Summary
Vi rapporterar en effektiv kol-11 radiolabeling teknik för att producera kliniskt relevanta spårämnen för positron emissions tomografi (PET) med hjälp av fasta fas extraktion patroner. elva C-metylerande medel leds genom en patron som är förladdad med prekursor och på varandra följande eluering med vattenbaserad etanol ger kemiskt och radiokemiskt ren PET-spårare i hög radiokemisk avkastning.
Abstract
Rutinmässig produktion av radiotracers som används i positron emissions tomografi (PET) främst förlitar sig på våt kemi där den radioaktiva Synthon reagerar med en icke-radioaktivt föregångare i lösning. Denna metod kräver rening av spårämne genom högeffektiv vätskekromatografi (HPLC) följt av omformulering i ett biokompatibelt lösningsmedel för Human administration. Vi har nyligen utvecklat en roman 11C-metylering strategi för mycket effektiv syntes av Carbon-11 märkta PET radiofarmaka, dra nytta av solid fas patroner som disponibel "3-i-1" enheter för syntes, rening och omformulering av tracers. Detta tillvägagångssätt undanröjer användningen av förberedande HPLC och minskar förlusterna av spårämne i överföringsledningar och på grund av radioaktivt sönderfall. Dessutom förbättrar den patron-baserade tekniken syntes tillförlitlighet, förenklar automationsprocessen och underlättar efterlevnaden av kraven för god tillverkningssed (GMP). Här demonstrerar vi denna teknik på exempel på produktion av ett PET Tracer Pittsburgh Compound B ([11C] PIB), en guld standard in vivo Imaging agent för amyloid plack i den mänskliga hjärnor.
Introduction
Positron emissions tomografi (PET) är en molekylär avbildning modalitet som förlitar sig på att upptäcka radioaktivt sönderfall av en isotop fäst vid en biologiskt aktiv molekyl för att möjliggöra in vivo visualisering av biokemiska processer, signaler och transformationer . Carbon-11 (t1/2 = 20,3 min) är en av de vanligaste radioisotoperna i PET på grund av dess överflöd i organiska molekyler och kort halveringstid som gör det möjligt för flera Tracer förvaltningar samma dag till samma mänskliga eller animaliska ämne och minskar patientens strålnings börda. Många spårämnen märkta med denna isotop används i kliniska studier och i grundläggande hälsoforskning för in vivo PET-avbildning av klassiska och framväxande biologiskt relevanta mål-[11c] Raclopride för D2/d3 -receptorer, [11c] PiB för amyloida plack, [11C] PBR28 för Translocator protein-för att bara nämna några.
Carbon-11 märkta PET spårämnen är huvudsakligen produceras via 11C-metylering av icke-radioaktiva prekursorer som innehåller-OH (alkohol, fenol och karboxylsyra),-NH (Amin och Amid) eller-SH (tiol) grupper. Kortfattat, är isotopen genereras i gas målet för en cyklotron via en 14N (p, α)11c kärn reaktion i kemisk form av [11c] Co2. Den senare omvandlas sedan till [11c] metyl jodid ([11c] CH3I) via antingen våt kemi (reduktion till [11c] CH3Oh med lialh4 följt av kylning med hi)1 eller torr kemi (katalytisk reduktion till [11C] CH4 följt av radikal av med molekylär I2)2. [11C] CH3jag kan sedan omvandlas ytterligare till den mer reaktiva 11c-metyl triflate ([11C] CH3OTf) genom att passera den över en silver triflate kolumn3. Den 11C-metylering utförs sedan genom att antingen bubblar den radioaktiva gasen till en lösning av icke-radioaktiva föregångare i organiskt lösningsmedel eller via den mer eleganta fångenskap lösningsmedel "loop" metod4,5. Den 11C-Tracer renas sedan med hjälp av HPLC, omformulerade i ett biokompatibelt lösningsmedel, och passerade genom ett sterilt filter innan de administreras till försökspersoner. Alla dessa manipulationer måste vara snabb och tillförlitlig med tanke på den korta halveringstiden för Carbon-11. Användningen av ett HPLC-system ökar dock avsevärt förlusterna av spår-och produktionstiden, kräver ofta användning av giftiga lösningsmedel, försvårar automatiseringen och leder ibland till misslyckade synteser. Dessutom förlänger den erforderliga rengöringen av reaktorerna och HPLC-kolonnen förseningarna mellan synteserna av efterföljande spår partier och ökar personalens exponering för strålning.
Den radiokemi av fluor-18 (t1/2 = 109,7 min), den annan vida använd sällskapsdjur isotopen, har i den senaste tid Avancerat via utvecklingen av kassetten-baserat kitsch så pass undanröja nöden för HPLC raffinera. Genom att använda solid Phase extraktion (SPE) patroner, dessa helt engångssatser möjliggör tillförlitlig rutinmässig produktion av 18f-tracers, inklusive [18f] FDG, [18f] fmiso, [18f] FMC och andra, med kortare syntes personalmedverkan och minimalt underhåll av utrustningen. En av anledningarna Carbon-11 förblir en mindre populär isotop i PET Imaging är en brist på liknande kit för rutinmässig produktion av 11C-tracers. Deras utveckling skulle avsevärt förbättra syntetisk tillförlitlighet, öka radiokemisk avkastning och förenkla automatisering och förebyggande underhåll av produktionsmoduler.
För närvarande tillgängliga produktionspaket dra nytta av billiga, disponibel, SPE patroner i stället för HPLC kolumner för separation av radiotracer från obesvarade radioaktiva isotoper, prekursorer och andra radioaktiva och icke-radioaktiva biprodukter. Helst fortsätter radiomärkt reaktion också på samma patron; till exempel, den [18f] fluoromethylation av Dimetylaminoetanol med gasformiga [18f] CH2Brf i produktionen av prostatacancer Imaging PET Tracer [18f] fluorometylkolin uppstår på en katjon-utbyte harts patron 6. även om liknande förfaranden för radioaktiv märkning av flera 11c-tracers på patroner har rapporterats7,8 och blev särskilt kraftfull för radio syntesen av [11c] kolin9 och [11C] metionin10, dessa exempel förblir begränsade till onkologiska PET-spår där separationen från föregångaren är ofta inte krävs. Vi rapporterade nyligen utvecklingen av "[11c] kit" för produktion av [11c] CH3I11 och efterföljande 11c-metylering, samt solid fas-stödda syntes12 i våra ansträngningar att förenkla den rutinmässiga produktionen av 11C-tracers. Här vill vi visa våra framsteg med hjälp av exemplet med den solida fasen stöds radiosyntes av [11C] PIB, en radiotracer för Aβ Imaging som revolutionerade området för Alzheimers sjukdom (AD) Imaging när det först utvecklades i 2003 ( Figur 1) 13,14. I denna metod, flyktiga [11C] CH3OTf (BP 100 ° c) är passerat över 6-Oh-BTA-0 föregångare deponeras på hartset av en engångspatron. PET Tracer [11C] PIB separeras sedan från föregångaren och radioaktiva föroreningar genom eluering från patronen med biokompatibel vatten etanol. Vidare automatiserade vi denna metod för [11C] PIB radiosyntes med hjälp av en fjärrstyrd radiokemi syntes modul och engångskassett kit. Specifikt genomförde vi denna radiosyntes på en 20-ventil radiokemi modul, utrustad med spruta enhet (dispenser) som passar standard 20 ml engångs Plastspruta, gas flödesregulator, vakuumpump och mätare. På grund av enkelheten i denna metod är vi övertygade om att den kan modifieras till de flesta kommersiellt tillgängliga automatiserade synthesizers, antingen kassett-baserade eller de som är utrustade med stationära ventiler. Denna solida fas stöds teknik underlättar [11C] PIB produktion överensstämmer med god tillverkningssed (GMP) förordningar och förbättrar syntes tillförlitlighet. Den teknik som beskrivs här minskar också mängden föregångare som krävs för radiosyntes, använder endast "gröna" biokompatibla lösningsmedel och minskar tiden mellan på varandra följande tillverkningssatser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av buffertar och eluenter
- Lös upp 2,72 g natriumacetattrihydrat i 100 mL vatten för beredning av 0,2 M natriumacetatlösning (lösning A).
- Lös 11,4 mL isättika i 1 liter vatten för beredning av 0,2 M ättiksyralösning (lösning B).
- Kombinera 50 mL lösning A med 450 mL lösning B för att bereda acetatbufferten vid pH 3,7 (buffert 1) enligt buffertreferens Center15. Kontrollera pH-värdet i bufferten med pH-remsor eller en pH-mätare.
- Kombinera 12,5 mL av absolut etanol med 87,5 mL buffert 1 för att göra 12,5% aqueous EtOH lösning (tvätta 1) i en 100 mL flaska.
- Kombinera 15 mL absolut etanol med 85 mL buffert 1 för att göra 15% vattenhaltigt EtOH lösning (tvätta 2) i en 100 mL flaska.
- Kombinera 5 mL absolut etanol med 5 mL buffert 1 för att göra 50% vattenhaltig EtOH-lösning (slutlig Eluent) och dra 2,5 mL av denna lösning till en 10 mL spruta.
2. tillämpning av föregångaren till cylinderampullen
- Passera 10 mL vatten följt av 5 mL aceton genom tC18 patronen för att förutsättningen det.
- Torka cylinderampullen med en ström av kväve vid 50 mL/min under 1 min.
- Lös upp 2 mg av föregångaren 6-OH-BTA-0 i 1 mL vattenfri aceton.
- Håll en Luer-Tip 250 μL precision glasspruta nedåt, dra upp 100 μL av föregångaren lösningen och 50 μL luftkudde ovanpå vätskan. Ta bort nålen och Använd föregångaren lösningen på tC18 patronen från den kvinnliga änden genom att sakta trycka kolven hela vägen ner. Tryck inte vidare på lösningen!
3. ställa in samlingsröret för automatiserad syntes
- Säkra standard 5-portens engångsgren rör på syntes modulen och montera den enligt figur 2 och steg 3,2-3,5 nedan.
Anmärkning: Vi rekommenderar att du använder aceton-resistenta grenrör (se tabell över material). - Port 1 har två lägen. Anslut den horisontella inloppet till den automatiserade dispenser som är försedd med en 20 mL spruta. Anslut den vertikala inloppet till flaskan med tvätt 1.
- Anslut utgången av modulen som producerar [11C] CH3OTf till port 2 av grenröret.
- Installera tC18 patronen laddad med föregångaren 6-OH-BTA-0 mellan portarna 3 och 4.
- Port 5 har två lägen. Anslut det horisontella utloppet till avfallsflaskan som måste rymma minst 200 mL. Anslut det vertikala utloppet till den sterila injektionsflaskan för spår insamling via det sterila filtret.
4. radiosyntes av [11C] PIB
FÖRSIKTIGHET: alla manipulationer som inbegriper radioaktiva isotoper måste utföras i en blyskyddad varm cell av personal med adekvat utbildning för att arbeta med radioaktiva ämnen.
Anmärkning: detta protokoll omfattar inte detaljerna i produktionen av [11c] Co2 i Cyclotron och dess omvandling till [11c] CH3OTf med hjälp av radiokemi modulen. Dessa förfaranden kommer att bero på den enskilda utrustningen i radiokemi labbet och är utanför tillämpningsområdet för detta protokoll. Vårt HUSDJURS centrum är utrustat med en IBA Cyclotron, som producerar kol-11 i kemisk form av [11c] Co2via den 14N (p, α)11c kärn reaktion med en N2/O2 gasblandning (99,5:0.5) i gas och en kommersiellt tillgänglig modul för produktion av [11c] CH3i via "torr metoden" (katalytisk REDUKTION till [11c] CH4 följt av radikal iodination). [11C] CH3OTf produceras genom att passera [11C] CH3I över en silver triflate kolonn uppvärmd till 175 ° c vid 20 ml/min.
- Leverera [11c] CH3OTF i grenröret genom port 2 och passera den genom den laddade tC18 cylinderampullen vid 20 ml/min utflöde som regleras av [11c] CH3OTF-modulen, via portarna 3 och 4 och i avfallsflaskan som visas på Figur 2A.
- När all radioaktivitet har överförts och fastnat på tC18 cylinderampullen som övervakas av radio aktivitets detektorn bakom patronhållaren, stoppa gasflödet genom att stänga port 2. Låt patronen sitta i 2 min för att slutföra reaktionen.
- Dra upp 19 mL tvätt 1-lösning (se steg 1,4) från 100 mL-flaskan till dispenser sprutan genom port 1 vid 100 mL/min som visas på bild 2B.
- Fördela 18,5 mL tvätt 1-lösning från behållaren genom tC18-kassetten via portarna 3 och 4 och in i avfallsflaskan på 50 ml/min som visas på figur 2C. Säkerställ frånvaron av luftbubblor i grenröret eftersom de kan minska separations effektiviteten.
- Upprepa steg 4,3 och 4,4 fyra gånger, dra ut och dispensera 18,5 mL tvätt 1-lösning varje gång. Den totala volymen av tvätt 1-lösning passerat tC18 är 92,5 mL; Det kan dock variera inom intervallet 90-100 mL beroende på den specifika syntes modul som används.
- Byt ingångs linje på port 1 från tvätt 1 till tvätt 2-lösning (se steg 1,5).
- Upprepa steg 4,3 och 4,4 tre gånger, dra ut och dispensera 18,5 mL tvätt 2-lösning varje gång. Den totala volymen av Wash 2-lösning som passerat genom tC18 är 55,5 mL. Det kan dock variera inom intervallet 50-60 mL beroende på den specifika syntes modul som används.
- Växla ventil 5 mot den slutliga injektionsflaskan som visas på bild 2D. Koppla bort linjen från behållaren och Anslut den till den 10 mL-spruta som innehåller 2,5 mL av den slutliga eluentlösningen (50% vattenhaltigt EtOH, se steg 1,6) och 7,5 mL luft.
- Håll sprutan nedåt, Skjut manuellt den slutliga eluentlösningen (2,5 mL) följt av luft (7,5 mL) genom tC18 cylinderampullen via portarna 3 och 4 och in i den sterila injektionsflaskan för spår insamling via det sterila filtret enligt figuren 2D.
- Koppla loss den tomma sprutan, Anslut den 10 mL-spruta som innehåller 10 mL av den sterila fosfatbufferten (recept som inte ingår eftersom det kan variera) och tryck in hela volymen genom tC18 cylinderampullen i den sterila injektionsflaskan enligt ovan (figur 2D ). Koppla bort sprutan och spola linjen med 10 mL luft med samma spruta.
- Dra upp 0,7 mL av den slutliga tracersammansättningen och samla in prover för kvalitetskontroll (0,1 mL), bakteriellt endotoxtest (0,1 mL) och sterilitet (0,5 mL).
5. förfaranden för kvalitetskontroll
Varning: varje parti av radiotracer måste genomgå lämpliga kvalitetskontrollförfaranden (QC) innan den släpps till PET Imaging site för administrering till människor eller djur försökspersoner. Författarna till detta manuskript är inte ansvariga för efterlevnaden av radiotracer produceras vid andra centra med lokala hälsomyndigheten förordningar.
- Utföra pre-release QC förfaranden, som måste omfatta tester för radiokemisk identitet (RCI), radiokemisk renhet (RCP), kemisk renhet och molar aktivitet av spårämne samt resterande lösningsmedel innehåll och pH i formuleringen.
- Bestäm RCI, RCP, kemisk renhet och molar aktivitet med hjälp av analytiska HPLC-system utrustad med UV (övervakning vid 350 nm) och radioaktivitet detektorer, och en omvänd fas kolonn. Bestäm retentionstiderna för 6-OH-BTA-0 och 6-OH-BTA-1 och kalibrera instrumentet för att kvantifiera innehållet i varje förening.
- Bestäm restlösningsmedelsinnehållet med hjälp av ett analytiskt gaskromatografisystem utrustat med en kapillärkolonn. Bestäm retentionstiderna för aceton och etanol och kalibrera instrumentet för att kvantifiera innehållet i varje lösningsmedel.
- Utför bakteriella endotoxinhalteprovet med hjälp av en patron läsare utrustad med lämpliga patroner.
- Utför sterilitet analys av provet minst 14 dag efter syntesen för att säkerställa frånvaron av bakterietillväxt eller skicka sterilitet provet till ett laboratorium som ackrediterats av den lokala hälsovårdsmyndigheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att sammanfatta en typisk radiosyntes av [11c] PIB, gasformiga [11c] CH3OTf först passerade genom en tC18 patron förladdad med en lösning av föregångare (figur 1). Separation av reaktionsblandningen uppnås sedan genom successiva eluering med vattenhaltiga etanol lösningar enligt följande. Först, 12,5% EtOH eluerar majoriteten av oreagerade [11c] CH3OTf och 6-Oh-BTA-0, sedan 15% EtOH tvättar ut resterande orenheter, och slutligen en 50% etanollösning eluerar önskad [11c] PIB i en steril flaska. Den Tracer späds sedan med steril fosfatbuffert och genomgår strikta QC förfaranden innan release till PET Imaging site. Typiska analytiska HPLC-UV-och radio aktivitets kromatogram av den [11C] PIB-sats som lämpar sig för administrering finns representerade i figur 3.
Den totala radio syntes tiden är 10 min med början från leveransen av [11c] CH3OTF, RCY [11c] PIB med 0,2 mg föregångare är 22% (från [11c] CH3OTF, inte korrigeras för förfall) och molar aktiviteten är 190 GBq/μmol. Spårämne måste överensstämma med alla QC specifikationer av multicenter Dominantly ärftlig Alzheimernätverk prövningar enhet (DIAN-TU) för kliniska prövningar: den radiokemiska renhet måste vara över 95%; halten icke-radioaktiva föroreningar skall vara lägre än 1,3 μg per 10 mL dos. pH-värdet måste vara inom intervallet 4-8; och etanol och aceton innehållet måste vara under 10% och 3000 ppm, respektive. Proverna måste också vara sterila och endotoxin fria. Resultaten av fyra typiska radiosyntes körningar sammanfattas i tabell 1.
För att den rapporterade tekniken ska fungera korrekt måste försiktighet iakttas vid flera kritiska steg som beskrivs ovan. För att tillämpa föregångaren på tC18 cylinderampullen (steg 2,4) får lösningen inte skjutas mot utgången, för att inte förkorta den effektiva vägen för separation av [11C] PIB från de oreagerade utgångsmaterialen och eventuella sidoprodukter. Flödet av [11C] CH3OTf genom en patron under överföringen får inte överstiga 20 ml/min (steg 4,1). När elueringen börjar (steg 4,4), är det mycket viktigt att hålla patronen våt och inte låta luft genom att undvika kanalisering effekter som kan resultera i lägre renhet av Tracer eller lägre RCY på grund av förlusterna av [11C] PIB i avfallet. Om det 5-portars grenrör som används i röntgen syntesen (steg 3,1) inte är resistent mot aceton, till exempel ett polykarbonatrör av standardtyp som ACC-101, får mängden aceton inte överstiga 100 μL eftersom större volymer kan skada grenröret under aktivitets överföringen och resultera i misslyckad syntes. Om pH-värdet inte uppfyller specifikationerna, kan tC18 cylinderampullen eventuellt sköljas med 10 mL sterilt vatten mellan steg 4,7 och 4,8 i avfallsflaskan.
Figur 1: radiosyntes av [11c] PIB med 11c-metylering av 6-Oh-BTA-0 prekursor med [11c] CH3OTf. [11c] PIB är en av de mest använda radiotracerna för avbildning av amyloida plack associerade med annons och andra neurodegenerativa förhållanden av PET. Denna Tracer syntetiseras vanligen via 11c-metylering av anilinprekursorer som kallas 6-Oh-BTA-0 med[11c] METYLTRIFLAT ([11c] CH3OTF) antingen i lösning eller i den torra HPLC-injekteringen (lösningsmedels intern teknik). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: steg för steg-syntes och rening av [11C] PIB på en tC18 patron. (A) gasformiga [11C] CH3OTf passerar genom patronen laddad med 6-Oh-BTA-0. Som beskrivs i steg 4,1 och 4,2, [11C] CH3OTf är fångad på patronen som innehåller föregångaren och reagerar med föregångaren vid rumstemperatur i 2 min. (B) tvätta 1 eller tvätta 2 lösning dras in i dispensern sprutan. Som beskrivs i steg 4,3, sprutpumpen av modulen drar kolven av den klippta sprutan uppåt, dra tillbaka en lösning av antingen elueringslösning genom en linje som är ansluten till port 1 av grenröret. C) föroreningarna tvättas ut i en avfallsflaska. Som beskrivs i steg 4,4, sprutpumpen av modulen flyttar kolven av den klippta sprutan nedåt, trycka den tillbakadragna tvättlösning genom tC18 patronen via portarna 1, 3 och 4 av samlingsröret i en avfallsflaska. Steg som återges i diagrammen B och C upprepas i en cykel flera gånger för att tvätta bort alla oreagerade material från patronen, enligt beskrivningen i steg 4,5-4,7. (D) [11C] PIB elueras med den slutliga eluenten i en steril flaska genom ett sterilt filter. Som beskrivs i steg 4,8 och 4,9, sprutan klippt i en spruta pumpen är frånkopplad från linjen och ersättas först med en 10 mL spruta som innehåller 2,5 mL av 50% vatten etanol. Port 5 av grenröret växlas sedan mot den sterila flaskan och [11C] PIB elueras från tC18 manuellt. Den tomma sprutan ersätts sedan med en annan spruta som innehåller 10 mL steril fosfatbuffert och hela innehållet trycks genom tC18 för att skölja linjerna enligt beskrivningen i steg 4,10. Den sterila injektionsflaskan innehåller nu [11C] PIB i en 12,5 ml 10% buffrad vatten etanollösning. Denna siffra har modifierats från Boudjemeline et al.12. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kvalitetskontroll analytisk HPLC på [11C] PIB. A) retentionstiderna för [11c] CH3OH (från hydrolys av [11c] CH3OTF), oreagerade [11c] CH3OTF, och tracer [11c] PIB på radio aktivitets kromatogrammet är 2,1, 4,0 och 6,6 min, Respektive. Analysen av radioaktiviteten spår visar att RCP av [11C] pib är 98,0%. (B) retentionstiderna för 6-Oh-BTA-0 (föregångare) och 6-Oh-BTA-1 (Tracer Peak) på UV-kromatogrammet är 3,6 respektive 5,9 min. Analysen av UV-spår visar resterande prekursorer koncentration under den acceptabla gränsen (1,3 μg) och frånvaron av andra icke-radioaktiva föroreningar. Den radiokemiska och kemiska renheten hos spårämne är därför godtagbar för kliniska PET-studier. HPLC-villkor-kolonn (tabell över material): 5 μm, 100 x 4,0 mm; mobil fas: 40:60 acetonitril/vattenflöde: 0,7 mL/min. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: optimering av 6-Oh-BTA-0 prekursor belopp. Det lägsta beloppet (0,1 mg) ger [11C] PIB i en måttlig radiokemisk avkastning (RCY) på 18,1 ± 3,8%. Radio syntes start från 0,2 mg ger [11C] PIB en RCY på 22,0 ± 3,1%, samtidigt öka mängden till 0,3 mg ytterligare förbättrar RCY till 32,1 ± 3,7%, på bekostnad av en något högre mängd av föregångaren i slutprodukten. Alla RCY: s korrigeras inte för förfall (radio syntes tid på 10 min) med början från radioaktiviteten i [11C] CH3OTf fångade på tC18 patron. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: kvalitetskontroll analytisk HPLC på [11C] ABP688. A) radioaktivitet kromatogram visar RCP av kombinerade (E)-och (Z)-[11C] ABP688 av 98,1%. B) UV-kromatogram visar restkoncentrationer av prekursorer över 10 μg. Medan den kemiska renhet kan vara acceptabelt för kliniska PET-studier, relativt låg effektiv molar aktivitet (enm ≪ 37 GBq/μmol) kräver ytterligare rening optimering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Batch | Run 1 | Run 2 | Run 3 | Run 4 |
| [11C] CH3OTf, GBq | 9,21 | 11,25 | 7,84 | 6,44 |
| [11C] PiB, GBq | 2,26 | 2,37 | 2,11 | 1,41 |
| RCY,% * | 24,5 | 21,1 | 26,9 | 21,8 |
| RCP,% | 98 | 97,2 | 97,8 | 99,2 |
| Molar aktivitet, GBq/μmol | 154,6 | 322,6 | 121,1 | 162,1 |
| Restprekursor, μg | 0,32 | 0,55 | 0,58 | 0,87 |
| Ph | 5 | 5 | 5 | 5 |
| EtOH-innehåll,% | 9,4 | 8,8 | 7,7 | 8,1 |
| Aceton innehåll, ppm | 33 | 38 | 46 | 33 |
| BET test | N/A | < 10 EU/mL | < 10 EU/mL | < 10 EU/mL |
| Sterilitet test | N/A | Ingen tillväxt | Ingen tillväxt | Ingen tillväxt |
| * Fotnot: från [11C] CH3OTf, inte korrigeras för förfall | ||||
Tabell 1. Representativa resultat av [11C] PIB produktion körs under optimerade förhållanden. Alla partier uppfyller kraven för spårämnen avsedda för kliniska PET-studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trots den senaste utvecklingen och FDA godkännande av flera 18F-märkta PET-tracers, såsom florbetapir, florbetaben och flutemetamol, [11C] PIB förblir en guld standard Tracer för amyloid Imaging på grund av den snabba hjärnan upptag och låg icke-specifik Bindande. För närvarande är denna Tracer syntetiseras via antingen våt kemi16 eller med hjälp av en "torr slinga" metod4,17. Båda metoderna kräver HPLC rening följt av omformulering i vatten etanol, som tar cirka 20-30 min från [11C] CH3OTf. Inspirerad av några av de tidigare rapporterna om solid fas stödde 11c-metylering tekniker och den kliniska betydelsen av [11c] PIB, syftade vi till att utveckla en radiosyntes av denna Tracer med hjälp av billig disponibel fast fas extraktion ( SPE) patroner som en "3-i-1" enhet för reaktion, rening och formulering.
De mest kritiska stegen för framgångsrik produktion av PET-spårämnen för in vivo-avbildning hos försökspersoner är: 1) införlivande av den radioaktiva isotopen i en spår molekyl; 2) separering av spårämne från obesvarade radioaktiva och icke-radioaktiva arter. 3) omformulering av spårämne i ett biologiskt kompatibelt lösningsmedel. 4) efterlevnad av kvalitetskontrollförfaranden. Baserat på den tidigare rapporterade metoden med lösningsmedels fångenskap, förväntade vi att den SPE-stödda tekniken skulle kräva en lägre mängd föregångare jämfört med 11C-metylering i lösning. I synnerhet har tidigare rapporterade lösningsmedels captive förfaranden för radiosyntesen av [11C] PIB kräver 0,5-1,0 mg av föregångaren4,17. Sålunda, vi undersökte inte korrigeras för Decay radiokemiska avkastningen på [11c] PIB från [11c] CH3OTf på tre olika mängder av 6-Oh-bta-0:0,1, 0,2, och 0,3 mg. Även det lägsta beloppet (0,1 mg) ger en måttlig mängd [11C] PIB, om än vid relativt låg och mindre tillförlitlig RCY (18,1 ± 3,8%). Radiosynthesis start från 0,2 mg ger en RCY på [11C] PIB (22,0 ± 3,1%), samtidigt öka mängden till 0,3 mg ytterligare förbättrar RCY (32,1 ± 3,7%), på bekostnad av en något högre mängd av föregångaren i slutprodukten. I samtliga fall var röntgen syntesen klar i 10 min. Sålunda, den optimala prekursorer beloppet beror på önskad RCY och renhet av [11C] PIB i synnerhet PET Centers. Resultaten av den radiokemiska avkastningen optimerings experiment baserat på prekursorer belopp sammanfattas i figur 4. Särskilt, radiosyntes försök med [11c] CH3I som ett metylerande medel eller etanol som ett reaktions lösningsmedel gav inte den önskade [11c] PIB (data som inte visas).
Den kvantitativa separationen av radio syntes reaktionen blandningen på en kort SPE patron var den mest utmanande delen av den beskrivna tekniken. Vi hypotes om att aromatiska aminer 6-Oh-BTA-0 och 6-Oh-BTA-1 huvudsakligen finns i deras protonerade former i sura medier och därför skulle ha skarpare eluering profiler från omvänd fas fast fas. Därför var alla vattenhaltiga etanol lösningar beredda med 0,2 M acetatbuffert vid pH 3,7. Därefter bestämde vi att vattenhaltiga etanol lösningar med EtOH koncentration upp till 15% gradvis eluera oreagerade föregångare 6-Oh-BTA-0 och [11c] CH3OTf, medan radioaktivt märkt [11c] PIB förblir fångade på tC18 patronen. För att förhindra att dessa föroreningar tailing till en slutlig tracerformulering ökades etanol koncentrationen från 12,5% till 15% i en lutnings upplösning. Efter att alla orenheter hade tvättats ur patronen uppnåddes spårningseluering med en minimal mängd (2,5 mL) av den koncentrerade etanollösningen (50%). För att hålla etanol innehållet under 10%-gränsen och för att få pH i den formulerade spårämnet inom det godtagbara intervallet för Human injektion (4-8), späddes spårämnet med steril fosfatbuffert.
Efter villkor optimering, var radiosyntesen av [11C] PIB automatiserad med hjälp av en kommersiellt tillgänglig automatiserad syntes enhet (ASU), utrustad med dispenser spruta och disponibel grenrör. De många inställningarna för just denna ASU är enkel som beskrivs i steg 3,1-3,5. Särskilt, denna metod kan enkelt genomföras på de flesta andra tillgängliga ASU: s efter recepten som beskrivs ovan. Under optimerade förhållanden, partier av [11C] PIB lämpar sig för klinisk tillämpning syntetiseras med sista aktiviteter från 1,4 till 2,4 gbq (38-61 MCI).
På senare tid har vi tillämpat "3-i-1"-tekniken för radioaktiv märkning av [11C] ABP688, ett PET-spår för avbildning av metabotropa glutamatreceptorer typ 5 (mGlu5)18,19. Radiosyntesen av denna Tracer förlitar sig på 11C-metylering av-OH-gruppen i oxiden; Därför krävs tillsats av bas för att deprotonate den desmetyl föregångare. Tetrabutylammoniumhydroxid (som en 1 M lösning i MeOH) valdes som bas eftersom den är löslig i de flesta polära organiska lösningsmedel. I ett preliminärt radioaktivt märkt experiment, en lösning av föregångare (0,5 mg) i DMSO (100 μL) blandades med 1 M TBAOH i MeOH (20 μL) och blandningen var noggrant tillämpas på tC18 patronen som beskrivs ovan (se steg 2,4). Gasformiga [11C] CH3jag passerade genom patronen som beskrivs i steg 4,1-4,2 och reaktionen tilläts fortsätta vid rumstemperatur i 5 min. sekventiell eluering med utspädda etanol lösningar i 0,2 M natriumbikarbonatbuffert (pH 8,5- 9,0)-92 mL 15% EtOH följt av 92 mL 20% EtOH-spolats ut den oreagerade [11C] CH3i och restprekursorer. Radiokemiskt ren [11C] ABP688 (RCY = 18,2%, rcp > 98.0%) sedan eluerades med 50% EtOH lösning i samma buffert genom ett sterilt filter som beskrivs i steg 4,9-4,11. Trots att över 98% av föregångaren avlägsnas med utspädd etanol tvättar, närvaron av vissa oreagerade föregångare i den slutliga spårämne (upp till 20 μg) kräver ytterligare optimering av radio syntes förfarandet. Denna optimering pågår, och resultaten av detta projekt kommer att publiceras i sinom gång. Representativa analytiska HPLC-UV-och radio aktivitets kromatogram av [11C] ABP688-satsen visas på figur 5.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat en effektiv solid fas stöds Carbon-11 radiolabeling förfarande med lätt tillgängliga billiga SPE patroner som "3-i-1" enheter för radio syntes, rening, och formulering av PET-spår som används för kliniska Imaging. Tracers lämpliga för mänsklig injektion produceras inom 10 min med början från tillsats av 11c-metylerande medel ([11c] CH3OTF eller [11c] CH3i) i hög RCY och molar aktivitet. Vi helt automatiserad denna teknik för att göra det förenligt med god tillverkningssed (GMP) förordningar som införts av hälso-och Strålsäkerhets myndigheterna. Solid fas stöds radiosyntes kräver en låg mängd föregångare, undviker användning av giftiga lösningsmedel, minskar syntes tiden och stråldos som upprätthålls av personalen. Att undvika HPLC-relaterade fel förbättrar dessutom radio syntes tillförlitligheten och möjliggör utveckling av engångssatser för rutinmässig spår produktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöddes delvis av ett bidrag 18-05 från Alzheimers Society i Kanada (för A. K.) och Brain Canada Foundation med stöd från Health Canada. Författarna vill erkänna McGill University fakulteten för medicin, Montreal neurologiska Institutet och McConnell Brain Imaging Centre för stöd för detta arbete. Vi tackar också Mrs Monica Lacatus-Samoila för hjälp med kvalitetskontrollförfaranden och DRS. Jean-Paul Soucy och Gassan Massarweh för tillgång till radioisotoper och radiokemi anläggningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-OH-BTA-0 | ABX advanced biochemical compounds | 5101 | Non-radioactive precursor of [11C]PiB |
| 6-OH-BTA-1 | ABX advanced biochemical compounds | 5140 | Non-radioactive standard of [11C]PiB |
| Agilent 1200 HPLC system | Agilent | Agilent 1200 | Analytical HPLC system |
| Ethanol absolute | Commercial alcohols | 432526 | |
| Hamilton syringe (luer-tip, 250 µL) | Hamilton | HAM80701 | |
| MZ Analytical PerfectSil 120 | MZ-Analysentechik GmbH | MZ1440-100040 | Analytical HPLC column |
| Perkin Elmer Clarus 480 GC system | Perkin Elmer | Clarus 480 | Gas chromotograph |
| polycarbonate manifold | Scintomics | ACC-101 | Synthesis manifold |
| Restek MTX-Wax column (30 m, 0.53 mm) | Restek | 70625-273 | Analytical GC column |
| Scintomics GRP module | Scintomics | Scintomics GRP | Automated synthesis unit |
| Sep-Pak tC18 Plus | Waters | WAT020515 | Solid phase extraction cartridge |
| solvent-resistant manifold | Scintomics | ACC-201 | Synthesis manifold |
| Spinal needle | BD | 405181 | |
| Sterile extension line | B. Braun | 8255059 | |
| Sterile filter | Millipore | SLLG013SL | |
| Sterile vial (20mL) | Huayi | SVV-20A | |
| Sterile water | Baxter | JF7623 | |
| Synthra MeIplus Research | Synthra | MeIplus Research | [11C]CH3I/[11C]CH3OTf module |
| Syringe (10 mL) | BD | 309604 | |
| Syringe (1mL) | BD | 309659 | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4617207V | Dispenser syringe |
| Vent filter | Millipore | TEFG02525 |
References
- Langstrom, B., Lundqvist, H. The preparation of 11C-methyl iodide and its use in the synthesis of 11C-methyl-L-methionine. The International journal of applied radiation and isotopes. 27 (7), 357-363 (1976).
- Larsen, P., Ulin, J., Dahlstrøm, K., Jensen, M. Synthesis of [11C]iodomethane by iodination of [11C]methane. Applied radiation and isotopes. 48 (2), 153-157 (1997).
- Jewett, D. M. A simple synthesis of [11C]methyl triflate. International journal of radiation applications and instrumentation. Part A, Applied radiation and isotopes. 43 (11), 1383-1385 (1992).
- Wilson, A. A., Garcia, A., Houle, S., Vasdev, N. Utility of commercial radiosynthetic modules in captive solvent [11C]-methylation reactions. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 52 (11), 490-492 (2009).
- Wilson, A. A., Garcia, A., Jin, L., Houle, S. Radiotracer synthesis from [(11)C]-iodomethane: a remarkably simple captive solvent method. Nuclear medicine and biology. 27 (6), 529-532 (2000).
- Fedorova, O. S., Vaitekhovich, F. P., Krasikova, R. N. Automated Synthesis of [18F]Fluoromethylcholine for Positron-Emission Tomography Imaging. Pharmaceutical Chemistry Journal. 52 (8), 730-734 (2018).
- Jewett, D. M., Ehrenkaufer, R. L., Ram, S. A captive solvent method for rapid radiosynthesis: application to the synthesis of [1-(11)C]palmitic acid. The International journal of applied radiation and isotopes. 36 (8), 672-674 (1985).
- Watkins, G. L., Jewett, D. M., Mulholland, G. K., Kilbourn, M. R., Toorongian, S. A. A captive solvent method for rapid N-[11C]methylation of secondary amides: application to the benzodiazepine, 4'-chlorodiazepam (RO5-4864). International journal of radiation applications and instrumentation. Part A, Applied radiation and isotopes. 39 (5), 441-444 (1988).
- Hockley, B. G., Henderson, B., Shao, X. Chapter 27, Synthesis of {11C]Raclopride. Radiochemical Syntheses. , John Wiley & Sons. 167-175 (2012).
- Lodi, F., et al. Reliability and reproducibility of N-[11C]methyl-choline and L-(S-methyl-[11C])methionine solid-phase synthesis: a useful and suitable method in clinical practice. Nuclear Medicine Communications. 29 (8), 736-740 (2008).
- Jolly, D., et al. Development of "[(11)C]kits" for a fast, efficient and reliable production of carbon-11 labeled radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography. Applied radiation and isotopes. 121, 76-81 (2017).
- Boudjemeline, M., et al. Highly efficient solid phase supported radiosynthesis of [(11) C]PiB using tC18 cartridge as a "3-in-1" production entity. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 60 (14), 632-638 (2017).
- Mathis, C. A., et al. A lipophilic thioflavin-T derivative for positron emission tomography (PET) imaging of amyloid in brain. Bioorganic and medicinal chemistry letters. 12 (3), 295-298 (2002).
- Mathis, C. A., et al. Synthesis and evaluation of 11C-labeled 6-substituted 2-arylbenzothiazoles as amyloid imaging agents. Journal of medicinal chemistry. 46 (13), 2740-2754 (2003).
- Buffer Reference Center. , Sigma Aldrich. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/life-science/core-bioreagents/biological-buffers/learning-center/buffer-reference-center.html (2019).
- Philippe, C., Mitterhauser, M., Wadsak, W. Chapter 18, Synthesis of 2-(4-N-[11C]Methylaminophenyl)-6-Hydroxybenzothiazole ([11C]6-OH-BTA-1; [11C]PIB). Radiochemical Syntheses. , John Wiley & Sons. 177-189 (2012).
- Shao, X., Fawaz, M. V., Jang, K., Scott, P. J. H. Synthesis and Applications of [11C]Hydrogen Cyanide. Radiochemical Syntheses. , John Wiley & Sons. 207-232 (2015).
- Ametamey, S. M., et al. Radiosynthesis and preclinical evaluation of 11C-ABP688 as a probe for imaging the metabotropic glutamate receptor subtype 5. Journal of Nuclear Medicine. 47 (4), 698-705 (2006).
- Ametamey, S. M., et al. Human PET studies of metabotropic glutamate receptor subtype 5 with 11C-ABP688. Journal of Nuclear Medicine. 48 (2), 247-252 (2007).
