTf, die RCY von [11C]PiB mit 0,2 mg Vorläufer beträgt 22% (ab [11C]CH3OTf, nicht für Zerfall korrigiert) und die molare Aktivität 190 GBq/Mol. Der Tracer muss alle QC-Spezifikationen der multizentrischen Dominantly Inherited Alzheimer Network Trials Unit (DIAN-TU) für klinische Studien erfüllen: Die radiochemische Reinheit muss über 95 % liegen; der Gehalt an nicht radioaktiven Verunreinigungen muss unter 1,3 g pro 10 ml Dosis liegen; der pH-Wert muss innerhalb des Bereichs 4 - 8 liegen; und der Ethanol- und Acetongehalt muss unter 10 % bzw. 3000 ppm liegen. Die Proben müssen auch steril und endotoxinfrei sein. Die Ergebnisse von vier typischen Radiosyntheseläufen sind in Tabelle 1zusammengefasst.

Damit die gemeldete Technik ordnungsgemäß funktioniert, muss bei mehreren oben beschriebenen kritischen Schritten Vorsicht geboten sein. Um den Vorläufer auf die tC18-Patrone (Schritt 2.4) aufzutragen, darf die Lösung nicht in Richtung Ausgang geschoben werden, um den effektiven Weg zur Trennung der [11C]PiB von den unreagierten Ausgangsstoffen und möglichen Nebenprodukten nicht zu verkürzen. Der Durchfluss von [11C]CH3OTf durch eine Patrone während der Übertragung darf 20 ml/min (Schritt 4.1) nicht überschreiten. Sobald die Elution beginnt (Schritt 4.4), ist es sehr wichtig, die Patrone nass zu halten und keine Luft durchzulassen, um Kanalisierungseffekte zu vermeiden, die aufgrund der Verluste von[11C]PiB im Abfall zu einer geringeren Reinheit des Tracers oder zu niedrigerer RCY führen könnten. Wenn der in der Radiosynthese verwendete 5-Port-Verteiler (Schritt 3.1) nicht resistent gegen Aceton ist, wie z. B. ein Standard-Polycarbonatkrümmer wie ACC-101, darf die Acetonmenge 100 l nicht überschreiten, da größere Volumina den Verteiler während der Aktivitätsübertragung beschädigen und zu einer fehlgeschlagenen Synthese führen. Entspricht der pH-Wert nicht den Spezifikationen, kann die tC18-Patrone optional mit 10 ml sterilem Wasser zwischen den Schritten 4.7 und 4.8 in die Abfallflasche spülen.

Figure 1
Abbildung 1: Radiosynthese von [11C]PiB durch 11C-Methylierung des 6-OH-BTA-0-Vorläufers mit [11C]CH3OTf. [11C]PiB ist einer der am häufigsten verwendeten Radiotracer zur Abbildung von Amyloid-Plaques im Zusammenhang mit mit AD und anderen neurodegenerativen Erkrankungen durch PET. Dieser Tracer wird üblicherweise über 11C-Methylierung des Anilinvorläufers 6-OH-BTA-0 mit[11C]methyltriflate ([11C]CH3OTf) entweder in Lösung oder in der trockenen HPLC-Injektionsschleife (Lösungsmittel Ingefangenschaft). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Schrittweise Synthese und Reinigung von [11C]PiB auf einer tC18-Patrone. (A) Gasförmig [11C]CH3OTf wird durch die mit 6-OH-BTA-0 beladene Patrone geleitet. Wie in den Schritten 4.1 und 4.2 beschrieben, wird [11C]CH3OTf auf der Patrone gefangen, die den Vorläufer enthält, und reagiert mit dem Vorläufer bei Raumtemperatur für 2 min. (B) Wash 1 oder Wash 2 Lösung wird in die Spenderspritze zurückgezogen. Wie in Schritt 4.3 beschrieben, zieht die Spritzenpumpe des Moduls den Kolben der abgeschnittenen Spritze nach oben und zieht eine Lösung von entweder Eluent durch eine Leitung, die mit Port 1 des Verteilers verbunden ist. (C) Die Verunreinigungen werden in eine Abfallflasche ausgewaschen. Wie in Schritt 4.4 beschrieben, bewegt die Spritzenpumpe des Moduls den Kolben der abgeschnittenen Spritze nach unten und schiebt die zurückgezogene Waschlösung über die Anschlüsse 1, 3 und 4 des Verteilers durch die tC18-Patrone in eine Abfallflasche. Die in den Diagrammen B und C dargestellten Schritte werden mehrmals in einem Zyklus wiederholt, um alle unreagierten Materialien aus der Patrone auszuwaschen, wie in den Schritten 4.5 - 4.7 beschrieben. (D) [11C]PiB wird mit dem Endeluent durch einen sterilen Filter in eine sterile Durchstechflasche eluiert. Wie in den Schritten 4.8 und 4.9 beschrieben, wird die in eine Spritzenpumpe geklemmte Spritze von der Leitung getrennt und zunächst durch eine 10 ml Spritze ersetzt, die 2,5 ml 50 % wässriges Ethanol enthält. Port 5 des Verteilers wird dann in Richtung der sterilen Durchstechflasche umgeschaltet und [11C]PiB wird manuell aus dem tC18 eluiert. Die leere Spritze wird dann durch eine andere Spritze ersetzt, die 10 ml sterilen Phosphatpuffer enthält, und der gesamte Inhalt wird durch das tC18 geschoben, um die in Schritt 4.10 beschriebenen Leitungen zu spülen. Die sterile Durchstechflasche enthält nun [11C]PiB in einer 12,5 ml 10% gepufferten wässrigen Ethanollösung. Diese Zahl wurde von Boudjemeline et al.12geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Qualitätskontrolle analytische RPLC von [11C]PiB. (A) Die Retentionszeiten von [11C]CH3OH (aus Hydrolyse von [11C]CH3OTf), unreagierte [11C]CH3OTf und Tracer [11C]PiB auf dem Radioaktivitätschromatogramm sind 2,1, 4,0 und 6,6 min, in dieser reihenfolge. Die Analyse der Radioaktivitätsspur zeigt, dass der RCP von [11C]PiB 98,0% beträgt. (B) Die Retentionszeiten von 6-OH-BTA-0 (Vorläufer) und 6-OH-BTA-1 (Tracerpeak) am UV-Chromatogramm betragen 3,6 bzw. 5,9 min. Die Analyse der UV-Spur zeigt die Restvorläuferkonzentration unterhalb des akzeptablen Grenzwerts (1,3 g) und das Fehlen anderer nichtradioaktiver Verunreinigungen. Somit ist die radiochemische und chemische Reinheit des Tracers für klinische PET-Studien akzeptabel. HPLC-Bedingungen - Säule (Materialtabelle):5 m, 100 x 4,0 mm; mobile Phase: 40:60 Acetonitril/Wasserdurchfluss: 0,7 ml/min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Optimierung des Vorläuferbetrags 6-OH-BTA-0. Die niedrigste Menge (0,1 mg) liefert [11C]PiB in einer moderaten radiochemischen Ausbeute (RCY) von 18,1 bis 3,8 %. Die Radiosynthese ab 0,2 mg liefert [11C]PiB eine RCY von 22,0 bis 3,1 %, während die Erhöhung der Menge auf 0,3 mg die RCY weiter auf 32,1 bis 3,7 % erhöht, auf Kosten einer etwas höheren Menge des Vorläufers im Endprodukt. Alle RCY es werden nicht für Zerfall (Radiosynthesezeit von 10 min) ab der Radioaktivität der [11C]CH3OTf auf tC18 Patrone gefangen korrigiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Analytische HPLC der Qualitätskontrolle von [11C]ABP688. (A) Radioaktivitätschromatogramm zeigt RCP von kombinierten (E)- und (Z)-[11C]ABP688 von 98,1%. (B) UV-Chromatogramm zeigt eine Restvorläuferkonzentration von über 10 g. Während die chemische Reinheit für klinische PET-Studien akzeptabel sein könnte, erfordert eine relativ geringe effektive Molaktivität (Am < 37 GBq/Mol) eine weitere Reinigungsoptimierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

menge Lauf 1 Lauf 2 Lauf 3 Lauf 4
[11C] CH3OTf, GBq 9.21 11.25 7.84 6.44
[11C] PiB, GBq 2.26 2.37 2.11 1.41
RCY, %* 24.5 21.1 26.9 21.8
RCP, % 98 97.2 97.8 99.2
Molaktivität, GBq/Mol 154.6 322.6 121.1 162.1
Restvorläufer, g 0.32 0.55 0.58 0.87
Ph 5 5 5 5
EtOH-Gehalt, % 9.4 8.8 7.7 8.1
Acetongehalt, ppm 33 38 46 33
BET-Test N/A <10 EU/ml <10 EU/ml <10 EU/ml
Sterilitätstest N/A Kein Wachstum Kein Wachstum Kein Wachstum
* Fußnote: Von [11C]CH3OTf, nicht wegen Zerfall s. korrigiert

Tabelle 1. Repräsentative Ergebnisse der [11C]PiB Produktion läuft unter optimierten Bedingungen. Alle Chargen entsprechen den Anforderungen an Tracer, die für klinische PET-Studien bestimmt sind.

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Discussion

Trotz der jüngsten Entstehung und FDA-Zulassung von mehreren 18F-markierten PET-Tracern, wie Florbetapir, Florbetaben und Flutemetamol, [11C]PiB bleibt ein Gold Standard Tracer für Amyloid-Bildgebung aufgrund der schnellen Gehirnaufnahme und niedrige unspezifische band. Derzeit wird dieser Tracer entweder über nasse Chemie16 oder mit einem "Trockenschleifen"-Ansatz4,17synthetisiert. Beide Methoden erfordern eine HPLC-Reinigung, gefolgt von einer Neuformulierung in wässrigem Ethanol, das ca. 20 - 30 min ab [11C]CH3OTf dauert. Inspiriert von einigen früheren Berichten über feste Phase unterstützt 11C-Methylierung sproges Techniken und die klinische Bedeutung von [11C]PiB, zielten wir darauf ab, eine Radiosynthese dieses Tracers mit kostengünstigen Einweg-Festphasenextraktion zu entwickeln ( SPE) Kartuschen als "3-in-1"-Einheit für Reaktion, Reinigung und Formulierung.

Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Produktion von PET-Tracern für die In-vivo-Bildgebung bei menschlichen Probanden sind: 1) Aufnahme des radioaktiven Isotops in ein Tracermolekül; 2) Trennung des Tracers von nicht rehandelt radioaktiven und nicht-radioaktiven Arten; 3) Neuformulierung des Tracers in einem biologisch kompatiblen Lösungsmittel; 4) Einhaltung der Qualitätskontrollverfahren. Basierend auf der zuvor gemeldeten Lösungsmittel-Captive-Methode erwarteten wir, dass die SPE-unterstützte Technik eine geringere Menge an Vorläufer im Vergleich zu 11C-Methylierung in Lösung erfordern würde. Insbesondere erfordern zuvor gemeldete Lösungsmittel-Captive-Verfahren zur Radiosynthese von [11C]PiB 0,5 - 1,0 mg des Vorläufers4,17. So untersuchten wir nicht korrigiert für Zerfall radiochemische Erträge von [11C]PiB ab [11C]CH3OTf bei drei verschiedenen Mengen von 6-OH-BTA-0: 0,1, 0,2 und 0,3 mg. Selbst der niedrigste Wert (0,1 mg) liefert eine moderate Menge von [11C]PiB, wenn auch bei relativ niedrigem und weniger zuverlässigem RCY (18,1 bis 3,8%). Die Radiosynthese ab 0,2 mg ergibt eine RCY von [11C]PiB (22,0 bis 3,1 %), erhöht gleichzeitig die Menge auf 0,3 mg verbessert die RCY (32,1 bis 3,7 %), was auf Kosten einer etwas höheren Menge des Vorläufers im Endprodukt zugeht. In allen Fällen wurde die Radiosynthese in 10 min abgeschlossen. Somit hängt die optimale Vorläufermenge von der gewünschten RCY und Reinheit von[11C]PiB in bestimmten PET-Zentren ab. Die Ergebnisse der radiochemischen Ertragsoptimierungsexperimente auf Basis der Vorläufermenge sind in Abbildung 4zusammengefasst. Insbesondere haben Radiosyntheseversuche, bei der [11C]CH3I als Methylierungsmittel oder Ethanol als Reaktionslösungsmittel verwendet wurde, nicht die gewünschte[11C]PiB ergeben (Daten nicht dargestellt).

Die quantitative Trennung des Radiosynthese-Reaktionsgemisches auf einer kurzen SPE-Patrone war der anspruchsvollste Teil der beschriebenen Technik. Wir vermuteten, dass aromatische Aminien 6-OH-BTA-0 und 6-OH-BTA-1 überwiegend in ihren protonierten Formen in sauren Medien existieren und daher schärfere Elutionsprofile aus der umgedrehten Solidphase aufweisen würden. Daher wurden alle wässrigen Ethanollösungen mit 0,2 M Acetatpuffer bei pH 3,7 hergestellt. Als nächstes stellten wir fest, dass wässrige Ethanollösungen mit EtOH-Konzentration von bis zu 15% nach und nach unreagierten Vorläufer 6-OH-BTA-0 und [11C]CH3OTf elute, während radioaktiv [11C]PiB auf der tC18-Patrone gefangen bleibt. Um zu verhindern, dass diese Verunreinigungen in eine endgültige Tracerformulierung eingegliedert werden, wurde die Ethanolkonzentration bei einer Gradientenelution von 12,5 % auf 15 % erhöht. Nachdem alle Verunreinigungen aus der Kartusche gewaschen worden waren, wurde die Tracer-Elution mit einer minimalen Menge (2,5 ml) der konzentrierten Ethanollösung (50%) erreicht. Um den Ethanolgehalt unter dem Grenzwert von 10 % zu halten und den pH-Wert des formulierten Tracers in den akzeptablen Bereich für die menschliche Injektion (4 - 8) zu bringen, wurde der Tracer mit einem sterilen Phosphatpuffer verdünnt.

Nach der Konditionsoptimierung wurde die Radiosynthese von [11C]PiB mit einer handelsüblichen automatisierten Syntheseeinheit (ASU) automatisiert, die mit einer Spenderspritze und einem Einwegkrümmer ausgestattet war. Die vielfältigen Einstellungen für diese spezielle ASU sind einfach, wie in den Schritten 3.1 - 3.5 beschrieben. Insbesondere kann diese Methode leicht auf den meisten anderen verfügbaren ASU nach den oben beschriebenen Rezepten implementiert werden. Unter optimierten Bedingungen werden Chargen von [11C]PiB, die für die klinische Anwendung geeignet sind, mit Endaktivitäten von 1,4 bis 2,4 GBq (38 - 61 mCi) synthetisiert.

In jüngerer Zeit haben wir die "3-in-1"-Technik für die Radiobeschriftung von [11C]ABP688, einem PET-Tracer zur Abbildung von metabotropen Glutamatrezeptoren Typ 5 (mGlu5)18,19, angewendet. Die Radiosynthese dieses Tracers beruht auf der 11-C-Methylierung der -OH-Gruppe im Oxim; daher ist eine Zugabe der Basis erforderlich, um den Desmethylvorläufer zu deprotonieren. Tetrabutylammoniumhydroxid (als 1 M Lösung in MeOH) wurde als Basis ausgewählt, da es in den meisten polaren organischen Lösungsmitteln löslich ist. In einem vorläufigen Radiolabeling-Experiment wurde eine Lösung des Vorläufers (0,5 mg) in DMSO (100 l) mit 1 M TBAOH in MeOH (20 l) gemischt und das Gemisch wurde wie oben beschrieben sorgfältig auf die tC18-Patrone aufgetragen (siehe Schritt 2.4). Gasförmig [11C]CH3I wurde durch die Kartusche wie in den Schritten 4.1 - 4.2 beschrieben und die Reaktion durfte bei Raumtemperatur für 5 min erfolgen. Sequenzielle Elution mit verdünnten Ethanollösungen in 0,2 M Natriumbicarbonatpuffer (pH 8,5 - 9.0) - 92 ml von 15% EtOH gefolgt von 92 ml von 20% EtOH - ausgewaschen die unreagierte [11C]CH3 Iund Restvorläufer. Radiochemisch rein [11C]ABP688 (RCY = 18,2%, RCP >98,0%) wurde dann mit 50% EtOH-Lösung im selben Puffer durch einen sterilen Filter eluiert, wie in den Schritten 4.9 - 4.11 beschrieben. Trotz der Tatsache, dass über 98% des Vorläufers mit verdünnten Ethanolspülungen entfernt wird, erfordert das Vorhandensein eines unreagierten Vorläufers im Endablauf (bis zu 20 g) eine weitere Optimierung des Radiosyntheseverfahrens. Diese Optimierung ist im Gange, und die Ergebnisse dieses Projekts werden zu gegebener Zeit veröffentlicht. Repräsentative analytische HPLC-UV- und Radioaktivitätschromatogramme der [11C]ABP688-Charge sind in Abbildung 5dargestellt.

Zusammenfassend haben wir ein effizientes, phasengestütztes Co2-11-Radiolabelverfahren entwickelt, bei dem leicht verfügbare, kostengünstige SPE-Kartuschen als "3-in-1"-Einheiten für die Radiosynthese, Reinigung und Formulierung von PET-Tracern für klinische Imaging. Für die menschliche Injektion geeignete Tracer werden innerhalb von 10 min ab der Zugabe von 11C-Methylierungsmitteln ([11C]CH3OTf oder [11C]CH3I) bei hoher RCY- und Molaktivität hergestellt. Wir haben diese Technik vollständig automatisiert, um sie mit den Vorschriften der Good Manufacturing Practice (GMP) zu erfüllen, die von Gesundheits- und Strahlenschutzbehörden auferlegt werden. Die solide phasengestützte Radiosynthese erfordert eine geringe Menge an Vorläufer, vermeidet den Einsatz toxischer Lösungsmittel, verringert die Synthesezeit und die Strahlendosis des Personals. Darüber hinaus verbessert die Vermeidung von HPLC-bedingten Ausfällen die Zuverlässigkeit der Radiosynthese und ermöglicht die Entwicklung von Einweg-Kits für die routinemäßige Tracer-Produktion.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Studie wurde teilweise durch ein Stipendium 18-05 von der Alzheimer es Society of Canada (für A. K.) und der Brain Canada Foundation mit Unterstützung von Health Canada unterstützt. Die Autoren möchten die McGill University Faculty of Medicine, das Montreal Neurological Institute und das McConnell Brain Imaging Centre für die Unterstützung dieser Arbeit würdigen. Wir danken auch Frau Monica Lacatus-Samoila für die Hilfe bei der Qualitätskontrolle und Drs. Jean-Paul Soucy und Gassan Massarweh für den Zugang zu Radioisotopen und der Radiochemieanlage.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-OH-BTA-0 ABX advanced biochemical compounds 5101 Non-radioactive precursor of [11C]PiB
6-OH-BTA-1 ABX advanced biochemical compounds 5140 Non-radioactive standard of [11C]PiB
Agilent 1200 HPLC system Agilent Agilent 1200 Analytical HPLC system
Ethanol absolute Commercial alcohols 432526
Hamilton syringe (luer-tip, 250 µL) Hamilton HAM80701
MZ Analytical PerfectSil 120 MZ-Analysentechik GmbH MZ1440-100040 Analytical HPLC column
Perkin Elmer Clarus 480 GC system Perkin Elmer Clarus 480 Gas chromotograph
polycarbonate manifold Scintomics ACC-101 Synthesis manifold
Restek MTX-Wax column (30 m, 0.53 mm) Restek 70625-273 Analytical GC column
Scintomics GRP module Scintomics Scintomics GRP Automated synthesis unit
Sep-Pak tC18 Plus Waters WAT020515 Solid phase extraction cartridge
solvent-resistant manifold Scintomics ACC-201 Synthesis manifold
Spinal needle BD 405181
Sterile extension line B. Braun 8255059
Sterile filter Millipore SLLG013SL
Sterile vial (20mL) Huayi SVV-20A
Sterile water Baxter JF7623
Synthra MeIplus Research Synthra MeIplus Research [11C]CH3I/[11C]CH3OTf module
Syringe (10 mL) BD 309604
Syringe (1mL) BD 309659
Syringe (20 mL) B. Braun 4617207V Dispenser syringe
Vent filter Millipore TEFG02525

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References

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Chemie Ausgabe 152 Kohlenstoff-11 Radiolabeling Positronenemissionstomographie Bildgebung [11C]PiB [11C]ABP688 11C-Methylierung Festphasen-gestützte Synthese Festphasenextraktion Automatisierung
Feste Phase <sup>11</sup>C-Methylierung, Reinigung und Formulierung für die Herstellung von PET Tracern
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Singleton, T. A., Boudjemeline, M., Hopewell, R., Jolly, D., Bdair, H., Kostikov, A. Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers. J. Vis. Exp. (152), e60237, doi:10.3791/60237 (2019).

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