Summary
ويقدم هذا العمل بروتوكولا لتنفيذ المجسم ، وغرس العصبية من صفائف ميكروالكترود في marmoset المشتركة. هذه الطريقة علي وجه التحديد تمكن التسجيلات الكهربائية في الحيوانية يتصرف بحريه ولكن يمكن تكييفها بسهوله لأي تدخل الجراحة العصبية الأخرى مماثله في هذا النوع (علي سبيل المثال ، قني لأداره المخدرات أو أقطاب لتحفيز الدماغ).
Abstract
Marmosets (Callithrix jacchus) هي الرئيسيات الصغيرة غير البشرية التي تكتسب شعبيه في البحوث الطبية الحيوية وما قبل السريرية ، بما في ذلك أعصاب. هذه الكائنات أقرب بكثير من البشر من القوارض كما انها تعرض السلوكيات المعقدة ، بما في ذلك مجموعه واسعه من النطق والتفاعلات الاجتماعية. هنا ، يوصف اجراء الجراحة العصبية الفراغية فعاله لغرس صفائف القطب التسجيل في marmoset المشتركة. هذا البروتوكول أيضا تفاصيل الخطوات قبل وبعد العملية الجراحية للعناية بالماشية المطلوبة لاجراء هذه الجراحة بنجاح. وأخيرا ، يظهر هذا البروتوكول مثالا علي الإمكانيات الميدانية المحلية والتسجيلات النشاط الطفرة في marmoset يتصرف بحريه 1 أسبوع بعد العملية الجراحية. عموما ، يوفر هذا الأسلوب فرصه لدراسة وظيفة الدماغ في اليقظة والتصرف بحريه marmosets. ويمكن استخدام نفس البروتوكول بسهوله من قبل الباحثين العاملين مع الرئيسيات الصغيرة الأخرى. الاضافه إلى ذلك ، فانه يمكن تعديلها بسهوله للسماح للدراسات الأخرى التي تتطلب يزرع ، مثل تحفيز الأقطاب الكهربائية ، والحقن المجهري ، وغرس optrodes أو دليل cannulas ، أو استئصال مناطق الانسجه المنفصلة.
Introduction
المارموسيين المشتركة (callithrix jacchus) تكتسب الاعتراف باعتبارها نموذجا كائنا حيا هاما في العديد من مجالات البحث ، بما في ذلك العلوم العصبية. هذه الرئيسيات العالم الجديد تمثل نموذجا الحيوانية التكميلية الهامه لكل من القوارض وغيرها من الرئيسات غير البشرية (NHPs) ، مثل المكاك الريسوس. مثل القوارض ، وهذه الكائنات الصغيرة ، وسهله للتلاعب ، واقتصاديه نسبيا لرعاية وتولد1،2،3،4، بالمقارنة مع nhps أكبر. وعلاوة علي ذلك ، فان هذه الكائنات لديها ميل للتوامه والخصوبة العالية بالنسبة إلى الأخرى nhps1،2،3. ميزه أخرى لل marmoset علي العديد من الرئيسيات الأخرى هو ان البيولوجيا الجزيئية الحديثة أدوات3،4،5،6،7 والجينوم المتسلسلة2 ,3,4,5, 8 وقد استخدمت لتعديل وراثيا لهم. كلا الطرق في الحيوانية باستخدام لينتيفيروس5، وضرب الخروج الحيوانية باستخدام الزنك الاصبع نوكليسيس (zfns) والنسخ المنشط مثل المنحرف المستجيب (talens)7، وقد أثمرت الحيوانية مؤسس قابله للحياة.
ميزه [أين رلايشن تو] قوارض ان [مرمويتس], كرئيسيات, [فيلوجيني] قريبه إلى أناس3,5,6,9,10,11. مثل البشر ، المارموسيين هي الحيوانية التي تعتمد علي النظام البصري متطورة للغاية لتوجيه الكثير من سلوكهم10. وعلاوة علي ذلك ، تظهر المارموسيين التعقيد السلوكي ، بما في ذلك مجموعه واسعه من السلوكيات الاجتماعية مثل استخدام النطق المختلفة3، مما يسمح للباحثين لمعالجه الاسئله غير ممكن في الأنواع الأخرى. من منظور [نيوروسكينتيفيك] ، وقد المارموسيين العقول lissenكيفالونيا ، علي عكس ماكاك أكثر شيوعا المستخدمة9. وعلاوة علي ذلك ، المارموسيين لديها الجهاز العصبي المركزي علي غرار البشر ، بما في ذلك القشرة الاماميه أكثر تطورا للغاية9. معا, كل هذه الخصائص وضع المارموسيين كنموذج قيمه لدراسة وظيفة الدماغ في الصحة والمرض.
وهناك طريقه شائعه لدراسة وظيفة المخ تنطوي علي زرع أقطاب كهربائيه في مواقع محدده تشريحيا عن طريق جراحه المخ والأعصاب الفراغية. وهذا يسمح للتسجيل الزمني للنشاط العصبي في المناطق المستهدفة المختلفة في مستيقظا وبحريه التصرف الحيوانية12,13. جراحه الأعصاب الفراغية هي تقنيه لا غني عنها تستخدم في العديد من خطوط البحث ، لأنها تسمح بالاستهداف الدقيق للمناطق العصبية. بالمقارنة مع الأدب المكاك والقوارض ، هناك عدد اقل من الدراسات المنشورة التي تصف جراحه المخ والأعصاب الفراغية الخاصة بالمارموسيت ، وهي تميل إلى تقديم تفاصيل متفرقة عن الخطوات التي تنطوي عليها الجراحة. وعلاوة علي ذلك ، فان أولئك الذين لديهم تفاصيل أكبر تركز أساسا علي إجراءات تسجيل الفيزيولوجيا الكهربية في الماشية المقيدة الراس14و15و16و17.
من أجل تسهيل اعتماد أوسع من المارموسيين ككائن نموذجي في بحوث علوم الأعصاب ، والطريقة الحالية يحدد الخطوات المحددة اللازمة لجراحه الأعصاب المجسمة الناجحة في هذا النوع. بالاضافه إلى غرس صفائف التسجيل ، كما هو مفصل في الطريقة الحالية ، يمكن تكييف نفس التقنية للعديد من الغايات التجريبية الأخرى ، بما في ذلك غرس الأقطاب الكهربائية المحفزة لعلاج الامراض18 أو القيادة السببية دائره السلوك19؛ غرس دليل cannulas لاستخراج والكمية من الناقلات العصبية20، وحقن الكواشف ، بما في ذلك تلك التي للحث علي نماذج المرض12 أو لدراسات تتبع الدوائر15؛ استئصال المناطق النسيجية المنفصلة21؛ غرس من [اوبترودس] ل أوبتوجينيتيك دراسات22; غرس النوافذ البصرية للتحليل المجهري القشري23؛ وغرس صفائف الكتروكورتيغرافي (ECoG)24. التالي ، فان الهدف العام لهذا الاجراء هو تحديد الخطوات الجراحية التي ينطوي عليها غرس صفائف ميكروالكترود للتسجيلات الكهربية الفسيولوجية المزمنة في السلوك الحر للمارموسيتس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت تجارب حيوانيه وفقا لدليل المعاهد الصحية الوطنية لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية ووافقت عليها لجنه الأخلاقيات التابعة لمعهد سانتوس دومونت (البروتوكول 02/2015 العاص).
1. اعداد الجراحة
- نعلق كل صفيف القطب الكهربائي إلى حامل القطب متوافق مع الإطار الفراغي لاستخدامها.
- ربط واحد حامل القطب إلى الجزئية المجسمة وتعيين واحد ميكروواير إلى الإحداثيات البينية. كرر هذا لصفائف القطب اضافيه وأصحاب ، إذا لزم الأمر.
ملاحظه: يمكن استخدام الإحداثي البيني لأي ميكروواير لحساب إحداثيات الغرس للمجموعة بأكملها ، لان المسافة النسبية بين الأسلاك المجهرية ثابته. عندما الصفيف لديه حزم مع أطوال مختلفه ، والتنسيق بين الاذنين من أطول سلك هو الأكثر ملاءمة لاستخدامها لوضع الصفر بين الاذنين. - فصل أصحاب القطب من الجزئي الفراغية وتعقيم الجمعيات (القطب الكهربائي تعلق علي حامل القطب) في الاشعه فوق البنفسجية (الاشعه فوق البنفسجية) مجلس الوزراء لمده لا تقل عن 2 ساعة.
- نعلق ابره 24 G إلى حامل المسبار المجسم ، توصيله إلى الجزئية وتعيين الإحداثيات بين الاذنين لغيض من الابره.
ملاحظه: قبل اجراء العملية الجراحية ، يجب ان تكون الإحداثيات الخاصة بجميع الجمجمات محدده مسبقا كمحيط 200 μm2 أكبر من الموضع الامامي (AP) والوسيط الوسيط (ML) لموقع الغرس المستهدف للمجموعة. استخدام 24 G ابره التحقيق الجمعية حامل لتحديد موقف الجمجمة في جمجمته استنادا إلى الإحداثيات الصفر بين الاذنين. - فصل حامل المسبار من الجزئي وتعقيم الجمعية في مجلس الوزراء الاشعه فوق البنفسجية لمده لا تقل عن 2 ح.
- جمع 6 − 8 مسامير التيتانيوم أو الفولاذ المقاوم للصدا. لحام الأسلاك الارضيه إلى نصفهم.
- تنظيم وتعقيم جميع الاداات والمعدات والمستهلكات المتبقية اللازمة للجراحة.
2-إجراءات ما قبل الجراحة
ملاحظه: تم استخدام اثنين من الذكور البالغين المارموسيين (callithrix jacchus) وزنها 320-370 ز في هذه الدراسة. تاكد من ان الحيوانية لم تؤكل لمده 6 ساعات قبل تحريض التخدير.
- تخدير الحيوانية مع الحقن العضلي من الاتروبين (0.05 ملغم/كغ) للحد من إفراز اللعاب والإفرازات القصبية. التحقق من عدم وجود ردود دواسة.
- بعد 5 دقائق تطبيق الكيتامين (10 − 20 مغ/كغ) عضل.
- حلق راس الحيوانية باستخدام مقص الحلاق الكهربائية.
- أداره ترامادول (2 مغ/كغ) عضل كمسكن عام.
- الحدس الحيواني.
- باستخدام قناع ، وفضح marmoset إلى ايزوفلونان في 1 − 2 ٪ الأكسجين مع معدل تدفق من 1 − 5 لتر/دقيقه للحث علي التخدير العميق. عندما يتم تخدير الحيوانية بعمق ، والحد من والحفاظ علي ايزوفلونان إلى 1 − 3 لتر/دقيقه.
- ارفق شريط مطاطي بالجدول الجراحي
- ضع المارموسيت في وضعيه الضعيف مع الراس نحو الفني وضع الحزام المطاطي في فم المرموسيت خلف الأنياب.
ملاحظه: من الأفضل وضع الراس بحيث يشير السطح الظهري نحو الارضيه ووجهها نحو الفني. - باستخدام مسبار ذو رؤوس قطنية ، تنظف المسحة لسان المارموسيت ، وتمسكه في يد واحده لإبقاء الفم مفتوحا.
- رش 10 ٪ ليدوكائين علي طرف أنبوب الرغامي.
- ادخل أنبوب الرغامي داخل القصبة الهوائية غير المقيد ، والقطر 2.0 ملم إلى الرغامي حتى علامة 4.0 سم عند مدخل القصبة الهوائية.
- نعلق الأنبوب إلى الجمعية التخدير مع الاصطناعي التنفس الصناعي تعيين إلى 40 التنفس/دقيقه وتاكيد التوسع السليم وانكماش الصدر.
ملاحظه: في هذا الوقت يجب ان يتم تسليم الايزوفلونان والأكسجين عبر أنبوب الرغامي ، وليس القناع. - قم بازاله الشريط المطاطي من فم المرموسيت بحيث يمكن تسجيل أنبوب الرغامي في الفك.
- ضع المارموسيت في موضع معرض بما يتماشى مع الإطار الفراغي وأصلح راس الحيوانية في الإطار الفراغي.
- أولا ، ادخل طرف شريط الاذن الأيمن في القناة السمعية اليمني للحيوان.
- بعد ذلك ، ادخل طرف شريط الاذن اليسرى في القناة السمعية اليسرى.
- توسيط راس الحيوانية في مركز الإطار الفراغي وإصلاح قضبان الاذن في المكان.
- ادراج اللسان في فم الحيوانية وضبط ارتفاعه بحيث يلامس الحنك الحيوانية. وفي الوقت نفسه ، ضع القضبان المدارية علي السطح السفلي للعظام المدارية.
- تاكد من محاذاة السطح السفلي للعظام المدارية أفقيا مع وسط قضبان الاذن.
- قم بتوصيل مقياس التاكسج النبض المحمول بيد المارموسيت. ضمان ان معدل ضربات القلب هو داخل 154-180 يدق/دقيقه (bpm) لمده الجراحة. في كثير من الأحيان معدل ضربات القلب فوق 200 bpm يعني الحيوانية هو الاستيقاظ. تاكد من ان تشبع الأكسجين فوق 95%. قد تنخفض أحيانا إلى 90 ٪ دون ضرر.
ملاحظه: يجب انخفاض معدل ضربات القلب أدناه 154 bpm ، وتقليل ايزوفلونان. - وضع مسبار درجه الحرارة المستقيم متصلا لوحه التدفئة هوثرميك في فتحه الشرج ، مع تعيين درجه الحرارة المطلوبة ل 37 درجه مئوية. الشريط هذا الاستشعار إلى الذيل للحفاظ علي انها ثابته في المكان.
- تطبيق زيوت التشحيم العينية معقمه للعيون.
- تنظيف وتطهير راس الحيوانية مع الكلورههيكسيدين واليود البوفيدون قبل تغطيه الحيوانية مع مجال الجراحة.
ملاحظه: تنفيذ جميع الإجراءات الجراحية التالية في ظل ظروف معقمه.
3. إجراءات الجراحة
- تطبيق جلد المسكنات المحلية (علي سبيل المثال ، ليدوكائين 20 ملغ/مل ، 0.1 مل) في موقع الشق المقصود. اجراء شق في الخط الأوسط من فروه الراس.
- فضح واعداد سطح الجمجمة.
- افصل العضلات الصدغية بعناية من الجمجمة. أولا ، استخدم مشرط لقطع اللفافة عند ادراجها في الجمجمة. ثم ، فصل برفق العضلات الصدغية من الجمجمة باستخدام راسباتوري العجان.
- قم بازاله السمحاق من جميع الجمجمة المكشوفة باستخدام راسباتوري التي يتم سرقتها.
- السيطرة علي النزيف مع مسحه قطنية معقمه ، إذا لزم الأمر.
- تنظيف سطح العظم مع بيروكسيد الهيدروجين.
- تحديد موقع بضع القحف بوضع علامات علي زواياها مع ثقوب الحفر الضحلة في سطح العظم. ثم ، حفر خارج محيط الجمجمة باستخدام مثقاب الأسنان باقصي سرعه (اي 350,000 دوره في الدقيقة). أضافه بضع قطرات من المحلول الملحي المعقم علي الجمجمة اثناء الحفر لمنع ارتفاع درجه الحرارة. قياس وضعيه بضع الجمجمة وإحداثيات غرسه القطب الكهربي فيما يتعلق بالإحداثيات البينية.
- زرع مسامير في الجمجمة.
- حفر 6 − 8 ثقوب المسمار في جمجمة.
- زرع مسامير من هذا القبيل ان كل الأسلاك الارضيه تنصهر المسمار هو المتاخمة ل القرب من المسمار دون تغيير (اي ، من غير سلك الأرض المرفقة به).
- الرياح كل الأسلاك الارضيه حول المسمار المجاورة ، دون تغيير.
- أضافه قطره من الطلاء الفضي بين الأسلاك الارضيه وكل برغي.
- أزاله العظم في منتصف بضع القحف باستخدام ملقط مع طرف منحني (علي سبيل المثال ، ملقط ماكفرسون). الحفاظ علي الام الجافية رطب مع المحلول الملحي المعقم.
- أزاله الام الجافية. استخدام ابره معقمه تحت الجلد (25 أو 26 G) مع ثني مائله في حوالي 90 درجه إلى ثقب ورفع سطح الام الجافية بعيدا عن سطح الدماغ. ثم ، قطع الام الجافية مع المقص الصغير. الحفاظ علي الدماغ المكشوفة رطب مع المالحة.
ملاحظه: إذا لوحظ نزيف كبير في الأورال ، استخدم الإسفنج الجيلاتين ماصه أو معقمه العقيمة غارقه في الجلطات25. - زرع صفائف ميكروالكترود.
- نعلق حامل القطب الكهربائي المعقم ومجموعه القطب الكهربي إلى الجزئية الفراغية.
- وضع الجزئي بحيث ان القطب هو في الإحداثيات المرغوبة الامامي والمتوسط.
- خفض مصفوفة القطب الكهربي حتى يلامس طرف أطول حزمه سطح الدماغ.
- ادخل المصفوفة ببطء في نسيج المخ حتى تصل إلى الإحداثيات البطنية.
- غطي القشرة المكشوفة بقطع صغيره من إسفنجات الجيلاتين المعقمة والماصة.
- تامين القطب إلى الجمجمة عن طريق تطبيق الأكريليك الأسنان إلى الجمجمة المكشوفة ، برغي واحد ، والقطب.
- فصل حامل القطب وأزاله من الجزئي.
- كرر اجراء الغرس من الخطوة 3.7 مع صفائف اضافيه ، إذا لزم الأمر.
- الرياح معا ولحام الأسلاك الارضيه من صفائف منفصلة ومسامير. استخدام الطلاء الفضي لتشكيل جسر حول لحام لضمان تم تحقيق اتصال كهربائي.
- باستخدام الأكريليك الأسنان ، وجعل headcap قوي حول المدى الجانبي للصفائف ، والحالة تماما الأسلاك الارضيه وأي الجمجمة المكشوفة ومسامير.
- إذا لزم الأمر ، قم بادراج شريط دعم في الغطاء الامامي. وهذا يمكن ان يكون اسطوانه بلاستيكية قوي مثل تلك من مسحه القطن. ختمها في مكان مع الأكريليك الأسنان.
ملاحظه: هذا يمكن ان يكون مفيدا في تامين موصلات الكابلات الكهربية في مكان ولكن قد تكون غير ضرورية اعتمادا علي المعدات المستخدمة. في الطريقة الحالية ، يتم لصق قضيب دعم مماثل للمرحلة الرئيسية بحيث يمكن للفرقة المطاطية ان تحمل بقوة مراحل الراس في مكانها علي الموصلات. - خياطه الجلد حول راس الغطاء.
4. الانتعاش بعد العملية الجراحية
- تطبيق محلول مطهر (علي سبيل المثال ، الكلوركهيكسيدين) حول الجرح.
- إيقاف العرض ايزوفلواني ولكن ليس الأكسجين وأزاله الحيوانية من الإطار الفراغي.
- وضع الحيوانية علي وساده التدفئة مع الأكسجين الحفاظ عليها من خلال أنبوب داخل الرغامي.
- قم بازاله الأنبوب الرغامي عند ظهور العلامات الاولي لردود الفعل العصبية ، مثل البلعوم الحنجرة.
- الحفاظ علي تزويد الأكسجين مع قناع حتى الحيوانية يقدم علامات واضحة من الانتعاش مخدر ، مثل ردود الفعل الوقائية ، لهجة الوضعي ، ومحاولات لأمبول.
- وضع الحيوانية داخل قفص نظيف في غرفه الانتعاش ل 24 − 48 ح قبل نقل الحيوانية إلى قفص منزلها. منزل كل زرع الحيوانية بشكل فردي.
ملاحظه: لان المارموسيين تميل إلى تسلق الجدران القفص ، واستخدام قفص مع الجدران الملساء أو تغطيه الجدران القفص مع سطح أملس لمنع الحيوانية من السقوط. - في الساعة الاولي بعد الجراحة ، ومراقبه الحيوانية لمشاهده علامات الاستغاثة أو غير منسقه الاتصال الراس ضد الجانب من القفص.
- أداره المضادات الحيوية (علي سبيل المثال ، اينروفلوكساسين 5 مغ/كغ ، جلد ، مره واحده في اليوم لمده 5 − 7 أيام) ، المسكنات (علي سبيل المثال ، ترامادول الفموي 1 ملغم/كغ ، كل 8 ساعات لمده 3 − 5 أيام) والادويه المضادة للالتهابات (مثل ديكساميثازون .
ملاحظه: بعد عمليه جراحيه ناجحه ، سيتم استرداد الماشية بالبالكامل في غضون 3 − 5 أيام.
5. التسجيلات الكهربائية الفسيولوجية المزمنة في التصرف بحريه المارموسيين
- بدء جلسات تسجيل الفسيولوجية الكهربائية علي الأقل 1 أسبوع بعد الجراحة.
ملاحظه: Habituate الحيوانية إلى الباحث والبيئات التجريبية قبل البدء في جميع الإجراءات التجريبية لمده شهر علي الأقل 1. - في بداية كل دوره ، تخدير طفيفه الحيوانية باستخدام ايزوفلوان (1 − 5 لتر/دقيقه ، 1 ٪ O2).
ملاحظه: اتبع الإرشادات الخاصة بالمؤسسة ذات الصلة فيما يتعلق بتخدير الرئيسيات الصغيرات. إذا كانت جلسات التسجيل متكررة جدا ، فانه يتم التعامل مع الماشية بحيث يمكن توصيل الكابلات بدون تخدير. - توصيل صفائف القطب إلى نظام تسجيل العصبية التجارية.
- وضع الحيوانية داخل الغرفة التجريبية.
ملاحظه: الغرفة التجريبية المستخدمة هنا هو مربع الأكريليك مكعب (0.45 m x 0.45 m x 0.45 m) مصممه لتقييم كميه ونمط النشاط الحركي العفوي26,27. - الانتظار لمده 30 دقيقه قبل البدء في التسجيلات لضمان استرداد الحيوانية تماما من التخدير.
ملاحظه: ايزوفلواني لديه بداية سريعة والعمل تعويض الذي يسمح للتخدير السريع والصحوة28. بمجرد ان يتم إيقاف تشغيل العرض ايزوفلواني ، سيبدا الحيوانية في الاستيقاظ. الحيوانية مستيقظا عندما يبقي في وضع تستقيم ويمكن ان أمبول بحريه في الغرفة التجريبية دون الوقوع. هذا يستغرق اقل من 15 دقيقه. لضمان عدم وجود اي اثار مهدئه ، تبدا التسجيلات 30 دقيقه بعد توقف ايزوفلونان. - تاكيد موقف القطب المجهري يزرع زرع بعد الوفاة بواسطة تلطيخ NISSL بعد تحديد والتماس الانسجه29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان الغرض من هذه الدراسة لوصف اجراء الجراحة العصبية الفراغية لغرس صفائف ميكروالكترود للتسجيلات الفسيولوجية الكهربائية في marmoset المشتركة. والجراحة النموذجية (من الحث التخدير للشفاء التخدير) تستمر لحوالي 5 − 7 ساعة ، اعتمادا علي عدد من صفائف مزروع. هنا ، تم زرع صفائف اثنين بشكل متناظر ، واحد في كل نصف الكره الدماغ. كل مجموعه تحتوي علي 32 الفولاذ المقاوم للصدا الأسلاك الدقيقة المرتبة في سبع حزم تستهدف عده هياكل من حلبه العقدة القاعدية-corticothalamic (الشكل 1) ، ولكن تصميم القطب والمناطق الدماغ المستهدفة قد تختلف تبعا التجربه. بعد الجراحة الناجحة وإجراءات ما بعد العملية الجراحية ، يجب استرداد الحيوانية بالبالكامل في غضون 3 − 5 أيام. إذا تم الاستناد إلى الصفيف وزرعها بشكل صحيح سيكون من الممكن لتسجيل المسامير (الشكل 2A) وإمكانات الحقل المحلي (الشكل 2 ب) في السلوك الحر الحيوانية علي مدي عده أسابيع أو أشهر ، قبل ان يتم إنشاء ندبه الناضجة التي يتم إنشاؤها 13و30. وعلي سبيل المثال ، فان البيانات الكهربائية الفسيولوجية التي تم جمعها في النموذج التجريبي الموصوف هنا قد استخدمت بفعالية لدراسة النشاط المتزامن للمناطق المختلفة من حلبه العقدة القاعدية-كورتيثاليتاميك خلال العفوية ، الارضيه الحركة في نموذج من مرض باركنسون26.
وأخيرا ، تنطوي الجراحة الناجحة أيضا علي غرس المصفوفات في الهياكل المستهدفة. ويمكن اجراء منهجيات التصوير غير الغازية ، مثل الرنين المغناطيسي أو الاشعه المقطعية بعد الجراحة وقبل بدء التسجيلات التجريبية. ولن يكون استخدام هذه المنهجية ممكنا الا إذا تم تصنيع الحشوات الخاصة المستخدمة لتكون متوافقة مع هذه التقنيات ، وإذا كان الباحث قادرا علي الوصول إلى المعدات الحيوانية الصغيرة المناسبة. كما يمكن اجراء التاكيد النهائي بعد الوفاة. ويمكن استخدام المقاطع الملونة nissl التي تحتوي علي مسارات القطب لتحديد بدقه موقف كل ميكروواير مزروع (الشكل 3). لاحظ ان المسارات القطب في المقاطع الاكليليه تظهر كما الدموع في الانسجه. التالي يجب استخدام العناية الفائقة عند تنفيذ العملية لتقليل فرصه إنشاء التحف التي من شانها ان نخلط التفسير.
الشكل 1: مصفوفة ميكروالكترود لغرسها في الرئيسيات الصغيرة. وتتالف مجموعه من 32 الفولاذ المقاوم للصدا ميكرواسلاك. وكانت الأسلاك 50 ميكرومتر في القطر ونظمت في سبع حزم تهدف إلى الوصول إلى المجالات التالية: القشرة المحرك الاوليه (M1) ، وبوتامين (وضع) ، مذنب (Cd) ، جلوبوس المسكنات (gpe) ، والجانبية الافقيه والجانبية الثلاثية المهاد (vpl) ، و نواه تحت المهاد ([ستن]). وكان التباعد بين الأقطاب في كل حزمه 300 μm. التباعد بين الحزمة يعتمد علي إحداثيات الهدف لكل منطقه الدماغ. ويمكن الاطلاع علي مزيد من المعلومات التفصيلية حول تصميم صفيف القطب المجهري والتصنيع في Nicolelis31, ليهيف و nicolelis32, و dizirasa et al.33. شريط مقياس = 5 ملم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتيجة الكهربية التمثيلية بعد عمليه جراحيه ناجحه. اللوحة اليسرى تظهر النشاط سبايك من اثنين من الخلايا العصبية (الأصفر والأخضر الموجي) المسجلة من قطب واحد. تظهر اللوحة اليمني تذبذبات محتمله للحقل المحلي مسجله من 14 قطبا كهربائيا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: قسم الانسجه الملونة Nissl مما يدل علي مسار القطب الكهربائي. هذا القسم (الإحداثي الامامي ، بالنسبة للخط البيني: + 8.0 ، وفقا لأطلس بواسطة Paxinos و Watson34) يصور مسار قطبي مع الطرف في Putamen ، كما هو مبين في المثلث الأسود. شريط مقياس = 1 ملم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويقدم هذا العمل وصفا مفصلا للإجراءات التي ينطوي عليها غرس صفائف تسجيل القطب المجهري في الدماغ marmoset. ويمكن استخدام هذا البروتوكول نفسه بسهوله عند غرس الأقطاب الكهربائية ، سواء كانت محليه الصنع أو متاحه تجاريا ، في الرئيسيات الصغيرة الأخرى. بالاضافه إلى ذلك ، فانه يمكن تكييفها بسهوله لغايات التجريبية الأخرى التي تتطلب استهداف دقيق للهياكل الدماغ. ولذلك ، فان هذا البروتوكول غامض بقصد فيما يتعلق بالإحداثيات الفراغية وتقنيات حفر الجمجمة ، لان تلك هي الجوانب التي قد تختلف أكثر من غيرها. علي سبيل المثال ، لزرع المصفوفات المستخدمة في هذه الجراحة ، تم تنفيذ الجمجمة لفتح إطارين بحجم مناسب في كل نصف الكره الارضيه. ومع ذلك ، عند زرع قوي ، والهياكل الفردية ، مثل الدليل cannulas ، لا هذا ولا استئصال المبيض ضروري. بدلا من ذلك ، فان ثقب لدغ بسيطه لمستوي الجافية يكفي. المثل ، عندما يتم اشراك يزرع غير الكهربائية فانه ليس من الضروري لمسامير ان ترتكز. التالي ، يمكن حذف الخطوة 3.9 في البروتوكول الجراحي. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأكريليك الأسنان لتغطيه ببساطه الجمجمة المكشوفة ، وزرع ، ومسامير.
بغض النظر عن الهدف التجريبي المحدد لجراحه المخ والأعصاب الفراغية ، فان التنفيذ الناجح للاجراء المعطي يدور إلى حد كبير حول الممارسات الجراحية الجيدة. وهذا يعني انه يجب اتباع بروتوكولات صارمة لاجراء الجراحة في ظل ظروف معقمه من أجل منع العدوى بعد العملية الجراحية35. بعض من اللحظات الأكثر اهميه هي حمل وأزاله التخدير. ولذلك فمن الضروري ان يتم رصد العلامات الحيوية للحيوان (معدل ضربات القلب ، وتشبع الأكسجين في الدم ، ودرجه حرارة الجسم) طوال العملية الجراحية36بأكملها. إذا حدث انخفاض في معدل ضربات القلب مع انخفاض متزامن في تشبع الأكسجين ، تاكد من ان الصدر هو تضخيم وانكماش عاده ، والا فان الاتصال إلى اله التنفس قد يكون علي خطا. الشيء الأول الذي يمكن القيام به لمحاولة استرداد معدل ضربات القلب وتشبع الأكسجين هو تقليل تركيز ايزوفلواني. إذا كان هذا لا يحل المشكلة ، قد تدار الاتروبين عضل لزيادة معدل ضربات القلب ومحاولة لتحقيق الاستقرار في الحيوانية. يجب ان يتم ذلك بحذر شديد ، لان التجربة السابقة تبين ان معدل ضربات القلب فوق 200 في الف بدون ايزوفلواني كافيه سوف توقظ الحيوانية.
علي عكس القوارض ، في الرئيسيات يتم قياس جميع الإحداثيات عاده بالنسبة للتنسيق بين الاذنين ، وليس bregma و لأمدا34. ولذلك ، فمن المهم لقياس الإحداثيات الصفر بين الاذنين من صفائف القطب وغيرها من التحقيقات قبل تحديد راس الحيوانية في جهاز ستريو. وعلاوة علي ذلك ، في المارموسيين يتم تعريف الطائرة الافقيه بأنها الطائرة التي تمر عبر الهامش السفلي من العظام المدارية ومركز meatus السمعية الخارجية. التالي ، من المهم محاذاة السطح السفلي للعظام المدارية مع مركز قضبان الاذن قبل إصلاح الراس في الإطار الفراغي. وعلاوة علي ذلك ، فان العضلات الصدغية للمرموشيه تغطي مساحة واسعه من الجمجمة. التالي ، تتطلب العديد من الأهداف العصبية الجمجمة التي يمكن أداؤها تحت أو علي مقربه جدا من هذه العضلات. لان هذه العضلات مهمة للاتصالات marmoset38, يجب علي الجراح فصل ببطء وبعناية هذه العضلات من جمجمة للتقليل من الضرر.
يجب ان يكون الباحثون المطلعون علي الاعمال السلوكية التي تنطوي علي القوارض أو المارموسيتس علي بينه من العديد من القيود عند أداء الفيزيولوجيا الكهربية في التصرف الحر NHPs. أولا ، في الترتيب الحالي والآخرين التي تنطوي علي صفائف عاليه الكثافة أو صفائف متعددة ، فمن المرجح ان يحفز التخدير الخفيف سيكون مطلوبا لإرفاق موصلات الكابل ، حتى بعد التعود المناسبة. وفي حين ان هذا الاجراء يندرج ضمن نطاق المبادئ التوجيهية التنظيمية لمعاهد القومية للصحة والبلدان الأخرى ، فانه ينبغي القيام به باعتدال للحد من الإجهاد الذهني والبدني الذي يمارس علي المارموسيت. وعلاوة علي ذلك ، من الاهميه بمكان ان يضمن الباحث الشفاء التام للحيوان من التخدير قبل البدء في اكتساب البيانات ، والا فان التخدير قد يثبت البيانات39. ومن القيود الأخرى ذات الصلة الوجود المادي للكابل نفسه. في حين أصبحت حلول التسجيل لاسلكي متاحه40، فان الخيارات السلكية الأكثر شيوعا تفرض قيودا ماديه علي الحيوانية. وأخيرا ، فان الغرفة التجريبية التي يجري استخدامها أيضا تقييد مجموعه من السلوكيات المتاحة ل marmoset. وعلي عكس القوارض ، تعرض المارموسيتس سلوكيات فريدة (مثل التسلق) لن تكون ممكنة اعتمادا علي الغرفة التجريبية المستخدمة.
التقدم في علوم المواد والهندسة تؤدي إلى الواجات العصبية رواية41. ومن شان إجراءات الجراحة العصبية الفعالة ، مثل العملية الموصوفة في هذه المخطوطة ، ان تسمح للباحثين بتنفيذ هذه الاداات الجديدة والمقبلة في المارموسيتس. مع التطورات المتزامنة في البيولوجيا الجزيئية3،4،5، المارموسيين لديها القدرة علي السماح بالتحقيق في الاسئله الاساسيه والسريرية الهامه في علم الأعصاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا برناردو لويز علي المساعدة التقنية في التصوير والتحرير. وقد دعم هذا العمل معهد سانتوس دومونت (ISD) ، ووزارة التعليم البرازيلية (MEC) وCoordenação دي ابيرفيتشونتو دي بيساك دي نيفل المتفوقة (الرؤوس).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| 683 Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | 55-0000 | |
| Anesthesia Assembly | BRASMED | COLIBRI | |
| Barber Clippers | Mundial | HC-SERIES | |
| Dental Drill | Norgen | B07-201-M1KG | |
| Homeothermic Heating Pad and Monitor | Harvard Apparatus, Inc. | 50-7212 | |
| Marmoset Stereotaxic Frame | Narishige Scientific Instrument Lab | SR-6C-HT | |
| Patient Monitor and Pulse Oximeter | Bionet Co., Ltd | BM3 | |
| Stereotaxic Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | SM-15R | |
| Surgical Microscope | Opto | SM PLUS IBZ | |
| Instruments | |||
| Allis tissue forceps | Sklar | 36-2275 | |
| Alm Retractor, rounded point, 4x4 teeth | Rhosse | RH11078 | |
| Angled McPherson Forceps | Oftalmologiabr | 11301A | |
| Curved Surgial Scissors | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8422 | |
| Curved Tissue Forceps | Sklar | 47-1186 | |
| Delicate Dissection forceps | WPI | WP5015 | |
| Dental Drill Bit | Microdont | ISO.806.314.001.524.010 | |
| Essring Tissue Forceps | Sklar | 19-2460 | |
| FG 1/4 Dental Drill Bit | Microdont | ISO.700.314.001.006.005 | |
| Halsey Needle Holder | WPI | 15926-G | |
| Halstead Mosquito forceps | WPI | 503724-12 | |
| Hemostatic Forceps, Straight | Sklar | 17-1260 | |
| Jewler Forceps | Sklar | 66-7436 | |
| McPherson-Vannas Optathalmic microscissor, 3 mm point | Argos Instrumental | ARGOS-4004 | |
| Pereosteal Raspatory | Golgran | 38-1 | |
| Scalpal Handle | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8354 | |
| Screwdrivers | Eurotool | SCR-830.00 | |
| Sodering Iron | Hikari | 21K006 | |
| Surgical Scissor | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8400 | |
| Toothed forceps | WPI | 501266-G | |
| Disposables/Single Use | |||
| 1 ml sterile syringe with 26 G needle | Descarpack | 7898283812785 | |
| 130 cm x 140 cm surgical field, presterilized | ProtDesc | 7898467276344 | |
| 24G Needle, presterilized | Descarpack | 7898283812846 | |
| 50 cm x 50 cm surgical field, presterilized | Esterili-med | 110100236 | |
| Cotton Tipped Probes, Presterilized | Jiangsu Suyun Medical Materials Co. LTD | 23007 | |
| Cotton tipped Qutips | Higie Topp | 7898095296063 | |
| Electrode Array | Home made | ||
| Endotracheal tube without cuff, internal diameter 2.0 mm, outer diameter 2.9 mm | Solidor | 7898913077201 | |
| Tinned copper wire, 0.15 mm diameter | |||
| M1.4x3 Stainless steel screws | USMICROSCREW | M14-30M-SS-P | |
| Medical Tape | Missner | 7896544910102 | |
| Nylon surgical sutures | Shalon | N540CTI25 | |
| Scalpal Blade, presterilized | AdvantiVe | 1037 | |
| solder | Kester | SN63PB37 | |
| Sterile Saline 0.9% | Isofarma | 7898361700041 | |
| Sterile Surgical Gloves | Maxitex | 7898949349051 | |
| Sterile Surgical Gown | ProtDesc | 7898467281208 | |
| Surgical Gauze, 15 cm x 26 cm presterilized | Héika | 7898488470315 | |
| Gelfoam | Pfizer | ||
| Drugs/Chemicals | |||
| 0.25mg/ml Atropine | Isofarma | ||
| 10% Lidocaine Spray | Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda. | 7896676405644 | |
| 2.5% Enrofloxacino veterinary antibiotic | Chemitec | 0137-02 | |
| Dexametasona Veterinary Anti inflammatory | MSD | R06177091A-00-15 | |
| Hydrogen Peroxide | Farmax | 7896902211537 | |
| Isoflourane | BioChimico | 7897406113068 | |
| Jet Acrylic polymerization solution | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Jet Auto Polymerizing Acrylic | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Ketamine 10% | Syntec | ||
| Lidocaine and Phenylephrine 1.8 ml local anesthetic | SS White | 7892525041049 | |
| Povidone-Iodine solutiom | Farmax | 7896902234093 | |
| Riohex 2% surgical Soap | Rioquímica | 7897780209418 | |
| Silver Paint | SPI Supplies | 05002-AB | |
| Tramadol chloride 50 mg/ml | União Química | 7896006245452 | |
| Refresh gel (polyacrylic acid) | Allergan |
References
- Okano, H., Hikishima, K., Iriki, A., Sasaki, E. The common marmoset as a novel animal model system for biomedical and neuroscience research applications. Seminars in Fetal and Neonatal Medicine. 17 (6), 336-340 (2012).
- Harris, R. A., et al. Evolutionary genetics and implications of small size and twinning in callitrichine primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (4), 1467-1472 (2014).
- Kishi, N., Sato, K., Sasaki, E., Okano, H. Common marmoset as a new model animal for neuroscience research and genome editing technology. Development, Growth & Differentiation. 56 (1), 53-62 (2014).
- Sasaki, E. Prospects for genetically modified non-human primate models, including the common marmoset. Neuroscience Research. 93, 110-115 (2015).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Sasaki, E. Creating Genetically Modified Marmosets. The Common Marmoset in Captivity and Biomedical Research. , 335-353 (2019).
- Sato, K., et al. Generation of a Nonhuman Primate Model of Severe Combined Immunodeficiency Using Highly Efficient Genome Editing. Cell Stem Cell. 19 (1), 127-138 (2016).
- Sato, K., et al. Resequencing of the common marmoset genome improves genome assemblies and gene-coding sequence analysis. Scientific Reports. 5, 16894 (2015).
- Chaplin, T. A., Yu, H. H., Soares, J. G. M., Gattass, R., Rosa, M. G. P. A Conserved Pattern of Differential Expansion of Cortical Areas in Simian Primates. Journal of Neuroscience. 33 (38), 15120-15125 (2013).
- Mitchell, J. F., Leopold, D. A. The marmoset monkey as a model for visual neuroscience. Neuroscience Research. 93, 20-46 (2015).
- Brok, H. P. M., et al. Non-human primate models of multiple sclerosis: Non-human primate models of MS. Immunological Reviews. 183 (1), 173-185 (2001).
- Santana, M. B., et al. Spinal Cord Stimulation Alleviates Motor Deficits in a Primate Model of Parkinson's disease. Neuron. 84 (4), 716-722 (2014).
- Ribeiro, M., Santana, M. B., Araujo, M. Neuronal signal description after chronic stainless-steel microelectrode array implants in marmosets. , Available from: http://www.canal6.com.br/cbeb/2014/artigos/cbeb2014_submission_766.pdf (2014).
- MacDougall, M., et al. Optogenetic manipulation of neural circuits in awake marmosets. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1286-1294 (2016).
- Wakabayashi, M., et al. Development of stereotaxic recording system for awake marmosets (Callithrix jacchus). Neuroscience Research. 135, 37-45 (2018).
- Johnston, K. D., Barker, K., Schaeffer, L., Schaeffer, D., Everling, S. Methods for chair restraint and training of the common marmoset on oculomotor tasks. Journal of Neurophysiology. 119 (5), 1636-1646 (2018).
- Sedaghat-Nejad, E., et al. Behavioral training of marmosets and electrophysiological recording from the cerebellum. Journal of Neurophysiology. , (2019).
- Kringelbach, M. L., Owen, S. L., Aziz, T. Z. Deep-brain stimulation. Future Neurology. 2 (6), 633-646 (2007).
- Talakoub, O., Gomez Palacio Schjetnan, A., Valiante, T. A., Popovic, M. R., Hoffman, K. L. Closed-Loop Interruption of Hippocampal Ripples through Fornix Stimulation in the Non-Human Primate. Brain Stimulation. 9 (6), 911-918 (2016).
- Oddo, M., Hutchinson, P. J. Understanding and monitoring brain injury: the role of cerebral microdialysis. Intensive Care Medicine. 44 (11), 1945-1948 (2018).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical Deconstruction of Parkinsonian Neural Circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
- Hammer, D. X., et al. Longitudinal vascular dynamics following cranial window and electrode implantation measured with speckle variance optical coherence angiography. Biomedical Optics Express. 5 (8), 2823-2836 (2014).
- Komatsu, M., Kaneko, T., Okano, H., Ichinohe, N. Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Surgical Techniques for Chronic Implantation of Microwire Arrays in Rodents and Primates. , CRC Press/Taylor & Francis. (2008).
- Santana, M. B., et al. Spinal Cord Stimulation Alleviates Motor Deficits in a Primate Model of Parkinson's disease. Neuron. 84 (4), 716-722 (2014).
- Santana, M., Palmér, T., Simplício, H., Fuentes, R., Petersson, P. Characterization of long-term motor deficits in the 6-OHDA model of Parkinson's disease in the common marmoset. Behavioural Brain Research. 290, 90-101 (2015).
- Misra, S., Koshy, T. A review of the practice of sedation with inhalational anaesthetics in the intensive care unit with the AnaConDa device. Indian Journal of Anaesthesia. 56 (6), 518-523 (2012).
- Freire, M. A. M., et al. Distribution and Morphology of Calcium-Binding Proteins Immunoreactive Neurons following Chronic Tungsten Multielectrode Implants. PLOS ONE. 10 (6), 0130354 (2015).
- Budoff, S., et al. Astrocytic Response to Acutely- and Chronically Implanted Microelectrode Arrays in the Marmoset (Callithrix jacchus) Brain. Brain Sciences. 9 (2), 19 (2019).
- Dzirasa, K., Fuentes, R., Kumar, S., Potes, J. M., Nicolelis, M. A. L. Chronic in vivo multi-circuit neurophysiological recordings in mice. Journal of Neuroscience Methods. 195 (1), 36-46 (2011).
- Nicolelis, M. A. L., et al. Chronic, multisite, multielectrode recordings in macaque monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 11041-11046 (2003).
- Lehew, G., Nicolelis, M. A. L. State-of-the-Art Microwire Array Design for Chronic Neural Recordings in Behaving Animals. , CRC Press/Taylor & Francis. (2008).
- Paxinos, G., Watson, C., Petrides, M., Rosa, M., Tokuno, H. The Marmoset Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Science Publishing Co Inc. San Diego. (2012).
- Brown, M. J., Pearson, P. T., Tomson, F. N. Guidelines for animal surgery in research and teaching. American Journal of Veterinary Research. 54 (9), 1544-1559 (1993).
- Flecknell, P. A. Anaesthesia of Animals for Biomedical Research. British Journal of Anaesthesia. 71 (6), 885-894 (1993).
- Kurihara, S., et al. A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset (Callithrix jacchus). Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Boer, R. A., de Vries, A. M. O., Louwerse, A. L., Sterck, E. H. M. The behavioral context of visual displays in common marmosets (Callithrix jacchus). American Journal of Primatology. 75 (11), 1084-1095 (2013).
- Kudo, C., Nozari, A., Moskowitz, M. A., Ayata, C. The impact of anesthetics and hyperoxia on cortical spreading depression. Experimental Neurology. 212 (1), 201-206 (2008).
- Ghomashchi, A., et al. A low-cost, open-source, wireless electrophysiology system. 2014 36th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 3138-3141 (2014).
- Fu, T. M., Hong, G., Viveros, R. D., Zhou, T., Lieber, C. M. Highly scalable multichannel mesh electronics for stable chronic brain electrophysiology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), 10046-10055 (2017).
