Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Prospektering mikrobiell stammer for Bioremediering og probiotika utvikling for Metaorganism forskning og bevaring

doi: 10.3791/60238 Published: October 31, 2019

Summary

Forurensning påvirker alle biomer. Marine miljøer har vært spesielt påvirket, spesielt korallrev, en av de mest følsomme økosystemer på jorden. Bioremediering er kapasiteten til organismer å svekke forurensninger. Her beskriver vi metoder for å isolere og teste mikrober som presenterer bioremediering evne og potensielle probiotiske egenskaper for koraller.

Abstract

Forurensning påvirker alle biomer. Marine miljøer har vært spesielt påvirket, spesielt korallrev, en av de mest følsomme økosystemer på jorden. Globalt er 4 500 000 000 mennesker økonomisk avhengige av havet, hvor de fleste av deres levebrød er levert av korallrev. Koraller er av stor betydning, og derfor deres utryddelse fører til katastrofale konsekvenser. Det finnes flere mulige løsninger på rette opp marin forurensning og lokal forurensning, inkludert bioremediering. Bioremediering er kapasiteten til organismer å svekke forurensninger. Tilnærmingen presenterer flere fordeler, slik som bærekraft, relativt lav kostnad, og det faktum at det kan brukes i ulike økosystemer, forårsaker minimale virkninger på miljøet. Som en ekstra fordel, manipulering av endogene microbiomes, inkludert antatte gunstige mikroorganismer for koraller (Pbmc), kan ha probiotiske effekter for marine dyr. I denne sammenhengen kan bruken av de to tilnærmingene, bioremediering og pBMC-inoculation kombineres, være lovende. Denne strategien vil fremme nedbrytning av spesifikke forurensende stoffer som kan være skadelig for koraller og andre metaorganisms samtidig øke verten motstand og elastisitet å håndtere forurensning og andre trusler. Denne metoden fokuserer på valg av Pbmc å svekke to forurensninger: syntetisk østrogen 17A-etinyløstradiol (EE2) og råolje. Begge har blitt rapportert å negativt påvirke marine dyr, inkludert koraller, og mennesker. Protokollen beskriver hvordan å isolere og teste bakterier i stand til å svekke den spesifikke forurensninger, etterfulgt av en beskrivelse av hvordan å oppdage noen antatte gunstige egenskaper av disse tilknyttede mikrober til sine koraller vert. Metodene som er beskrevet her er relativt billig, enkel å utføre, og svært tilpasningsdyktig. Nesten alle slags løselig mål sammensatte kan brukes i stedet for EE2 og olje.

Introduction

Forurensning er et stort problem som berører mennesker, dyr og plante helse over hele verden. Selv om forurensning kan være naturlig, for eksempel vulkansk aske1, menneskelige aktiviteter er den primære årsaken til de fleste forurensning. Menneskeskapte aktiviteter er forurensende jord, vann og luft, som direkte eller indirekte føre til nesten 20 000 000 for tidlig menneskelig dødsfall2 og decimate milliarder av andre former for liv årlig. Forurensning er til stede selv i de mest avsidesliggende områdene av planeten. For eksempel, tungmetaller og vedvarende organiske forbindelser har blitt påvist i dypvanns virvelløse dyr og Polar pattedyr, henholdsvis3,4.

Marine miljøer har blitt spesielt påvirket av forurensning. I lang tid, ble det antatt at havet ville forbli upåvirket og levere en endeløs kilde til varer på grunn av sin massive volumet av vann5. Av denne grunn, alle typer industri og institusjoner fritt utgitt avfall i vannforekomster i århundrer6,7. Flere forurensninger av alle typer, for eksempel plast8, syntetiske hormoner9, plantevernmidler10, olje11, næringsstoffer12, tungmetaller3, og radioaktivt avfall13 har blitt rapportert som påvirker hav økosystemer. I denne sammenhengen er korallrev blant de viktigste og mest følsomme økosystemene i marine miljøer14. Skjær er kyst beskyttere, avgjørende for utviklingen av tusenvis av marine arter ved å spille viktige roller i næringsstoffer sykling og klimakontroll. Skjær også bidra til økonomien ved å tilby fisk, varer og turisme, blant andre15. For eksempel er 4 500 000 000 mennesker avhengig av havet fisk som sin viktigste mat kilde16, som er sterkt støttet av korallrev.

Uavhengig av deres økologiske, sosiale og økonomiske betydning, korallrev blir desimert17,18. Menneskeskapte aktiviteter er primært ansvarlig for å bidra til de tre viktigste årsakene til koraller ' død: klimaendringer, overfiske, og vannforurensning19. Selv om det er viktig å arbeide med reduksjonen av global oppvarming, er det også viktig å arbeide med å minimere lokal forurensning, inkludert vannforurensning, som kan kritisk bidra til korall nedgang20. Dermed er det et presserende behov for utvikling av strategier for å øke koraller levetid, noe som kan gi dem ekstra tid til å tilpasse seg og overleve.

I denne forbindelse er det svært viktig å finne løsninger for å minimere forurensning og å utvikle strategier for å øke egnethet av koraller. Strategier for å rette opp marin forurensning er svært mangfoldig og kan grupperes i fysiske, kjemiske og biologiske tilnærminger. Fysiske tilnærminger er nyttig. Men de er ikke alltid effektive. For eksempel kan plastavfall minimeres ved fysisk fjerning, mens vannløselige forbindelser trenger andre metoder for å bli eliminert. Eksempler på slike forbindelser er råolje, utgitt av oljeindustrien aktiviteter og søl, samt andre mikropollutanter, som syntetiske hormoner, vanligvis brukt som estrogenic komponent i p-piller og tilstede i kloakk21, 22. Bruk av kjemiske stoffer for å redusere forurensning kan løse et bestemt problem, men det kan også representere en ekstra kilde til forurensning. Dette er tilfellet med kjemisk dispergeringsmidler for å dempe olje forurensning, som har blitt beskrevet som enda mer giftig for Marine økosystemer enn olje forurensning selv23. Av disse grunner, biologiske tilnærminger presentere flere fordeler i forhold til andre metoder. Bioremediering er kapasiteten til levende organismer, eller deres metabolske produkter, å transformere forurensninger i mindre giftige eller ikke-giftige former24. De viktigste fordelene med å bruke biologiske metoder er bærekraft, relativ lav pris, det faktum at de er miljøvennlige, og at de kan brukes i ulike økosystemer, forårsaker minimal eller færre virkninger på miljøet21, 25,26,27.

I tillegg gjør manipulering av mikrobiell samfunnet til stede i et miljø en ekstra potensiell fordel. Det er microbiomes som er forbundet med verter og er avgjørende for deres helse. Det er velkjent at disse tilknyttede symbiotisk microbiomes er nødvendig for å opprettholde verten homeostase19. Manipulering av disse tilknyttede mikroorganismer har vært godt utforsket for verter som planter og pattedyr28,29, men bruken av Coral probiotika er fortsatt romanen15. Koraller også vert, samhandle med, og avhenger av store og spesifikke populasjoner av mikroorganismer for å overleve19. Rollen til disse mikrobielle samfunnene i helse og dysbiosis av koraller er under aktiv studie, men det er fortsatt langt fra å være fullt ut forstått30. En av de mest populære hypoteser kalles Coral probiotiske hypotese. Det tyder på eksistensen av en dynamisk sammenheng mellom symbiotisk mikroorganismer og miljømessige forhold som bringer om valg av de mest fordelaktige korall metaorganisms31. Basert på denne informasjonen, viktige potensielle probiotiske mekanismer, samt strategier for isolasjon, manipulasjon, og levering av gunstige mikroorganismer for koraller (BMCs) for flere formål, ble foreslått32 og testet33. Disse potensielle gunstige egenskaper inkluderer motstand mot temperaturøkning, beskyttelse mot reaktive oksygen arter (ROS), nitrogen fiksering, motstand mot forurensninger, og biologisk kontroll mot patogener, blant andre32.

Denne studien fokuserer på valg av BMCs og fritt levende mikroorganismer presentere evnen til å svekke to forurensninger som vanligvis finnes i marine miljøer: syntetisk østrogen 17A-etinyløstradiol (EE2) og råolje. Forurensende stoffer som inneholder hormon aktive midler er ofte til stede i vannforekomster34,35,36,37,38,39,40, 41,42. Blant dem, syntetiske estrogenic endokrine-disruptor forbindelser (EDCs) etterligne handlingen av østrogen på målet celler, forårsaker flere virkninger på dyr, inkludert brystkreft, infertilitet, og Futanari9. EE2 utskilles av mennesker på grunn av bruk av p-piller. Det er ikke fjernet fra kloakk av tradisjonelle avløpsvann-renseanlegg og har negative effekter selv ved svært lave konsentrasjoner (f. eks ng/L eller μg/L)43,44,45. Lite er kjent om virkningene av østrogen på Coral fysiologi46,47. Men på andre marine virvelløse dyr, slik som svamper, krepsdyr og bløtdyr, ble østrogen rapportert å forårsake flere negative effekter hovedsakelig knyttet til reproduksjon, slik som utvikling og/eller stimulering av kjønnscellene, endring i enzymatisk og protein handlinger, problemer i embryonale prosesser, og andre48,49,50,51,52. De negative konsekvensene forårsaket av EE2 forurensning fremheve nødvendigheten av å utvikle bærekraftige tilnærminger for å fjerne denne forbindelsen fra miljøet uten at det påvirker marint liv.

Parallelt med olje for tiden sto for nesten 40% av verdens konsumert energikilder53, kronisk forurensning og oljesøl forekommer ofte i nærheten av rev områder11. Olje forurensning ble rapportert å forårsake negative effekter i flere arter av marine dyr, fugler, planter, og mennesker54,55,56,57. På koraller, det fører til bleking, reduserer motstanden av larver til termisk stress58, forstyrrer mikrobiell tilknyttede samfunn21, og forårsaker vev nekrose. I tillegg kjemisk dispergeringsmidler, en olje Utbedring teknikk som vanligvis brukes av oljeselskaper å rette opp søl, er enda mer giftig for koraller enn oljen selv23. Gunstige mikroorganismer isolert fra koraller, i kontrast, er kjent for å spille avgjørende roller på verts helse. Imidlertid må manipulering av disse potensielle probiotika være bedre utforsket for å undersøke mulige negative bivirkninger og metabolske kapasiteter som kan bli vist for å forbedre egnethet av metaorganism. I denne sammenheng, egenskaper som den antimikrobielle aktiviteten mot koraller patogener, produksjon av catalase for å bekjempe oksidativt stress, evnen til å svekke urea (som kan ha viktige roller i forkalkning prosessen), og tilstedeværelsen av gener som kan overdra potensielle fordelaktige egenskaper, blant annet, må være fokus for etterforskningen. Her viser vi hvordan bioremediering og probiotika kan brukes til samtidig å dempe virkningene av forurensning og forbedre koraller helse. Utviklingen av innovative tilnærminger som kan brukes som intervensjoner for å øke marine arter utholdenhet representerer et skritt mot en mer bærekraftig og sunnere planet.

Protocol

1. vann og korall samling og lagring for mikrobiell isolasjon

Merk: det er viktig å ta koordinatene og temperaturen på prøvetaking nettsteder. Hvis det er mulig, kan metadata som saltinnhold, pH, dybde og lys intensitet også bidra til å finne finjusterte metoder for dyrking og fremtidig tolkning av data. For å få pålitelige resultater må du holde prøvene lagret i minst mulig tid. Vann/korall microbiomes kan endres betraktelig hvis prøvene ikke oppbevares ved riktig temperatur og/eller oppbevares i lengre perioder. Hvis isolasjons trinnet ikke utføres umiddelbart etter oppsamling, er det avgjørende å opprettholde prøvene ved 4 ° c til prosessering. Jo lengre prøvene er lagret, selv ved 4 ° c, jo mer mikrobiell samfunnet vil endre.

  1. Prøve og lagre sjøvann.
    1. Samle 500 mL prøver av vann i minst tre eksemplarer fra hvert målrettede Prøvetakings sted. Bruk fortrinnsvis sterile flasker med skrulokk.
    2. Hvis behandlingen av vannet umiddelbart etter oppsamling, holde flaskene på RT for et kort intervall. Hvis prøve behandlingen skjer senere, beholder du flaskene ved 4 ° c.
  2. Prøve og lagre koraller.
    1. Bruk en steril tang for å kutte koraller fragmenter fra samme prøvetaking stedet av vannprøvene. For å unngå forurensning, berører koraller bare med sterile hansker.
    2. Skyll samplet korall fragment med 20 mL steril saltoppløsning (3% NaCl i destillert vann) eller kunstig sjøvann for å bli kvitt de løst festet fritt levende bakterier i sjøvannet.
    3. Ved hjelp av tang, plasser hver korall fragment i en steril 250 − 500 mL container med en skrue cap som inneholder steril saltløsning.
    4. I laboratoriet, ved hjelp av sterile tang og tang, veie 5 g av koraller fragmenter ved hjelp av sterile 100 mm x 20 mm Petri retter på en veie skala.
    5. Overfør 5 g korall prøve til en steril mørtel og macerate den ved hjelp av en steril morter.
    6. Bruk en steril spatel, og overfør den macerated prøven til en steril kultur kolbe som inneholder 45 mL 3% NaCl steril oppløsning og 10 − 15 glassperler på 5 mm. Bruk noen av 45 mL steril saltløsning for å vaske mørtel og gjenopprette den maksimale mengden av macerate.
    7. Hold flaskene under konstant omrøring (150 x g) i 16 timer ved vanntemperaturen på Prøvetakings stedet.
      Merk: for grunt vann koraller vil optimal temperatur variere fra 24 − 28 ° c. Dette trinnet vil løsne mikroorganismer fra ulike koraller rom, for eksempel de som er knyttet til verten cellene, eller de som bor inne i vevet og skjelettet. Etter dette trinnet skal korall spylesystem ikke lagres, og isolasjons trinnet må utføres umiddelbart.

2. isolering av EE2-nedverdigende bakterier fra sjøvann og/eller koraller

  1. Velg bakterier.
    Merk: etter trinn 1.1.2 og 1.2.7, konsentrasjonen av mikroorganismer i sjøvann som har løsrevet fra de ulike korall spylesystem vil være ukjent og variabel. For å garantere isolering av individuelle mikrobielle kolonier i Petri retter som inneholder agar medier, er seriell fortynninger nødvendig.
    1. Utfør seriell fortynninger på opptil 10-9 i steril saltløsning for korall prøver og opptil 10-6 for vann prøver. Pipetter fortynninger opp og ned 5x før du forkaster tuppen. Vortex prøver for 5 s hver gang før du utfører neste serie fortynning.
    2. Pipetter 100 μL av hver fortynning på Petri retter som inneholder 3% NaCl lysogeny buljong (LB) agar medium, og plate dem.
      Merk: Bruk Marine agar (MA) som et alternativ medium. Triplicates av hver fortynning er nødvendig for pålitelige resultater.
    3. Ruge platene i 1 − 3 dager ved mål temperaturen (f.eks. 26 ° c). Sjekk platene en gang om dagen.
    4. Velg og isolere koloniene presentere distinkte vekst morfologier på nye plater ved hjelp av strek plate teknikk. Gjenta dette steget så mange ganger som nødvendig for å få rene kolonier som vokser på platene.
    5. Hvis prosedyren ikke umiddelbart fortsetter å trå 2.3.1, skal Oppbevar isoleres ved 4 ° c eller i glyserol som beskrevet i avsnitt 2,2.
  2. Forbered glyserol aksjer.
    Merk: dette trinnet er valgfritt og kan brukes for langsiktige bakterie lager lagring.
    1. Plukk enkelt kolonier fra den friske platen eller fra platene lagret ved 4 ° c og uavhengig vaksinere dem i 2 mL sterilt LB medium.
    2. Plasser rørene under konstant omrøring (150 x g) ved 24 − 28 ° c over natten (on).
    3. Tilsett 1 mL av bakteriekulturer fra trinn 2.2.2 og steril glyserol til en endelig konsentrasjon på 20% til 2 mL cryovials.
    4. La cryovials være på ved 4 ° c.
    5. Plasser glyserol bakterielle aksjer ved-80 ° c til nødvendig.
  3. Utfør den EE2-fornedrelse evne testen.
    1. Aktiver isolerer i LB buljong eller alternative medier. For dette, plukke en enkelt koloni fra de friske platene eller platen som er lagret ved 4 ° c, og vaksinere 2 mL sterilt LB medium. I tilfelle det er en glyserol lager, første stripe den på LB agar plater og ruge ved 24 − 28 ° c ON å ha enkelt kolonier vokser. Plasser røret som inneholder LB medium tilbøyelig under konstant omrøring (150 x g) ved 24 − 28 ° c på.
    2. Etter bakteriell vekst, pellet cellene ved sentrifugering dem ved 8 000 x g i 8 min ved romtemperatur (RT). Kast supernatanten og forsiktig pipettering opp og ned, resuspend cellene i et lik volum (2 mL) av saltvann for å vaske de resterende LB kjøttkraft.
    3. Gjenta trinn 2.3.2 to ganger for å garantere at det ikke er spor av karbon kilde, blanding cellene i et likt volum av saltoppløsning. For eksempel, hvis det ble startet med en 2 mL kultur, resuspend cellene i et endelig volum på 2 mL saltoppløsning.
    4. Vaksinere de vasket og resuspendert celler i minimum Bushnell Haas kultur medium (BH buljong) som inneholder EE2 som den eneste karbon kilde59.
      Merk: EE2 er oppløst i etanol ved en endelig konsentrasjon på 5 mg/L i kultur mediet. Gjør endringer i forurensende type og/eller konsentrasjon ved behov.
    5. Vurder bakteriell vekst ved optisk tetthet ved 600 NM og/eller kolonier forming enheter (CFU) på LB agar medium33, for 16-72 h av inkubasjons.
      Merk: Alternativt kan mikroorganismer være direkte isolert på minimum medier som inneholder EE2, eller andre forbindelser, som den eneste karbon kilde. Dette trinnet vil dirigere utvalget og unngå uønsket vekst.

3. isolering av olje-nedverdigende bakterier fra sjøvann og/eller koraller

  1. Forbered minimum medier som inneholder en olje vannløselig brøk (oWSF) og olje vann-uløselig brøkdel (oWIF) som den eneste karbon kilde21.
    1. Tilsett 1 − 2% råolje til 500 mL sterilt destillert vann. Bruk en filter kolbe åpnet på bunnen for å ta løselig brøk ut uten å forstyrre det øvre laget av uløselig brøk.
    2. Hold blandingen under konstant omrøring ved 24 − 28 ° c ved 150 x g for 48 h.
    3. Plasser filter flasken som inneholder råoljen fraksjoner på en stabil overflate og vent 10 − 20 min for å tillate løselig og uløselig brøk separasjon.
    4. Overfør oWSF til en ny steril kolbe, lagre oWIF ved å åpne den nederste filteret kolbe og ta ut løselig brøk.
    5. Bruke alle oWSF utvinnes i forrige trinn (~ 400 mL), forberede 1 L av BH agar minimum medium som inneholder oWSF som eneste karbon kilde.
    6. Bruke oWIF resterende i flasken fra trinn 3.1.4, forberede 1 L av BH agar minimum medium som inneholder oWIF som eneste karbon kilde.
  2. Isoler oWSF-og oWIF-nedverdigende bakterier.
    1. Ved hjelp av vann og korall macerate fra trinn 1.1.2 og 1.2.7, fortynne prøvene opp til 10-6 i steril saltoppløsning som beskrevet i trinn 2.1.1.
    2. Pipetter 100 μL av hver fortynning på Petri retter som inneholder BH-oWSF og BH-oWIF agar Media og plate dem.
    3. Gjenta prosedyrene som er beskrevet fra trinn 2.1.3 til trinn 2.1.5.

4. Consortium medlem utvalg

  1. Pakk ut og sekvens DNA for taksonomisk identifisering.
    1. Aktiver isolerer lager i glyserol som beskrevet i trinn 2.3.1.
    2. Pakk ut DNA ved hjelp av en DNA-ekstraksjon Kit (se tabell over materialer).
    3. Bruk primere 27f (5 '-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3 ') og 1492r (5 ′-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3 ') for forsterkning av 16S rRNA genet.
    4. Utfør 50 μL PCR-reaksjoner i henhold til følgende protokoll: 5 μL av 10x polymerase buffer, 2 mM MgCl2, 0,2 mm dNTPs, 5 mm av hver primer, 10 ng av genomisk DNA, og 2,5 U av Taq DNA polymerase. Legg til negative kontroller (dvs. blank DNA-utdrag og PCR-reaksjoner uten mal DNA) for å sikre at det ikke er forurensning.
    5. Sett opp følgende termiske sykling trinn: en første denaturering syklus ved 94 ° c for 4 min; 35 sykluser ved 94 ° c i 1 min, etterfulgt av 50 ° c i 1 min, og 72 ° c for 2,5 min; en siste Utvidelses syklus for 10 min ved 72 ° c.
    6. Sjekk amplicon integritet i 1,2% agarose gel med 80 V.
    7. Gel renser prøvene ved hjelp av en gel rensing Kit (se tabell over materialer).
    8. Kvantifisere PCR-produkter ved hjelp av en fluorometer.
    9. Send produktet for sekvenser.
      Merk: for bedre taxonomical klassifikasjoner, den sanger metoden anbefales60, fordi det gir lange sekvenser. Den universelle primere 27f og 1492r kan brukes til å forsterke nesten hele lengden av 16S rRNA genet61. Hvis contigs ikke kan monteres ved hjelp av ett par primere, bør et ekstra par i midten av sekvensen vurderes.
  2. Bestem vekstkurven.
    1. Aktiver isolerer i glyserol aksjer fra trinn 2.2.5 som beskrevet i trinn 2.3.1, men ved hjelp av 5 mL i stedet for 2 mL.
    2. Tilsett 1% (v/v) av den dyrkede 5 mL kulturen fra trinn 4.2.1 i triplicates, til en 250 mL kolbe som inneholder 100 mL av 3% LB Media. Sørg for å forberede triplicates av en negativ kontroll (ingen inokulum) også.
    3. Plasser flaskene i en inkubator under konstant omrøring (150 x g) ved 24 − 28 ° c.
    4. Ta 1 mL alikvoter hver 4 h for 48 h. Hvis stammene utgjør en høy vekstrate, redusere 4 h intervall.
    5. Mål den optiske tettheten (OD) estimering ved 600 NM bølgelengde og koloni forming enheter (CFU) telles fra seriell fortynninger belagt på rike medier plater (100 μL bør inokulert i hver plate og normalisert til volumet av 1 mL).
    6. Plot OD og CFU kurver og analysere korrelasjon av OD/CFU av hver enkelt stamme. Fra nå av beregner du antall celler basert på OD-verdiene.
  3. Utfør motsetningen test.
    1. Aktiver isolerer som beskrevet i trinn 2.3.1.
    2. Vaksinere en belastning om gangen langs midten av platene inneholder agar Media og de andre vinkelrett på den sentrale en. Gjenta til hver valgt mikrobiell stamme er testet mot alle andre.
    3. Ruge platene ved 24 − 28 ° c og Overvåk dem daglig for å observere potensiell Halo som indikerer fiendtlig aktivitet. Hvis det observeres en av disse som indikerer en fiendtlig aktivitet mellom to stammer, bør en av dem utelukkes.
  4. Utfør konsortium montering.
    1. Aktiver isolerer som beskrevet i trinn 2.3.1.
    2. Pellets cellene ved 3 500 x g og vask dem forsiktig 2x i et likt volum av saltoppløsning. Resuspend cellene i et lik volum (dvs. Hvis det endelige volumet var 2 mL celler, vask dem med 2 mL saltoppløsning og Resuspend dem i et endelig volum på 2 mL).
    3. Vaksinere 1 mL kultur i 100 mL 3% NaCl LB medium og ruge på ved 150 x g.
    4. Gjenta trinn 4.5.2, vaksinere de 100 mL dyrket, vasket, og resuspendert kulturer i 10 L kulturer. Ruge ON i steril luft-Lift bioreaktorer, mottar filtrert luft fra en pumpe. Hvis mer kultur er nødvendig, alltid vaksinere 1% av dyrket kultur i friske medier.
    5. Sentrifuger dyrket kulturer ved 8 000 x g i 8 min ved 4 ° c. Kast supernatanten etter sentrifugering.
    6. Vask pellet, forsiktig blanding cellene i 500 mL steril saltoppløsning.
    7. Gjenta trinn 4.5.5 og 4.5.6.
    8. Resuspend hver enkelt kultur i 100 mL saltoppløsning og mål OD å anslå antall celler.
    9. Beregn volumet av hver kultur er nødvendig for å nå en endelig konsentrasjon av 107 celler ml-1.
    10. Utføre CFU teller på rike medier for en endelig bekreftelse av celle levedyktighet og konsentrasjon.
    11. Bland et likt volum av hver enkelt kultur i sterile flasker og alikvot konsortiet i 50 mL sterile rør.
    12. Oppbevares ved 4 ° c til inoculation.
      Merk: Forbered konsortiet forsamlingen så fersk som mulig for å garantere cellene vil fortsatt være levedyktig. Alternativt kan CFU teller utføres før inoculation. For å sette sammen en ideell konsortium, er det nødvendig å bruke isolerer presentere ulike og komplementære metabolske kapasiteter. Vanligvis brukes 6 − 10 isolat for å danne konsortier, men dette antallet vil variere avhengig av medlemmenes egenskaper og formål.

5. påvisning av antatte fordelaktige egenskaper for koraller

  1. Aktiver isolerer fra glyserol aksjer ved striper dem på LB agar plater og incubating dem ved 24 − 28 ° c på å ha enkelt kolonier vokser. Plukk en enkelt koloni fra platene og vaksinere den i 2 mL steril LB medium. Plasser rør som inneholder LB medium tilbøyelig under konstant omrøring (150 x g) ved 24 − 28 ° c på.
  2. Utfør DNA-ekstraksjon som beskrevet i avsnitt 4,1 for påvisning av potensielt gunstige gener ved PCR.
    Merk: PCR reaksjonsbetingelser og primere vil avhenge av det målrettede genet. Metoder for å teste BMC-egenskapene til individuelle stammer og PCR-deteksjon for potensielt gunstige gener er beskrevet i tabell 1.

Representative Results

Basert på metodene som er beskrevet her, var det mulig å isolere mikroorganismer fra ulike vannkilder og koraller Nubbins presentere antatte BMC egenskaper og i stand til å svekke ulike klasser av forurensninger (figur 1). Ved hjelp av vann prøver samlet på et kloakkrenseanlegg, Hentet fra CESA-UFRJ (Experimental Center of Environmental sanitær av Federal University of Rio de Janeiro), og basert på prosedyren som presenteres her, 33 bakterielle belastninger i stand til å svekke EE2 på en endelig konsentrasjon på 5 mg/L ble isolert (figur 2A). I tillegg bruker teknikken for valg av olje-nedverdigende bakterier, 20 stammer i stand til å forringe både oWSF (figur 2B) og oWIF (figur 2C) ble isolert.

Antatte BMC egenskaper ble vist i mikroorganismer isolert fra ulike koraller arter under ulike forhold. Blant dem, en belastning presentere sterk fiendtlig aktivitet mot koraller patogen Vibrio coralliilyticus (Figur 3a), spenninger i stand til å svekke urea (Figur 3B), en god catalase produsent (Figur 3 C), og mikroorganismer presentere potensielt gunstige gener (Figur 3D) ble funnet.

Ansette de to tilnærminger kombinert (dvs. bioremediering og BMC inoculation), var det mulig å beskytte koraller fra olje eksponering virkninger. For dette var en olje bioremediator pBMC konsortium, isolert fra korall Mussismilia harttii, inokulert på korall Nubbins eksponert for 1% olje i triplicates21. Behandlingene eksponert for olje presenterte en progressiv nedgang i FV/FM fra den fjerde dagen og framover, og nådde verdier nær null av den tiende dagen. Variabel fluorescens/maksimal fluorescens (FV/FM) ga et mål på maksimal photosystem II (PSII) fotokjemisk effektiviteten av zooxanthellae, som representerer en indirekte måling av korall helse. På den andre side, korall Nubbins gave inne akvariet inokulert med det Consortium viste en bedre-bevart fotokjemisk evne (skikkelsen 4).

Figure 1
Figur 1: oppsummering av de viktigste trinnene i en bioremediator-pBMC konsortium utvalg og montering. Ordningen med forurensende-nedverdigende mikroorganismer utvalg trinn (i grått) og siste trinnene som brukes for konsortiet mikrobiell utvalg (DNA-sekvensering, vekst kurve, fiendtlighet test, og konsortium montering i rødt). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: valg av forurensende-nedverdigende bakterier. (A) bakteriell isolerer vokser på minimum Media plater som inneholder EE2 som eneste karbon kilde. (B) bakterie kolonier vokser på minimum Media plater som inneholder oWSF som eneste karbon kilde. (C) bakterie kolonier vokser på minimum Media plater som inneholder oWIF som eneste karbon kilde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: påvisning av pBMC-egenskaper. (A) flekker i triplicates av belastningen presentere fiendtlig aktivitet mot koraller patogen Vibrio coralliilyticus (i svart) og en kontroll stamme (i grønt). (B) stammer vokser på medier som inneholder urea som den eneste karbon kilde. (C) belastning produsere catalase (+) og en dårlig catalase produsent stamme (-). (D) eksempel på PCR-deteksjon av nirK-genet (Lane 1 = 1kb Ladder; Lane 2 = blank DNA-ekstraksjon negativ kontroll; Lane 3 = nirK Detection; Lane 4 = PCR reaksjoner uten mal DNA). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: FV/FM målinger av M. harttii Nubbins mørk-tilpasset ved 5 PM, ved hjelp av en DIVING-Pam klorofyll fluorometer. FV/FM målinger av behandlingene kontroll konsortium, olje og olje med konsortium ble utført i triplicates hver dag i 10 dager. Standard avvik vises. Funksjoner av grafen ble endret med tillatelse fra tidligere resultater21, tilgjengelig på https://www.Nature.com/articles/srep18268 under en Creative Commons Attribution 4,0. Fullstendige termer på http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Moa Mikroorganismen Deteksjon teknikk Referanser
Klimaregulering; surfur sykling; antimikrobielle forbindelser; øke antioksidant beskyttelse av celler. Aspergillus sydowii PCR for dddP-genet 81
Pseudovibrio Sp. P12 Kultur medium med DMSP 82
Pseudoalteromonas Sp. PCR for dmdA-genet 33
Biologisk regulering av patogener. Mikrobiomet fra Acropora palmata mucus Tøm sone av hemming 83
Ekstrakter fra koraller Veksthemming analysen 84
Marinobacter Sp. Kryr av analyser 85
Pseudoalteromonas Sp. Agar plate Cross-striper 86
Pseudoalteromonas Sp. Agar-Diffusion metode 33
Fordel for forkalkning prosessen; kilde til nitrogen for scleractinian koraller. Symbiodinium spp. Fargemetrisk metode 87
Mikrobiomet fra Stylophora pistillata mucus ___ 88
Mikrobiomet fra Acropora alciminata Metode ved Bolland et al. 80 89
Nitrogen syklus; øke nitrogen fiksering. Mikrobiell samfunnet qPCR 90
Mikrobiell samfunnet Pcr 91
Mikrobiell samfunnet qPCR 92
Mikrobiell samfunnet Tilpasset acetylen (C2H2) reduksjons teknikk 93
Pseudoalteromonas Sp. og Halomonas taeanensis Pcr 33
Nitrogen syklus; reduksjon av ammonium konsentrasjon. Pseudoalteromonas Sp. Pcr 33
Mikrobiomet fra Tubastraea coccinea Pcr 94
Mikrobiomet fra Xestospongia testudinaria Prediktiv metagenome analyse 95
Holobiont beskyttelse mot reaktive oksygen arter (ROS). Pseudoalteromonas Sp., Cobetia Marina og Halomonas taeanensis Catalase test 33
Symbiodinium spp. Amplex rød 96
Vibrio Pelagius og Sync-chococcus Sp. Pepperrot peroksidase-scopoletin metode 97
Vibrio fischeri Flere metoder 98

Tabell 1: påvisning av antatte BMC-egenskaper, virkningsmekanisme (MOA), rapporterte mikroorganismer som presenterer potensialet og teknikken som brukes til å oppdage den karakteristiske.

Discussion

Bioremediering tilnærminger har blitt massivt utforsket de siste 50 årene. For eksempel har over 200 mikrober blant bakterier, cyanobakterier, mikroalger og sopp i flere forskjellige habitater, blitt utpekt som stand til å indikere tilstedeværelse og/eller forringe olje hydrokarboner62,63,64 . I tillegg er andre klasser av forbindelser som forårsaker virkninger på miljøet og mennesker, for eksempel plast, bisfenol A, endokrine disruptors, og tungmetaller, er mål for bioremediering teknikk utvikling65,66, i 67. På den annen side har Marin probiotiske utvikling vært begrenset til de feltene som har en åpenbar innvirkning på økonomien, slik som fiske probiotika i akvakultur68,69. Men isolasjon og karakterisering av gunstige mikroorganismer for å beskytte korallrev, marine økosystemer som støtter fiskeri, turisme og andre lønnsomme aktiviteter, begynner å bli verdsatt15. Her, en billig, enkel og tilgjengelig protokoll for å velge forurensende-nedverdigende mikroorganismer som også kan presentere potensielt fordelaktige egenskaper til lokale Marine økosystemer, spesielt antatte gunstige mikroorganismer til koraller (Pbmc), er Beskrevet.

I tillegg er metoden demonstrert her er svært tilpasningsdyktig til flere forbindelser og ulike typer mikrobielle kilder. Det er mulig å målrette ulike forurensende stoffer ved å erstatte den eneste karbon kilde lagt til minimum Media. For dette, i stedet for olje eller EE2, bør andre forbindelser legges på ønsket konsentrasjon. Dette vil være selektiv press for å isolere degraders for målrettede forurensende stoffer. For eksempel, mikroorganismer i stand til nedverdigende andre klasser av endokrine disruptors har allerede blitt valgt og testet ved hjelp av samme metodikk70. Videre andre marine-og terrestriske organismer, slik som svamper og planter71,72, samt distinkte typer miljø prøver, slik som jord, drivstoff, og bergarter kan brukes som nedverdigende-mikrobielle kilder25, 73,74. For eksempel var det mulig å oppdage og isolere hydrokarboner nedverdigende bakterier fra ulike jord og sediment prøver25,54,63,64,75. Til slutt, utføre små modifikasjoner i Media, mikroorganismer enn bakterier kan lett velges som nedverdigende-mikrober. For eksempel, en mikroalger stamme med evnen til å effektivt svekke østrogen forbindelser har blitt rapportert76.

Ideelt sett må bioremediering-probiotiske konsortier monteres for hver spesifikke sammensatte eller areal. Mikrober som vokser i et bestemt miljø kan ikke vokse så vel i nye områder i forhold til sine opprinnelige forhold. Fordi forskerne ikke har funnet et produkt som kan effektivt brukes under alle ulike miljøforhold, bør ny konsortier montering utføres for hver enkelt situasjon. Dette ville være beslektet med personlig medisin for miljø-skreddersydd utvinning. Av denne grunn er opprettelsen av en sentralbank av mikrobielle stammer med potensielle probiotiske egenskaper og fornedrelse kapasitet et avgjørende skritt for fremdriften av dette feltet. Dette initiativet vil spare tid og arbeid, bidra til montering av nye spesifikke konsortier over hele verden.

Mikroorganismer assosiert med koraller (dvs. mikroalger, bakterier, Archaea, sopp og virus) har en kompleks og intrikat rolle i å opprettholde verten homeostase19. Miljømessige stressfaktorer, slik som forurensning, kan også destabilisere korall mikrobiomet, noe som resulterer i dysbiosis, som kan forårsake sykdom og dødelighet30. Mekanismene som koraller mikrobiomet kan støtte koraller helse begynner å bli avslørt. Disse mekanismene er nøkkelen til å forstå koraller motstand og elastisitet til miljømessige stressfaktorer, og følgelig å fremme rev utholdenhet og bevaring. I tillegg vil funnene i feltet bidra til å forstå generelle mikrobiomet interaksjoner, som kan bidra til utvikling av bedre probiotika og helsefremmende strategier i andre områder. Det er også viktig å bedre undersøke hvordan disse probiotika vaksiner kan forstyrre metaorganism helse under stress hendelser. For eksempel, arbeid som viser at styrking i koraller ytelse skyldes probiotika og ikke bare koraller med bakterier som mat kilde er fortsatt nødvendig.

Parallelt, utvikling av nye konsortier levering tilnærminger og forbedring av de eksisterende er av stor betydning. Alternative metoder for konsortium immobilisering så vel som innovative tilnærminger, for eksempel vaksinere korall mat (dvs. Artemia og rotatorier) og bruke dem som vektorer, er lovende. Disse leveringssystemene kan også modifiseres for å målrette mot andre marine organismer og vil være avgjørende for suksessen til det marine probiotika.

Forurensning utslippsreduksjoner og korallrev utholdenhet er for tiden to av de viktigste temaene fremhevet i miljømessige konferanser regelmessig. Agenda 2030, et dokument publisert av FN som beskriver det globale mål samfunnet bør nå for å muliggjøre en bærekraftig fremtid, tilegne seg konkrete mål for hvert problem. Mens mål 6 fremhever viktigheten av forbedring av vannkvaliteten ved å redusere forurensningen, forsterker Goal 14 relevansen av bevaring og bærekraftig bruk av hav, hav og marine ressurser77. I denne sammenheng avhenger Coral Reef bevaring på endringer som bør oppnås i nær fremtid, inkludert forurensning utslippsreduksjoner. Dette er av stor betydning, fordi de fleste massive korall tap skjedde da andre faktorer ble lagt til klima hendelser, for eksempel lokale habitat ødeleggelse og forurensning78,79. Dette papiret viste at det er mulig å kombinere bioremediering og pBMC inoculation å svekke spesifikke forurensende stoffer, mens det kan øke koraller motstand og elastisitet å håndtere forurensning og andre problemer. Optimaliseringen av eksisterende protokoller og/eller utvikling av innovative metoder, kombinert eller uavhengig anvendt, vil være avgjørende for å bestemme fremtiden for Marine økosystemer.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble utført i samarbeid med det pågående R & D-prosjektet registrert som ANP 21005-4, «PROBIO-DEEP-Survey av potensielle virkninger forårsaket av olje-og gass leting på hav Marin holobionts og valg av potensiell bioindicators og bioremediering prosesser for disse økosystemene "(UFRJ/Shell Brasil/ANP) –" PROBIO-DEEP-Levantamento de potenciais impactos causados pela exploração de óleo e gás EM holobiontes marinhos EM Mar profundo e seleção de potenciais bioindicadores e processos biorremediadores para esses ecossistemas ", sponset av Shell Brasil under ANP R & D Levy som" Compromisso de investimentos com Pesquisa e Desenvolvimento. Forfatterne takker også Conselho Nacional de Desenvolvimento Uvv e Tecnológico (CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (KAPPER) for økonomisk støtte, og til Camila Messias, Phillipe Rosado, og Henrique Fragoso dos Santos, for bildene som er oppgitt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 mL PYREX Media Storage Bottle thomas scientific/Corning 1743E20/1395-500 Used to sample water.
500 mL Aspirator Bottles thomas scientific/Corning 1234B28/1220-2X Used to separate the oil fractions.
6-inch wire cutter plier thomas scientific/Restek 1173Y64/23033 Used to cut coral fragments.
17a-Ethinylestradiol LGC Standards DRE-C13245100 Used as the only carbon source to make the selective media.
Agar Himedia PCT0901-1KG Used to make solid media.
Bushnell Haas Broth Himedia M350-500G Used as minimum media to be supplemented with carbon sources.
Erlenmeyer Flask thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble) 4882H35/26500-125 Used to incubate coral macerate with glass beads.
GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit GE Healthcare 28903470 Used to purify PCR products before sending them for sequencing.
Glass Beads MP Biomedicals 1177Q81/07DP1070 Used to detach the microorganisms from coral structures.
Laminar Flow Hood Needed to work at sterile conditions.
Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth) Himedia M1245-1KG Used as rich media to grow bacteria.
Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar) Himedia M384-500G Used as rich media to grow bacteria.
Orbital-Shaker Incubator Used to incubate liquid media and oil.
Plates Incubator Used to incubate plates.
Porcelain Mortar and Pestle Thomas scientific/United Scientific Supplies 1201U69/JMD150 Used to macerate coral fragments.
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Used for nucleic acids quantification of DNA and PCR products.
Refrigerated Centrifuge Used to centrifuge bacterial cultures.
Spectrophotometer Used to measure optical density of bacterial cultures.
Wizard Genomic DNA Purification kit Promega A1120 Used for microbial strains DNA extraction.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Durand, M., Grattan, J. Effects of volcanic air pollution on health. Lancet. 357, 164 (2001).
  2. Ramaswami, A., Russell, A. G., Culligan, P. J., Sharma, K. R., Kumar, E. Meta-principles for developing smart, sustainable, and healthy cities. Science. 352, 940-943 (2016).
  3. Dökmeci, A. H., Yildiz, T., Ongen, A., Sivri, N. Heavy metal concentration in deepwater rose shrimp species (Parapenaeus longirostris, Lucas, 1846) collected from the Marmara Sea Coast in Tekirdağ. Environmental Monitoring and Assessment. 186, 2449-2454 (2014).
  4. Skaare, J. U., et al. Ecological risk assessment of persistent organic pollutants in the arctic. Toxicology. 181-182, 193-197 (2002).
  5. Garstang, W. The impoverishment of the sea. A critical summary of the experimental and statistical evidence bearing upon the alleged depletion of the trawling grounds. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 6, 1-69 (1900).
  6. Korajkic, A., Brownell, M. J., Harwood, V. J. Investigation of human sewage pollution and pathogen analysis at Florida Gulf coast beaches. Journal of Applied Microbiology. 110, 174-183 (2011).
  7. Liu, J., Yang, W. Water sustainability for China and beyond. Science. 337, 649-650 (2012).
  8. Eriksen, M., et al. Plastic pollution in the world’s oceans: more than 5 trillion plastic pieces weighing over 250,000 tons afloat at sea. PLoS One. 9, 111913 (2014).
  9. Vilela, C. L. S., Bassin, J. P., Peixoto, R. S. Water contamination by endocrine disruptors: Impacts, microbiological aspects and trends for environmental protection. Environmental Pollution. 235, 546-559 (2018).
  10. Ueno, D., et al. Global pollution monitoring of PCBs and organochlorine pesticides using skipjack tuna as a bioindicator. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 45, 378-389 (2003).
  11. Villela, H. D. M., Peixoto, R. S., Soriano, A. U., do Carmo, F. L. Microbial bioremediation of oil contaminated seawater: A survey of patent deposits and the characterization of the top genera applied. Science of the Total Environment. 666, 743-758 (2019).
  12. Rabalais, N. N., et al. Eutrophication-driven deoxygenation in the coastal ocean. Oceanography. 27, 172-183 (2014).
  13. Calmet, D. P. Ocean disposal of radioactive waste. Status report. IAEA Bulletin. 31, 47-50 (1989).
  14. Swart, P. K. Coral Reefs: Canaries of the Sea, Rainforests of the oceans. Nature Education Knowledge. 4, 5 (2013).
  15. National Academies of Sciences and Medicine, E. A Research Review of Interventions to Increase the Persistence and Resilience of Coral Reefs. The National Academies Press. Washington, D.C. (2019).
  16. Béné, C., et al. Feeding 9 billion by 2050-Putting fish back on the menu. Food Security. 7, 261-274 (2015).
  17. Hughes, T. P., et al. Global warming and recurrent mass bleaching of corals. Nature. 543, 373 (2017).
  18. Hughes, T. P., et al. Spatial and temporal patterns of mass bleaching of corals in the Anthropocene. Science. 359, 80-83 (2018).
  19. Rosenberg, E., Koren, O., Reshef, L., Efrony, R., Zilber-Rosenberg, I. The role of microorganisms in coral health, disease and evolution. Nature Reviews Microbiology. 5, 355 (2007).
  20. Shaver, E. C., Burkepile, D. E., Silliman, B. R. Local management actions can increase coral resilience to thermally-induced bleaching. Nature Ecology & Evolution. 2, 1075-1079 (2018).
  21. Santos, H., et al. Impact of oil spills on coral reefs can be reduced by bioremediation using probiotic microbiota. Scientific Reports. 5, 18268 (2015).
  22. Whitman, W. B. Bacteria and the fate of estrogen in the environment. Cell Chemical Biology. 24, 652-653 (2017).
  23. DeLeo, D. M., Ruiz-Ramos, D. V., Baums, I. B., Cordes, E. E. Response of deep-water corals to oil and chemical dispersant exposure. Deep-Sea Research. Part II Topical Studies in oceanography. 129, 129-147 (2016).
  24. Zinicovscaia, I., Cepoi, L. Cyanobacteria for bioremediation of wastewaters. Springer. Berlin, Germany. (2016).
  25. Cury, J. C., et al. Microbial diversity and hydrocarbon depletion in low and high diesel-polluted soil samples from Keller Peninsula, South Shetland Islands. Antarctic Science. 27, 263-273 (2015).
  26. Sinha, R. K., Valani, D., Sinha, S., Singh, S., Herat, S. Bioremediation of contaminated sites: a low-cost nature’s biotechnology for environmental clean up by versatile microbes, plants, earthworms. Solid Waste Management and Environmental Remediation. 971-978 (2009).
  27. Maila, M. P., Cloete, T. E. Bioremediation of petroleum hydrocarbons through landfarming: Are simplicity and cost-effectiveness the only advantages. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 3, 349-360 (2004).
  28. Madsen, K., et al. Probiotic bacteria enhance murine and human intestinal epithelial barrier function. Gastroenterology. 121, 580-591 (2001).
  29. Saleem, M., Arshad, M., Hussain, S., Bhatti, A. S. Perspective of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) containing ACC deaminase in stress agriculture. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 34, 635-648 (2007).
  30. Sweet, M. J., Bulling, M. T. On the importance of the microbiome and pathobiome in coral health and disease. Frontiers in Marine Science. 4, 9 (2017).
  31. Reshef, L., Koren, O., Loya, Y., Zilber-Rosenberg, I., Rosenberg, E. The coral probiotic hypothesis. Environmental Microbiology. 8, 2068-2073 (2006).
  32. Peixoto, R., Rosado, P. M., Leite, D. C. deA., Rosado, A. S., Bourne, D. G. Beneficial Microorganisms for Corals (BMC): Proposed Mechanisms for Coral Health and Resilience. Frontiers in Microbiology. 8, 341 (2017).
  33. Rosado, P., et al. Marine probiotics: increasing coral resistance to bleaching through microbiome manipulation. The The ISME Journal. 13, 921-936 (2019).
  34. Heberer, T., Reddersen, K., Mechlinski, A. From municipal sewage to drinking water: fate and removal of pharmaceutical residues in the aquatic environment in urban areas. Water Science and Technology. 46, 81-88 (2002).
  35. Barel-Cohen, K., et al. Monitoring of natural and synthetic hormones in a polluted river. Journal of Environmental Management. 78, 16-23 (2006).
  36. Balest, L., Mascolo, G., Di Iaconi, C., Lopez, A. Removal of endocrine disrupter compounds from municipal wastewater by an innovative biological technology. Water Science and Technology. 58, 953-956 (2008).
  37. Liu, Z., Kanjo, Y., Mizutani, S. A review of phytoestrogens: Their occurrence and fate in the environment. Water Research. 44, 567-577 (2010).
  38. Chapman, H. F., et al. A national approach to health risk assessment, risk communication and management of chemical hazards from recycled water. Waterlines. 48, (2011).
  39. Rocha, M. J., Cruzeiro, C., Ferreira, C., Rocha, E. occurrence of endocrine disruptor compounds in the estuary of the Iberian Douro River and nearby Porto Coast (NW Portugal). Toxicological and Environmental Chemistry. 94, 252-261 (2012).
  40. Nie, M., et al. Environmental estrogens in a drinking water reservoir area in Shanghai: occurrence, colloidal contribution and risk assessment. Science of the Total Environment. 487, 785-791 (2014).
  41. Ribeiro, C., Ribeiro, A. R., Tiritan, M. E. Priority substances and emerging organic pollutants in Portuguese aquatic environment: a review. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 238, 1-44 (2016).
  42. Wu, C., Huang, X., Lin, J., Liu, J. Occurrence and fate of selected endocrine-disrupting chemicals in water and sediment from an urban lake. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 68, 225-236 (2015).
  43. Shi, W., Wang, L., Rousseau, D. P. L., Lens, P. N. L. Removal of estrone, 17α-ethinylestradiol, and 17ß-estradiol in algae and duckweed-based wastewater treatment systems. Environmental Science and Pollution Research. 17, 824-833 (2010).
  44. Ternes, T., Bonerz, M., Schmidt, T. Determination of neutral pharmaceuticals in wastewater and rivers by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 938, 175-185 (2001).
  45. Ternes, T. A., Andersen, H., Gilberg, D., Bonerz, M. Determination of estrogens in sludge and sediments by liquid extraction and GC/MS/MS. Analytical Chemistry. 74, 3498-3504 (2002).
  46. Tarrant, A. M., Atkinson, M. J., Atkinson, S. Effects of steroidal estrogens on coral growth and reproduction. Marine Ecology Progress Series. 269, 121-129 (2004).
  47. Atkinson, S., Atkinson, M. J., Tarrant, A. M. Estrogens from sewage in coastal marine environments. Environmental Health Perspectives. 111, 531-535 (2003).
  48. Schoenmakers, H. J. N., Van Bohemen, C. G., Dieleman, S. J. Effects of Oestradiol-17 β on the Ovaries of the Starfish Asterias rubens. Development Growth and Differentiation. 23, 125-135 (1981).
  49. Sarojini, R., Jayalakshmi, K., Sambashivarao, S. Effect of external steroids on ovarian development in freshwater prawn, Macrobrachium lamerrii. Journal of Advanced Zoology. 7, 50 (1986).
  50. Hathaway, R. R., Black, R. E. Interconversions of estrogens and related developmental effects in sand dollar eggs. General and Comparative Endocrinology. 12, 1-11 (1969).
  51. Ghosh, D., Ray, A. K. Subcellular action of estradiol-17β in a freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. General and Comparative Endocrinology. 90, 274-281 (1993).
  52. Aris, A. Z., Shamsuddin, A. S., Praveena, S. M. occurrence of 17α-ethynylestradiol (EE2) in the environment and effect on exposed biota: a review. Environment International. 69, 104-119 (2014).
  53. International Energy Agency. Key World Energy Statistics (KWES). (2018).
  54. Carmo, F. L., et al. Bacterial structure and characterization of plant growth promoting and oil degrading bacteria from the rhizospheres of mangrove plants. Journal of Microbiology. 49, 535-543 (2011).
  55. Piatt, J. F., Lensink, C. J., Butler, W., Kendziorek, M., Nysewander, D. R. Immediate impact of the'Exxon Valdez'oil spill on marine birds. The Auk. 107, (2), 387-397 (1990).
  56. White, H. K., et al. Impact of the Deepwater Horizon oil spill on a deep-water coral community in the Gulf of Mexico. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20303-20308 (2012).
  57. Abdel-Shafy, H. I., Mansour, M. S. M. A review on polycyclic aromatic hydrocarbons: source, environmental impact, effect on human health and remediation. Egyptian Journal of Petroleum. 25, 107-123 (2016).
  58. Negri, A. P., Hoogenboom, M. O. Water contamination reduces the tolerance of coral larvae to thermal stress. PLoS One. 6, 19703 (2011).
  59. Brown, E. J., Resnick, S. M., Rebstock, C., Luong, H. V., Lindstrom, J. UAF radiorespirometric protocol for assessing hydrocarbon mineralization potential in environmental samples. Biodegradation. 2, 121-127 (1991).
  60. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
  61. Vergin, K. L., et al. Screening of a Fosmid Library of Marine Environmental Genomic DNA Fragments Reveals Four Clones Related to Members of the Order Planctomycetales. Applied and Environmental Microbiology. 64, (8), 3075-3078 (1998).
  62. Yakimov, M. M., Timmis, K. N., Golyshin, P. N. Obligate oil-degrading marine bacteria. Current Opinion in Biotechnology. 18, 257-266 (2007).
  63. Santos, H. F., Cury, J. C., Carmo, F. L., Rosado, A. S., Peixoto, R. S. 18S rDNA sequences from microeukaryotes reveal oil indicators in mangrove sediment. PLoS One. 5, 12437 (2010).
  64. Jurelevicius, D., Cotta, S. R., Peixoto, R., Rosado, A. S., Seldin, L. Distribution of alkane-degrading bacterial communities in soils from King George Island, Maritime Antarctic. European Journal of Soil Biology. 51, 37-44 (2012).
  65. Paço, A., et al. Biodegradation of polyethylene microplastics by the marine fungus Zalerion maritimum. Science of the Total Environment. 586, 10-15 (2017).
  66. Zhang, W., Yin, K., Chen, L. Bacteria-mediated bisphenol A degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97, 5681-5689 (2013).
  67. Gadd, G. M. Metals, minerals and microbes: geomicrobiology and bioremediation. Microbiology. 156, 609-643 (2010).
  68. Balcázar, J. L., et al. The role of probiotics in aquaculture. Veterinary Microbiology. 114, 173-186 (2006).
  69. Gatesoupe, F. J. The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture. 180, 147-165 (1999).
  70. Ren, Y. X., Nakano, K., Nomura, M., Chiba, N., Nishimura, O. Effects of bacterial activity on estrogen removal in nitrifying activated sludge. Water Research. 41, 3089-3096 (2007).
  71. Santos-Gandelman, J. F., Giambiagi-deMarval, M., Muricy, G., Barkay, T., Laport, M. S. Mercury and methylmercury detoxification potential by sponge-associated bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 106, 585-590 (2014).
  72. Yamaga, F., Washio, K., Morikawa, M. Sustainable biodegradation of phenol by Acinetobacter calcoaceticus P23 isolated from the rhizosphere of duckweed Lemna aoukikusa. Environmental Science & Technology. 44, 6470-6474 (2010).
  73. Soriano, A. U., et al. Microbiological aspects of biodiesel and biodiesel/diesel blends biodeterioration. International Biodeterioration & Biodegradation. 99, 102-114 (2015).
  74. Da Cunha, C. D., Rosado, A. S., Sebastián, G. V., Seldin, L., Von der Weid, I. Oil biodegradation by Bacillus strains isolated from the rock of an oil reservoir located in a deep-water production basin in Brazil. Applied Microbiology and Biotechnology. 73, 949-959 (2006).
  75. Prantera, M. T., Drozdowicz, A., Leite, S. G., Rosado, A. S. Degradation of gasoline aromatic hydrocarbons by two N 2-fixing soil bacteria. Biotechnology Letters. 24, 85-89 (2002).
  76. Lai, K. M., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Biotransformation and bioconcentration of steroid estrogens by Chlorella vulgaris. Applied and Environmental Microbiology. 68, 859-864 (2002).
  77. United Nations. Transforming our World: The 2030 Agenda for Sustainable Development. (2015).
  78. Bellwood, D. R., Hughes, T. P., Folke, C., Nyström, M. Confronting the coral reef crisis. Nature. 429, 827 (2004).
  79. Pandolfi, J. M., et al. Global trajectories of the long-term decline of coral reef ecosystems. Science. 301, 955-958 (2003).
  80. Bolland, E. G., Cook, A. R., Turner, N. A. Urea as a sole source of nitrogen for plant growth. I. The development of urease activity in Spirodela oligorrhiza. Planta. 83, 1-12 (1968).
  81. Kirkwood, M., Todd, J. D., Rypien, K. L., Johnston, A. W. B. The opportunistic coral pathogen Aspergillus sydowii contains dddP and makes dimethyl sulfide from dimethylsulfoniopropionate. The ISME Journal. 4, 147-150 (2010).
  82. Raina, J., Tapiolas, D., Motti, C., Foret, S., Seemann, T. Isolation of an antimicrobial compound produced by bacteria associated with reef-building corals. Peer J. 4, 2275 (2016).
  83. Ritchie, K. B. Regulation of microbial populations by coral surface mucus and mucus-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 322, 1-14 (2006).
  84. Gochfeld, D. J., Aeby, G. S. Antibacterial chemical defenses in Hawaiian corals provide possible protection from disease. Marine Ecology Progress Series. 362, 119-128 (2008).
  85. Alagely, A., Krediet, C. J., Ritchie, K. B., Teplitski, M. Signaling mediated cross-talk modulates swarming and biofilm formation in a coral pathogen Serratia marcescens. The ISME Journal. 5, 1609-1620 (2011).
  86. Kvennefors, E. C. E., et al. Regulation of bacterial communities through antimicrobial activity by the coral holobiont. Microbial Ecology. 63, 605-618 (2012).
  87. Biscere, T., et al. Enhancement of coral calcification via the interplay of nickel and urease. Aquatic Toxicology. 200, 247-256 (2018).
  88. Grover, R., Maguer, J., Allemand, D., Ferrier-Pages, C. Urea uptake by the scleractinian coral Stylophora pistillata. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 332, 216-225 (2006).
  89. Crossland, C. J., Barnes, D. J. The Role of Metabolic Nitrogen in Coral Calcification. Marine Biology. 28, 325-332 (1974).
  90. Olson, N. D., Ainsworth, T. D., Gates, R. D., Takabayashi, M. Diazotrophic bacteria associated with Hawaiian Montipora corals: diversity and abundance in correlation with symbiotic dinoflagellates. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 371, 140-146 (2009).
  91. Lema, K. A., Willis, B. L., Bourneb, D. G. Corals form characteristic associations with symbiotic nitrogen-fixing bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 78, 3136-3144 (2012).
  92. Santos, H. F., et al. Climate change affects key nitrogen-fixing bacterial populations on coral reefs. The ISME Journal. 8, 2272-2279 (2014).
  93. Cardini, U., et al. Functional significance of dinitrogen fixation in sustaining coral productivity under oligotrophic conditions. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282, 20152257 (2015).
  94. Yang, S., Sun, W., Zhang, F., Li, Z. Phylogenetically diverse denitrifying and ammonia-oxidizing bacteria in corals Alcyonium gracillimum Tubastraea coccinea. Marine Biotechnology. 15, 540-551 (2013).
  95. de Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. M., Polonia, A. R. M., Gomes, N. C. M. Bacterial community composition and predicted functional ecology of sponges, sediment and seawater from the thousand islands reef complex, West Java, Indonesia. FEMS Microbiology Ecology. 91, (2015).
  96. Suggett, D. J., et al. Photosynthesis and production of hydrogen peroxide by Symbiodinium (Pyrrhophyta) phylotypes with different thermal tolerances. Journal of Phycology. 44, 948-956 (2008).
  97. Petasne, R. G., Zika, R. G. Hydrogen peroxide lifetimes in south Florida coastal and offshore waters. Marine Chemistry. 56, 215-225 (1997).
  98. McFall-Ngai, M. J. Consequences of evolving with bacterial symbionts: insights from the squid-Vibrio associations. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 30, 235-256 (1999).
Prospektering mikrobiell stammer for Bioremediering og probiotika utvikling for Metaorganism forskning og bevaring
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Villela, H. D. M., Vilela, C. L. S., Assis, J. M., Varona, N., Burke, C., Coil, D. A., Eisen, J. A., Peixoto, R. S. Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation. J. Vis. Exp. (152), e60238, doi:10.3791/60238 (2019).More

Villela, H. D. M., Vilela, C. L. S., Assis, J. M., Varona, N., Burke, C., Coil, D. A., Eisen, J. A., Peixoto, R. S. Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation. J. Vis. Exp. (152), e60238, doi:10.3791/60238 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter