Summary
Questo lavoro presenta un protocollo per eseguire un impianto stereotassico e neurochirurgico di array di microelettrodi nel comune marmoset. Questo metodo consente specificamente registrazioni elettrofisiologiche in animali che si comportano liberamente, ma può essere facilmente adattato a qualsiasi altro intervento neurochirurgico simile in questa specie (ad esempio, cannula per la somministrazione di farmaci o elettrodi per la stimolazione cerebrale).
Abstract
I marmoset (Callithrix jacchus) sono piccoli primati non umani che stanno guadagnando popolarità nella ricerca biomedica e preclinica, comprese le neuroscienze. Filogeneticamente, questi animali sono molto più vicini agli esseri umani dei roditori. Mostrano anche comportamenti complessi, tra cui una vasta gamma di vocalizzazioni e interazioni sociali. Qui, viene descritta un'efficace procedura neurochirurgica stereotassica per l'impianto di array di elettrodi di registrazione nel marmoset comune. Questo protocollo descrive anche i passaggi pre e postoperatori della cura degli animali che sono necessari per eseguire con successo tale intervento chirurgico. Infine, questo protocollo mostra un esempio di potenziale sul campo locale e registrazioni di attività di picco in una marmoset liberamente comandata 1 settimana dopo la procedura chirurgica. Nel complesso, questo metodo offre l'opportunità di studiare la funzione cerebrale in marmoset svegli e liberamente comportandosi. Lo stesso protocollo può essere facilmente utilizzato dai ricercatori che lavorano con altri piccoli primati. Inoltre, può essere facilmente modificato per consentire altri studi che richiedono impianti, come elettrodi stimolanti, microiniezioni, impianto di optrodes o cannula guida, o ablazione di regioni tissutali discrete.
Introduction
Marmoset comuni (Callithrix jacchus) stanno guadagnando il riconoscimento come un importante organismo modello in molti campi della ricerca, tra cui le neuroscienze. Questi primati del nuovo mondo rappresentano un importante modello animale complementare sia per i roditori che per altri primati non umani (NHP), come il macaco di rhesus. Come i roditori, questi animali sono piccoli, facili da manipolare e relativamente economici da curare e allevare1,2,3,4, rispetto ai NHP più grandi. Inoltre, questi animali hanno una propensione per il gemellaggio e l'elevata fecondità rispetto ad altri NHP1,2,3. Un altro vantaggio che il marmoset ha rispetto a molti altri primati è che i moderni strumenti di biologia molecolare3,4,5,6,7 e un genoma sequenziato2 ,3,4,5,8 sono stati utilizzati per modificarli geneticamente. Entrambi gli animali knock-in che utilizzano il lentivirus5, e gli animali knock-out utilizzando nucleasi zinco-dito (FN) e trascrizione attivatore-come nucleases (TALENS)7, hanno prodotto animali fondatori vitali.
Un vantaggio in relazione ai roditori è che i marmoset, come primati, sono filogeneticamente più vicini agli esseri umani3,5,6,9,10,11. Come gli esseri umani, le marmotte sono animali diurni che dipendono da un sistema visivo altamente sviluppato per guidare gran parte del loro comportamento10. Inoltre, le marmotte presentano complessità comportamentale, tra cui una vasta gamma di comportamenti sociali come l'uso di diverse vocalizzazioni3, consentendo ai ricercatori di affrontare questioni non possibili in altre specie. Da un punto di vista neuroscientifico, le marmotte hanno cervelli lissencefalia, a differenza del macaco rhesus9 piùcomunemente usato. Inoltre, le marmotte hanno un sistema nervoso centrale simile agli esseri umani, tra cui una corteccia prefrontale9più sviluppata. Insieme, tutte queste caratteristiche posizionano le marmotte come un modello prezioso per studiare la funzione cerebrale in salute e malattia.
Un metodo comune per studiare la funzione cerebrale consiste nell'impiantare elettrodi in posizioni specifiche anatomicamente per mezzo di neurochirurgia stereotassica. Questo permette la registrazione cronica dell'attività neurale in diverse aree bersaglio in animali svegli e liberamente comportanti12,13. La neurochirurgia stereotassica è una tecnica indispensabile utilizzata in molte linee di ricerca, in quanto consente un targeting preciso delle regioni neuroanatomiche. Rispetto alla letteratura macaca e roditore, ci sono meno studi pubblicati che descrivono la neurochirurgia stereotassica specifica per il marmoset, e tendono a fornire dettagli sparse dei passaggi coinvolti nell'intervento chirurgico. Inoltre, coloro che hanno maggiori dettagli si concentrano principalmente sulle procedure per la registrazione elettrofisiologica in animali a testa limitata14,15,16,17.
Al fine di facilitare una più ampia adozione delle marmotte come organismo modello nella ricerca sulle neuroscienze, il metodo attuale definisce i passaggi specifici necessari per una neurochirurgia stereotassica di successo in questa specie. Oltre all'impianto di array di registrazione, come descritto nel presente metodo, la stessa tecnica può essere adattata per molti altri scopi sperimentali, compreso l'impianto di elettrodi stimolanti per il trattamento delle malattie18 o la guida causale comportamento del circuito19; l'impianto di cannule guida per l'estrazione e la quantificazione dei neurotrasmettitori20, iniezioni di reagenti, compresi quelli perl'induzione di modelli di malattia 12 o per studi di tracciamento del circuito15; ablazione di regioni tissutali discrete21; impianto di optrodes per studi optogenetici22; impianto di finestre ottiche per l'analisi microscopica corticale23; e l'impianto di array elettrocorticografici (ECoG)24. Pertanto, l'obiettivo generale di questa procedura è quello di delineare i passaggi chirurgici coinvolti nell'impianto di array di microelettrodi per registrazioni elettrofisiologiche croniche in marmoset che si comportano liberamente.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati in conformità con il National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e approvati dal Santos Dumont Institute Ethics Committee (protocollo 02/2015AAS).
1. Preparazione chirurgia
- Fissare ogni array di elettrodi a un supporto per elettrodi compatibile con il telaio stereotassico da utilizzare.
- Collegare un supporto per elettrodi al micromanipolatore stereotassico e impostare un microfilo alle coordinate interaurali. Ripetere questa operazione per gli array e i supporti di elettrodi aggiuntivi, se necessario.
NOTA: La coordinata interaurale di qualsiasi microfilo può essere utilizzata per calcolare le coordinate di impianto per l'intero array, poiché la distanza relativa tra i microfili è costante. Quando l'array ha fasci con lunghezze diverse, la coordinata interaurale del filo più lungo è la più comoda da usare per impostare lo zero interaurale. - Staccare i supporti dell'elettrodo dal micromanipolatore stereotassico e sterilizzare gli assiemi (elettrodo attaccato al supporto dell'elettrodo) in un armadietto di luce ultravioletta (UV) per almeno 2 h.
- Attaccare un ago da 24 G a un supporto della sonda stereotassico, collegarlo al micromanipolatore e impostare le coordinate interaurali per la punta dell'ago.
NOTA: Prima dell'intervento, le coordinate di tutte le craniotomie devono essere predefinite come un perimetro di 200 m2 più grande della posizione anteroposteriore (AP) e mediolaterale (ML) del sito di impianto di destinazione dell'array. Utilizzare l'assieme del supporto della sonda ad ago da 24 G per determinare la posizione delle craniotomie nel cranio in base alle coordinate zero. - Staccare il supporto della sonda dal micromanipolatore e sterilizzare l'assieme in un armadio UV per almeno 2 h.
- Raccogli viti in titanio o in acciaio inossidabile. Solder un filo di terra a metà di loro.
- Organizzare e sterilizzare tutti gli strumenti, le attrezzature e gli usa e getta rimanenti necessari per l'intervento chirurgico.
2. Procedure di preoperatoria
NOTA: in questo studio sono state utilizzate due marmoset maschi adulti (Callithrix jacchus) del peso di 320-370 g. Assicurarsi che l'animale non abbia mangiato per 6 h prima dell'induzione dell'anestesia.
- Anestetizzare l'animale con un'iniezione intramuscolare di atropina (0,05 mg/kg) per ridurre la salivazione e le secrezioni bronchiali. Verificare la mancanza di risposte ai pedali.
- Dopo 5 min applicare la chetamina (10-20 mg/kg) per via intramuscolare.
- Rasa la testa dell'animale usando un tagliabarista elettrico.
- Somministrare il tramadolo (2 mg/kg) per via intramuscolare come analgesico generale.
- Intubare l'animale.
- Usando una maschera, esponi il marmoset all'isoflurane con ossigeno dell'1%2% con una portata di 1/5 L/min per indurre l'anestesia profonda. Quando l'animale è profondamente anetizzato, ridurre e mantenere l'isoflurane a 1/3 L/min.
- Fissare un elastico al tavolo chirurgico con del nastro adesivo.
- Posizionare il marmoset in una posizione supina con la testa verso il tecnico e posizionare l'elastico nella bocca del marmoset dietro i suoi canini.
NOTA: È meglio posizionare la testa in modo che la superficie dorsale sia rivolta verso il pavimento e la sua faccia sia rivolta verso il tecnico. - Utilizzando una sonda con punta di cotone, asciugare la lingua del marmoset e afferrarla in una mano per tenere la bocca aperta.
- Spruzzare il 10% di lidocaina sulla punta del tubo endotracheale.
- Inserire il tubo endotrachea di dispari di 2,0 mm di diametro nella trachea fino a quando il marchio di 4,0 cm è all'ingresso della trachea.
- Attaccare il tubo al gruppo di anestesia con il ventilatore artificiale impostato a 40 respiri/min e confermare la corretta espansione e contrazione del torace.
NOTA: In questo momento l'isoflurane e l'ossigeno devono essere erogati attraverso il tubo endotracheale, non la maschera. - Togliere la fascia elastica dalla bocca del marmoset in modo che il tubo endotracheale possa essere agcato alla mascella.
- Posizionare il marmoset in una posizione prona in linea con il telaio stereotassico e fissare la testa dell'animale nel telaio stereotassico.
- In primo luogo, inserire la punta della barra dell'orecchio destro nel giusto canale uditivo dell'animale.
- Successivamente, inserire la punta della barra dell'orecchio sinistro nel canale uditivo sinistro.
- Centrare la testa dell'animale al centro del telaio stereotaxic e fissare le barre dell'orecchio in posizione.
- Inserire il boccaglio nella bocca dell'animale e regolarne l'altezza in modo che tocchi il palato dell'animale. Allo stesso tempo, posizionare le barre orbitali sulla superficie inferiore dell'osso orbitale.
- Assicurarsi che la superficie inferiore dell'osso orbitale sia allineata orizzontalmente con il centro delle barre dell'orecchio.
- Collegare un ossimetro a impulsi portatile alla mano del marmoset. Assicurarsi che la frequenza cardiaca sia entro 154,180 battiti/min (bpm) per tutta la durata dell'intervento chirurgico; spesso una frequenza cardiaca superiore a 200 bpm implica che l'animale si sta svegliando. Assicurarsi che la saturazione di ossigeno sia superiore al 95%. Occasionalmente può scendere al 90% senza danni.
NOTA: Se la frequenza cardiaca scende al di sotto di 154 bpm, diminuire l'isoflurane. - Posizionare la sonda di temperatura rettale collegata a una piastra di riscaldamento omeotermica nell'ano, con la temperatura desiderata impostata per 37 gradi centigradi. Nastro questo sensore alla coda per tenerlo fisso in posizione.
- Applicare un lubrificante oftalmico sterile agli occhi.
- Pulire e disinfettare la testa dell'animale con clorolessidine e iodio povidone prima di coprire l'animale con un campo chirurgico.
NOTA: Eseguire tutte le seguenti procedure chirurgiche in condizioni asettiche.
3. Procedure chirurgiche
- Applicare sottocutaneamente analgesico locale (ad esempio, lidocaina 20 mg/mL, 0,1 mL) nel sito dell'incisione prevista. Fare un'incisione nella linea mediana del cuoio capelluto.
- Esporre e preparare la superficie del cranio.
- Staccare con attenzione il muscolo temporale dal cranio. In primo luogo, utilizzare un bisturi per tagliare la fascia al suo inserimento nel cranio. Quindi, separare delicatamente il muscolo temporale dal cranio utilizzando un raspatory periosteal.
- Rimuovere il periosteo da tutto il cranio esposto utilizzando un raspatorio periosteal.
- Controllare il sanguinamento con un tampone di cotone sterile, se necessario.
- Pulire la superficie ossea con perossido di idrogeno.
- Delineare la posizione della craniotomia segnando i suoi angoli con fori di burro poco profondi nella superficie ossea. Quindi, perforare il perimetro della craniotomia utilizzando un trapano dentale alla massima velocità (cioè 350.000 rpm). Aggiungere qualche goccia di sterile salina sul cranio durante la perforazione per evitare il surriscaldamento. Misurare la posizione della craniotomia e le coordinate dell'impianto dell'elettrodo rispetto alle coordinate entrol.
- Impianto viti nel cranio.
- Forare i fori a vite 6-8 nel cranio.
- Impiantare le viti in modo che ogni vite di filo di terra fusa sia adiacente e in prossimità di una vite inalterata (cioè senza un filo di terra collegato ad esso).
- Avvolgere ogni filo di terra intorno all'adiacente, vite inalterata.
- Aggiungere una goccia di vernice d'argento tra il filo di terra e ogni vite.
- Rimuovere l'osso al centro della craniotomia utilizzando pinze con una punta curva (ad esempio, pinze McPherson). Mantenere il dura mater idratato con sterile salina.
- Togliere la dura mater. Utilizzare un ago ipodermico sterile (25 o 26 G) con la smussatura piegata a circa 90 gradi per forare e sollevare la superficie del dura mater lontano dalla superficie del cervello. Quindi, tagliare la dura mater con microscissors. Mantenere il cervello esposto idratato con salina.
NOTA: Se si osserva un sanguinamento in durale significativo, utilizzare cavolo o spugne sterili di gelatina assorbenti imbevuti di trombina25. - Array di microelettrodi implantari.
- Attaccare il supporto sterilizzato per gli elettrodi e l'array di elettrodi al micromanipolatore stereotassico.
- Posizionare il micromanipolatore in modo che l'elettrodo si trova alle coordinate anteroposteriori e mediolaterali desiderate.
- Abbassare l'array di elettrodi fino a toccare la superficie del cervello fino a quando la punta del fascio più lungo.
- Inserire lentamente l'array nel tessuto cerebrale fino a raggiungere le coordinate dorsoventral.
- Coprire la corteccia esposta con piccoli pezzi di sterili spugne di gelatina assorbente.
- Fissare l'elettrodo al cranio applicando l'acrilico dentale al cranio esposto, una vite e l'elettrodo.
- Staccare il supporto dell'elettrodo e rimuoverlo dal micromanipolatore.
- Ripetere la procedura di impianto dal passaggio 3.7 con gli array aggiuntivi, se necessario.
- Avvolgere insieme e saldare i fili di terra dei fili separati e viti. Utilizzare vernice argentata per formare un ponte intorno alla saldatura per garantire che sia stato raggiunto un collegamento elettrico.
- Utilizzando l'acrilico dentale, fare un robusto headcap intorno all'estensione laterale degli array, e racchiudere completamente i fili di terra e qualsiasi cranio esposto e viti.
- Se necessario, inserire una barra di supporto nel tappo della testa. Questo può essere un cilindro di plastica robusto come quelli di un tampone di cotone. Sigillalo in posizione con l'acrilico dentale.
NOTA: Questo può essere utile per proteggere i connettori dei cavi di elettrofisiologia in atto, ma potrebbe non essere necessario a seconda dell'apparecchiatura utilizzata. Nel metodo attuale, un'asta di supporto simile è apposto sullo stadio della testa in modo che una fascia elastica possa tenere robustamente le fasi della testa in posizione sui connettori. - Suturare la pelle intorno alla testata.
4. Recupero postoperatorio
- Applicare la soluzione antisettica (ad esempio, clorhessia) intorno alla ferita.
- Spegnere l'alimentazione isoflurane ma non l'ossigeno e rimuovere l'animale dal telaio stereotassico.
- Posizionare l'animale sul pad di riscaldamento con l'ossigeno mantenuto attraverso il tubo endotracheale.
- Rimuovere il tubo endotracheale quando si osservano i primi segni di riflessi neurogenici, come i ladengosmi.
- Continua a fornire l'ossigeno con una maschera fino a quando l'animale presenta chiari segni di recupero anestetico, come riflessi protettivi, tono posturale e tentativi di ambulazione.
- Posizionare l'animale all'interno di una gabbia pulita in una stanza di recupero per 24-48 ore prima di spostare l'animale nella sua gabbia di casa. Casa ogni animale impiantato individualmente.
NOTA: Poiché le marmotte tendono a scalare le pareti della gabbia, utilizzare una gabbia con pareti lisce o coprire le pareti della gabbia con una superficie liscia per evitare che l'animale cada. - Nella prima ora dopo l'intervento chirurgico, osservare l'animale per guardare per segni di angoscia o contatto visivo non coordinato contro il lato della gabbia.
- Somministrare antibiotici (ad es. enrofloxcin 5 mg/kg, sottocutaneamente, una volta al giorno per 5/7 giorni), analgesici (ad esempio, oral tramadol 1 mg/kg, ogni 8 h h per 3/5 giorni) e farmaci antinfiammatori (ad esempio, dexamethasone 0,5-1,5 mg/kg, sottocutaneamente, una volta al giorno per 1/3 giorni) .
NOTA: Dopo un intervento chirurgico di successo, gli animali saranno completamente recuperati entro 3/5 giorni.
5. Registrazioni elettrofisiologiche croniche in marmotte che si comportano liberamente
- Iniziare le sessioni di registrazione elettrofisiologica almeno 1 settimana dopo l'intervento chirurgico.
NOTA: abituare gli animali al ricercatore e agli ambienti sperimentali prima di iniziare tutte le procedure sperimentali per almeno 1 mese. - All'inizio di ogni sessione, anantichezzare leggermente l'animale usando l'isoflurane (1-5 L/min, 1% O2).
NOTA: Seguire le linee guida dell'istituzione competente in merito alla sedazione di piccoli primati. Se le sessioni di registrazione sono molto frequenti, abituare gli animali da maneggiare in modo che i cavi possano essere collegati senza anestesia. - Collegare gli array di elettrodi a un sistema di registrazione neurale commerciale.
- Posizionare l'animale all'interno della camera sperimentale.
NOTA: La camera sperimentale utilizzata qui è una scatola acrilica cubica (0,45 m x 0,45 m x 0,45 m) progettata per valutare la quantità e il modello di attività motoria spontanea26,27. - Attendere 30 min prima di iniziare le registrazioni per assicurarsi che l'animale sia completamente recuperato dall'anestesia.
NOTA: Isoflurane ha una rapida insorgenza e un'azione di compensazione che consente una rapida sedazione erisveglio 28. Una volta disattivato l'alimentazione dell'isoflurane, l'animale inizierà a svegliarsi. L'animale è sveglio quando rimane in posizione eretta e può ambulatoare liberamente nella camera sperimentale senza cadere. Questo richiede meno di 15 min. Per garantire l'assenza di effetti sedativi, iniziare le registrazioni 30 min dopo l'isoflurane è interrotto. - Confermare la posizione degli impianti di microelettrodi postmortem da colorazione NISSL dopo aver fissato e sezioato il tessuto29.
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Representative Results
Lo scopo di questo studio era quello di descrivere una procedura neurochirurgica stereotassica per l'impianto di array di microelettrodi per registrazioni elettrofisiologiche nel marmoset comune. Un intervento chirurgico tipico (dall'induzione dell'anestesia al recupero dell'anestesia) durerà circa 5-7 h, a seconda del numero di array impiantati. Qui, due array sono stati impiantati simmetricamente, uno in ogni emisfero cerebrale. Ogni matrice conteneva 32 microfili in acciaio inossidabile disposti in sette fasci mirati a diverse strutture del circuito ganglia-corticothalamico basale(Figura 1),ma la progettazione degli elettrodi e le regioni cerebrali mirate possono variare a seconda del rsperimento. Dopo un intervento chirurgico di successo e procedure postoperatorie, l'animale deve essere completamente recuperato entro 3/5 giorni. Se l'array è stato atterrito e impiantato correttamente sarà possibile registrare i picchi (Figura 2A) e le potenzialità locali sul campo (Figura 2B) negli animali che si comportano liberamente per diverse settimane o mesi, prima che venga stabilita una cicatrice gliotica matura 13,30. Ad esempio, i dati elettrofisiologici raccolti nel paradigma sperimentale qui descritto sono stati effettivamente utilizzati per studiare l'attività simultanea di diverse regioni del circuito ganglia-corticothalamico basale durante locomozione in un modello di morbo di Parkinson26.
Infine, un intervento chirurgico di successo comporta anche l'impianto degli array nelle strutture mirate. Le metodologie di imaging non invasive, come la risonanza magnetica o la tomografia, possono essere eseguite dopo l'intervento chirurgico e prima di iniziare le registrazioni sperimentali. L'uso di tale metodologia sarà possibile solo se gli impianti specifici utilizzati sono fabbricati per essere compatibili con tali tecniche e se il ricercatore ha accesso a attrezzature animali di piccole dimensioni appropriate. La conferma finale può essere eseguita anche dopo la morte. Le sezioni colorate Nissl contenenti tracce di elettrodi possono essere utilizzate per determinare con precisione la posizione di ogni microfilo impiantato (Figura 3). Si noti che le tracce di elettrodi nelle sezioni coronali appaiono come lacrime nel tessuto. Pertanto, è necessario prestare estrema attenzione quando viene eseguita la sezionamento per ridurre la possibilità di creare artefatti che confonderanno l'interpretazione.
Figura 1: Matrice di microelettrodi per l'impianto in piccoli primati. L'array era composto da 32 microfili in acciaio inox. I fili erano di 50 m di diametro e sono stati organizzati in sette fasci destinati a raggiungere le seguenti aree: corteccia motoria primaria (M1), putamen (Put), caudate (Cd), globus pallidus (GPe), ventrolateral e ventroposteriore nucleo talno talamico posteriore (VPL), e nucleo subthalamico (STN). La spaziatura interelettrode in ogni fascio era di 300 m. La spaziatura del interbundle dipende dalle coordinate di destinazione per ogni area del cervello. Informazioni più dettagliate sulla progettazione e la produzione di array di microelettrodi sono disponibili in Nicolelis31, Lehew e Nicolelis32e Dizirasa et al.33. Barra di scala - 5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultato elettrofisiologico rappresentativo dopo un intervento chirurgico di successo. Il pannello di sinistra mostra l'attività del picco di due neuroni (forme d'onda gialle e verdi) registrati da un elettrodo. Il pannello di destra mostra le potenziali oscillazioni del campo locale registrate da 14 elettrodi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Sezione di tessuto colorato Nissl che mostra una traccia di elettrodo. Questa sezione (coordinata anteroposteriore, relativa alla linea interaurale: 8,0, secondo l'atlante di Paxinos e Watson34) raffigura una traccia di elettrodi con la punta al Putamen, come indicato dal triangolo nero. Barra di scala : 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata delle procedure coinvolte nell'impianto di array di registrazione di microelettrodi nel cervello marmoset. Questo stesso protocollo può essere facilmente utilizzato quando si impiantano elettrodi, sia fatti in casa che disponibili in commercio, in altri piccoli primati. Inoltre, può essere facilmente adattato per altre estremità sperimentali che richiedono un targeting preciso delle strutture cerebrali. Pertanto, questo protocollo è volutamente vago per quanto riguarda le coordinate stereotaxiche e le tecniche di perforazione cranica, perché questi sono gli aspetti che possono variare di più. Ad esempio, per impiantare gli array utilizzati in questo intervento chirurgico, sono state eseguite craniotomie per aprire due finestre di dimensioni appropriate in ogni emisfero. Tuttavia, quando si impiantano robuste strutture individuali, come le cannule guida, non è necessaria né questa né la durectomia. Piuttosto, un semplice buco bava al livello della dura sarà sufficiente. Allo stesso modo, quando sono coinvolti impianti non elettrici, non è necessario che le viti siano a terra. Pertanto, il passaggio 3.9 nel protocollo chirurgico può essere omesso. Invece, l'acrilico dentale può essere utilizzato per coprire semplicemente il cranio esposto, l'impianto e le viti.
Indipendentemente dall'obiettivo sperimentale specifico della neurochirurgia stereotassica, l'implementazione di successo della procedura data ruota in gran parte intorno a buone pratiche chirurgiche. Ciò significa che devono essere seguiti protocolli rigorosi per eseguire l'intervento chirurgico in condizioni asettiche al fine di prevenire le infezioni postoperatorie35. Alcuni dei momenti più critici sono l'induzione e la rimozione dell'anestesia. È quindi essenziale che i segni vitali dell'animale (frequenza cardiaca, saturazione di ossigeno nel sangue e temperatura corporea) siano monitorati per tutta la procedura chirurgica36. Se si verifica una diminuzione della frequenza cardiaca con un calo simultaneo della saturazione dell'ossigeno, verificare che il torace si gonfi a esibisca normalmente, altrimenti la connessione alla macchina respiratoria potrebbe essere difettosa. La prima cosa che si può fare per tentare di recuperare la frequenza cardiaca e la saturazione di ossigeno è diminuire la concentrazione di isofurane. Se questo non risolve il problema, l'atropina può essere somministrata per via intramuscolare per aumentare la frequenza cardiaca e tentare di stabilizzare l'animale. Questo deve essere fatto con estrema cautela, perché l'esperienza precedente dimostra che una frequenza cardiaca superiore a 200 bpm senza sufficiente isoflurane risveglierà l'animale.
A differenza dei roditori, nei primati tutte le coordinate sono di solito misurate rispetto alla coordinata interaurale, non il bregma e l'espressione lambda34. Pertanto, è importante misurare le coordinate zero interaurali degli array di elettrodi e di altre sonde prima di fissare la testa dell'animale nell'apparato stereotassico. Inoltre, nelle marmotte il piano orizzontale è definito come il piano che passa attraverso il margine inferiore dell'osso orbitale e il centro del meatus uditivo esterno. Pertanto, è importante allineare la superficie inferiore dell'osso orbitale con il centro delle barre dell'orecchio prima di fissare la testa nel telaio stereotassico. Inoltre, i muscoli temporali del marmoset coprono una vasta area del cranio. Così, molti obiettivi neurali richiedono craniotomie da eseguire sotto o in stretta vicinanza a questa muscolatura. Poiché questi muscoli sono importanti per la comunicazione marmoset38, il chirurgo deve staccare lentamente e con attenzione questa muscolatura dal cranio per ridurre al minimo i danni.
I ricercatori che hanno familiarità con il lavoro comportamentale che coinvolge roditori o marmotte dovrebbero essere consapevoli di diverse limitazioni quando si esegue l'elettrofisiologia nel comportarsi liberamente NHP. In primo luogo, nella disposizione attuale e altri che coinvolgono array ad alta densità o più array, è probabile che l'induzione dell'anestesia leggera sarà necessaria per collegare i connettori dei cavi, anche dopo un'adeguata assuefazione. Questa procedura, nell'ambito delle linee guida normative di NIH e di altri paesi, dovrebbe essere eseguita con parsimonia per ridurre lo stress mentale e fisico sul marmoset. Inoltre, è fondamentale che il ricercatore garantisca che l'animale sia completamente recuperato dall'anestesia prima di iniziare l'acquisizione dei dati, altrimenti l'anestesia può confondere i dati39. Un'altra limitazione correlata è la presenza fisica del cavo stesso. Mentre le soluzioni di registrazione wireless stanno diventando disponibili40, le opzioni cablate più comuni impongono una restrizione fisica all'animale. Infine, la camera sperimentale utilizzata limiterà anche la gamma di comportamenti disponibili per il marmoset. A differenza dei roditori, le marmotte mostrano comportamenti unici (ad esempio, l'arrampicata) che non saranno possibili a seconda della camera sperimentale utilizzata.
I progressi nella scienza dei materiali e nell'ingegneria stanno portando alle nuove interfacce neurali41. Procedure neurochirurgiche efficaci, come quella descritta in questo manoscritto, consentiranno ai ricercatori di implementare questi nuovi e prossimi strumenti nelle marmotte. In combinazione con gli sviluppi simultanei nella biologia molecolare3,4,5, marmoset hanno il potenziale per consentire lo studio di importanti questioni di base e cliniche in neuroscienze.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Bernardo Luiz per l'assistenza tecnica con le riprese e il montaggio. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto Santos Dumont (ISD), dal Ministero dell'Istruzione brasiliano (MEC) e dal Superiore di Coordenao de Aperfei-oamento de Pessoal de Novel (CAPES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| 683 Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | 55-0000 | |
| Anesthesia Assembly | BRASMED | COLIBRI | |
| Barber Clippers | Mundial | HC-SERIES | |
| Dental Drill | Norgen | B07-201-M1KG | |
| Homeothermic Heating Pad and Monitor | Harvard Apparatus, Inc. | 50-7212 | |
| Marmoset Stereotaxic Frame | Narishige Scientific Instrument Lab | SR-6C-HT | |
| Patient Monitor and Pulse Oximeter | Bionet Co., Ltd | BM3 | |
| Stereotaxic Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | SM-15R | |
| Surgical Microscope | Opto | SM PLUS IBZ | |
| Instruments | |||
| Allis tissue forceps | Sklar | 36-2275 | |
| Alm Retractor, rounded point, 4x4 teeth | Rhosse | RH11078 | |
| Angled McPherson Forceps | Oftalmologiabr | 11301A | |
| Curved Surgial Scissors | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8422 | |
| Curved Tissue Forceps | Sklar | 47-1186 | |
| Delicate Dissection forceps | WPI | WP5015 | |
| Dental Drill Bit | Microdont | ISO.806.314.001.524.010 | |
| Essring Tissue Forceps | Sklar | 19-2460 | |
| FG 1/4 Dental Drill Bit | Microdont | ISO.700.314.001.006.005 | |
| Halsey Needle Holder | WPI | 15926-G | |
| Halstead Mosquito forceps | WPI | 503724-12 | |
| Hemostatic Forceps, Straight | Sklar | 17-1260 | |
| Jewler Forceps | Sklar | 66-7436 | |
| McPherson-Vannas Optathalmic microscissor, 3 mm point | Argos Instrumental | ARGOS-4004 | |
| Pereosteal Raspatory | Golgran | 38-1 | |
| Scalpal Handle | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8354 | |
| Screwdrivers | Eurotool | SCR-830.00 | |
| Sodering Iron | Hikari | 21K006 | |
| Surgical Scissor | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8400 | |
| Toothed forceps | WPI | 501266-G | |
| Disposables/Single Use | |||
| 1 ml sterile syringe with 26 G needle | Descarpack | 7898283812785 | |
| 130 cm x 140 cm surgical field, presterilized | ProtDesc | 7898467276344 | |
| 24G Needle, presterilized | Descarpack | 7898283812846 | |
| 50 cm x 50 cm surgical field, presterilized | Esterili-med | 110100236 | |
| Cotton Tipped Probes, Presterilized | Jiangsu Suyun Medical Materials Co. LTD | 23007 | |
| Cotton tipped Qutips | Higie Topp | 7898095296063 | |
| Electrode Array | Home made | ||
| Endotracheal tube without cuff, internal diameter 2.0 mm, outer diameter 2.9 mm | Solidor | 7898913077201 | |
| Tinned copper wire, 0.15 mm diameter | |||
| M1.4x3 Stainless steel screws | USMICROSCREW | M14-30M-SS-P | |
| Medical Tape | Missner | 7896544910102 | |
| Nylon surgical sutures | Shalon | N540CTI25 | |
| Scalpal Blade, presterilized | AdvantiVe | 1037 | |
| solder | Kester | SN63PB37 | |
| Sterile Saline 0.9% | Isofarma | 7898361700041 | |
| Sterile Surgical Gloves | Maxitex | 7898949349051 | |
| Sterile Surgical Gown | ProtDesc | 7898467281208 | |
| Surgical Gauze, 15 cm x 26 cm presterilized | Héika | 7898488470315 | |
| Gelfoam | Pfizer | ||
| Drugs/Chemicals | |||
| 0.25mg/ml Atropine | Isofarma | ||
| 10% Lidocaine Spray | Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda. | 7896676405644 | |
| 2.5% Enrofloxacino veterinary antibiotic | Chemitec | 0137-02 | |
| Dexametasona Veterinary Anti inflammatory | MSD | R06177091A-00-15 | |
| Hydrogen Peroxide | Farmax | 7896902211537 | |
| Isoflourane | BioChimico | 7897406113068 | |
| Jet Acrylic polymerization solution | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Jet Auto Polymerizing Acrylic | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Ketamine 10% | Syntec | ||
| Lidocaine and Phenylephrine 1.8 ml local anesthetic | SS White | 7892525041049 | |
| Povidone-Iodine solutiom | Farmax | 7896902234093 | |
| Riohex 2% surgical Soap | Rioquímica | 7897780209418 | |
| Silver Paint | SPI Supplies | 05002-AB | |
| Tramadol chloride 50 mg/ml | União Química | 7896006245452 | |
| Refresh gel (polyacrylic acid) | Allergan |
References
- Okano, H., Hikishima, K., Iriki, A., Sasaki, E. The common marmoset as a novel animal model system for biomedical and neuroscience research applications. Seminars in Fetal and Neonatal Medicine. 17 (6), 336-340 (2012).
- Harris, R. A., et al. Evolutionary genetics and implications of small size and twinning in callitrichine primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (4), 1467-1472 (2014).
- Kishi, N., Sato, K., Sasaki, E., Okano, H. Common marmoset as a new model animal for neuroscience research and genome editing technology. Development, Growth & Differentiation. 56 (1), 53-62 (2014).
- Sasaki, E. Prospects for genetically modified non-human primate models, including the common marmoset. Neuroscience Research. 93, 110-115 (2015).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Sasaki, E. Creating Genetically Modified Marmosets. The Common Marmoset in Captivity and Biomedical Research. , 335-353 (2019).
- Sato, K., et al. Generation of a Nonhuman Primate Model of Severe Combined Immunodeficiency Using Highly Efficient Genome Editing. Cell Stem Cell. 19 (1), 127-138 (2016).
- Sato, K., et al. Resequencing of the common marmoset genome improves genome assemblies and gene-coding sequence analysis. Scientific Reports. 5, 16894 (2015).
- Chaplin, T. A., Yu, H. H., Soares, J. G. M., Gattass, R., Rosa, M. G. P. A Conserved Pattern of Differential Expansion of Cortical Areas in Simian Primates. Journal of Neuroscience. 33 (38), 15120-15125 (2013).
- Mitchell, J. F., Leopold, D. A. The marmoset monkey as a model for visual neuroscience. Neuroscience Research. 93, 20-46 (2015).
- Brok, H. P. M., et al. Non-human primate models of multiple sclerosis: Non-human primate models of MS. Immunological Reviews. 183 (1), 173-185 (2001).
- Santana, M. B., et al. Spinal Cord Stimulation Alleviates Motor Deficits in a Primate Model of Parkinson's disease. Neuron. 84 (4), 716-722 (2014).
- Ribeiro, M., Santana, M. B., Araujo, M. Neuronal signal description after chronic stainless-steel microelectrode array implants in marmosets. , Available from: http://www.canal6.com.br/cbeb/2014/artigos/cbeb2014_submission_766.pdf (2014).
- MacDougall, M., et al. Optogenetic manipulation of neural circuits in awake marmosets. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1286-1294 (2016).
- Wakabayashi, M., et al. Development of stereotaxic recording system for awake marmosets (Callithrix jacchus). Neuroscience Research. 135, 37-45 (2018).
- Johnston, K. D., Barker, K., Schaeffer, L., Schaeffer, D., Everling, S. Methods for chair restraint and training of the common marmoset on oculomotor tasks. Journal of Neurophysiology. 119 (5), 1636-1646 (2018).
- Sedaghat-Nejad, E., et al. Behavioral training of marmosets and electrophysiological recording from the cerebellum. Journal of Neurophysiology. , (2019).
- Kringelbach, M. L., Owen, S. L., Aziz, T. Z. Deep-brain stimulation. Future Neurology. 2 (6), 633-646 (2007).
- Talakoub, O., Gomez Palacio Schjetnan, A., Valiante, T. A., Popovic, M. R., Hoffman, K. L. Closed-Loop Interruption of Hippocampal Ripples through Fornix Stimulation in the Non-Human Primate. Brain Stimulation. 9 (6), 911-918 (2016).
- Oddo, M., Hutchinson, P. J. Understanding and monitoring brain injury: the role of cerebral microdialysis. Intensive Care Medicine. 44 (11), 1945-1948 (2018).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical Deconstruction of Parkinsonian Neural Circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
- Hammer, D. X., et al. Longitudinal vascular dynamics following cranial window and electrode implantation measured with speckle variance optical coherence angiography. Biomedical Optics Express. 5 (8), 2823-2836 (2014).
- Komatsu, M., Kaneko, T., Okano, H., Ichinohe, N. Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Surgical Techniques for Chronic Implantation of Microwire Arrays in Rodents and Primates. , CRC Press/Taylor & Francis. (2008).
- Santana, M. B., et al. Spinal Cord Stimulation Alleviates Motor Deficits in a Primate Model of Parkinson's disease. Neuron. 84 (4), 716-722 (2014).
- Santana, M., Palmér, T., Simplício, H., Fuentes, R., Petersson, P. Characterization of long-term motor deficits in the 6-OHDA model of Parkinson's disease in the common marmoset. Behavioural Brain Research. 290, 90-101 (2015).
- Misra, S., Koshy, T. A review of the practice of sedation with inhalational anaesthetics in the intensive care unit with the AnaConDa device. Indian Journal of Anaesthesia. 56 (6), 518-523 (2012).
- Freire, M. A. M., et al. Distribution and Morphology of Calcium-Binding Proteins Immunoreactive Neurons following Chronic Tungsten Multielectrode Implants. PLOS ONE. 10 (6), 0130354 (2015).
- Budoff, S., et al. Astrocytic Response to Acutely- and Chronically Implanted Microelectrode Arrays in the Marmoset (Callithrix jacchus) Brain. Brain Sciences. 9 (2), 19 (2019).
- Dzirasa, K., Fuentes, R., Kumar, S., Potes, J. M., Nicolelis, M. A. L. Chronic in vivo multi-circuit neurophysiological recordings in mice. Journal of Neuroscience Methods. 195 (1), 36-46 (2011).
- Nicolelis, M. A. L., et al. Chronic, multisite, multielectrode recordings in macaque monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 11041-11046 (2003).
- Lehew, G., Nicolelis, M. A. L. State-of-the-Art Microwire Array Design for Chronic Neural Recordings in Behaving Animals. , CRC Press/Taylor & Francis. (2008).
- Paxinos, G., Watson, C., Petrides, M., Rosa, M., Tokuno, H. The Marmoset Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Science Publishing Co Inc. San Diego. (2012).
- Brown, M. J., Pearson, P. T., Tomson, F. N. Guidelines for animal surgery in research and teaching. American Journal of Veterinary Research. 54 (9), 1544-1559 (1993).
- Flecknell, P. A. Anaesthesia of Animals for Biomedical Research. British Journal of Anaesthesia. 71 (6), 885-894 (1993).
- Kurihara, S., et al. A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset (Callithrix jacchus). Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Boer, R. A., de Vries, A. M. O., Louwerse, A. L., Sterck, E. H. M. The behavioral context of visual displays in common marmosets (Callithrix jacchus). American Journal of Primatology. 75 (11), 1084-1095 (2013).
- Kudo, C., Nozari, A., Moskowitz, M. A., Ayata, C. The impact of anesthetics and hyperoxia on cortical spreading depression. Experimental Neurology. 212 (1), 201-206 (2008).
- Ghomashchi, A., et al. A low-cost, open-source, wireless electrophysiology system. 2014 36th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 3138-3141 (2014).
- Fu, T. M., Hong, G., Viveros, R. D., Zhou, T., Lieber, C. M. Highly scalable multichannel mesh electronics for stable chronic brain electrophysiology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), 10046-10055 (2017).
