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Chemistry

Fase solida 11C-Metilazione, purificazione e formulazione per la produzione di traccianti PET

Published: October 24, 2019 doi: 10.3791/60237
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1,2
1McConnell Brain Imaging Centre, Montreal Neurological Institute, McGill University, 2Department of Neurology and Neurosurgery, McGill University
* These authors contributed equally

Summary

Riportiamo un'efficiente tecnica di radioetichettatura del carbonio-11 per produrre traccianti clinicamente rilevanti per la tomografia a emissione di Positron (PET) utilizzando cartucce di estrazione in fase solida. 11 Del sistema di L'agente c-metilante viene passato attraverso una cartuccia precaricata con precursore e l'eluizione successiva con etanolo acquoso fornisce traccianti PET chimicamente e radiochimicamente puri in alti rese radiochimiche.

Abstract

La produzione di routine di radiotracciatori utilizzati nella tomografia a emissione di positroni (PET) si basa principalmente sulla chimica umida in cui il synthon radioattivo reagisce con un precursore non radioattivo nella soluzione. Questo approccio richiede la purificazione del tracciante dalla cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) seguita dalla riformulazione in un solvente biocompatibile per l'amministrazione umana. Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo approccio a metilazione a 11C per la sintesi altamente efficiente di prodotti radiofarmaceutici PET con etichettato carbonio 11, sfruttando le cartucce di fase solide come unità monouso "3-in-1" per la sintesi, la purificazione e riformulazione dei traccianti. Questo approccio evita l'uso di HPLC preparativo e riduce le perdite del tracciante nelle linee di trasferimento e a causa del decadimento radioattivo. Inoltre, la tecnica basata sulla cartuccia migliora l'affidabilità della sintesi, semplifica il processo di automazione e facilita la conformità ai requisiti GMP (Good Manufacturing Practice). Qui, dimostriamo questa tecnica sull'esempio di produzione di un composto B di Pittsburgh, tracciante PET ([11C]PiB), un agente di imaging in vivo gold standard per placche amiloidi nel cervello umano.

Introduction

La tomografia a emissione di positroni (PET) è una modalità di imaging molecolare che si basa sulla rilevazione del decadimento radioattivo di un isotopo attaccato a una molecola biologicamente attiva per consentire la visualizzazione in vivo di processi, segnali e trasformazioni biochimiche . Il carbonio-11 (t1/2 x 20,3 min) è uno dei radioisotopi più comunemente utilizzati nel PET a causa della sua abbondanza in molecole organiche e della breve emivita che consente più amministrazioni tracciari nello stesso giorno allo stesso soggetto umano o animale e riduce il carico di radiazioni sui pazienti. Molti tracciari etichettati con questo isotopo sono utilizzati negli studi clinici e nella ricerca sanitaria di base per l'imaging PET in vivo di bersagli classici ed emergenti biologicamente rilevanti - [11C]raclopride per i recettori D2/ D3, [11C] PiB per placche amiloidi, [11C]PBR28 per la proteina traslocatore - per citarne solo alcuni.

I traccianti PET con etichetta di carbonio 11 sono prevalentemente prodotti tramite 11modelli c-metilazione di precursori non radioattivi contenenti -OH (alcol, fenolo e acido carboxil), -NH (amine e amide) o -SH (thiol). In breve, l'isotopo viene generato nell'obiettivo gassoso di un ciclotrone tramite una reazione nucleare 11N11 11nella forma chimica di [11C]CO2. Quest'ultimo viene poi convertito in iodidedimetil ([11C]CH3I) tramite chimica umida (riduzione a [11C]CH3OH con LiAlH4 seguita da disseta con HI)1 o asciutto chimica (riduzione catalitica a [11C]CH4 seguita da iodinazione radicale con molecolare I2)2. [11C] CH3Posso quindi essere ulteriormente convertito nel triflate più reattivo di 11C-metil ([11C]CH3OTf) passandolo sopra una colonna triflate d'argento3. L'11C-metilazione viene quindi eseguita bollendo il gas radioattivo in una soluzione di precursore non radioattivo nel solvente organico o attraverso il più elegante metodo "loop" del solvente in cattività4,5. Il 11C-tracer viene quindi purificato per mezzo di HPLC, riformulato in un solvente biocompatibile e passato attraverso un filtro sterile prima di essere somministrato a soggetti umani. Tutte queste manipolazioni devono essere veloci e affidabili data l'emivita breve del carbonio-11. Tuttavia, l'uso di un sistema HPLC aumenta significativamente le perdite del tracciante e del tempo di produzione, spesso richiede l'uso di solventi tossici, complica l'automazione e talvolta porta a sintesi fallite. Inoltre, la pulizia necessaria dei reattori e della colonna HPLC prolunga i ritardi tra le sintesi dei successivi lotti traccianti e aumenta l'esposizione del personale alle radiazioni.

La radiochimica del fluoro-18 (t1/2 - 109,7 min), l'altro isotopo PET ampiamente utilizzato, è stata recentemente avanzata attraverso lo sviluppo di kit basati su cassette che eliminano la necessità di purificazione dell'HPLC. Utilizzando cartucce di estrazione di fase solide (SPE), questi kit completamente usa e getta consentono la produzione di routine affidabile di 18F-tracciar, tra cui [18F]FDG,[18F]FMISO, [18F]FMC e altri, con sintesi più breve riduzione del coinvolgimento del personale e manutenzione minima dell'apparecchiatura. Uno dei motivi per cui il carbonio-11 rimane un isotopo meno popolare nell'imaging PET è la mancanza di kit simili per la produzione di routine di 11traccianti C. Il loro sviluppo migliorerebbe significativamente l'affidabilità sintetica, aumenterebbe le rese radiochimiche e semplificherebbe l'automazione e la manutenzione preventiva dei moduli di produzione.

I kit di produzione attualmente disponibili sfruttano le cartucce SPE poco costose e usa e getta al posto delle colonne HPLC per la separazione del radiotracer da isotopi radioattivi non reagiti, precursori di altri sottoprodotti radioattivi e non radioattivi. Idealmente, la reazione di radioetichettatura procede anche sulla stessa cartuccia; per esempio, la[18F]fluoromalalazione del dimetilaminoetolo con gassoso [18F]CH2BrF nella produzione di cancro alla prostata PET tracciar [18F]fluoromethylcolina si verifica su una cartuccia di resina cation-exchange 6. Anche se procedure simili per la radioetichettatura di diversi 11traccianti C sulle cartucce sono state riportate7,8 ed è diventato particolarmente potente per la radiosintesi di [11C]colina9 e [11C]methionina10, questi esempi rimangono limitati ai traccianti PET oncologici in cui la separazione dal precursore spesso non è necessaria. Recentemente abbiamo riferito lo sviluppo di"[11C]kit" per la produzione di [11C]CH3I11 e la successiva 11C-metilazione, così come la solida sintesi sostenuta in fase12 nei nostri sforzi per semplificare la produzione di routine di 11traccianti C. In questo caso, vogliamo dimostrare il nostro progresso utilizzando l'esempio della radiosintesi solida supportata dalla fase di [11C]PiB, un radiotracer per l'imaging A- che ha rivoluzionato il campo dell'imaging della malattia di Alzheimer (AD) quando è stato sviluppato per la prima volta nel 2003 ( Figura 1) 13,14. In questo metodo, il precursore volatile [11C]CH3OTf (bp 100) viene passato sopra il precursore 6-OH-BTA-0 depositato sulla resina di una cartuccia usa e getta. Il tracciante PET [11C]PiB viene quindi separato dal precursore e dalle impurità radioattive per eluizione dalla cartuccia con etanolo acquoso biocompatibile. Inoltre, abbiamo automatizzato questo metodo di radiosintesi [11C]PiB utilizzando un modulo di sintesi radiochimica azionato a distanza e kit di cassette usa e getta. In particolare, abbiamo implementato questa radiosintesi su un modulo di radiochimica a 20 valvole, dotato di unità siringa (dispenser) che si adatta a siringa di plastica monouso standard da 20 mL, controller di flusso del gas, pompa a vuoto e misuratore. Grazie alla semplicità di questo metodo, siamo fiduciosi che possa essere modificato per la maggior parte dei sintetizzatori automatici disponibili in commercio, sia su cassetta che quelli dotati di valvole fisse. Questa tecnica solida supportata in fase facilita la conformità alla produzione [11C]PiB con le normative GMP (Good Manufacturing Practice) e migliora l'affidabilità della sintesi. La tecnica qui descritta riduce anche la quantità di precursore necessaria per la radiosintesi, utilizza solo solventi biocompatibili "verdi" e diminuisce il tempo tra i lotti di produzione consecutivi.

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Protocol

1. Preparazione di tamponi ed eluenti

  1. Sciogliere 2,72 g di triidrato di acetato di sodio in 100 mL di acqua per preparare la soluzione di acetato di sodio da 0,2 M (soluzione A).
  2. Sciogliere 11,4 mL di acido acetico glaciale in 1 L di acqua per preparare la soluzione di acido acetico 0,2 M (soluzione B).
  3. Unire 50 mL della soluzione A con 450 mL della soluzione B per preparare il buffer di acetato a pH 3.7 (buffer 1) in base al buffer reference center15. Verificare il pH del buffer con strisce pH o un misuratore di pH.
  4. Unire 12,5 mL di etanolo assoluto con 87,5 mL di tampone 1 per rendere 12,5% soluzione EtOH aqueous (lavaggio 1) in una bottiglia da 100 mL.
  5. Unire 15 mL di etanolo assoluto con 85 mL di tampone 1 per rendere il 15% acquosa soluzione EtOH (lavaggio 2) in una bottiglia da 100 mL.
  6. Combinare 5 mL di etanolo assoluto con 5 mL di buffer 1 per fare 50% soluzione EtOH acquosa (eluente finale) e disegnare 2,5 mL di questa soluzione in una siringa da 10 mL.

2. Applicazione del precursore della cartuccia

  1. Passare 10 mL di acqua seguita da 5 mL di acetone attraverso la cartuccia tC18 per precondizionarlo.
  2. Asciugare la cartuccia con un flusso di azoto a 50 mL/min per 1 min.
  3. Sciogliere 2 mg del precursore 6-OH-BTA-0 in 1 mL di anhydrous acetone.
  4. Tenendo una siringa di vetro di precisione Luer da 250 gradi verso il basso, ritirare 100 l della soluzione precursore e 50 l di cuscinetto d'aria sulla parte superiore del liquido. Rimuovere l'ago e applicare la soluzione precursore sulla cartuccia tC18 dall'estremità femminile spingendo lentamente lo stantuffo fino in fondo. Non spingere ulteriormente la soluzione!

3. Impostazione del collettore per la sintesi automatica

  1. Fissare il collettore monouso standard a 5 porte sul modulo di sintesi e assemblarlo secondo la Figura 2 e i passaggi 3.2 - 3.5 riportati di seguito.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare collettore resistente agli acetone (vedere Tabella dei materiali).
  2. La porta 1 ha due posizioni. Collegare l'inboccino orizzontale all'erogatore automatico dotato di una siringa da 20 mL. Collegare l'ingresso verticale alla bottiglia con il lavaggio 1.
  3. Collegare l'uscita del modulo che produce [11C]CH3OTf alla porta 2 del collettore.
  4. Installare la cartuccia tC18 caricata con il precursore 6-OH-BTA-0 tra le porte 3 e 4.
  5. La porta 5 ha due posizioni. Collegare la presa orizzontale alla bottiglia di scarto che deve contenere almeno 200 mL. Collegare la presa verticale alla fiala sterile per la raccolta tracer tramite il filtro sterile.

4. Radiosintesi di [11C]PiB

AGGIORNAMENTO: Tutte le manipolazioni che coinvolgono isotopi radioattivi devono essere eseguite in una cella calda schermata dal piombo da personale con un addestramento adeguato per lavorare con materiali radioattivi.
NOTA: Questo protocollo non copre i dettagli della produzione di [11C]CO2 nel ciclotrone e la sua conversione in [11C]CH3OTf utilizzando il modulo di radiochimica. Queste procedure dipenderanno dalle singole apparecchiature del laboratorio di radiochimica e esulano dall'ambito di questo protocollo. Il nostro centro PET è dotato di un ciclotrone IBA, che produce carbonio-11 sotto forma chimica di [11C]CO2attraverso la reazione nucleare 14N(p,z)11C con una miscela di gas N2/O2 (99.5:0.5) nel gas un modulo disponibile in commercio per la produzione di [11C]CH3I attraverso il "metodo secco" (riduzione catalitica a [11C]CH4 seguito da iodinazione radicale). [11C] CH3OTf è prodotto passando [11C]CH3I su una colonna triflate d'argento riscaldata a 175 gradi centigradi a 20 mL/min.

  1. Consegnare [11C]CH3OTf nel collettore attraverso la porta 2 e passarlo attraverso la cartuccia tC18 caricata a 20 mL/min flusso di uscita regolato dal modulo [11C]CH3OTf, tramite le porte 3 e 4 e nella bottiglia di scarto come mostrato Figura 2A.
  2. Una volta che tutta la radioattività è stata trasferita e intrappolata sulla cartuccia tC18 come monitorato dal rilevatore di radioattività dietro il supporto della cartuccia, arrestare il flusso di gas chiudendo la porta 2. Lasciare che la cartuccia si sieda per 2 minuti per completare la reazione.
  3. Ritirare 19 mL di soluzione di lavaggio 1 (vedere il punto 1.4) dalla bottiglia da 100 mL nella siringa del distributore attraverso la porta 1 a 100 mL/min come mostrato nella Figura 2B.
  4. Distribuisce 18,5 mL di soluzione di lavaggio 1 dal distributore attraverso la cartuccia tC18 tramite le porte 3 e 4 e nella bottiglia di scarto a 50 mL/min come mostrato nella Figura 2C. Assicurarsi l'assenza di bolle d'aria nel collettore in quanto potrebbero diminuire l'efficienza di separazione.
  5. Ripetere i passaggi 4.3 e 4.4 quattro volte, ritirando e erogando 18,5 mL di soluzione di lavaggio 1. Il volume totale della soluzione di lavaggio 1 passato attraverso tC18 è di 92,5 mL; tuttavia, può variare all'interno della gamma 90 - 100 mL a seconda del particolare modulo di sintesi utilizzato.
  6. Accendere la linea di ingresso sulla porta 1 dal lavaggio 1 alla soluzione di lavaggio 2 (vedere il passaggio 1.5).
  7. Ripetere i passaggi 4.3 e 4.4 tre volte, ritirando e erogare 18,5 mL di soluzione 2 lavaggio. Il volume totale della soluzione di lavaggio 2 passato attraverso tC18 è 55,5 mL. Tuttavia, può variare all'interno della gamma 50 - 60 mL a seconda del particolare modulo di sintesi utilizzato.
  8. Passare la valvola 5 verso la fiala finale, come illustrato nella figura 2D. Scollegare la linea dal dispenser e collegarla alla siringa da 10 mL contenente 2,5 mL della soluzione finale (50% acquosa EtOH, vedere il passaggio 1.6) e 7,5 mL di aria.
  9. Tenendo la siringa verso il basso, spingere manualmente la soluzione finale eluente (2,5 mL) seguita dall'aria (7,5 mL) attraverso la cartuccia tC18 tramite le porte 3 e 4 e nella fiala sterile per la raccolta del tracciante tramite il filtro sterile, come mostrato nella figura 2D.
  10. Scollegare la siringa vuota, collegare la siringa da 10 mL contenente 10 mL del buffer sterile di fosfato (ricetta non inclusa in quanto può variare) e spingere l'intero volume attraverso la cartuccia tC18 nella fiala sterile come descritto sopra (Figura 2D ). Scollegare la siringa e lavare la linea con 10 mL di aria utilizzando la stessa siringa.
  11. Ritirare 0,7 mL della formulazione finale del tracciante e raccogliere campioni per le procedure di controllo qualità (0,1 mL), il test dell'endotossina batterica (0,1 mL) e la sterilità (0,5 mL).

5. Procedure di controllo della qualità

AVVISO: ogni lotto del radiotracer deve essere sottoposto alle procedure di controllo qualità (QC) appropriate prima del rilascio al sito di imaging PET per la somministrazione in soggetti umani o animali. Gli autori di questo manoscritto non sono responsabili per la conformità del radiotracer prodotto in altri centri con le normative delle autorità sanitarie locali.

  1. Eseguire procedure di Controllo qualità pre-rilascio, che devono includere test per l'identità radiochimica (RCI), la purezza radiochimica (RCP), la purezza chimica e l'attività molare del tracciante, nonché il contenuto di solvente residuo e il pH della formulazione.
  2. Determinare l'RCI, RCP, la purezza chimica e l'attività molare mediante sistemi HPLC analitici dotati di rilevatori UV (monitoraggio a 350 nm) e radioattività e una colonna di fase invertita. Determinare i tempi di conservazione di 6-OH-BTA-0 e 6-OH-BTA-1 e calibrare lo strumento per quantificare il contenuto di ogni composto.
  3. Determinare il contenuto di solvente residuo mediante un sistema di cromatografia a gas analitico dotato di una colonna capillare. Determinare i tempi di ritenzione di acetone ed etanolo e calibrare lo strumento per quantificare il contenuto di ciascun solvente.
  4. Eseguire il test delle endotossine batteriche utilizzando un lettore di cartucce dotato di cartucce adatte.
  5. Eseguire l'analisi della sterilità del campione almeno 14 giorni dopo la sintesi per garantire l'assenza di crescita batterica o inviare il campione di sterilità a un laboratorio accreditato dall'autorità sanitaria locale.

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Representative Results

Per riassumere una tipica radiosintesi di [11C]PiB, il gassoso [11C]CH3OTf viene prima passato attraverso una cartuccia tC18 precaricata con una soluzione di precursore (Figura 1). La separazione della miscela di reazione viene quindi ottenuta mediante eluizione successiva con soluzioni etanolo acquose come segue. In primo luogo, il 12,5% di EtOH eluisce la maggior parte dei non reagiti [11C]CH3OTf e 6-OH-BTA-0, poi il 15% EtOH lava le impurità residue e infine una soluzione di etanolo del 50% eluisce il desiderato [11C]PiB in una fiala sterile. Il tracciante viene quindi diluito con buffer sterile di fosfato e viene sottoposto a rigide procedure di controllo qualità prima del rilascio al sito di imaging PET. Tipici cromatogrammi analitici HPLC UV e radioattività del lotto[11C]PiB adatto alla somministrazione sono rappresentati nella Figura 3.

Il tempo totale di radiosintesi è di 10 min a partire dalla consegna di [11C]CH3OTf, il RCY di [11C]PiB utilizzando 0,2 mg di precursore è 22% (a partire da [11C]CH3OTf, non corretto per decadimento) e l'attività molare è 190 GBq/zmol. Il tracciante deve rispettare tutte le specifiche QC della multicentrica Dominantly Inherited Alzheimer Network Trials Unit (DIAN-TU) per le sperimentazioni cliniche: la purezza radiochimica deve essere superiore al 95%; il contenuto di impurità non radioattive deve essere inferiore a 1,3 g per dose di 10 mL; il pH deve essere compreso nell'intervallo 4 - 8; e il contenuto di etanolo e acetone devono essere al di sotto di 10% e 3000 ppm, rispettivamente. I campioni devono anche essere sterili ed endotossina libera. I risultati di quattro cicli tipici di radiosintesi sono riassunti nella Tabella 1.

Affinché la tecnica segnalata funzioni correttamente, è necessario prestare attenzione durante diversi passaggi critici descritti in precedenza. Per applicare il precursore sulla cartuccia tC18 (passaggio 2.4) la soluzione non deve essere spinta verso l'uscita, in modo da non abbreviare il percorso effettivo per la separazione del [11C]PiB dai materiali di partenza non reagiti e dai possibili prodotti laterali. Il flusso di [11C]CH3OTf attraverso una cartuccia durante il trasferimento non deve superare i 20 mL/min (passaggio 4.1). Una volta che inizia l'eluizione (passaggio 4.4), è molto importante mantenere la cartuccia bagnata e non lasciare passare l'aria per evitare effetti di canalizzazione che potrebbero provocare una minore purezza del tracciante o un RCY inferiore a causa delle perdite di [11C]PiB nei rifiuti. Se il collettore a 5 porte utilizzato nella radiosintesi (passaggio 3.1) non è resistente all'acetone, come un collettore di policarbonato standard come ACC-101, la quantità di acetone non deve superare i 100 risultato in una sintesi fallita. Nel caso in cui il pH non soddisfi le specifiche, la cartuccia tC18 può essere facoltativamente sciacquata con 10 mL di acqua sterile tra i passaggi 4.7 e 4.8 nella bottiglia di scarto.

Figure 1
Figura 1: La radiosintesi di [11C]PiB di 11C-metilazione del precursore 6-OH-BTA-0 con [11C]CH3OTf. [11C]PiB è uno dei radiopermonitori più utilizzati per l'imaging di placche amiloidi associate con AD e altre condizioni neurodegenerative da pet. Questo tracciante è comunemente sintetizzato tramite 11C-metilazione del precursore anilina chiamato 6-OH-BTA-0 utilizzando [11C]methyl triflate ([11 C]CH3OTf) sia in soluzione che nel ciclo di iniezione secco HPLC (solvente tecnica in cattività). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: sintesi e purificazione passo-passo di [11C]PiB su una cartuccia tC18. (A) Gaseous [11C]CH3OTf viene passato attraverso la cartuccia caricata con 6-OH-BTA-0. Come descritto nei passi 4.1 e 4.2, [11C]CH3OTf è intrappolato sulla cartuccia contenente il precursore e reagisce con il precursore a temperatura ambiente per 2 min. (B) La soluzione di lavaggio 1 o lavaggio 2 viene ritirata nella siringa del distributore. Come descritto nel passaggio 4.3, la pompa di siringa del modulo tira lo stantuffo della siringa ritagliata verso l'alto, ritirando una soluzione di entrambi eluenti attraverso una linea collegata alla porta 1 del collettore. (C) Le impurità vengono lavate in una bottiglia di scarto. Come descritto nel passaggio 4.4, la pompa a siringa del modulo sposta lo stantuffo della siringa ritagliata verso il basso, spingendo la soluzione di lavaggio ritirata attraverso la cartuccia tC18 attraverso le porte 1, 3 e 4 del collettore in una bottiglia di scarto. I passaggi rappresentati nei diagrammi B e C vengono ripetuti più volte in un ciclo per lavare via tutti i materiali non reagiti dalla cartuccia, come descritto nei passaggi da 4.5 - 4.7. (D) [11C]PiB viene eluito con l'eluente finale in una fiala sterile attraverso un filtro sterile. Come descritto nei passaggi 4.8 e 4.9, la siringa ritagliata in una pompa di siringa viene scollegata dalla linea e sostituita prima con una siringa da 10 mL contenente 2,5 mL di etanolo aquelo del 50%. La porta 5 del collettore viene quindi attivata o disattivata verso la fiala sterile e [11C]PiB viene espulsa manualmente dal tC18. La siringa vuota viene quindi sostituita con un'altra siringa contenente 10 mL di buffer di fosfato sterile e l'intero contenuto viene spinto attraverso il tC18 per sciacquare le linee come descritto al punto 4.10. La fiala sterile ora contiene [11C]PiB in una soluzione di etanolo aquosa tamposo tampone tampologato di 12,5 mL. Questa cifra è stata modificata da Boudjemeline etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: HPLC analitico del controllo qualità di [11C]PiB. (A) I tempi di ritenzione di [11C]CH3OH (dall'idrolisi di [11C]CH3OTf), non reagiti [11C]CH3OTf e tracciante [11C]PiB sul cromatogramma di radioattività sono 2.1, 4.0 e 6.6 min, rispettivamente. L'analisi della traccia di radioattività mostra che l'RCP di [11C]PiB è del 98,0%. (B) I tempi di ritenzione di 6-OH-BTA-0 (precursore) e 6-OH-BTA-1 (picco tracciante) sul cromatogramma UV sono rispettivamente 3,6 e 5,9 min. L'analisi della traccia UV mostra una concentrazione residua del precursore al di sotto del limite accettabile (1,3 g) e l'assenza di altre impurità non radioattive. Pertanto, la purezza radiochimica e chimica del tracciante è accettabile per gli studi clinici PET. Condizioni HPLC - colonna (Tabella dei materiali): 5 m, 100 x 4,0 mm; fase mobile: 40:60 acetonitrile/water flow rate: 0,7 mL/min. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa cifra.

Figure 4
Figura 4: Ottimizzazione della quantità precursore 6-OH-BTA-0. L'importo più basso (0,1 mg) fornisce [11C]PiB in una resa radiochimica moderata (RCY) del 18,1-3,8%. La radiosintesi a partire da 0,2 mg fornisce [11C]PiB un RCY del 22,0 -3,1%, aumentando al contempo l'importo a 0,3 mg migliora ulteriormente la RCY a 32,1-7%, a scapito di una quantità leggermente superiore del precursore nel prodotto finale. Tutti gli RCY non sono corretti per il decadimento (tempo di radiosintesi di 10 min) a partire dalla radioattività della[11C]CH3OTf intrappolata sulla cartuccia tC18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: HpLC analitico di controllo qualità di [11C]ABP688. (A) Il cromatogramma a radioattività mostra l'RCP combinato (E)- e(z)-[11C]ABP688 del 98,1%. (B) Il cromatogramma UV mostra una concentrazione residua del precursore superiore a 10 g. Mentre la purezza chimica potrebbe essere accettabile per gli studi clinici PET, un'attività molare effettiva relativamente bassa (Am < 37 GBq/mol) richiede un'ulteriore ottimizzazione della purificazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

lotto Esegui 1 Esecuzione 2 Esecuzione 3 Esegui 4
[11C] CH3OTf, GBq 9.21 11.25 7.84 6.44
[11C] PiB, GBq 2.26 2.37 2.11 1.41
RCY, % 24.5 21.1 26.9 21.8
RCP, % 98 97.2 97.8 99.2
Attività molare, GBq/zmol 154.6 322.6 121.1 162.1
Precursore residuo, 0.32 0.55 0.58 0.87
Ph 5 5 5 5
Contenuto EtOH, % 9.4 8.8 7.7 8.1
Contenuto di acetone, ppm 33 38 46 33
Test BET non pertinente <10 UE/mL <10 UE/mL <10 UE/mL
Test di sterilità non pertinente Nessuna crescita Nessuna crescita Nessuna crescita
Nota a piè di pagina: Da [11C]CH3OTf, non corretto per il decadimento

Tabella 1. Risultati rappresentativi della produzione di [11C]PiB viene eseguita in condizioni ottimizzate. Tutti i lotti sono conformi ai requisiti per i traccianti destinati agli studi clinici PET.

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Discussion

Nonostante la recente comparsa e l'approvazione FDA di diversi traccianti PET etichettati da 18F, come florbetapir, florbetaben e flutemetamolo, [11C]PiB rimane un tracciante standard d'oro per l'imaging amiloide a causa della rapida assunzione del cervello e rilegatura. Attualmente questo tracciante è sintetizzato tramite chimica bagnata16 o utilizzando un approccio "ciclo secco"4,17. Entrambi i metodi richiedono la purificazione dell'HPLC seguita dalla riformulazione nell'etanolo acquoso, che dura circa 20 -30 min a partire da [11C]CH3OTf. Ispirati da alcune delle precedenti relazioni sulla fase solida supportavano 11tecniche di metilazione C e l'importanza clinica di [11C]PiB, abbiamo mirato a sviluppare una radiosintesi di questo tracciante utilizzando un'estrazione di fase solida usa e getta poco costosa ( SPE) come entità "3-in-1" per reazione, purificazione e formulazione.

I passaggi più critici per la produzione di successo di traccianti PET per l'imaging in vivo nei soggetti umani sono: 1) incorporazione dell'isotopo radioattivo in una molecola tracciante; 2) separazione del tracciante da specie radioattive e non radioattive non reagite; 3) riformulazione del tracciante in un solvente biologicamente compatibile; 4) il rispetto delle procedure di controllo della qualità. Sulla base del metodo in cattività solvente precedentemente riportato, ci aspettavamo che la tecnica SPE supportata richiedesse una minore quantità di precursore rispetto a 11C-metilazione nella soluzione. In particolare, le procedure in cattività solvente precedentemente riportate per la radiosintesi di [11C]PiB richiedono 0,5 - 1,0 mg del precursore4,17. Così, abbiamo studiato non corretto per il decadimento rese radiochimiche di [11C]PiB a partire da [11C]CH3OTf a tre diverse quantità di 6-OH-BTA-0: 0.1, 0.2, e 0.3 mg. Anche l'importo più basso (0,1 mg) fornisce una quantità moderata di [11C]PiB, anche se a RCY relativamente basso e meno affidabile (18,1 -3,8%). La radiosintesi a partire da 0,2 mg fornisce un RCY di [11C]PiB (22,0-3,1%), mentre l'aumento dell'importo a 0,3 mg migliora ulteriormente la RCY (32,1 -3,7%), a scapito di una quantità leggermente superiore del precursore nel prodotto finale. In tutti i casi, la radiosintesi è stata completata in 10 min. Pertanto, la quantità ottimale di precursori dipende dalla RCY desiderata e dalla purezza di [11C]PiB in particolari centri PET. I risultati degli esperimenti di ottimizzazione della resa radiochimica basati sulla quantità precursore sono riassunti nella Figura 4. In particolare, i tentativi di radiosintesi utilizzando [11C]CH3I come agente metilante o etanolo come solvente di reazione non hanno prodotto il desiderio [11C]PiB (dati non mostrati).

La separazione quantitativa della miscela di reazione alla radiosintesi su una corta cartuccia SPE è stata la parte più impegnativa della tecnica descritta. Abbiamo ipotizzato che le ammine aromatiche 6-OH-BTA-0 e 6-OH-BTA-1 esistano prevalentemente nelle loro forme protonate nei media acidi e quindi avrebbero profili di eluizione più nitidi dalla fase solida in fase invertita. Quindi, tutte le soluzioni acquose di etanolo sono state preparate utilizzando 0,2 M di acetato buffer a pH 3.7. Successivamente, abbiamo determinato che le soluzioni di etanolo acquoso con concentrazione di EtOH fino al 15% elicano gradualmente il precursore non reagito 6-OH-BTA-0 e [11C]CH3OTf, mentre la radioetichetta[11C]PiB rimane intrappolata sulla cartuccia tC18. Per evitare che tali impurità in una formulazione finale del tracciante la concentrazione di etanolo sia aumentata dal 12,5% al 15% in una eluizione graduale. Dopo che tutte le impurità sono state lavate dalla cartuccia, l'eluizione del tracciante è stata ottenuta utilizzando una quantità minima (2,5 mL) della soluzione di etanolo concentrato (50%). Al fine di mantenere il contenuto di etanolo al di sotto del limite del 10% e di portare il pH del tracciante formulato all'interno dell'intervallo accettabile per l'iniezione umana (4 - 8), il tracciante è stato diluito con tampone sterile di fosfato.

In seguito all'ottimizzazione delle condizioni, la radiosintesi di [11C]PiB è stata automatizzata utilizzando un'unità di sintesi automatizzata disponibile in commercio (ASU), dotata di siringa di dispenser e collettore usa e getta. La configurazione del collettore per questo particolare ASU è semplice come descritto nei passaggi 3.1 - 3.5. In particolare, questa metodologia può essere facilmente implementata sulla maggior parte delle altre ASU disponibili seguendo le ricette descritte sopra. In condizioni ottimizzate, i lotti di [11C]PiB adatti per l'applicazione clinica sono sintetizzati con attività finali che vanno da 1,4 a 2,4 GBq (38 - 61 mCi).

Più recentemente, abbiamo applicato la tecnica "3-in-1" per la radioetichettatura di [11C]ABP688, un tracciante PET per l'imaging di recettori metabotropici glutammato tipo 5 (mGlu5)18,19. La radiosintesi di questo tracciante si basa sulla metilazione 11C-metilazione del gruppo -OH nell'ossima; pertanto, è necessaria l'aggiunta di base per deprotonare il precursore desmetil. L'idrossido di tetrabutylammonium (come soluzione da 1 M in MeOH) è stato selezionato come base perché è solubile nella maggior parte dei solventi organici polari. In un esperimento preliminare di radioetichettatura, una soluzione di precursore (0,5 mg) nel DMSO (100 ) è stata miscelata con 1 M TBAOH in MeOH (20 - L) e la miscela è stata applicata con cura sulla cartuccia tC18 come descritto sopra (vedi passo 2.4). Gaseous [11C]CH3Sono passato attraverso la cartuccia come descritto nei passaggi 4.1 - 4.2 e la reazione è stata autorizzata a procedere a temperatura ambiente per 5 min. Eluzioni sequenziali con soluzioni di etanolo diluito nel buffer di bicarbonato di sodio da 0,2 M (pH 8.5 - 9.0) - 92 mL del 15% EtOH seguito da 92 mL del 20% EtOH - ha sbiadito il non refatto [11C]CH3I e il precursore residuo. Radiochimicamente puro [11C]ABP688 (RCY - 18,2%, RCP >98,0%) è stato poi eluito con soluzione EtOH 50% nello stesso buffer attraverso un filtro sterile come descritto nei passaggi 4.9 - 4.11. Nonostante il fatto che oltre il 98% del precursore venga rimosso con i fumi di etanolo diluito, la presenza di qualche precursore non reagito nel tracciante finale (fino a 20 g) richiede un'ulteriore ottimizzazione della procedura di radiosintesi. Questa ottimizzazione è in corso e i risultati di questo progetto saranno pubblicati a tempo debito. Rappresentativo analitico HPLC UV e cromatogrammi di radioattività del lotto [11C]ABP688 è mostrato nella Figura 5.

In conclusione, abbiamo sviluppato un'efficiente procedura di radioetichettatura del carbonio-11 supportata in fase solida utilizzando cartucce SPE prontamente disponibili come entità "3-in-1" per la radiosintesi, la purificazione e la formulazione dei traccianti PET utilizzati per i traccianti Imaging. I traccianti adatti per l'iniezione umana sono prodotti entro 10 min a partire dall'aggiunta di 11C-metilante agente ([11C]CH3OTf o [11C]CH3I) in alta attività di RCY e molare. Abbiamo completamente automatizzato questa tecnica per renderla conforme alle normative GMP (Good Manufacturing Practice) imposte dalle autorità di sicurezza per la salute e le radiazioni. La radiosintesi supportata in una solida fase richiede una bassa quantità di precursori, evita l'uso di solventi tossici, riduce il tempo di sintesi e le radiazioni dose sostenute dal personale. Inoltre, evitare guasti correlati all'HPLC migliora l'affidabilità della radiosintesi e consente lo sviluppo di kit usa e getta per la produzione di traccianti di routine.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo studio è stato parzialmente sostenuto da una sovvenzione 18-05 della Alzheimer's Society of Canada (per A. K.) e Brain Canada Foundation con il sostegno di Health Canada. Gli autori desiderano riconoscere la Facoltà di Medicina dell'Università McGill, l'Istituto Neurologico di Montreal e il McConnell Brain Imaging Centre per il supporto di questo lavoro. Ringraziamo anche la signora Monica Lacatus-Samoila per l'aiuto con le procedure di controllo della qualità e i dottori Jean-Paul Soucy e Gassan Massarweh per l'accesso ai radioisotopi e alla struttura di radiochimica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-OH-BTA-0 ABX advanced biochemical compounds 5101 Non-radioactive precursor of [11C]PiB
6-OH-BTA-1 ABX advanced biochemical compounds 5140 Non-radioactive standard of [11C]PiB
Agilent 1200 HPLC system Agilent Agilent 1200 Analytical HPLC system
Ethanol absolute Commercial alcohols 432526
Hamilton syringe (luer-tip, 250 µL) Hamilton HAM80701
MZ Analytical PerfectSil 120 MZ-Analysentechik GmbH MZ1440-100040 Analytical HPLC column
Perkin Elmer Clarus 480 GC system Perkin Elmer Clarus 480 Gas chromotograph
polycarbonate manifold Scintomics ACC-101 Synthesis manifold
Restek MTX-Wax column (30 m, 0.53 mm) Restek 70625-273 Analytical GC column
Scintomics GRP module Scintomics Scintomics GRP Automated synthesis unit
Sep-Pak tC18 Plus Waters WAT020515 Solid phase extraction cartridge
solvent-resistant manifold Scintomics ACC-201 Synthesis manifold
Spinal needle BD 405181
Sterile extension line B. Braun 8255059
Sterile filter Millipore SLLG013SL
Sterile vial (20mL) Huayi SVV-20A
Sterile water Baxter JF7623
Synthra MeIplus Research Synthra MeIplus Research [11C]CH3I/[11C]CH3OTf module
Syringe (10 mL) BD 309604
Syringe (1mL) BD 309659
Syringe (20 mL) B. Braun 4617207V Dispenser syringe
Vent filter Millipore TEFG02525

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References

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Chimica Numero 152 carbonio-11 radioetichettatura tomografia a emissione di positroni imaging,[11C]PiB [11C]ABP688 11C-metilazione sintesi supportata in fase solida estrazione di fase solida automazione
Fase solida <sup>11</sup>C-Metilazione, purificazione e formulazione per la produzione di traccianti PET
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Singleton, T. A., Boudjemeline, M., Hopewell, R., Jolly, D., Bdair, H., Kostikov, A. Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers. J. Vis. Exp. (152), e60237, doi:10.3791/60237 (2019).

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