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Bioengineering

मेटाबायोमेशन अनुसंधान और संरक्षण के लिए जैव उपचार और प्रोबायोटिक्स विकास के लिए संभावित सूक्ष्मजीवी तनाव

Published: October 31, 2019 doi: 10.3791/60238
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 2, 1,2,3
1LEMM, Laboratory of Molecular Microbial Ecology, Institute of Microbiology Paulo de Góes, Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2Genome Center, University of California, Davis, 3IMAM-AquaRio - Rio de Janeiro Aquarium Research Center

Summary

प्रदूषण सभी बायोम को प्रभावित करता है। समुद्री वातावरण विशेष रूप से प्रभावित किया गया है, विशेष रूप से प्रवाल भित्तियों, पृथ्वी पर सबसे संवेदनशील पारिस्थितिकी प्रणालियों में से एक. जैव-चिकित्सा जीवों की संदूषकों को नीचा करने की क्षमता है। यहाँ, हम अलग करने के लिए तरीकों का वर्णन और कोरल के लिए bioremediation क्षमता और संभावित प्रोबायोटिक विशेषताओं पेश रोगाणुओं का परीक्षण.

Abstract

प्रदूषण सभी बायोम को प्रभावित करता है। समुद्री वातावरण विशेष रूप से प्रभावित किया गया है, विशेष रूप से प्रवाल भित्तियों, पृथ्वी पर सबसे संवेदनशील पारिस्थितिकी प्रणालियों में से एक. वैश्विक स्तर पर, 4.5 अरब लोग आर्थिक रूप से समुद्र पर निर्भर हैं, जहां उनकी अधिकांश आजीविका प्रवाल भित्तियों द्वारा प्रदान की जाती है। कोरल बहुत महत्व के हैं और इसलिए उनके विलुप्त होने भयावह परिणाम की ओर जाता है. समुद्री प्रदूषकों और स्थानीय संदूषण को सुधारने के लिए कई संभावित समाधान हैं, जिनमें बायोरिमेडियेशन भी शामिल है। जैव-चिकित्सा जीवों की संदूषकों को नीचा करने की क्षमता है। दृष्टिकोण ऐसे स्थिरता, अपेक्षाकृत कम लागत के रूप में कई लाभ प्रस्तुत करता है, और तथ्य यह है कि यह विभिन्न पारिस्थितिकी प्रणालियों में लागू किया जा सकता है, पर्यावरण के लिए कम से कम प्रभावों के कारण. एक अतिरिक्त लाभ के रूप में, अंतर्जात माइक्रोबायोम के हेरफेर, कोरल (pBMCs) के लिए putative लाभकारी सूक्ष्मजीवों सहित, समुद्री जानवरों के लिए प्रोबायोटिक प्रभाव हो सकता है। इस संदर्भ में, दो दृष्टिकोणों, बायोरिमेडियेशन और पीबीएमसी टीका संयुक्त का उपयोग आशाजनक हो सकता है। यह रणनीति विशिष्ट प्रदूषकों की गिरावट को बढ़ावा देगी जो कोरल और अन्य मेटाजीवों के लिए हानिकारक हो सकते हैं, साथ ही प्रदूषण और अन्य खतरों से निपटने के लिए मेजबान प्रतिरोध और लचीलापन भी बढ़ा सकते हैं। इस विधि pBMCs के चयन पर केंद्रित है दो contaminants नीचा: सिंथेटिक एस्ट्रोजन 17a-ethinylestradiol (EE2) और कच्चे तेल. दोनों को समुद्री जानवरों को नकारात्मक रूप से प्रभावित करने के लिए सूचित किया गया है, कोरल सहित, और मनुष्य. प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे अलग करने के लिए और विशिष्ट contaminants अपमानजनक करने में सक्षम बैक्टीरिया का परीक्षण करने के लिए, कैसे अपने कोरल मेजबान के लिए इन जुड़े रोगाणुओं के कुछ putative लाभकारी विशेषताओं का पता लगाने के लिए का एक विवरण के बाद. यहाँ वर्णित तरीके अपेक्षाकृत सस्ते हैं, प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और अत्यधिक अनुकूलनीय. लगभग घुलनशील लक्ष्य यौगिक के किसी भी प्रकार के बजाय EE2 और तेल का इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

प्रदूषण दुनिया भर में मानव, पशु, और पौधों के स्वास्थ्य को प्रभावित करने वाला एक प्रमुख मुद्दा है। हालांकि प्रदूषण प्राकृतिक हो सकता है, जैसे ज्वालामुखी राख1,मानव गतिविधियों सबसे प्रदूषण का प्राथमिक कारण हैं. मानवजनित गतिविधियां मिट्टी, पानी और हवा को दूषित कर रही हैं, जिससे प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से लगभग 20 मिलियन समयपूर्व मानव मृत्यु2 हो जाती है और प्रतिवर्ष अरबों जीवन का विनाश होता है। प्रदूषक भी ग्रह के सबसे दूरदराज के क्षेत्रों में मौजूद हैं. उदाहरण के लिए, गहरे समुद्र अकशेरुकी और ध्रुवीय स्तनधारियों मेंक्रमशः3,4में भारी धातुओं और लगातार कार्बनिक यौगिकों का पता लगाया गया है।

समुद्री वातावरण विशेष रूप से प्रदूषण से प्रभावित किया गया है. एक लंबे समय के लिए, यह मान लिया गया था कि सागर अप्रभावित रहेगा और पानी की भारी मात्रा5के कारण वस्तुओं का एक अंतहीन स्रोत की आपूर्ति करेगा। इस कारण से , सभी प्रकार के उद्योग और संस्थान स्वतंत्र रूप से6,7शताब्दियों के लिए जल निकायों में अपशिष्ट को मुक्त कर देते हैं . सभी प्रकार के कई संदूषक, जैसे प्लास्टिक8, सिंथेटिक हार्मोन9, कीटनाशक10, तेल11, पोषक तत्व12, भारीधातु3, और रेडियोधर्मी अपशिष्ट13 को प्रभावित करने के रूप में सूचित किया गया है सागर पारिस्थितिकी तंत्र. इस संदर्भ में, प्रवाल भित्तियों समुद्री वातावरण में सबसे महत्वपूर्ण और संवेदनशील पारिस्थितिकी प्रणालियों में से एक हैं14. रीफ तटीय रक्षक हैं, जो पोषक तत्वों साइकिल चालन और जलवायु नियंत्रण में आवश्यक भूमिका निभाकर समुद्री प्रजातियों के हजारों के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं। रीफ भी मछली, माल, और पर्यटन प्रदान करके अर्थव्यवस्था में योगदान, अन्य15के बीच . उदाहरण के लिए, 4.5 अरब लोगों को उनके मुख्य खाद्य स्रोत16,जो बहुत प्रवाल भित्तियों द्वारा समर्थित हैं के रूप में सागर मछली पर निर्भर करते हैं.

उनके पारिस्थितिक, सामाजिक और आर्थिक महत्व के बावजूद प्रवाल भित्तियों को17,18को नष्ट किया जा रहा है . मानवजनित गतिविधियां मुख्य रूप से कोरल की मृत्यु के तीन मुख्य कारणों में योगदान करने के लिए जिम्मेदार हैं: जलवायु परिवर्तन, अति मछली पकड़ने, और जल प्रदूषण19. हालांकि यह ग्लोबल वार्मिंग के कम करने पर काम करने के लिए महत्वपूर्ण है, यह भी महत्वपूर्ण है कि जल प्रदूषण सहित स्थानीय संदूषण को कम करने पर काम करने के लिए, कि गंभीर रूप से कोरल गिरावट20में योगदान कर सकते हैं. इस प्रकार, कोरल के जीवनकाल को बढ़ाने के लिए रणनीतियों के विकास के लिए एक तत्काल आवश्यकता है, जो उन्हें अनुकूलित करने और जीवित रहने के लिए अतिरिक्त समय प्रदान कर सकता है।

इस संबंध में, संदूषण को कम करने के लिए समाधान खोजने के लिए और कोरल की फिटनेस बढ़ाने के लिए रणनीतियों को विकसित करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। समुद्री प्रदूषकों को उपचारित करने के लिए रणनीतियाँ अत्यधिक विविध हैं और उन्हें भौतिक, रासायनिक और जैविक दृष्टिकोणों में समूहीकृत किया जा सकता है। शारीरिक दृष्टिकोण सहायक होते हैं. हालांकि, वे हमेशा कुशल नहीं हैं. उदाहरण के लिए, प्लास्टिक कचरे को भौतिक हटाने से कम किया जा सकता है, जबकि पानी में घुलनशील यौगिकों को समाप्त करने के लिए अन्य तरीकों की आवश्यकता होती है। ऐसे यौगिकों के उदाहरण कच्चे तेल, तेल उद्योग की गतिविधियों और spills द्वारा जारी कर रहे हैं, साथ ही अन्य micropollutants, जैसे सिंथेटिक हार्मोन, सामान्य रूप से मौखिक गर्भ निरोधकों में एस्ट्रोजन घटक के रूप में इस्तेमाल किया और सीवेज21में मौजूद, 22.संदूषण को कम करने के लिए रासायनिक पदार्थों का उपयोग एक विशिष्ट समस्या का समाधान कर सकता है, लेकिन यह प्रदूषण के अतिरिक्त स्रोत का भी प्रतिनिधित्व कर सकता है। तेल के संदूषण को कम करने के लिए रासायनिक dispersants के साथ ऐसा ही मामला है, जिसे समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों के लिए तेल संदूषण से भी अधिक विषाक्त बताया गया है। इन कारणों के लिए, जैविक दृष्टिकोण अन्य तरीकों की तुलना में कई लाभ मौजूद है. जैव चिकित्सा जीवित जीवों की क्षमता है, या उनके चयापचय उत्पादों, कम विषाक्त या गैर विषैले रूपों में contaminants को बदलने के लिए24. जैविक तरीकों का उपयोग करने का मुख्य लाभ स्थिरता, सापेक्ष कम लागत, तथ्य यह है कि वे पारिस्थितिक रूप से अनुकूल हैं, और यह कि वे विभिन्न पारिस्थितिकी प्रणालियों में लागू किया जा सकता है, पर्यावरण के लिए कम या कम प्रभावों के कारण21, 25,26,27.

इसके अतिरिक्त, एक वातावरण में मौजूद माइक्रोबियल समुदाय के हेरफेर एक अतिरिक्त संभावित लाभ की अनुमति देता है. वहाँ microbiomes कि मेजबान के साथ जुड़े रहे हैं और उनके स्वास्थ्य के लिए आवश्यक हैं. यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि मेजबान होमियोस्टेसिस19को बनाए रखने के लिए ये संबद्ध सहजीवी माइक्रोबायोम आवश्यक हैं। इन संबद्ध सूक्ष्मजीवों के हेरफेर का अच्छी तरह से पता लगाया गया है जैसे कि पौधे और स्तनधारी28,29, लेकिन प्रवाल प्रोबायोटिक्स का उपयोग अभी भी उपन्यास15है . कोरल भी मेजबान, के साथ बातचीत, और सूक्ष्मजीवों की बड़ी और विशिष्ट आबादी पर निर्भर करने के लिए19जीवित रहते हैं. कोरल के स्वास्थ्य और डिस्बिओसिस में इन माइक्रोबियल समुदायों की भूमिका सक्रिय अध्ययन के अधीन है, लेकिन यह अभी भी पूरी तरह से30को समझने से दूर है। सबसे लोकप्रिय hypotheses में से एक कोरल प्रोबायोटिक परिकल्पना कहा जाता है. यह सहजीवी सूक्ष्मजीवों और पर्यावरणीय स्थितियों के बीच गतिशील संबंध के अस्तित्व का सुझाव देता है जो सबसे लाभप्रद प्रवाल मेटावों के चयन के बारे में लाता है31. इस जानकारी के आधार पर, प्रमुख संभावित प्रोबायोटिक तंत्र, साथ ही कई प्रयोजनों के लिए कोरल (बीएमसी) के लिए लाभकारी सूक्ष्मजीवों के अलगाव, हेरफेर और वितरण के लिए रणनीतियों का प्रस्तावकिया गया था और33का परीक्षण किया गया था। इन संभावित लाभकारी विशेषताओं में तापमान में वृद्धि के लिए प्रतिरोध, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) से सुरक्षा, नाइट्रोजन स्थिरीकरण, संदूषकों का प्रतिरोध, और रोगजनकों के विरुद्ध जैविक नियंत्रण,अन्य 32शामिल हैं।

यह अध्ययन बीएमसी और मुक्त रहने वाले सूक्ष्मजीवों के चयन पर केंद्रित है जो आमतौर पर समुद्री वातावरण में पाए जाने वाले दो संदूषकों को नीचा दिखाने की क्षमता पेश करते हैं: सिंथेटिक एस्ट्रोजन 17a-ethinylestradiol (EE2) और कच्चे तेल। हार्मोन सक्रिय एजेंटों वाले प्रदूषक प्राय : जल निकायों34,35,36,37,38,39,40में पाए जाते हैं. 41,42. उनमें से, सिंथेटिक एस्ट्रोजन अंत: स्रावी-विघ्नकारी यौगिकों (EDCs) लक्ष्य कोशिकाओं पर एस्ट्रोजेन की कार्रवाई की नकल, स्तन कैंसर सहित जानवरों पर कई प्रभावों के कारण,, infertility, और hermaphroditism9. EE2 मौखिक गर्भ निरोधकों के उपयोग की वजह से मनुष्य द्वारा उत्सर्जित किया जाता है। इसे पारंपरिक अपशिष्ट जल-उपचार संयंत्रों द्वारा सीवेज से नहीं हटाया जाता है और इसका बहुत कम सांद्रता पर भी नकारात्मक प्रभाव पड़ता है (जैसे, एनजी/एल या जेडजी/एल)43,44,45. प्रवाल शरीर क्रिया विज्ञान पर एस्ट्रोजेन के प्रभाव के बारेमें बहुतकम जानकारी है. हालांकि, अन्य समुद्री अकशेरुकी पर, जैसे स्पंज, क्रस्टेशियन, और मोलस्क, एस्ट्रोजेन को मुख्य रूप से प्रजनन से संबंधित कई नकारात्मक प्रभाव पैदा करने के लिए सूचित किया गया था, जैसे कि विकास और/या युग्मकों की उत्तेजना, एंजाइमी और प्रोटीन क्रियाओं , भ्रूण प्रक्रियाओं में समस्याओं , और अन्य48,49,50,51,52. EE2 संदूषण की वजह से नकारात्मक परिणाम समुद्री जीवन को प्रभावित किए बिना पर्यावरण से इस परिसर को दूर करने के लिए स्थायी दृष्टिकोण विकसित करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला.

समानांतर में, तेल के साथ वर्तमान में दुनिया की खपत ऊर्जा स्रोतों के लगभग 40% के लिए लेखांकन53, पुरानी संदूषण और तेल फैल अक्सर चट्टान क्षेत्रों11के पास होते हैं. तेल संदूषण समुद्री जानवरों , पक्षियों , पौधों , और मनुष्यों की कई प्रजातियों में नकारात्मक प्रभाव पैदा करने के लिए सूचित किया गया54,55,56,57. कोरल पर, यह विरंजन का कारण बनता है, थर्मल तनाव58के लिए लार्वा के प्रतिरोध को कम कर देता है, माइक्रोबियल संबद्ध समुदायों21को बाधित करता है , और ऊतक नेक्रोसिस का कारण बनता है। इसके अलावा, रासायनिक dispersants, एक तेल उपचार तकनीक आमतौर पर तेल कंपनियों द्वारा इस्तेमाल के लिए फैल उपचार, तेल ही23से कोरल के लिए और भी अधिक विषाक्त कर रहे हैं. इसके विपरीत, कोरल से अलग किए गए लाभकारी सूक्ष्मजीवों को मेजबान स्वास्थ्य पर महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है। हालांकि, संभव नकारात्मक पक्ष प्रभाव और चयापचय क्षमता है कि मेटाबायोजन की फिटनेस में सुधार करने के लिए जांच की जा सकती है की जांच करने के लिए इन संभावित प्रोबायोटिक्स के हेरफेर बेहतर पता लगाया जाना चाहिए। इस संदर्भ में, प्रवाल रोगजनकों के खिलाफ एंटीमाइक्रोबियल गतिविधि, ऑक्सीडेटिव तनाव से लड़ने के लिए कैटालेस का उत्पादन, यूरिया को नीचा करने की क्षमता (जो कैल्सिफिकेशन प्रक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिकाएं हो सकती है), और जीनों की उपस्थिति जैसी विशेषताएं कि संभावित लाभकारी विशेषताओं प्रदान, दूसरों के अलावा, जांच का ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए. यहाँ, हम बताते हैं कि कैसे bioremediation और प्रोबायोटिक्स सहवर्ती प्रदूषण के प्रभावों को कम करने और कोरल स्वास्थ्य को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. समुद्री प्रजातियों हठ बढ़ाने के लिए हस्तक्षेप के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि अभिनव दृष्टिकोण के विकास के एक और अधिक टिकाऊ और स्वस्थ ग्रह की ओर एक कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं.

Protocol

1. पानी और कोरल संग्रह और माइक्रोबियल अलगाव के लिए भंडारण

नोट: यह निर्देशांक और नमूना साइटों के तापमान लेने के लिए आवश्यक है. यदि संभव हो तो, लवणता, पीएच, गहराई, और प्रकाश तीव्रता जैसे मेटाडेटा भी ठीक-ट्यून किए गए खेती के दृष्टिकोण और डेटा की भविष्य की व्याख्या खोजने में मदद कर सकते हैं। विश्वसनीय परिणामों के लिए, संभव समय की न्यूनतम लंबाई के लिए संग्रहीत नमूने रखें. यदि नमूनों को सही तापमान पर नहीं रखा जाता है और/या लंबी अवधि के लिए संग्रहीत किया जाता है तो जल/कोरल माइक्रोबायोम काफी बदल सकता है। अलगाव कदम संग्रह के बाद तुरंत नहीं किया जाता है, तो यह प्रसंस्करण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। अब नमूने जमा हो जाती है, यहां तक कि 4 डिग्री सेल्सियस पर, और अधिक माइक्रोबियल समुदाय बदल जाएगा।

  1. नमूना और समुद्री जल की दुकान.
    1. प्रत्येक लक्षित नमूना साइट से कम से कम तीन में पानी के 500 एमएल नमूने ले लीजिए. स्क्रू कैप के साथ बाँझ बोतलों का प्राथमिकता से उपयोग करें।
    2. यदि संग्रह के बाद तुरंत पानी प्रसंस्करण, एक छोटे अंतराल के लिए आरटी पर बोतलों रखें. यदि नमूना प्रसंस्करण बाद में हो रहा है, तो बोतलों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. नमूना और कोरल की दुकान.
    1. पानी के नमूनों की एक ही नमूना साइट से कोरल टुकड़े में कटौती करने के लिए प्लास की एक बाँझ जोड़ी का प्रयोग करें। संदूषण से बचने के लिए, केवल बाँझ दस्ताने के साथ कोरल को स्पर्श करें।
    2. समुद्री जल के ढीले संलग्न मुक्त रहने वाले बैक्टीरिया से छुटकारा पाने के लिए 20 एमएल बाँझ नमकीन समाधान (3% नासीएल आसुत पानी में) या कृत्रिम समुद्री जल का उपयोग करके नमूना कोरल टुकड़े को कुल्ला करें।
    3. forceps का उपयोग करना, बाँझ नमकीन समाधान युक्त एक पेंच टोपी के साथ एक बाँझ 250 -500 एमएल कंटेनर में प्रत्येक कोरल टुकड़ा जगह है।
    4. प्रयोगशाला में, बाँझ संदंश और प्लास का उपयोग करके, वजन पैमाने पर बाँझ 100 मिमी x 20 मिमी पेट्री व्यंजन का उपयोग करके 5 ग्राम कोरल टुकड़े का वजन करें।
    5. एक बाँझ मोर्टार के लिए कोरल नमूना के 5 ग्राम स्थानांतरण और यह एक बाँझ मूसल का उपयोग कर macerate.
    6. एक बाँझ स्पैटुला का उपयोग करके, गदाक्रमित नमूने को एक बाँझ संस्कृति फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें 3% नैकल बाँझ समाधान के 45 एमएल और 5 मिमी के 10 डिग्री 15 ग्लास मोती होते हैं। मोर्टार धोने और मैकेरेट की अधिकतम मात्रा को ठीक करने के लिए 45 एमएल बाँझ लवणीय समाधान में से कुछ का उपयोग करें।
    7. नमूना स्थल के जल तापमान पर 16 ज के लिए फ्लास्क को निरंतर आंदोलन (150 x ग्राम) के अंतर्गत रखें।
      नोट: उथले पानी कोरल के लिए इष्टतम तापमान 24 डिग्री 28 डिग्री सेल्सियस से लेकर होगा। यह चरण विभिन्न कोरल डिब्बों से सूक्ष्मजीवों को अलग करेगा, जैसे मेजबान कोशिकाओं से जुड़े लोग, या ऊतक और कंकाल के अंदर रहने वाले। इस कदम के बाद, कोरल macerates संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए, और अलगाव कदम तुरन्त प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

2. समुद्री जल और/या कोरल से ईई 2-डिग्रेडिंग बैक्टीरिया का अलगाव

  1. बैक्टीरिया का चयन करें।
    नोट: चरण 1.1.2 और 1.2.7 के बाद, समुद्री जल में सूक्ष्मजीवों की एकाग्रता जो विभिन्न कोरल मैकेरेट से अलग है, अज्ञात और चर होगा। agar मीडिया युक्त पेट्री व्यंजन में व्यक्तिगत माइक्रोबियल कालोनियों के अलगाव की गारंटी के लिए, सीरियल कमजोर पड़ने की जरूरत है.
    1. कोरल नमूनों के लिए बाँझ नमकीन समाधान में 10-9 करने के लिए और पानी के नमूने के लिए 10-6 अप करने के लिए सीरियल कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं। टिप discarding से पहले Pipette ऊपर और नीचे 5x तनु हो जाता है. अगले धारावाहिक कमजोर पड़ने के प्रदर्शन से पहले 5 s हर बार के लिए भंवर नमूने.
    2. पेटरी व्यंजन ों पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के Pipette 100 $L 3% NaCl lysogeny शोरबा (एलबी) agar मध्यम, और उन्हें थाली.
      नोट: एक वैकल्पिक माध्यम के रूप में समुद्री आगर (एमए) का उपयोग करें। प्रत्येक कमजोर पड़ने के triplices विश्वसनीय परिणाम के लिए आवश्यक हैं.
    3. लक्ष्य तापमान (उदाहरण के लिए, 26 डिग्री सेल्सियस) पर 1 डिग्री 3 दिनों के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें। दिन में एक बार प्लेटों की जाँच करें।
    4. चुनें और लकीर प्लेट तकनीक का उपयोग कर नई प्लेटों पर अलग विकास morphologies पेश कालोनियों को अलग. प्लेटों पर बढ़ रही शुद्ध कालोनियों के लिए आवश्यक के रूप में कई बार के रूप में इस कदम को दोहराएँ।
    5. यदि प्रक्रिया तुरन्त कदम 2.3.1 करने के लिए जारी नहीं है, स्टोर पर अलग 4 डिग्री सेल्सियस या ग्लिसरोल में खंड 2.2 में वर्णित के रूप में.
  2. ग्लिसरोल स्टॉक तैयार करें।
    नोट: यह कदम वैकल्पिक है और लंबी अवधि के जीवाणु स्टॉक भंडारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
    1. ताजा प्लेट से या 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत प्लेटों से एकल कालोनियों उठाओ और स्वतंत्र रूप से उन्हें बाँझ एलबी माध्यम के 2 एमएल में टीका।
    2. लगातार आंदोलन के तहत ट्यूब प्लेस (150 x ग्राम) 24 डिग्री 28 डिग्री सेल्सियस रात में (पर).
    3. चरण 2.2.2 से जीवाणु संस्कृतियों के 1 एमएल जोड़ें और बाँझ ग्लिसरोल 2 एमएल cryovials के लिए 20% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए.
    4. क्रायोविलों को 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
    5. -80 डिग्री सेल्सियस पर ग्लिसरोल जीवाणु स्टॉक रखें जब तक की जरूरत है।
  3. EE2-अवक्रमण क्षमता परीक्षण निष्पादित करें।
    1. LB शोरबा या वैकल्पिक मीडिया में अलग को सक्रिय करें। इसके लिए, ताजा प्लेटों या 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत प्लेट से एक कॉलोनी चुनें, और बाँझ एलबी माध्यम के 2 एमएल टीका लगाएं। यदि यह ग्लिसरोल स्टॉक है, तो पहले इसे एलबी गार प्लेटों पर लकीर और 24 डिग्री 28 डिग्री सेल्सियस पर एकल कालोनियों को उगाने के लिए इनक्यूबेट करें। एलबी माध्यम युक्त ट्यूब को स्थिर आंदोलन (150 x ग्राम) के अंतर्गत 24 डिग्री 28 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. जीवाणु वृद्धि के बाद, कमरे के तापमान (आरटी) पर 8 मिनट के लिए 8,000 x ग्राम पर उन्हें सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा कोशिकाओं को गोली। सुपरनेंट को छोड़ दें और, धीरे से ऊपर और नीचे पाइपिंग, शेष एलबी शोरबा धोने के लिए नमकीन पानी के बराबर मात्रा (2 एमएल) में कोशिकाओं को फिर से खड़ा करें।
    3. यह गारंटी देने के लिए चरण 2.3.2 को दो बार दोहराएँ कि कार्बन स्रोत का कोई निशान नहीं है, कोशिकाओं को लवणीय विलयन की समान मात्रा में पुनः निलंबित करना। उदाहरण के लिए, यदि यह 2 एमएल संस्कृति के साथ प्रारंभ किया गया था, तो कोशिकाओं को 2 एमएल लवणीय समाधान के अंतिम खंड में पुन: निलंबित करें.
    4. न्यूनतम Bushnell Haas संस्कृति माध्यम (BH Broth) में धोया और resuspended कोशिकाओं टीका केवल कार्बन स्रोत59के रूप में EE2 युक्त .
      नोट: EE2 संस्कृति माध्यम में 5 मिलीग्राम/L की अंतिम सांद्रता में इथेनॉल में भंग किया जाता है। यदि आवश्यक हो तो प्रदूषक प्रकार और/या एकाग्रता में परिवर्तन करें।
    5. एल बी एगर मीडियम33पर 600 एनएम और/या कालोनियों में ऑप्टिकल घनत्व द्वारा जीवाणु वृद्धि का आकलन करें, 16 डिग्री 72 एच ऊष्मायन के लिए।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, सूक्ष्मजीवों सीधे EE2 युक्त न्यूनतम मीडिया पर अलग किया जा सकता है, या अन्य यौगिकों, केवल कार्बन स्रोत के रूप में. यह कदम चयन को निर्देशित करेगा और अवांछनीय विकास से बचना होगा।

3. समुद्री जल और/या कोरल से तेल-अपमानजनक बैक्टीरिया का अलगाव

  1. एक तेल पानी में घुलनशील अंश (OWSF) और तेल पानी में घुलनशील अंश (OWIF) केवल कार्बन स्रोत21के रूप में युक्त न्यूनतम मीडिया तैयार करें.
    1. बाँझ आसुत पानी के 500 एमएल में 1 $2% कच्चे तेल जोड़ें। अघुलनशील अंश की ऊपरी परत परेशान किए बिना घुलनशील अंश को बाहर ले जाने के लिए तल पर खोले गए फ़िल्टर फ्लास्क का उपयोग करें।
    2. मिश्रण को 48 ज के लिए 150 x ग्राम पर 24 डिग्री 28 डिग्री सेल्सियस पर निरंतर आंदोलन के तहत रखें।
    3. एक स्थिर सतह पर कच्चे तेल के अंशयुक्त फिल्टर फ्लास्क रखें और घुलनशील और अघुलनशील अंश जुदाई की अनुमति देने के लिए 10 "20 मिनट प्रतीक्षा करें।
    4. एक नया बाँझ फ्लास्क के लिए oWSF स्थानांतरण, नीचे फिल्टर फ्लास्क खोलने और घुलनशील अंश बाहर लेने के द्वारा oWIF बचत.
    5. पिछले चरण ($400 एमएल) में बरामद सभी ओडब्ल्यूएसएफ का उपयोग करते हुए, केवल कार्बन स्रोत के रूप में ओडब्ल्यूएसएफ युक्त BH agar न्यूनतम माध्यम का 1 L तैयार करें।
    6. चरण 3.1.4 से फ्लास्क में शेष ओडब्ल्यूआईएफ का उपयोग करके केवल कार्बन स्रोत के रूप में ओडब्ल्यूआईएफ युक्त BH agar न्यूनतम माध्यम का 1 L तैयार करें।
  2. अलग oWSF- और oWIF-degrading बैक्टीरिया.
    1. चरण 1.1.2 और 1.2.7 से पानी और कोरल मैकेरेट का उपयोग करना, चरण 2.1.1 में वर्णित बाँझ लवण समाधान में 10-6 तक के नमूनों को पतला करें।
    2. Peti व्यंजन BH-oWSF और BH-oWIF agar मीडिया और थाली उन्हें प्लेट युक्त पेट्री व्यंजन पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 100 डिग्री सेल्सियस पिपेट.
    3. चरण 2.1.3 से चरण 2.1.5 करने के लिए वर्णित कार्यविधियों को दोहराएँ।

4. कंसोर्टियम सदस्य चयन

  1. निकालें और वर्गीकरण पहचान के लिए डीएनए अनुक्रम.
    1. चरण 2.3.1 में वर्णित के रूप में ग्लिसरोल में रखता अलग को सक्रिय करें।
    2. डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर डीएनए निकालें (सामग्री की तालिकादेखें )।
    3. 16S आरआरएनए जीन के प्रवर्धन के लिए प्राइमर 27f (5[-AGA GTT TGA TCA TGA TGG CTC AG-3]) और 1492r (5]-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3]) का उपयोग करें।
    4. निम्नलिखित प्रोटोकॉल के अनुसार 50 डिग्री एल पीसीआर प्रतिक्रियाओं को निष्पादित करें: 10x पॉलिमरेज बफर के 5 डिग्री एल, 2 एमएम एमजीसीएल2,0.2 एमएम डीएनटीपी, प्रत्येक प्राइमर के 5 एमएम, जीनोमिक डीएनए के 10 एनजी, और ताक डीएनए पॉलिमरेज के 2.5 यू। नकारात्मक नियंत्रण जोड़ें (यानी, खाली डीएनए extractions और टेम्पलेट डीएनए के बिना पीसीआर प्रतिक्रियाओं) सुनिश्चित करें कि वहाँ कोई संदूषण है.
    5. निम्नलिखित थर्मल साइकिल चालन कदम सेट करें: 4 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर एक पहला विकृतीकरण चक्र; 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर 35 चक्र, 1 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस के बाद, और 2.5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक अंतिम विस्तार चक्र।
    6. 80 वी का उपयोग कर 1.2% agarose जेल में amplicon अखंडता की जाँच करें.
    7. जेल एक जेल शोधन किट का उपयोग कर नमूने को शुद्ध (सामग्री की तालिकादेखें)।
    8. एक fluorometer का उपयोग कर पीसीआर उत्पादों की मात्रा।
    9. अनुक्रमण के लिए उत्पाद भेजें.
      नोट: बेहतर taxonomical वर्गीकरण के लिए, Sanger विधि की सिफारिश की है60,क्योंकि यह लंबे दृश्यों प्रदान करता है. सार्वत्रिक प्राइमर 27f और 1492r का उपयोग 16S आरआरए एन ए जीन61की लगभग पूरी लंबाई को बढ़ाना है . यदि contigs प्राइमर की एक जोड़ी का उपयोग कर इकट्ठा नहीं किया जा सकता है, अनुक्रम के बीच में एक अतिरिक्त जोड़ी पर विचार किया जाना चाहिए.
  2. वृद्धि वक्र निर्धारित करें।
    1. चरण 2.2.5 से ग्लिसरोल स्टॉक में अलग को सक्रिय करें जैसा कि चरण 2.3.1 में वर्णित है, लेकिन 2 एमएल के बजाय 5 एमएल का उपयोग कर रहा है।
    2. ट्रिपीकेट्स में चरण 4.2.1 से बड़े 5 एमएल संस्कृति का 1% (v/v) जोड़ें, 3% एलबी मीडिया के 100 एमएल वाले 250 एमएल फ्लास्क में जोड़ें। एक नकारात्मक नियंत्रण (कोई inoculum) के triplicates के रूप में अच्छी तरह से तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें.
    3. लगातार आंदोलन (150 x ग्राम) के अंतर्गत एक इन्क्यूबेटर में फ्लास्क को 24 डिग्री 28 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    4. 48 ज के लिए हर 4 ज 1 एमएल एलिकोट्स लें। यदि उपभेदों में उच्च वृद्धि दर मौजूद है, तो 4 ज अंतराल को कम करें।
    5. 600 एनएम तरंगदैर्ध्य और कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) पर ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) अनुमान उपाय अमीर मीडिया प्लेटों पर चढ़ाया धारावाहिक कमजोर पड़ने से गिना (100 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक प्लेट में टीका लगाया और की मात्रा के लिए सामान्यीकृत किया जाना चाहिए 1 एमएल).
    6. ओडी और CFU घटता प्लॉट और प्रत्येक व्यक्ति तनाव के OD/CFU के सहसंबंध का विश्लेषण. अब से, OD मानों के आधार पर कक्षों की संख्या की गणना करें.
  3. विरोध परीक्षण करें।
    1. चरण 2.3.1 में वर्णित के रूप में अलग को सक्रिय करें।
    2. आगर मीडिया और अन्य लोगों को केंद्रीय एक के सीधा युक्त प्लेटों के बीच के साथ एक समय में एक तनाव टीका. दोहराएँ जब तक हर चयनित माइक्रोबियल तनाव अन्य सभी के खिलाफ परीक्षण किया है.
    3. प्लेटों को 24 डिग्री 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और उनकी प्रतिदिन निगरानी करें ताकि संभावित हैलोमोन्स का अवलोकन किया जा सके जो विरोधी गतिविधि को दर्शाता है। यदि हेलोदो दो उपभेदों के बीच विरोधी गतिविधि का संकेत देखा जाता है, उनमें से एक को बाहर रखा जाना चाहिए.
  4. संघ की सभा करें।
    1. चरण 2.3.1 में वर्णित के रूप में अलग को सक्रिय करें।
    2. 3,500 x g पर कोशिकाओं को गोली और धीरे उन्हें नमकीन समाधान के एक बराबर मात्रा में 2x धो लें. कोशिकाओं को समान आयतन में पुन: निलंबित करें (अर्थात, यदि अंतिम खंड 2 एमएल कक्षों का था, तो उन्हें 2 एमएल लवणीय विलयन का उपयोग करके धोलें और उन्हें 2 एमएल के अंतिम खंड में पुन: निलंबित करें).।
    3. 100 एमएल 3% NaCl LB मध्यम में 1 एमएल संस्कृति टीका और 150 x ग्राम पर पर इनक्यूबेट।
    4. दोहराएँ चरण 4.5.2, 100 एमएल हो, धोया, और 10 एल संस्कृतियों में resuspended संस्कृतियों टीका. बाँझ हवा लिफ्ट bioreactors में पर इनक्यूबेट, एक पंप से फ़िल्टरहवा प्राप्त. यदि अधिक संस्कृति की जरूरत है, हमेशा ताजा मीडिया में विकसित संस्कृति का 1% टीका.
    5. सेंट्रीफ्यूज हो गया संस्कृतियों पर 8,000 x g के लिए 8 मिनट पर 4 डिग्री सेल्सियस. अपकेंद्रण के बाद महादलित को त्याग ें।
    6. गोली धो लें, धीरे बाँझ नमकीन समाधान के 500 एमएल में कोशिकाओं resssssssssss.
    7. 4.5.5 और 4.5.6 चरणों को दोहराएँ.
    8. लवणीय समाधान के 100 एमएल में प्रत्येक व्यक्ति की संस्कृति को पुन: निलंबित करें और कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए ओडी को मापें।
    9. 107 कोशिकाओं एमएल-1की अंतिम सांद्रता तक पहुँचने के लिए आवश्यक प्रत्येक संस्कृति की मात्रा की गणना कीजिए।
    10. सेल व्यवहार्यता और एकाग्रता के एक अंतिम पुष्टि के लिए अमीर मीडिया पर CFU मायने रखता है प्रदर्शन.
    11. बाँझ फ्लास्क में प्रत्येक व्यक्ति संस्कृति के एक समान मात्रा में मिलाएं और 50 एमएल बाँझ ट्यूबों में संघ को एलिकोट करें।
    12. टीका तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: कोशिकाओं की गारंटी के लिए संभव के रूप में ताजा के रूप में संघ विधानसभा तैयार अभी भी व्यवहार्य हो जाएगा. वैकल्पिक रूप से, CFU मायने रखता है टीका से पहले किया जा सकता है. एक आदर्श संघ को इकट्ठा करने के लिए, यह अलग और पूरक चयापचय क्षमता पेश अलग का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. आमतौर पर, 6 "10 अलग consortia बनाने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन यह संख्या सदस्यों की विशेषताओं और उद्देश्यों के आधार पर अलग अलग होंगे.

5. कोरल के लिए putative लाभकारी विशेषताओं का पता लगाने

  1. ग्लिसरोल स्टॉक से अलग को एलबी एगर प्लेटों पर लकीरें द्वारा सक्रिय करें और उन्हें 24 डिग्री 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके एकल कालोनियों को उगाने के लिए। प्लेटों से एक कॉलोनी उठाओ और यह बाँझ एलबी माध्यम के 2 एमएल में टीका. प्लेस ट्यूब जिसमें एलबी माध्यम होता है जो निरंतर आंदोलन (150 x ग्राम) के अंतर्गत 24 डिग्री 28 डिग्री सेल्सियस पर होता है।
  2. पीसीआर द्वारा संभावित रूप से लाभकारी जीन का पता लगाने के लिए अनुभाग 4.1 में वर्णित के रूप में डीएनए निष्कर्षण प्रदर्शन.
    नोट: पीसीआर प्रतिक्रिया शर्तों और प्राइमर लक्षित जीन पर निर्भर करेगा. संभावित रूप से लाभकारी जीनों के लिए व्यक्तिगत उपभेदों और पीसीआर का पता लगाने की बीएमसी विशेषताओं का परीक्षण करने की विधि तालिका 1में वर्णित है।

Representative Results

यहाँ वर्णित विधियों के आधार पर विभिन्न जल स्रोतों और प्रवाल नब्बिनों से सूक्ष्मजीवों को अलग-थलग करना संभव था, जो बीएमसी विशेषताओं को प्रस्तुत करते हैं और संदूषकों के विभिन्न वर्गों को नीचा दिखाने में सक्षम होते हैं (चित्र 1)। एक सीवेज उपचार संयंत्र में एकत्र पानी के नमूने का उपयोग करना, CESA-UFRJ से प्राप्त (रियो डी जनेरियो के संघीय विश्वविद्यालय के पर्यावरण स्वच्छता के प्रायोगिक केंद्र), और यहाँ प्रस्तुत प्रक्रिया के आधार पर, 33 जीवाणु उपभेदों पर नीचा करने में सक्षम EE2 5mg/L का अंतिम सांद्रता अलग-थलग कर दी गई थी (चित्र 2क) इसके अतिरिक्त, तेल-अपमानजनक बैक्टीरिया के चयन के लिए तकनीक का उपयोग करते हुए, 20 उपभेदों दोनों oWSF नीचा करने में सक्षम (चित्र 2बी) और oWIF (चित्र 2ब्) अलग थे.

विभिन्न परिस्थितियों में विभिन्न कोरल प्रजातियों से अलग सूक्ष्मजीवों में पुटेटिव बीएमसी विशेषताओं की जांच की गई। उनमें से, प्रवाल रोगज़नक़ विब्रिओ कोरैलिलिटिकस के विरुद्ध प्रबल विरोधी गतिविधि प्रस्तुत करने वाला एक तनाव (चित्र 3ए), यूरिया को नीचा करने में सक्षम तनाव (चित्र 3बी), एक अच्छा कैटालेस निर्माता ( चित्र3 ) ग), और सूक्ष्मजीव संभावित रूप से लाभकारी जीन पेश करते हैं (चित्र 3डी) पाए गए .

संयुक्त दो दृष्टिकोण ों को रोजगार (यानी, bioremediation और बीएमसी टीका), यह तेल जोखिम प्रभावों से कोरल की रक्षा के लिए संभव था. इसके लिए, एक तेल bioremediator pBMC संघ, कोरल Mussismilia harttiiसे अलग, कोरल nubbins पर टीका लगाया गया था triplicates21में 1% तेल के संपर्क में . तेल के संपर्क में आने वाले उपचारों ने चौथे दिन से एफवी/एफएम में एक प्रगतिशील कमी प्रस्तुत की, जो दसवें दिन तक शून्य के करीब मूल्यों तक पहुंच गया। परिवर्तनीय फ्लोरोसेंट/अधिकतम प्रतिदीप्ति (एफवी/एफएम) ने प्रवाल स्वास्थ्य के अप्रत्यक्ष माप का प्रतिनिधित्व करने वाले जूक्सेंथेले की अधिकतम फोटोसिस्टम II (पीएसआईआई) फोटोकेमिकल दक्षता का एक माप प्रदान किया। दूसरी ओर, संघ के साथ टीका लगाया एक्वैरियम में मौजूद कोरल nubbins एक बेहतर संरक्षित photochemical क्षमता दिखाया (चित्र 4).

Figure 1
चित्र 1: एक bioremediator-pBMC संघ चयन और विधानसभा के मुख्य चरणों का सारांश. प्रदूषक-अपमानजनक सूक्ष्मजीवों के चयन चरणों (ग्रे में) और संघ माइक्रोबियल चयन (डीएनए अनुक्रमण, विकास वक्र, विरोध परीक्षण, और लाल रंग में संघ विधानसभा) के लिए इस्तेमाल अंतिम कदम की योजना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रदूषक-अपमानजनक बैक्टीरिया का चयन। ((ए)जीवाणु केवल कार्बन स्रोत के रूप में ईई 2 युक्त न्यूनतम मीडिया प्लेटों पर बढ़ रहा है। (बी)बैक्टीरिया कालोनियों केवल कार्बन स्रोत के रूप में oWSF युक्त न्यूनतम मीडिया प्लेटों पर बढ़ रही है। (ग)बैक्टीरिया कालोनियों केवल कार्बन स्रोत के रूप में oWIF युक्त न्यूनतम मीडिया प्लेटों पर बढ़ रही है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: पीबीएमसी विशेषताओं का पता लगाना। (ए) प्रवाल रोगज़नक़ विब्रिओ कोरैलिटिकस (काले रंग में) और एक नियंत्रण तनाव (हरे रंग में) के विरुद्ध विरोधी गतिविधि प्रस्तुत करने वाले तनाव के ट्रिपीकेट्स में स्पॉट। (ख)केवल कार्बन स्रोत के रूप में यूरिया युक्त मीडिया पर बढ़ रहा तनाव। (ग) कैटालेस का उत्पादन करने वाले तनाव (+) और एक खराब कैटालेस उत्पादक तनाव (-)। (घ)निर्क जीन का पीसीआर का पता लगाने का उदाहरण (लेन 1 ] 1kb सीढ़ी; लेन 2 ] रिक्त डीएनए निष्कर्षण नकारात्मक नियंत्रण; लेन 3 ] nirK का पता लगाने; लेन 4 ] पीसीआर प्रतिक्रियाओं टेम्पलेट डीएनए के बिना). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एफवी/एफएम माप एम हार्ट्टीआई न्यूबिन्स के काले रंग में शाम 5 बजे, एक डाइविंग-पीएएम क्लोरोफिल फ्लोरोमीटर का उपयोग करते हुए। उपचार नियंत्रण संघ, तेल, और संघ के साथ तेल के Fv/Fm माप 10 दिनों के लिए हर दिन triplicates में प्रदर्शन किया गया. मानक विचलन दिखाया गया है. ग्राफ की विशेषताएं पिछले परिणाम21से अनुमति के साथ संशोधित किया गया, एक क्रिएटिव कॉमन्स रोपण 4.0 के तहत https://www.nature.com/articles/srep18268 पर उपलब्ध है. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ पर पूर्ण शर्तें. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Moa सूक्ष्मजीव जांच तकनीक संदर्भ
जलवायु विनियमन; सरफ़र साइकिल चलाना; एंटीमाइक्रोबियल यौगिकों; कोशिकाओं के एंटीऑक्सीडेंट संरक्षण में वृद्धि. एस्पेरगिलस सिडोआई डीडीपी जीन के लिए पीसीआर 81
Pseudovibrio sp. P12 DMSP के साथ संस्कृति माध्यम 82
कूटाश्रयणम् । डीएमडीए जीन के लिए पीसीआर 33
रोगजनकों का जैविक विनियमन. एक्रोफोरा पामेटा बलगम से माइक्रोबायोम संदमन का स्पष्ट क्षेत्र 83
कोरल से अर्क विकास निषेध परख 84
मैरिनोबैक्टर एसपी. स्वेत्स ी आवेश 85
कूटाश्रयणम् । आगर प्लेट क्रॉस-स्ट्रेकिंग 86
कूटाश्रयणम् । आगर-विसरण विधि 33
Calification प्रक्रिया के लिए लाभ; स्क्लेरैक्टिनियन कोरल के लिए नाइट्रोजन का स्रोत। सिम्बायोडिनियम एस.पी. रंगमितीय विधि 87
स्टाइलोफोरा पिस्टिलाटा बलगम से माइक्रोबायोम ___ 88
एक्रोफोरा एल्सिमिनेटा से माइक्रोबायोम विधि by Bolland et al.80 89
नाइट्रोजन चक्र; नाइट्रोजन स्थिरीकरण में वृद्धि. सूक्ष्मजीवी समुदाय क्यूपीसीआर 90
सूक्ष्मजीवी समुदाय पीसीआर 91
सूक्ष्मजीवी समुदाय क्यूपीसीआर 92
सूक्ष्मजीवी समुदाय अनुकूलित ऐसीटिलीन (C2H2) कमी तकनीक 93
स्यूडोल्टरमोनास एसपी और हेलोमोनास taeanensis पीसीआर 33
नाइट्रोजन चक्र; अमोनियम एकाग्रता में कमी. कूटाश्रयणम् । पीसीआर 33
Tubastraea coccinea से माइक्रोबायोम पीसीआर 94
Xestospongia testudinaria से माइक्रोबायोम भविष्यसूचक मेटाजेनोम विश्लेषण 95
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के खिलाफ Holobiont संरक्षण। कूटालोमोनास एसपी, कोबेतिया मरीना और हेलोमोनास taeanensis कैटालेस परीक्षण 33
सिम्बायोडिनियम एस.पी. एम्प्लेक्स लाल 96
विब्रिओ पेलागिस और सिंक-कोकोकस एसपी। हॉर्सराडिश पेरोक्सिडसे-स्कोपोलिटिन विधि 97
विब्रिओ फिशरी एकाधिक विधियाँ 98

तालिका 1: putative बीएमसी विशेषताओं का पता लगाने, कार्रवाई के तंत्र (एमओए), विशेषता का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया क्षमता और तकनीक पेश सूक्ष्मजीवों की सूचना दी।

Discussion

पिछले 50 वर्षों में जैव-उपचार दृष्टिकोणों का बड़े पैमाने पर पता लगाया गया है। उदाहरण के लिए, बैक्टीरिया, सायनोबैक्टीरिया, माइक्रोएग्लेग और कवक के बीच विभिन्न आवासों में 200 से अधिक सूक्ष्मजीवों को उपस्थिति और/या तेल हाइड्रोकार्बन62,63,64 को इंगित करने में सक्षम के रूप में नामित किया गया है। . इसके अतिरिक्त, यौगिकों के अन्य वर्गों है कि पर्यावरण के लिए और मनुष्यों के लिए प्रभावों का कारण, जैसे प्लास्टिक, bisphenol ए, अंत: स्रावी disrupters, और भारी धातुओं, bioremediation तकनीक विकास के लिए लक्ष्य कर रहे हैं65,66, 67| दूसरी ओर समुद्री प्रोबायोटिक विकास उन क्षेत्रों तक सीमित रहा है जिनका अर्थव्यवस्था पर स्पष्ट प्रभाव पड़ता है, जैसे जलकृषि में मछली प्रोबायोटिक्स68,69. तथापि, प्रवाल भित्तियों, समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों, जो मत्स्य पालन, पर्यटन और अन्य लाभदायक गतिविधियों का समर्थन करते हैं, की रक्षा के लिए लाभकारी सूक्ष्मजीवों के पृथक्करण और विशेषता का मूल्य15हो रहा है। यहाँ, एक सस्ता, आसान, और सुलभ प्रोटोकॉल प्रदूषक-अपमानजनक सूक्ष्मजीवों का चयन करने के लिए जो स्थानीय समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों के लिए संभावित रूप से लाभकारी विशेषताओं को भी पेश कर सकता है, विशेष रूप से कोरल (पीबीएमसी) के लिए घातक लाभकारी सूक्ष्मजीवों, है वर्णित.

इसके अतिरिक्त, विधि यहाँ का प्रदर्शन अत्यधिक कई यौगिकों और माइक्रोबियल स्रोतों के विविध प्रकार के लिए अनुकूलनीय है. यह केवल कार्बन स्रोत न्यूनतम मीडिया में जोड़ा की जगह द्वारा विभिन्न प्रदूषकों को लक्षित करने के लिए संभव है. इस के लिए, के बजाय तेल या EE2, अन्य यौगिकों वांछित एकाग्रता में जोड़ा जाना चाहिए. यह लक्षित प्रदूषकों के लिए degraders को अलग करने के लिए चयनात्मक दबाव होगा. उदाहरण के लिए, अंत: स्रावी disrupters के अन्य वर्गों के अपमानजनक करने में सक्षम सूक्ष्मजीवों पहले से ही चयनित किया गया है और एक ही पद्धति का उपयोग कर परीक्षणकिया गया है 70. इसके अलावा, अन्य समुद्री और स्थलीय जीवों, जैसे स्पंज और पौधे71,72, साथ ही मिट्टी, ईंधन, और चट्टानों जैसे अलग-अलग प्रकार के पर्यावरणीय नमूने, अपमानजनक-माइक्रोबायल स्रोतोंकेरूप में इस्तेमाल किए जा सकतेहैं, 73,74. उदाहरण के लिए , विभिन्न मिट्टी और तलछट के नमूनों से हाइड्रोकार्बन को कम करने वाले बैक्टीरिया का पता लगाना और उन्हें अलग करना संभव था25,54,63,64,75. अंत में, मीडिया में मामूली संशोधन करने, बैक्टीरिया के अलावा अन्य सूक्ष्मजीवों को आसानी से अपमानजनक सूक्ष्मजीवों के रूप में चुना जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक microalgae तनाव कुशलता से एस्ट्रोजन यौगिकों नीचा करने की क्षमता के साथ76की सूचना दी गई है.

आदर्श रूप में, bioremediation-प्रोबायोटिक कंसोटिया प्रत्येक विशिष्ट यौगिक या क्षेत्र के लिए इकट्ठा किया जाना चाहिए. Microbes कि एक विशिष्ट वातावरण में विकसित के रूप में अच्छी तरह से नई साइटों में उनके मूल शर्तों की तुलना में विकसित नहीं हो सकता है. क्योंकि शोधकर्ताओं को एक उत्पाद है कि कुशलतापूर्वक सभी विभिन्न पर्यावरण की स्थिति के तहत लागू किया जा सकता नहीं मिला है, नए consortia विधानसभा प्रत्येक विशिष्ट स्थिति के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए. यह पर्यावरण-पुच्छीय वसूली के लिए व्यक्तिगत दवा के समान होगा। इस कारण से, संभावित प्रोबायोटिक विशेषताओं और गिरावट क्षमता के साथ माइक्रोबियल उपभेदों के एक केंद्रीय बैंक का निर्माण इस क्षेत्र की प्रगति के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। इस पहल के समय और काम की बचत होगी, दुनिया भर में नए विशिष्ट consortia की विधानसभा में योगदान.

कोरल (यानी, माइक्रोशैवाल, बैक्टीरिया, आर्किया, कवक, और वायरस) के साथ जुड़े सूक्ष्मजीवों की मेजबान होमियोस्टेसिस19को बनाए रखने में एक जटिल और जटिल भूमिका होती है। पर्यावरण तनाव, जैसे प्रदूषण, कोरल माइक्रोबायोम को भी अस्थिर कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप डिस्बिओसिस हो सकता है, जिससे बीमारी और मृत्यु दर30हो सकती है। तंत्र जिसके द्वारा कोरल microbiome कोरल स्वास्थ्य का समर्थन कर सकते हैं पता चला शुरू कर रहे हैं. इन तंत्र कोरल प्रतिरोध और पर्यावरण तनाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं और, इसके परिणामस्वरूप, चट्टान हठ और संरक्षण को बढ़ावा देने के लिए. इसके अतिरिक्त, क्षेत्र में निष्कर्ष सामान्य मेजबान-माइक्रोबायोम बातचीत को समझने में मदद करेंगे, जो अन्य क्षेत्रों में बेहतर प्रोबायोटिक्स और स्वास्थ्य को बढ़ावा देने वाली रणनीतियों के विकास में योगदान दे सकते हैं। यह भी बेहतर जांच कैसे इन प्रोबायोटिक्स inoculations तनाव की घटनाओं के दौरान मेटाबायोटिक्स के स्वास्थ्य पर हस्तक्षेप कर सकते हैं महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, काम दिखा रहा है कि कोरल प्रदर्शन में वृद्धि प्रोबायोटिक्स के कारण है और न केवल कोरल एक खाद्य स्रोत के रूप में बैक्टीरिया का उपयोग कर अभी भी जरूरत है.

समानांतर में, नए consortia वितरण दृष्टिकोण के विकास और मौजूदा लोगों के सुधार के बहुत महत्व के हैं. संघ स्थिरीकरण के लिए वैकल्पिक तरीकों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अभिनव दृष्टिकोण, इस तरह के कोरल भोजन टीका के रूप में (यानी, artemia और rotifers) और उन्हें वैक्टर के रूप में उपयोग कर, वादा कर रहे हैं. इन वितरण प्रणालियों को अन्य समुद्री जीवों को लक्षित करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है और समुद्री प्रोबायोटिक्स क्षेत्र की सफलता के लिए आवश्यक होगा।

प्रदूषण शमन और प्रवाल भित्ति दृढ़ता वर्तमान में मुख्य विषयों में से दो नियमित रूप से पर्यावरण सम्मेलनों में प्रकाश डाला. एजेंडा 2030, संयुक्त राष्ट्र द्वारा प्रकाशित एक दस्तावेज जो वैश्विक लक्ष्यों का वर्णन करता है कि समाज को एक स्थायी भविष्य की अनुमति देने के लिए पहुंचना चाहिए, प्रत्येक मुद्दे के लिए विशिष्ट लक्ष्यों को समर्पित करना चाहिए। जबकि लक्ष्य 6 प्रदूषण को कम करके जल गुणवत्ता सुधार के महत्व पर प्रकाश डालता है, लक्ष्य 14 महासागरों, समुद्रों और समुद्रीसंसाधनोंके संरक्षण और सतत उपयोग की प्रासंगिकता को सुदृढ़ करता है। इस संदर्भ में, प्रवाल भित्ति संरक्षण उन परिवर्तनों पर निर्भर करता है जिन्हें प्रदूषण न्यूनीकरण सहित निकट भविष्य में प्राप्त किया जाना चाहिए। यह बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि सबसे बड़े पैमाने पर कोरल नुकसान हुआ जब अन्य कारकों जैसे स्थानीय निवास विनाश और संदूषण78,79के रूप में जलवायु की घटनाओंमेंजोड़ा गया . इस पत्र का प्रदर्शन किया है कि यह bioremediation और pBMC टीका गठबंधन करने के लिए विशिष्ट प्रदूषकनीचा गठबंधन संभव है, जबकि यह कोरल प्रतिरोध और लचीलापन में वृद्धि करने के लिए प्रदूषण और अन्य मुद्दों से निपटने के लिए हो सकता है. मौजूद प्रोटोकॉल और/या अभिनव तरीकों, संयुक्त या स्वतंत्र रूप से लागू के विकास के अनुकूलन, समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों के भविष्य का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण होगा।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह अनुसंधान एएनपी 21005-4 के रूप में पंजीकृत चल रहे अनुसंधान एवं विकास परियोजना के सहयोग से किया गया था, "प्रोबायो-डीईपी - गहरे समुद्र में समुद्री होलोबियोट पर तेल और गैस की खोज के कारण संभावित प्रभावों का सर्वेक्षण और संभावित बायोइंडिकेटरों का चयन और इन पारिस्थितिकी प्रणालियों के लिए bioremediation प्रक्रियाओं" (UFRJ / शैल ब्राजील / एएनपी) - "PROBIO-DEEP - Levantamento de potenciais impactos causados pela explora]o de [leo e g]s holo embiontes marinhos em profundo e sele de potenciais bioindicors process biorremediadores पैरा esses ecosisstemas", एएनपी आर एंड डी लेवी के तहत शैल ब्राजील द्वारा प्रायोजित के रूप में "Compromisso de Invementos com Pesquisa e Desenvolvimento. लेखकों को भी वित्तीय सहायता के लिए Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient]fico e Tecnol]gico (CNPQ) और Coordena-o de Aperfei-oamento de Pessoal de Nvel सुपीरियर (CAPES) को वित्तीय सहायता के लिए धन्यवाद, और कैमिला मेसियास, फिलिपरोस, और फ्रेगोस, सेंटोस, प्रदान की छवियों के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 mL PYREX Media Storage Bottle thomas scientific/Corning 1743E20/1395-500 Used to sample water.
500 mL Aspirator Bottles thomas scientific/Corning 1234B28/1220-2X Used to separate the oil fractions.
6-inch wire cutter plier thomas scientific/Restek 1173Y64/23033 Used to cut coral fragments.
17a-Ethinylestradiol LGC Standards DRE-C13245100 Used as the only carbon source to make the selective media.
Agar Himedia PCT0901-1KG Used to make solid media.
Bushnell Haas Broth Himedia M350-500G Used as minimum media to be supplemented with carbon sources.
Erlenmeyer Flask thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble) 4882H35/26500-125 Used to incubate coral macerate with glass beads.
GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit GE Healthcare 28903470 Used to purify PCR products before sending them for sequencing.
Glass Beads MP Biomedicals 1177Q81/07DP1070 Used to detach the microorganisms from coral structures.
Laminar Flow Hood Needed to work at sterile conditions.
Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth) Himedia M1245-1KG Used as rich media to grow bacteria.
Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar) Himedia M384-500G Used as rich media to grow bacteria.
Orbital-Shaker Incubator Used to incubate liquid media and oil.
Plates Incubator Used to incubate plates.
Porcelain Mortar and Pestle Thomas scientific/United Scientific Supplies 1201U69/JMD150 Used to macerate coral fragments.
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Used for nucleic acids quantification of DNA and PCR products.
Refrigerated Centrifuge Used to centrifuge bacterial cultures.
Spectrophotometer Used to measure optical density of bacterial cultures.
Wizard Genomic DNA Purification kit Promega A1120 Used for microbial strains DNA extraction.

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References

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