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Bioengineering

メタ生物研究と保存のためのバイオレメディエーションおよびプロバイオティクス開発のための微生物株の探知

doi: 10.3791/60238 Published: October 31, 2019

Summary

汚染はすべてのバイオームに影響を与える。海洋環境は特に影響を受けており、特に地球上で最も敏感な生態系の一つであるサンゴ礁が影響を受けています。バイオレメディエーションは、汚染物質を分解する生物の能力です。ここでは、サンゴのバイオレメディエーション能力と潜在的なプロバイオティクス特性を提示する微生物を分離および試験する方法論について説明する。

Abstract

汚染はすべてのバイオームに影響を与える。海洋環境は特に影響を受けており、特に地球上で最も敏感な生態系の一つであるサンゴ礁が影響を受けています。世界的に見て、45億人の人々が経済的に海に依存しており、その生活のほとんどはサンゴ礁によって提供されています。サンゴは非常に重要であり、したがって、その絶滅は壊滅的な結果につながります。海洋汚染物質や局所汚染を修復するための解決策は、バイオレメディエーションを含むいくつかの可能な解決策があります。バイオレメディエーションは、汚染物質を分解する生物の能力です。このアプローチには、持続可能性、比較的低コスト、異なるエコシステムで適用できるという事実など、いくつかの利点があり、環境への影響は最小限に抑えられます。余分な利点として、サンゴ(pBMC)に対する推定有益微生物を含む内因性微生物の操作は、海洋動物に対するプロバイオティクス効果を有し得る。この文脈において、バイオレメディエーションとpBMC接種を組み合わせた2つのアプローチの使用は有望であり得る。この戦略は、サンゴやその他のメタ生物に有害な特定の汚染物質の劣化を促進すると同時に、汚染やその他の脅威に対処するためのホスト耐性と耐性を高めます。この方法は、2つの汚染物質を分解するpBMCの選択に焦点を当てています:合成エストロゲン17a-エチニルエストラジオール(EE2)と原油。いずれもサンゴや人間を含む海洋動物に悪影響を及ぼすと報告されている。このプロトコルは、特定の汚染物質を分解し得る細菌を単離および試験する方法を記述し、続いてこれらの関連微生物の何らかの形容的有益な特性をサンゴ宿主に検出する方法を説明する。ここで説明する方法論は、比較的安価で、実行しやすく、適応性が高い方法です。EE2およびオイルの代わりに、ほぼすべての種類の可溶性標的化合物を使用することができます。

Introduction

汚染は、世界中の人間、動物、植物の健康に影響を与える大きな問題です。火山灰1のような汚染は自然であるが、人間の活動はほとんどの汚染の主な原因である。人類起源の活動は土壌、水、空気を汚染し、直接的または間接的に約2,000万人の早期死亡2を引き起こし、年間数十億の他の生命を減少させます。汚染物質は、地球の最も遠隔地にも存在します。例えば、重金属および持続性有機化合物は、それぞれ深海無脊椎動物および極性哺乳動物において、3、4検出されている。

海洋環境は特に汚染の影響を受けています。長い間、海は影響を受けずに、水5の膨大な量のために無限の商品源を供給すると仮定されていました。このため、あらゆる種類の産業や機関が、何世紀にもわたって水域内の廃棄物を自由に放出した6、7.プラスチック8、合成ホルモン9、農薬10、油11、栄養素12、金属3、放射性廃棄物13など、あらゆる種類の汚染物質が影響を与えるとして報告されている海洋生態系。この文脈では、サンゴ礁は海洋環境の中で最も重要で敏感な生態系の一つです14.リーフは沿岸の保護者であり、栄養素のサイクリングや気候管理に不可欠な役割を果たすことによって、何千もの海洋種の開発に不可欠です。リーフはまた、魚、物品、観光を提供することにより、経済に貢献し、とりわけ15.例えば、45億人がサンゴ礁に大きく支えられている主な食料源16として海洋魚に依存しています。

彼らの生態学的、社会的、経済的重要性にかかわらず、サンゴ礁は17、18に減少しています。人類起源の活動は、主にサンゴの死の3つの主な原因に貢献する責任があります: 気候変動, 乱獲, 水質汚染19.地球温暖化の緩和に取り組むことは重要ですが、サンゴの減少に大きく寄与する水質汚染を含む地域汚染の最小化にも取り組むことも重要です。したがって、サンゴの寿命を延ばすための戦略の開発が急務であり、サンゴが適応し、生き残るための余分な時間を与える可能性があります。

この点で、汚染を最小限に抑え、サンゴの適性を高める戦略を策定するソリューションを見つけることが極めて重要です。海洋汚染物質を修復する戦略は非常に多様であり、物理的、化学的、生物学的アプローチにグループ化することができます。物理的なアプローチが役立ちます。ただし、必ずしも効率的であるとは限りません。例えば、プラスチック廃棄物は物理的な除去によって最小限に抑えることができるが、水溶性化合物は除去するために他の方法論を必要とする。このような化合物の例は、原油、石油産業活動および流出によって放出される、ならびに合成ホルモンなどの他の微小汚染物質、通常経口避妊薬および下水21に存在するエストロゲン成分として使用される、22.化学物質を使用して汚染を減らすことは、特定の問題を解決することができますが、それはまた、汚染の余分な源を表す可能性があります。これは、油汚染自体23よりもさらに海洋生態系に対して毒性があると記載されている油汚染を緩和するための化学分散剤の場合である。これらの理由から、生物学的アプローチは、他の方法と比較した場合にいくつかの利点を提示する。バイオレメディエーションは、汚染物質を毒性または非毒性の少ない形態24に変換する生物またはその代謝産物の能力である。生物学的方法を使用する主な利点は、持続可能性、相対的な低コスト、生態学的に優しいという事実、およびそれらが異なる生態系に適用され、環境への影響を最小限または少なく引き起こすことである21、 25、26、27 .

さらに、環境中に存在する微生物群集の操作は、余分な潜在的な利点を可能にする。ホストに関連し、その健康に不可欠なマイクロバイオームがあります。これらの関連する共生微生物叢が宿主恒常性19を維持するために必要であることはよく知られている。これらの関連微生物の操作は、植物や哺乳類28、29などの宿主のためによく探求されてきたが、サンゴのプロバイオティクスの使用はまだ新しい15である。サンゴはまた、19を生き残るために微生物の大規模かつ特定の集団を宿主、相互作用し、依存する。サンゴの健康とジスバイオシスにおけるこれらの微生物群集の役割は活発な研究の下にあるが、それはまだ完全に理解されている30から遠い。最も人気のある仮説の一つは、サンゴプロバイオティクス仮説と呼ばれています。これは、最も有利なサンゴメタ生物31の選択をもたらす共生微生物と環境条件との間の動的な関係の存在を示唆する。この情報に基づいて、主要な潜在的なプロバイオティクス機構、ならびにいくつかの目的のためのサンゴ(BMC)のための有益な微生物の分離、操作、および送達のための戦略は、32を提案し、33を試験した。これらの潜在的な有益な特性は、温度上昇に対する耐性、活性酸素種(ROS)からの保護、窒素固定、汚染物質に対する耐性、および病原体に対する生物学的制御、とりわけ32である。

本研究では、海洋環境で一般的に見られる2つの汚染物質(合成エストロゲン17a-エチニルエストラジオール(EE2)と原油の分解能力を示すBMCおよび自由生微生物の選択に焦点を当てています。ホルモン活性剤を含む汚染物質は、多くの場合、水域に存在する 34,35,36,37,38,39,40, 41、42.中でも、合成エストロゲン内分泌攪乱化合物(EDC)は、標的細胞に対するエストロゲンの作用を模倣し、乳癌、不妊症、およびヘルマフロディティズム9を含む動物にいくつかの影響を引き起こす。EE2は経口避妊薬の使用のために人間によって排泄される。それは伝統的な排水処理プラントによって下水から除去されず、非常に低い濃度(例えば、ng/Lまたはμg/L)43、44、45でも悪影響を及ぼす。サンゴ生理学に対するエストロゲンの影響についてはほとんど知られていない46,47.しかし、スポンジ、甲殻類、軟体動物などの他の海洋無脊椎動物では、エストロゲンは、主にゲームプレイの発達や刺激、酵素の変化、およびタンパク質作用、胚プロセスにおける問題、および他の48、49、50、51、52。EE2汚染によって引き起こされる負の結果は、海洋生物に影響を与えることなく、環境からこの化合物を除去するための持続可能なアプローチを開発する必要性を強調しています。

並行して、現在、世界の消費エネルギー源53のほぼ40%を占める石油では、慢性汚染と石油流出がリーフエリア11付近で起こることが多い。油汚染は、海洋動物、鳥類、植物、およびヒト54、55、56、57のいくつかの種で悪影響を引き起こすことが報告された。サンゴでは、漂白を引き起こし、熱応力58に対する幼虫の耐性を低下させ、微生物関連群集21を破壊し、組織壊死を引き起こす。加えて、化学分散剤は、石油会社が流出を修復するために一般的に使用される石油修復技術であり、油自体23よりもサンゴに対してさらに有毒である。対照的に、サンゴから分離された有益な微生物は、宿主の健康に重要な役割を果たしているとして知られている。しかし、これらの潜在的なプロバイオティクスの操作は、可能な負の副作用とメタ生物の適合性を改善するためにスクリーニングすることができる代謝能力を調べるために、より良い探索されなければなりません。この文脈において、サンゴ病原体に対する抗菌活性、酸化ストレスと戦うカタアラスの産生、尿素を分解する能力(石灰化過程で重要な役割を有する可能性がある)、遺伝子の存在などの特性潜在的な有益な特性を与えることは、とりわけ、調査の焦点でなければならない。ここでは、バイオレメディエーションとプロバイオティクスを使用して、汚染の影響を一伴って軽減し、サンゴの健康を高める方法を示します。海洋種の持続性を高めるための介入として利用できる革新的なアプローチの開発は、より持続可能で健康的な惑星への一歩を表しています。

Protocol

1. 微生物分離のための水とサンゴの収集と貯蔵

メモ:サンプリングサイトの座標と温度を取ることは不可欠です。可能であれば、湿度、pH、深さ、光強度などのメタデータは、微調整された栽培アプローチや将来のデータ解釈を見つけるのに役立ちます。信頼性の高い結果を得るには、サンプルを可能な限り長く保存しておきます。サンプルが適切な温度で保存されていない場合や、長期間保存されている場合、水/サンゴのマイクロバイオームはかなり変化する可能性があります。採取後すぐに隔離工程が行われない場合は、処理までサンプルを4°Cに維持することが重要です。サンプルが保存される時間が長ければ長いほど、4°Cであっても、微生物群集はより変化します。

  1. 海水をサンプルして保存します。
    1. 各標的サンプリング部位から少なくとも三重に水の500 mLサンプルを収集します。スクリューキャップ付きの滅菌ボトルを使用してください。
    2. 回収後すぐに水を処理する場合は、ボトルを短い間隔でRTに保ちます。サンプル処理が後で行う場合は、ボトルを4°Cに保ちます。
  2. サンゴをサンプリングして保存します。
    1. 水サンプルの同じサンプリング部位からサンゴの断片をカットするために、無菌のペンチを使用してください。汚染を避けるために、無菌手袋だけでサンゴに触れます。
    2. 20mL滅菌生理食塩水(蒸留水中3%NaCl)または人工海水を使用してサンプルサンゴの断片をすすいで、海水の緩く付着した自由生菌を取り除きます。
    3. 鉗子を使用して、滅菌生理食塩水を含むスクリューキャップ付きの滅菌250-500 mL容器に各サンゴの断片を置きます。
    4. 実験室では、滅菌鉗子とペンチを使用して、計量スケールで無菌100ミリメートルx20ミリメートルペトリ皿を使用してサンゴの断片の5 gを重量を量る。
    5. 5gのサンゴ試料を滅菌モルタルに移し、滅菌害虫を使って黄斑する。
    6. 滅菌スパチュラを使用して、3%NaCl滅菌溶液の45 mLと5mmの10−15ガラスビーズを含む滅菌培養フラスコに浸漬サンプルを移します。
    7. フラスコは、サンプリング部位の水温で16時間、一定の攪拌(150 x g)の下に保管してください。
      注:浅瀬サンゴの場合、最適な温度は24-28°Cの範囲です。このステップは、宿主細胞に取り付けられたものや、組織や骨格の中に生息するものなど、異なるサンゴのコンパートメントから微生物を切り離します。このステップの後、サンゴのマセレートを保存する必要があり、分離ステップを即座に実行する必要があります。

2. 海水やサンゴからのEE2分解細菌の分離

  1. 細菌を選択します。
    注:ステップ1.1.2および1.2.7の後、異なるサンゴの黄斑から切り離された海水中の微生物の濃度は不明で可変的です。寒天培地を含むペトリ皿の個々の微生物コロニーの分離を保証するためには、連続希釈が必要である。
    1. サンゴのサンプルのための無菌生理食塩水で10-9までの連続希釈を行い、水のサンプルのための10-6まで。ピペット希釈は、先端を廃棄する前に5倍上下に希釈する。次のシリアル希釈を行う前に、毎回5sの渦サンプルを採取する。
    2. 3%NaClリソジェニースープ(LB)寒天培地を含むペトリ皿の各希釈のピペット100μL、およびそれらをプレート。
      注:海洋寒天(MA)を代替媒体として使用してください。各希釈の三重化は、信頼性の高い結果のために必要とされます。
    3. 目標温度(例えば、26°C)でプレートを1〜3日間インキュベートします。1日1回プレートを確認してください。
    4. ストリークプレート技術を使用して、新しいプレート上で明確な成長形態を提示するコロニーを選択して分離します。プレート上に純粋なコロニーを成長させるために、必要な回数だけこの手順を繰り返します。
    5. 手順がステップ2.3.1に即座に継続されない場合は、セクション2.2で説明されているように、4°Cまたはグリセロールに分離物を保存します。
  2. グリセロールストックを準備します。
    注:このステップはオプションであり、長期の細菌ストック貯蔵に使用できます。
    1. 新鮮なプレートまたは4°Cで保存されたプレートから単一のコロニーを選択し、滅菌LB培地の2 mLで独立して接種します。
    2. チューブを一定の攪拌(150 x g)の下に24−28°C(ON)で置きます。
    3. ステップ2.2.2から細菌培養物の1 mLを加え、2mLの凍結膜に20%の最終濃度に滅菌グリセロールを加えます。
    4. 凍結膜は4°Cのままにしておきます。
    5. 必要になるまで、グリセロール細菌ストックを-80°Cに置きます。
  3. EE2-劣化能力試験を実行します。
    1. LBブロスまたは代替メディアで分離をアクティブにします。このために、新鮮なプレートまたは4°Cで保存されたプレートから単一のコロニーを選択し、滅菌LB培地の2 mLを接種する。グリセロールストックの場合は、まずLB寒天プレートにストリークし、24-28°ONでインキュベートして、単一のコロニーを成長させます。LB培地を含むチューブを一定の攪拌(150 x g)下に24−28°CONに置きます。
    2. 細菌増殖後、細胞を8,000 x gで室温(RT)で8分間遠心分離してペレット化する。上清を捨て、上下に軽くピペットをして、生理食用水の等量(2mL)で細胞を再スレドし、残りのLBスープを洗浄する。
    3. 手順2.3.2を2回繰り返して、炭素源の痕跡がないことを保証し、細胞を同じ量の生理線溶液に再びサスペンドします。例えば、2 mL培養で開始された場合、細胞を2mL生理線溶液の最終体積で再中断する。
    4. EE2を唯一の炭素源59として含有する最小ブッシュネルハース培養培地(BHブロス)で洗浄および再懸濁細胞を接種する。
      注:EE2は、培養培地中の5mg/Lの最終濃度でエタノールに溶解する。必要に応じて、汚染物質の種類や濃度を変更します。
    5. LB寒天培地33上の600 nmおよび/またはコロニー形成ユニット(CFU)での光学密度によって細菌の増殖を評価し、16−72時間のインキュベーションを行う。
      注:あるいは、微生物は、EE2、または他の化合物を含む最小媒体上で直接炭素源として単離することができる。このステップは、選択を指示し、望ましくない成長を避けるだろう。

3. 海水やサンゴからの油分解細菌の分離

  1. 唯一の炭素源21として油水溶性画分(oWSF)および油水不溶性分率(oWIF)を含む最小媒体を調製する。
    1. 滅菌蒸留水の500 mLに1-2%の原油を加えます。底部に開いたフィルターフラスコを使用して、不溶性画分の上層を乱すことなく可溶性画分を取り出します。
    2. 混合物を150 x gで24−28°Cで48時間一定に保ちます。
    3. 原油分画を含むフィルターフラスコを安定した表面に置き、10~20分待って可溶性および不溶性画分分離を可能にします。
    4. oWSFを新しい滅菌フラスコに移し、底部フィルターフラスコを開いて可溶性画分を取り出してoWIFを節約します。
    5. 前工程で回収したすべてのoWSF(〜400mL)を用いて、oWSFを含むBH寒天最小培地の1Lを唯一の炭素源として調製する。
    6. ステップ3.1.4からフラスコに残っているoWIFを用いて、oWIFを含むBH寒天最小培地の1Lを唯一の炭素源として調製する。
  2. oWSF-およびoWIF分解細菌を分離する。
    1. ステップ1.1.2および1.2.7の水とサンゴのマセレートをそれぞれ使用して、ステップ2.1.1で説明したように滅菌生理食塩水溶液中のサンプルを10-6まで希釈します。
    2. BH-oWSFおよびBH-oWIF寒天培地を含むペトリ皿の各希釈のピペット100°Lとそれらをプレート。
    3. 手順 2.1.3 からステップ 2.1.5 に記載されている手順を繰り返します。

4. コンソーシアム会員の選考

  1. 分類学的同定のためにDNAを抽出し、配列する。
    1. ステップ2.3.1の説明に従って、グリセロールにストックされた分離をアクティブにします。
    2. DNA抽出キットを使用して DNA を抽出します (材料表を参照)。
    3. プライマー 27f (5'-AGA GTT TGA TCA TGT CTC AG-3) および 1492r (5'-GTT CTT GTT ACG ACT T-3') を使用して、16S rRNA遺伝子を増幅します。
    4. 次のプロトコルに従って50μL PCR反応を行います:10xポリメラーゼバッファーの5 μL、2mM MgCl 2、0.2 mM dNTP、各プライマーの5mM、ゲノムDNAの10ng、およびTaq DNAポリメラーゼの2.5U。負のコントロール(すなわち、テンプレートDNAなしで空白のDNA抽出とPCR反応)を追加して、汚染がないことを確認します。
    5. 次のサーマルサイクリングステップを設定します:4分間94°Cで最初の変性サイクル。94°Cで35サイクル、1分間で50°C、2.5分で72°C。72 °Cで10分間の最終延長サイクル。
    6. 80 Vを使用して1.2%アガロースゲルのアンプリコンの完全性を確認します。
    7. ゲル精製キットを使用してサンプルを精製します(材料表を参照)。
    8. 蛍光計を使用してPCR製品を定量化します。
    9. 優先順位のために製品を送信します。
      注: 分類分類を改善するには、長いシーケンスを提供するため、Sanger メソッドは60を推奨します。ユニバーサルプライマー27fおよび1492rは、16S rRNA遺伝子61のほぼ全長を増幅するために使用することができる。1 組のプライマーを使用してコンティグを組み立てることができない場合は、シーケンスの途中で余分なペアを考慮する必要があります。
  2. 成長曲線を決定します。
    1. ステップ 2.3.1 で説明したように、ステップ 2.2.5 からグリセロールストック内の分離をアクティブにしますが、2 mL の代わりに 5 mL を使用します。
    2. ステップ4.2.1から成長した5mL培養物の1%(v/v)を、3%LBメディアの100 mLを含む250 mLフラスコに加えます。負のコントロール(接種なし)の三重を準備してください。
    3. フラスコをインキュベーターに入れ、一定の攪拌(150 x g)の24−28°Cに置きます。
    4. 48時間毎に1 mLアリコートを服用します。株が高い成長速度を示す場合は、4時間間隔を減少させる。
    5. リッチメディアプレート上にめっきされたシリアル希釈から数えた600nm波長およびコロニー形成単位(CFU)での光学密度(OD)推定を測定する(100μLは各プレートに接種し、1mLの体積に正規化する必要があります)。
    6. OD カーブと CFU カーブをプロットし、個々のひずみの OD/CFU の相関関係を解析します。今後は、OD 値に基づいてセルの数を計算します。
  3. 拮抗テストを実行します。
    1. ステップ 2.3.1 の説明に従って分離をアクティブにします。
    2. 寒天培地を含むプレートの中央に沿って一度に1つの株を接種し、中央の1つに垂直な他の株を接種します。選択したすべての微生物株が他のすべての株に対してテストされるまで繰り返します。
    3. プレートを24−28°Cでインキュベートし、拮抗活性を示す潜在的なハローを観察するために毎日監視します。2つの株間の拮抗活性を示すハローが観察された場合、そのうちの1つを除外する必要があります。
  4. コンソーシアムアセンブリを実行します。
    1. ステップ 2.3.1 の説明に従って分離をアクティブにします。
    2. 細胞を3,500 x gでペレットし、同じ量の生理線溶液で2倍軽く洗浄します。細胞を等しい体積で再中断します(つまり、最終体積が2mLの細胞であった場合は、2 mLの生理線溶液を使用して洗浄し、2 mLの最終体積で再中断します)。
    3. 100 mL 3% NaCl LB培地で1mL培養を接種し、150xgでオンをインキュベートする。
    4. ステップ4.5.2を繰り返し、10L培養、洗浄、再懸濁培養物を10L培養して100mLに接種する。無菌エアリフトバイオリアクターでONをインキュベートし、ポンプから濾過空気を受け取ります。より多くの文化が必要な場合は、常に新鮮なメディアで成長した文化の1%を接種します。
    5. 遠心分離は8,000 x gで培養し、4分間で4分間栽培した。遠心分離後に上清を廃棄する。
    6. ペレットを洗浄し、無菌生理食塩水の500mLで細胞を穏やかに再サスペンドする。
    7. 手順 4.5.5 と 4.5.6 を繰り返します。
    8. 各培養物を100mLの生理線溶液で再中断し、ODを測定して細胞数を推定する。
    9. 107細胞mL-1の最終濃度に到達するために必要な各培養の体積を計算する。
    10. 細胞の生存率と濃度の最終確認のためにリッチメディアでCFUカウントを実行します。
    11. 滅菌フラスコに各個々の培養物の等量を混合し、50 mLの無菌チューブにコンソーシアムをアリコートします。
    12. 接種するまで4°Cにしてください。
      注: セルが引き続き実行可能であることを保証するために、コンソーシアムアセンブリをできるだけ新たに準備します。あるいは、接種前にCFUカウントを実行することもできる。理想的なコンソーシアムを組み立てるには、異なる相補的な代謝能力を提示する単離性を使用する必要があります。通常、6 ~10 個の分離がコンソーシアムの形成に使用されますが、この数はメンバーの特性や目的によって異なります。

5. サンゴに対する有益な特性の検出

  1. LB寒天プレートにストリークして24-28°Cでインキュベートし、単一のコロニーを成長させることで、グリセロールストックから分離物を有効にします。プレートから単一のコロニーを選択し、滅菌LB培地の2 mLでそれを接種します。一定の攪拌(150 x g)の下に傾斜したLB培地を含むチューブを24−28°CONに置きます。
  2. PCRによる潜在的に有益な遺伝子の検出のために、セクション4.1に記載のDNA抽出を行う。
    注:PCR反応条件およびプライマーは標的遺伝子に依存する。個々の株のBMC特性を試験する方法論および潜在的に有益な遺伝子に対するPCR検出を表1に記載する。

Representative Results

ここで説明する方法に基づいて、異なる水源およびサンゴナビンから微生物を分離することができ、評判のBMC特性を提示し、異なるクラスの汚染物質を分解することができた(図1)。CESA-UFRJ(リオデジャネイロ連邦大学環境衛生実験センター)から得られた下水処理場で採取した水サンプルを用いて、ここで提示した手順に基づいて、33の細菌株がEE2を分解することができる5mg/Lの最終濃度を単離した(図2A)。さらに、油分解菌を選択する技術を用いて、oWSF(図2B)及びoWIF(図2C)の両方を分解できる20株を単離した。

様々な条件下で異なるサンゴ種から単離された微生物において、ベーティブBMC特性をスクリーニングした。中でも、サンゴ病原体ビブリオコラリ分解性に対して強い拮抗作用を示す株(図3A)、尿素を分解できる株(図3B)、良好なカタラーゼ生産者(図3) C)、および潜在的に有益な遺伝子を提示する微生物(図3D)が見つかった。

組み合わせた2つのアプローチ(すなわち、バイオレメディエーションおよびBMC接種)を採用して、油暴露の影響からサンゴを保護することが可能であった。このために、サンゴムシミリア・ハートティから単離された油バイオレーマpBMCコンソーシアムを、トリプリケート21で1%の油にさらされたサンゴナビンに接種した。石油にさらされた治療は、4日目以降のFv/Fmの進行性の減少を示し、10日目までにゼロに近い値に達した。可変蛍光/最大蛍光(Fv/Fm)は、サンゴの健康の間接的な測定を表す、ズオキサンテラ科の最大光システムII(PSII)光化学効率の尺度を提供した。一方、コンソーシアムと接種した水族館に存在するサンゴナビンは、より保存性の高い光化学的能力を示した(図4)。

Figure 1
図1:バイオレーマエーターpBMCコンソーシアムの選択と組み立ての主なステップの概要コンソーシアム微生物選択に用いられる汚染物質分解微生物の選択工程(グレー)および最終工程(DNAシーケンシング、成長曲線、拮抗試験、および赤のコンソーシアム組み立て)のスキーム。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:汚染物質分解菌の選択(A)唯一の炭素源としてEE2を含む最小媒体板上で増殖する細菌分離物。(B)oWSFを唯一の炭素源として含有する最小媒体板上で増殖する細菌コロニー。(C)唯一の炭素源としてoWIFを含む最小媒体プレート上で増殖する細菌コロニー。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:pBMC特性の検出(A)サンゴ病原体ビブリオコラリティクス(黒)および対照株(緑色)に対して拮抗活性を示す株の三重の斑点。(B)唯一の炭素源として尿素を含有する媒体上で増殖する株。(C)株産生カタラゲ(+)および悪いカタアゲ生産者株(-)。(D)nirK遺伝子のPCR検出例(レーン1=1kbラダー;レーン2=ブランクDNA抽出陰性制御;レーン3=nirK検出;レーン4=テンプレートDNAを含まないPCR反応)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:M.ハートティ・ナビンのFv/Fm測定値は、ダイビングPAMクロロフィルフルオロメータを用いて、午後5時に暗く適応した。治療制御コンソーシアム、オイル、オイルとコンソーシアムのFv/Fm測定を、毎日10日間3回行った。標準偏差が表示されます。グラフの特徴は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0の下でhttps://www.nature.com/articles/srep18268で利用可能な、以前の結果21からの許可を得て変更されました。http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/で完全な用語。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Moa 微生物 検出技術 参照
気候規制;サーフィールサイクリング;抗菌化合物;細胞の抗酸化保護を高める. アスペルギルス・シドウイ dddP遺伝子用PCR 81
シュードビブリオ sp. P12 DMSPを用いた培養培地 82
シュードアルタノミナス sp. dmdA遺伝子用PCR 33
病原体の生物学的調節。 アクロボラ・パルパータ粘液からの微生物 阻害の明確なゾーン 83
サンゴからの抽出物 成長抑制アッセイ 84
マリノバクター sp. 群れのアッセイ 85
シュードアルタノミナス sp. 寒天プレートクロスストリーキング 86
シュードアルタノミナス sp. 寒天拡散法 33
石灰化プロセスの利点;スクレラクチニアンサンゴのための窒素の源。 シンビオディニウム spp. 比色法 87
スチロフォラ・ピスティラタ・ムカからのマイクロバイオーム ___ 88
アクロボラ・アルシミナタのマイクロバイオーム ボランドら80の方法 89
窒素サイクル;窒素固定を増加させます。 微生物群集 qPCR 90
微生物群集 Pcr 91
微生物群集 qPCR 92
微生物群集 適応アセチレン(C2H2)還元技術 93
シュードアルタノミナスsp.とハロモナス・タエネンシス Pcr 33
窒素サイクル;アンモニウム濃度の低下。 シュードアルタノミナス sp. Pcr 33
ツバストラエ・コクシネアからのマイクロバイオーム Pcr 94
キセストスポンジア・テストゥジナリアからのマイクロバイオーム 予測メタゲノム解析 95
活性酸素種(ROS)に対するホロビオン保護。 シューダロモナスsp.、コベチアマリーナとハロモナス・タエネンシス カタアゲ糖試験 33
シンビオディニウム spp. アンプルクス・レッド 96
ビブリオペラギウスとシンクチョコッカクスsp. ホースラディッシュペルオキシダーゼコポレチン法 97
ヴィブリオ・フィシェリ 複数のメソッド 98

表1:評判BMC特性の検出、作用機序(MOA)、特性を検出するために用いられる電位および技術を提示する微生物を報告した。

Discussion

バイオレメディエーションのアプローチは、過去50年間にわたり大規模に検討されてきました。例えば、細菌、シアノバクテリア、微細藻類、真菌の中で200以上の微生物がいくつかの異なる生息地において、油炭化水素62、63、64の存在および/または分解可能であると指定されている.また、プラスチック、ビスフェノールA、内分泌攪乱物質、重金属など、環境や人間に影響を与える化合物の他のクラスは、バイオレメディエーション技術開発65、66の標的である。 67.一方、海洋プロバイオティクス開発は、養殖における魚のプロバイオティクスなど、経済に明らかな影響を与える分野に限定されてきた68、69.しかし、サンゴ礁を保護するための有益な微生物の分離と特性評価、漁業、観光、その他の収益性の高い活動を支える海洋生態系は、15と評価され始めている。ここで、局所海洋生態系、特にサンゴ(pBMC)に有益な微生物を特に有益な微生物に提示できる汚染物質分解微生物を選択するための安価で、容易で、アクセス可能なプロトコルは、説明。

さらに、ここで示す方法は、いくつかの化合物および多様な種類の微生物源に非常に適応性がある。最小媒体に添加された唯一の炭素源を交換することで、異なる汚染物質を標的にすることが可能です。このためには、油またはEE2の代わりに、所望の濃度で他の化合物を添加する必要があります。これは、標的汚染物質の劣化剤を分離するための選択的圧力であろう。例えば、内分泌攪乱物質の他のクラスを分解することができる微生物は、既に選択され、同じ方法論70を用いて試験されている。また、スポンジや植物71、72などの他の海洋生物や陸上生物、ならびに土壌、燃料、岩石などの異なる種類の環境試料を、分解微生物源25として用いることができる。 73、74.例えば、異なる土壌および堆積物試料25、54、63、64、75から炭化水素分解細菌を検出および単離することができる。最後に、培地中でわずかな改変を行い、細菌以外の微生物を分解微生物として容易に選択することができる。例えば、エストロゲン化合物を効率的に分解する能力を有する微細藻類株は76が報告されている。

理想的には、バイオレメディエーション-プロバイオティクスコンソーシアムは、特定の化合物または領域ごとに組み立てる必要があります。特定の環境で成長する微生物は、新しいサイトでは本来の状態に比べて成長しない場合があります。研究者は、すべての異なる環境条件下で効率的に適用できる製品を発見していないので、特定の状況ごとに新しいコンソーシアムアセンブリを実行する必要があります。これは、環境に合わせた回復のためのパーソナライズされた医療に似ています。このため、潜在的なプロバイオティクス特性と劣化能力を持つ微生物株の中央銀行の作成は、この分野の進歩のための重要なステップです。このイニシアチブは、時間と作業を節約し、世界中の新しい特定のコンソーシアムの組み立てに貢献します。

サンゴに関連する微生物(すなわち、微細藻類、細菌、古細菌、真菌、およびウイルス)は、宿主恒常性19を維持する上で複雑かつ複雑な役割を有する。汚染などの環境ストレッサーはまた、サンゴの微生物叢を不安定化させ、その結果、ジビオシスを引き起こし、疾患および死亡率30を引き起こす可能性がある。サンゴの微生物がサンゴの健康を支えるメカニズムが明らかにされ始めている。これらのメカニズムは、サンゴの抵抗性と環境ストレスに対する耐性を理解し、その結果、リーフの持続性と保存を促進するための鍵となります。さらに、この分野での知見は、一般的な宿主と微生物の相互作用を理解するのに役立ち、他の分野におけるより良いプロバイオティクスおよび健康増進戦略の開発に寄与する可能性がある。また、これらのプロバイオティクス接種がストレスイベント中にメタ生物の健康にどのように干渉できるかをよりよく調査することも重要です。例えば、サンゴの性能の増強はプロバイオティクスによるものであり、単に細菌を食料源として使用するサンゴではないことを示す作業が依然として必要である。

並行して、新しいコンソーシアム配信アプローチの開発と既存のものの改善は非常に重要です。コンソーシアムの固定化のための代替方法と、サンゴの食べ物(すなわち、アルテミアおよびロチファー)を接種し、それらをベクターとして使用するなどの革新的なアプローチが有望である。これらの送達システムはまた、他の海洋生物を標的にするために変更することができ、海洋プロバイオティクス分野の成功に不可欠であろう。

汚染の軽減とサンゴ礁の持続性は、現在、定期的に環境会議で強調されている主要なトピックの2つです。国連が発行する「アジェンダ2030」は、持続可能な未来を可能にするために社会が到達すべき文書で、各課題に対する具体的な目標を捧げています。ゴール6は汚染を減らすことによる水質改善の重要性を強調しているが、ゴール14は海洋、海洋、海洋資源の保全と持続可能な利用の関連性を強化する。この文脈において、サンゴ礁の保全は、汚染の緩和を含め、近い将来に達成されるべき変化に依存する。これは、地域の生息地の破壊や汚染78、79などの気候イベントに他の要因が追加されたときに最も大規模なサンゴの損失が発生したので、非常に重要です。本論文は、バイオレメディエーションとpBMC接種を組み合わせて特定の汚染物質を分解することが可能である一方、汚染物質やその他の問題に対処するためにサンゴの耐性と耐性を高める可能性があることを実証した。存在するプロトコルの最適化や革新的な方法の開発は、組み合わせたり、独立して適用されたりして、海洋生態系の将来を決定するために重要になります。

Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

本研究は、ANP 21005-4「PROBIO-DEEP - 深海海洋ホロビオンに対する石油・ガス探査による潜在的な影響の調査」および潜在的なバイオ指標の選択に関連して行われました。これらの生態系のバイオレメディエーションプロセス」(UFRJ/ シェル・ブラジル/ANP) - "PROBIO-DEEP - レバンタメント・デ・ポテンシアス・インパクオス・カウサドス・ペラ・エクスプロラソン・デ・オレオ・エ・ガエス・エム・ホロビオンテス・マリンホス・エム・マル・プロフンド・エ・セレソン・デ・ポテンシアス・ビオ・イミノ「コムプロミッソ・デ・インベスティメントス・コム・ペスキサ・エ・デセンボルヴィメント」としてANP R&Dレビーの下でシェル・ブラジルがスポンサーを務めるビオレメディドール・パラ・エス・エコシステマ。著者はまた、コンセルホ・ナシオナル・デ・デセンヴォルヴィメント・シエンティフィコ・エ・テクノロフィコ(CNPq)とコオルデナソン・デ・アペルフェイソアメント・デ・ペソアル・デ・ニヴェル・スーペスペリオール(CAPES)、カミラ・メシアス、フィリペ・ロサド、ヘンリケ・フラゴソ・ドスに感謝します。提供された画像の場合。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 mL PYREX Media Storage Bottle thomas scientific/Corning 1743E20/1395-500 Used to sample water.
500 mL Aspirator Bottles thomas scientific/Corning 1234B28/1220-2X Used to separate the oil fractions.
6-inch wire cutter plier thomas scientific/Restek 1173Y64/23033 Used to cut coral fragments.
17a-Ethinylestradiol LGC Standards DRE-C13245100 Used as the only carbon source to make the selective media.
Agar Himedia PCT0901-1KG Used to make solid media.
Bushnell Haas Broth Himedia M350-500G Used as minimum media to be supplemented with carbon sources.
Erlenmeyer Flask thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble) 4882H35/26500-125 Used to incubate coral macerate with glass beads.
GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit GE Healthcare 28903470 Used to purify PCR products before sending them for sequencing.
Glass Beads MP Biomedicals 1177Q81/07DP1070 Used to detach the microorganisms from coral structures.
Laminar Flow Hood Needed to work at sterile conditions.
Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth) Himedia M1245-1KG Used as rich media to grow bacteria.
Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar) Himedia M384-500G Used as rich media to grow bacteria.
Orbital-Shaker Incubator Used to incubate liquid media and oil.
Plates Incubator Used to incubate plates.
Porcelain Mortar and Pestle Thomas scientific/United Scientific Supplies 1201U69/JMD150 Used to macerate coral fragments.
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Used for nucleic acids quantification of DNA and PCR products.
Refrigerated Centrifuge Used to centrifuge bacterial cultures.
Spectrophotometer Used to measure optical density of bacterial cultures.
Wizard Genomic DNA Purification kit Promega A1120 Used for microbial strains DNA extraction.

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メタ生物研究と保存のためのバイオレメディエーションおよびプロバイオティクス開発のための微生物株の探知
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Villela, H. D. M., Vilela, C. L. S., Assis, J. M., Varona, N., Burke, C., Coil, D. A., Eisen, J. A., Peixoto, R. S. Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation. J. Vis. Exp. (152), e60238, doi:10.3791/60238 (2019).More

Villela, H. D. M., Vilela, C. L. S., Assis, J. M., Varona, N., Burke, C., Coil, D. A., Eisen, J. A., Peixoto, R. S. Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation. J. Vis. Exp. (152), e60238, doi:10.3791/60238 (2019).

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