Summary
Este trabajo presenta un protocolo para realizar una implantación estereoquirúrgica y neuroquirúrgica de matrices de microelectrodos en el marmoset común. Este método permite específicamente grabaciones electrofisiológicas en animales que se comportan libremente, pero se puede adaptar fácilmente a cualquier otra intervención neuroquirúrgica similar en esta especie (por ejemplo, cánula para administración de fármacos o electrodos para estimulación cerebral).
Abstract
Los marmosets(Callithrix jacchus)son pequeños primates no humanos que están ganando popularidad en la investigación biomédica y preclínica, incluyendo las neurociencias. Filogenéticamente, estos animales están mucho más cerca de los seres humanos que los roedores. También muestran comportamientos complejos, incluyendo una amplia gama de vocalizaciones e interacciones sociales. Aquí, se describe un procedimiento neuroquirúrgico estereotaxico eficaz para la implantación de matrices de electrodos de grabación en el marmoset común. Este protocolo también detalla los pasos pre y postoperatorios del cuidado de los animales que se requieren para realizar con éxito una cirugía de este tipo. Por último, este protocolo muestra un ejemplo de potencial de campo local y registros de actividad de pico en un marmoset de trabajo libre 1 semana después del procedimiento quirúrgico. En general, este método proporciona una oportunidad para estudiar la función cerebral en marmosets despiertos y de comportarse libremente. El mismo protocolo puede ser fácilmente utilizado por los investigadores que trabajan con otros primates pequeños. Además, se puede modificar fácilmente para permitir otros estudios que requieren implantes, como electrodos estimulantes, microinyecciones, implantación de optrodes o cánulas guía, o ablación de regiones de tejido discretas.
Introduction
Los marmostes comunes (Callithrix jacchus) están ganando reconocimiento como un organismo modelo importante en muchos campos de la investigación, incluyendo la neurociencia. Estos primates del nuevo mundo representan un importante modelo animal complementario tanto para roedores como para otros primates no humanos (NCP), como el macaco rhesus. Al igual que los roedores, estos animales son pequeños, fáciles de manipular y relativamente económicos para cuidar y criar1,2,3,4,en comparación con los NCP más grandes. Además, estos animales tienen una propensión al hermanamiento y alta fecundidad en relación con otros NCP1,2,3. Otra ventaja que tiene el marmoset sobre muchos otros primates es que las herramientas modernas de biología molecular3,4,5,6,7 y un genoma secuenciado2 ,3,4,5,8 se han utilizado para modificarlos genéticamente. Tanto los animales que llaman con lentivirus5,como los animales noqueados que utilizan nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y las nucleasas de efector similares a los activadores de transcripción (TALENS)7,han producido animales fundadores viables.
Una ventaja en relación con los roedores es que los marmotas, como primates, están filogenéticamente más cerca de los seres humanos3,5,6,9,10,11. Al igual que los seres humanos, los marmosets son animales diurnos que dependen de un sistema visual altamente desarrollado para guiar gran parte de su comportamiento10. Además, los marmosets exhiben complejidad conductual, incluyendo una amplia gama de comportamientos sociales como el uso de diferentes vocalizaciones3,permitiendo a los investigadores abordar preguntas que no son posibles en otras especies. Desde una perspectiva neurocientífica, los marmosets tienen cerebros lissencefalia, a diferencia del más comúnmente utilizado rhesus macaque9. Además, los marmosets tienen un sistema nervioso central similar a los humanos, incluyendo una corteza prefrontal más desarrollada9. Juntos, todas estas características posicionan los marmosets como un modelo valioso para estudiar la función cerebral en la salud y la enfermedad.
Un método común para estudiar la función cerebral consiste en implantar electrodos en lugares anatómicamente específicos mediante neurocirugía estereoonópica. Esto permite el registro crónico de la actividad neuronal en diferentes áreas objetivo en animales despiertos y que se comportan libremente12,13. La neurocirugía estereoócica es una técnica indispensable utilizada en muchas líneas de investigación, ya que permite la focalización precisa de las regiones neuroanatómicas. En comparación con la literatura de macacos y roedores, hay menos estudios publicados que describen la neurocirugía estereotaxia específica del marmoset, y tienden a proporcionar detalles escasos de los pasos involucrados en la cirugía. Por otra parte, aquellos con mayor detalle se centran principalmente en los procedimientos para el registro de electrofisiología en animales restringidos por la cabeza14,15,16,17.
Con el fin de facilitar una adopción más amplia de los marmotas como organismo modelo en la investigación de la neurociencia, el presente método define los pasos específicos necesarios para una neurocirugía estereotaxia exitosa en esta especie. Además de la implantación de matrices de grabación, como se detalla en el método actual, la misma técnica puede adaptarse para muchos otros fines experimentales, incluida la implantación de electrodos estimulantes para el tratamiento de enfermedades18 o la conducción causal comportamiento del circuito19; implantación de cánulas guía para la extracción y cuantificación de neurotransmisores20, inyecciones de reactivos, incluyendo los de inducir modelos de enfermedad12 o para estudios de rastreo de circuitos15; ablación de regiones de tejidos discretos21; implantación de optrodes para estudios optogenéticos22; implantación de ventanas ópticas para análisis microscópico cortical23; e implantación de matrices electrocorticográficas (ECoG)24. Por lo tanto, el objetivo general de este procedimiento es esbozar los pasos quirúrgicos involucrados en la implantación de matrices de microelectrodos para grabaciones electrofisiológicas crónicas en marmosets de comportarse libremente.
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Protocol
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía de Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de ética del Instituto Santos Dumont (protocolo 02/2015AAS).
1. Preparación de la cirugía
- Conecte cada matriz de electrodos a un soporte de electrodo compatible con el marco estereotaxico que se utilizará.
- Conecte un soporte de electrodo al micromanipulador estereotaxico y ajuste un microhilo a las coordenadas interaurales. Repita esto para las matrices y soportes de electrodos adicionales, si es necesario.
NOTA: La coordenada interaural de cualquier microhilo se puede utilizar para calcular las coordenadas de implantación para toda la matriz, ya que la distancia relativa entre los microhilos es constante. Cuando la matriz tiene haces con diferentes longitudes, la coordenada interaural del cable más largo es la más conveniente de usar para establecer el cero interaural. - Separe los soportes de electrodos del micromanipulador estereotaxico y esterilice los conjuntos (electrodo unido al soporte del electrodo) en un gabinete de luz ultravioleta (UV) durante al menos 2 h.
- Fije una aguja de 24 G a un soporte de sonda estereotaxia, conéctela al micromanipulador y ajuste las coordenadas interaurales para la punta de la aguja.
NOTA: Antes de la cirugía, las coordenadas de todas las craneotomías deben estar predefinidas como un perímetro 200 m2 más grande que la posición anteroposterior (AP) y mediolateral (ML) del sitio de implantación objetivo de la matriz. Utilice el conjunto del soporte de la sonda de aguja de 24 G para determinar la posición de las craneotomías en el cráneo basándose en las coordenadas interaurales cero. - Separe el soporte de la sonda del micromanipulador y esterilice el conjunto en un gabinete UV durante al menos 2 h.
- Reúne 6x8 tornillos de titanio o acero inoxidable. Soldar un cable de tierra a la mitad de ellos.
- Organice y esterilice todos los instrumentos, equipos y desechables restantes necesarios para la cirugía.
2. Procedimientos preoperatorios
NOTA: En este estudio se utilizaron dos marmotas macho adultas(Callithrix jacchus)que pesan entre 320 y 370 g. Asegúrese de que el animal no haya comido durante 6 h antes de la inducción de la anestesia.
- Anestesia al animal con una inyección intramuscular de atropina (0,05 mg/kg) para reducir la salivación y las secreciones bronquiales. Compruebe la falta de respuestas de pedal.
- Después de 5 min aplicar ketamina (10-20 mg/kg) por vía intramuscular.
- Achaque la cabeza del animal con una cortadora de barbero eléctrica.
- Administrar tramadol (2 mg/kg) por vía intramuscular como analgésico general.
- Intubar al animal.
- Usando una máscara, exponga el marmolo a isoflurano en oxígeno de 1-2% con un caudal de 1 x 5 L/min para inducir anestesia profunda. Cuando el animal esté profundamente anestesiado, reduzca y mantenga el isoflurano a 1 x 3 L/min.
- Coloque una banda elástica en la mesa quirúrgica con cinta adhesiva.
- Coloque el marmoset en una posición supina con la cabeza hacia el técnico y coloque la banda elástica en la boca del marmoset detrás de sus caninos.
NOTA: Lo mejor es colocar la cabeza de tal manera que la superficie dorsal esté apuntando hacia el suelo y su cara hacia el técnico. - Con una sonda con punta de algodón, seque la lengua del marmoset y agarren con una mano para mantener la boca abierta.
- Rocíe 10% lidocaína en la punta del tubo endotraqueal.
- Inserte el tubo endotraqueal sin esposar de 2,0 mm de diámetro en la tráquea hasta que la marca de 4,0 cm esté en la entrada de la tráquea.
- Fije el tubo al conjunto de anestesia con el respirador artificial ajustado a 40 respiraciones/min y confirme la expansión y contracción adecuadas del pecho.
NOTA: En este momento el isoflurano y el oxígeno deben ser entregados a través del tubo endotraqueal, no la máscara. - Retire la banda elástica de la boca del marmoset para que el tubo endotraqueal se pueda pegar a la mandíbula.
- Coloque el marmoset en una posición propensa en línea con el marco estereotaxico y fije la cabeza del animal en el marco estereotaxico.
- Primero, inserte la punta de la barra del oído derecho en el canal auditivo derecho del animal.
- A continuación, inserte la punta de la barra del oído izquierdo en el canal auditivo izquierdo.
- Centra la cabeza del animal en el centro del marco estereotaxico y fija las barras de los oídos en su lugar.
- Inserte la boquilla en la boca del animal y ajuste su altura para que toque el paladar del animal. Al mismo tiempo, coloque las barras orbitales en la superficie inferior del hueso orbital.
- Asegúrese de que la superficie inferior del hueso orbital esté alineada horizontalmente con el centro de las barras del oído.
- Conecte un oxímetro de pulso portátil a la mano del marmoset. Asegúrese de que la frecuencia cardíaca esté dentro de 154-180 latidos/min (bpm) durante la duración de la cirugía; a menudo una frecuencia cardíaca por encima de 200 bpm implica que el animal está despertando. Asegúrese de que la saturación de oxígeno está por encima del 95%. Ocasionalmente puede caer al 90% sin daño.
NOTA: Si la frecuencia cardíaca cae por debajo de 154 lpm, disminuya el isoflurano. - Coloque la sonda de temperatura rectal conectada a una almohadilla de calentamiento homeothermic en el ano, con la temperatura deseada establecida para 37 oC. Pegue este sensor a la cola para mantenerlo fijo en su lugar.
- Aplique lubricante oftálmico estéril en los ojos.
- Limpie y desinfecte la cabeza del animal con clorhexidina y yodo povidona antes de cubrirlo con un campo quirúrgico.
NOTA: Lleve a cabo todos los siguientes procedimientos quirúrgicos en condiciones asépticas.
3. Procedimientos de cirugía
- Aplicar por vía subcutánea local (p. ej., lidocaína 20 mg/ml, 0,1 ml) en el lugar de la incisión prevista. Haga una incisión en la línea media del cuero cabelludo.
- Exponer y preparar la superficie del cráneo.
- Desenganche cuidadosamente el músculo temporal del cráneo. Primero, usa un bisturí para cortar la fascia en su inserción en el cráneo. Luego, separa suavemente el músculo temporal del cráneo usando un raspatorio periosteal.
- Retire el periiosteum de todo el cráneo expuesto usando un raspatorio periosteal.
- Controle el sangrado con un hisopo de algodón estéril, si es necesario.
- Limpie la superficie ósea con peróxido de hidrógeno.
- Delinea la ubicación de la craneotomía marcando sus esquinas con agujeros de rebaba poco profundos en la superficie ósea. A continuación, taladre el perímetro de la craneotomía utilizando un taladro dental a máxima velocidad (es decir, 350.000 rpm). Agregue unas gotas de solución salina estéril sobre el cráneo mientras perfora para evitar el sobrecalentamiento. Mida la posición de la craneotomía y las coordenadas del implante de electrodo con respecto a las coordenadas interaurales.
- El implante se atornilla en el cráneo.
- Taladre agujeros de tornillo de 6 x 8 en el cráneo.
- Implante los tornillos de tal manera que cada tornillo fundido de alambre de tierra esté adyacente y en la proximidad de un tornillo inalterado (es decir, sin un cable de tierra unido a él).
- Enrolle cada cable de tierra alrededor del tornillo adyacente e inalterado.
- Agregue una gota de pintura plateada entre el alambre de tierra y cada tornillo.
- Retire el hueso en el centro de la craneotomía usando fórceps con una punta curva (por ejemplo, fórceps McPherson). Mantenga el dura mater hidratado con solución salina estéril.
- Retire la dura mater. Utilice una aguja hipodérmica estéril (25 o 26 G) con el bisel doblado a aproximadamente 90o para perforar y levantar la superficie de la dura mater lejos de la superficie del cerebro. Luego, corta la dura mater con microtijeras. Mantenga el cerebro expuesto hidratado con salina.
NOTA: Si se observa un sangrado dural significativo, utilice esponjas de gelatina absorbentes estériles o estériles empapadas en trombina25. - Matriz de microelectrodos de implantes.
- Conecte el soporte de electrodos esterilizados y la matriz de electrodos al micromanipulador estereotaxico.
- Coloque el micromanipulador de forma que el electrodo esté en las coordenadas anteroposteriores y mediolaterales deseadas.
- Baje la matriz de electrodos hasta que la punta del haz más largo toque la superficie del cerebro.
- Inserte lentamente la matriz en el tejido cerebral hasta que llegue a las coordenadas dorsoventral.
- Cubra la corteza expuesta con pequeños trozos de esponjas de gelatina estériles y absorbentes.
- Fije el electrodo al cráneo aplicando acrílico dental al cráneo expuesto, a un tornillo y al electrodo.
- Separe el soporte del electrodo y retírelo del micromanipulador.
- Repita el procedimiento de implantación del paso 3.7 con las matrices adicionales, si es necesario.
- Enrolle y suelde los cables de tierra de las matrices y tornillos separados. Utilice pintura plateada para formar un puente alrededor de la soldadura para asegurarse de que se ha logrado una conexión eléctrica.
- Usando acrílico dental, haga un lápiz resistente alrededor de la extensión lateral de las matrices, y encierre completamente los cables de tierra y cualquier cráneo y tornillos expuestos.
- Si es necesario, inserte una barra de soporte en el cabezal. Esto puede ser un cilindro de plástico resistente como los de un hisopo de algodón. Sella en su lugar con el acrílico dental.
NOTA: Esto puede ser útil para asegurar los conectores de cable de electrofisiología en su lugar, pero puede ser innecesario dependiendo del equipo utilizado. En el método actual, una varilla de soporte similar se fija a la etapa de la cabeza de tal manera que una banda elástica puede sostener robustamente las etapas de la cabeza en su lugar en los conectores. - Sutura la piel alrededor del capuchón.
4. Recuperación postoperatoria
- Aplique una solución antiséptica (p. ej., clorhexidina) alrededor de la herida.
- Apague el suministro de isoflurano pero no el oxígeno y retire al animal del marco estereotaxico.
- Coloque el animal sobre la almohadilla calefactora con el oxígeno mantenido a través del tubo endotraqueal.
- Retire el tubo endotraqueal cuando se observen los primeros signos de reflejos neurogénicos, como laringospasmos.
- Sigue suministrando el oxígeno con una máscara hasta que el animal presente signos claros de recuperación anestésica, como reflejos protectores, tono postural e intentos de ambular.
- Coloque el animal dentro de una jaula limpia en una sala de recuperación de 24 a 48 horas antes de moverlo a su jaula de origen. Aunar cada animal implantado individualmente.
NOTA: Debido a que los marmotas tienden a escalar las paredes de la jaula, utilice una jaula con paredes lisas o cubra las paredes de la jaula con una superficie lisa para evitar que el animal caiga. - En la primera hora después de la cirugía, observe al animal para observar signos de angustia o contacto descoordinado con la cabeza contra el lado de la jaula.
- Administrar antibióticos (p. ej., enrofloxacino 5 mg/kg, por vía subcutánea, una vez al día durante 5 a 7 días), analgésicos (p. ej., tramadol oral 1 mg/kg, cada 8 h durante 3 x 5 días) y antiinflamatorios (p. ej., dexametasona 0,5 x 1,5 mg/kg, por vía subcutánea, una vez al día durante 1 3 días) .
NOTA: Después de una cirugía exitosa, los animales se recuperarán completamente dentro de 3 a 5 días.
5. Grabaciones electrofisiológicas crónicas en marmosets que se comportan libremente
- Inicie las sesiones de grabación electrofisiológica al menos 1 semana después de la cirugía.
NOTA: Habitua los animales al investigador y a los entornos experimentales antes de iniciar todos los procedimientos experimentales durante al menos 1 mes. - Al comienzo de cada sesión, anestesia ligeramente al animal usando isoflurano (1-5 L/min, 1% O2).
NOTA: Siga las directrices de la institución correspondiente con respecto a la sedación de pequeños primates. Si las sesiones de grabación son muy frecuentes, habituar los animales a manipular para que los cables se puedan conectar sin anestesia. - Conecte las matrices de electrodos a un sistema de grabación neuronal comercial.
- Coloque al animal dentro de la cámara experimental.
NOTA: La cámara experimental utilizada aquí es una caja de acrílico cúbico (0,45 m x 0,45 m x 0,45 m) diseñada para evaluar la cantidad y el patrón de actividad motora espontánea26,27. - Espere 30 minutos antes de iniciar las grabaciones para asegurarse de que el animal está completamente recuperado de la anestesia.
NOTA: El isoflurano tiene una acción de inicio y desplazamiento rápida que permite una sedación rápida y el despertar28. Una vez que el suministro de isoflurano está apagado, el animal comenzará a despertarse. El animal está despierto cuando permanece en posición vertical y puede ambulado libremente en la cámara experimental sin caerse. Esto toma menos de 15 min. Para asegurar la ausencia de efectos sedantes, comenzar las grabaciones 30 min después de que se suspende el isoflurano. - Confirmar la posición de los implantes de matriz de microelectrodos postmortem por tinción NISSL después de fijar y seccionar el tejido29.
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Representative Results
El propósito de este estudio fue describir un procedimiento neuroquirúrgico estereotaxico para la implantación de matrices de microelectrodos para grabaciones electrofisiológicas en el marmoset común. Una cirugía típica (desde la inducción de la anestesia hasta la recuperación de la anestesia) durará aproximadamente 5 a 7 h, dependiendo del número de matrices implantadas. Aquí, dos matrices fueron implantadas simétricamente, una en cada hemisferio cerebral. Cada matriz contenía 32 microcables de acero inoxidable dispuestos en siete paquetes dirigidos a varias estructuras del circuito basal de ganglios-corticotalalamicos(Figura 1),pero el diseño del electrodo y las regiones cerebrales objetivo pueden variar dependiendo de la Experimento. Después de una cirugía exitosa y procedimientos postoperatorios, el animal debe ser completamente recuperado dentro de 3 a 5 días. Si la matriz ha sido puesta a tierra e implantada correctamente será posible registrar picos(Figura 2A)y potenciales de campo locales(Figura 2B)en animales que se comportan libremente durante varias semanas o meses, antes de que se establezca una cicatriz gliotica madura 13,30. Por ejemplo, los datos electrofisiológicos recogidos en el paradigma experimental descrito aquí se han utilizado eficazmente para estudiar la actividad simultánea de diferentes regiones del circuito basal ganglia-corticotallamic durante los espontáneos locomoción en un modelo de la enfermedad de Parkinson26.
Por último, una cirugía exitosa también implica implantar las matrices en las estructuras específicas. Las metodologías de diagnóstico por imágenes no invasivas, como la RMN o la tomografía, se pueden realizar después de la cirugía y antes de iniciar grabaciones experimentales. El uso de esta metodología sólo será posible si los implantes específicos utilizados se fabrican para ser compatibles con tales técnicas, y si el investigador tiene acceso a equipos de animales pequeños apropiados. La confirmación final también se puede realizar después de la autopsia. Las secciones manchadas de Nissl que contienen orugas de electrodos se pueden utilizar para determinar con precisión la posición de cada microhilo implantado(Figura 3). Observe que las huellas de electrodos en las secciones coronales aparecen como lágrimas en el tejido. Por lo tanto, se debe tener mucho cuidado cuando se realiza la sección para reducir la posibilidad de crear artefactos que confundirán la interpretación.
Figura 1: Matriz de microelectrodos para implantación en primates pequeños. La matriz estaba compuesta por 32 microhilos de acero inoxidable. Los cables tenían un diámetro de 50 m y se organizaban en siete haces destinados a llegar a las siguientes áreas: corteza motora primaria (M1), putamen (Put), caudado (Cd), globus pallidus (GPe), núcleo vetrolateral y vetroposterior lateral talámico (VPL), y núcleo subtalámico (STN). El interelectrode en cada haz era de 300 m. El espaciado entre paquetes depende de las coordenadas de destino para cada región cerebral. Puede encontrar información más detallada sobre el diseño y la fabricación de arreglos de microelectrodos en Nicolelis31,Lehew y Nicolelis32y Dizirasa et al.33. Barra de escala de 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultado electrofisiológico representativo después de una cirugía exitosa. El panel izquierdo muestra la actividad del pico de dos neuronas (formas de onda amarillas y verdes) registradas desde un electrodo. El panel derecho muestra las oscilaciones potenciales de campo local registradas a partir de 14 electrodos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Sección de tejido manchado nissl que demuestra una pista de electrodos. Esta sección (coordenada anteroposterior, relativa a la línea interaural: +8.0, según el atlas de Paxinos y Watson34)representa una pista de electrodos con la punta en la Putamen, como indica el triángulo negro. Barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este trabajo proporciona una descripción detallada de los procedimientos involucrados en la implantación de matrices de registro de microelectrodos en el cerebro de la marmalseta. Este mismo protocolo se puede utilizar fácilmente al implantar electrodos, ya sean caseros o disponibles comercialmente, en otros primates pequeños. Además, se puede adaptar fácilmente para otros extremos experimentales que requieren una focalización precisa de las estructuras cerebrales. Por lo tanto, este protocolo es deliberadamente vago con respecto a las coordenadas estereotaxias y técnicas de perforación craneal, porque esos son los aspectos que más pueden variar. Por ejemplo, para implantar los arreglos utilizados en esta cirugía, se realizaron craneotomias para abrir dos ventanas de tamaño adecuado en cada hemisferio. Sin embargo, cuando se implantan estructuras individuales resistentes, como cánulas guía, ni esto ni la durectomía son necesarios. Más bien, un simple agujero de rebaba al nivel de la dura será suficiente. Del mismo modo, cuando se trata de implantes no eléctricos, no es necesario que los tornillos se aterparan a tierra. Por lo tanto, se puede omitir el paso 3.9 en el protocolo quirúrgico. En su lugar, el acrílico dental se puede utilizar para cubrir simplemente el cráneo expuesto, el implante y los tornillos.
Independientemente del objetivo experimental específico de la neurocirugía estereotaxia, la implementación exitosa del procedimiento dado gira en gran medida en torno a buenas prácticas quirúrgicas. Esto significa que se deben seguir protocolos rigurosos para realizar la cirugía en condiciones asépticas con el fin de prevenir infecciones postoperatorias35. Algunos de los momentos más críticos son inducir y eliminar la anestesia. Por lo tanto, es esencial que los signos vitales del animal (frecuencia cardíaca, saturación de oxígeno en la sangre y temperatura corporal) sean monitoreados a lo largo de todo el procedimiento quirúrgico36. Si se produce una disminución de la frecuencia cardíaca con una disminución simultánea de la saturación de oxígeno, confirme que el tórax se está inflando y desinflando normalmente, de lo contrario la conexión al respirador puede ser culpable. Lo primero que se puede hacer para intentar recuperar la frecuencia cardíaca y la saturación de oxígeno es disminuir la concentración de isoflurano. Si esto no resuelve el problema, la atropina se puede administrar por vía intramuscular para aumentar la frecuencia cardíaca e intentar estabilizar al animal. Esto debe hacerse con mucha cautela, porque la experiencia previa muestra que una frecuencia cardíaca por encima de 200 bpm sin suficiente isoflurano despertará al animal.
A diferencia de los roedores, en los primates todas las coordenadas se miden generalmente en relación con la coordenada interaural, no con el bregma y el lambda34. Por lo tanto, es importante medir las coordenadas interaurales cero de las matrices de electrodos y otras sondas antes de fijar la cabeza del animal en el aparato estereotaxico. Además, en marmosets el plano horizontal se define como el plano que pasa a través del margen inferior del hueso orbital y el centro del carnoso auditivo externo. Por lo tanto, es importante alinear la superficie inferior del hueso orbital con el centro de las barras de los oídos antes de fijar la cabeza en el marco estereotaxico. Además, los músculos temporales del marmoset cubren una amplia área del cráneo. Por lo tanto, muchos objetivos neuronales requieren que las craneotomías se realicen bajo o muy cerca de esta musculatura. Debido a que estos músculos son importantes para la comunicación de marmoset38,el cirujano debe separar lenta y cuidadosamente esta musculatura del cráneo para minimizar el daño.
Los investigadores familiarizados con el trabajo conductual que involucran roedores o marmotas deben ser conscientes de varias limitaciones al realizar electrofisiología en el comportamiento libre de los NCP. En primer lugar, en la disposición actual y en otros que implican matrices de alta densidad o múltiples matrices, es probable que se requiera inducir anestesia ligera para conectar los conectores de cable, incluso después de una habituación adecuada. Este procedimiento, si bien está comprendido en el ámbito de aplicación de las directrices reglamentarias de los NIH y de otros países, debe realizarse con moderación para reducir el estrés mental y físico en el marmoset. Además, es fundamental que el investigador se asegure de que el animal está totalmente recuperado de la anestesia antes de comenzar la adquisición de datos, de lo contrario la anestesia puede confundir los datos39. Otra limitación relacionada es la presencia física del cable en sí. Mientras que las soluciones de grabación inalámbrica están disponibles40, las opciones cableadas más comunes imponen una restricción física al animal. Por último, la cámara experimental que se utiliza también restringirá la gama de comportamientos disponibles para el marmoset. A diferencia de los roedores, los marmotas muestran comportamientos únicos (por ejemplo, escalada) que no serán posibles dependiendo de la cámara experimental que se utilice.
Los avances en ciencia de materiales e ingeniería están llevando a las nuevas interfaces neuronales41. Los procedimientos neuroquirúrgicos eficaces, como el descrito en este manuscrito, permitirán a los investigadores implementar estas nuevas y próximas herramientas en los marmotas. Combinado con los desarrollos simultáneos en biología molecular3,4,5, marmosets tienen el potencial de permitir investigaciones de importantes cuestiones básicas y clínicas en neurociencia.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores quieren agradecer a Bernardo Luiz por su asistencia técnica en el rodaje y la edición. Esta obra fue apoyada por el Instituto Santos Dumont (ISD), el Ministerio de Educación de Brasil (MEC) y la Coordenaéo de Aperfei-oamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| 683 Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | 55-0000 | |
| Anesthesia Assembly | BRASMED | COLIBRI | |
| Barber Clippers | Mundial | HC-SERIES | |
| Dental Drill | Norgen | B07-201-M1KG | |
| Homeothermic Heating Pad and Monitor | Harvard Apparatus, Inc. | 50-7212 | |
| Marmoset Stereotaxic Frame | Narishige Scientific Instrument Lab | SR-6C-HT | |
| Patient Monitor and Pulse Oximeter | Bionet Co., Ltd | BM3 | |
| Stereotaxic Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | SM-15R | |
| Surgical Microscope | Opto | SM PLUS IBZ | |
| Instruments | |||
| Allis tissue forceps | Sklar | 36-2275 | |
| Alm Retractor, rounded point, 4x4 teeth | Rhosse | RH11078 | |
| Angled McPherson Forceps | Oftalmologiabr | 11301A | |
| Curved Surgial Scissors | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8422 | |
| Curved Tissue Forceps | Sklar | 47-1186 | |
| Delicate Dissection forceps | WPI | WP5015 | |
| Dental Drill Bit | Microdont | ISO.806.314.001.524.010 | |
| Essring Tissue Forceps | Sklar | 19-2460 | |
| FG 1/4 Dental Drill Bit | Microdont | ISO.700.314.001.006.005 | |
| Halsey Needle Holder | WPI | 15926-G | |
| Halstead Mosquito forceps | WPI | 503724-12 | |
| Hemostatic Forceps, Straight | Sklar | 17-1260 | |
| Jewler Forceps | Sklar | 66-7436 | |
| McPherson-Vannas Optathalmic microscissor, 3 mm point | Argos Instrumental | ARGOS-4004 | |
| Pereosteal Raspatory | Golgran | 38-1 | |
| Scalpal Handle | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8354 | |
| Screwdrivers | Eurotool | SCR-830.00 | |
| Sodering Iron | Hikari | 21K006 | |
| Surgical Scissor | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8400 | |
| Toothed forceps | WPI | 501266-G | |
| Disposables/Single Use | |||
| 1 ml sterile syringe with 26 G needle | Descarpack | 7898283812785 | |
| 130 cm x 140 cm surgical field, presterilized | ProtDesc | 7898467276344 | |
| 24G Needle, presterilized | Descarpack | 7898283812846 | |
| 50 cm x 50 cm surgical field, presterilized | Esterili-med | 110100236 | |
| Cotton Tipped Probes, Presterilized | Jiangsu Suyun Medical Materials Co. LTD | 23007 | |
| Cotton tipped Qutips | Higie Topp | 7898095296063 | |
| Electrode Array | Home made | ||
| Endotracheal tube without cuff, internal diameter 2.0 mm, outer diameter 2.9 mm | Solidor | 7898913077201 | |
| Tinned copper wire, 0.15 mm diameter | |||
| M1.4x3 Stainless steel screws | USMICROSCREW | M14-30M-SS-P | |
| Medical Tape | Missner | 7896544910102 | |
| Nylon surgical sutures | Shalon | N540CTI25 | |
| Scalpal Blade, presterilized | AdvantiVe | 1037 | |
| solder | Kester | SN63PB37 | |
| Sterile Saline 0.9% | Isofarma | 7898361700041 | |
| Sterile Surgical Gloves | Maxitex | 7898949349051 | |
| Sterile Surgical Gown | ProtDesc | 7898467281208 | |
| Surgical Gauze, 15 cm x 26 cm presterilized | Héika | 7898488470315 | |
| Gelfoam | Pfizer | ||
| Drugs/Chemicals | |||
| 0.25mg/ml Atropine | Isofarma | ||
| 10% Lidocaine Spray | Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda. | 7896676405644 | |
| 2.5% Enrofloxacino veterinary antibiotic | Chemitec | 0137-02 | |
| Dexametasona Veterinary Anti inflammatory | MSD | R06177091A-00-15 | |
| Hydrogen Peroxide | Farmax | 7896902211537 | |
| Isoflourane | BioChimico | 7897406113068 | |
| Jet Acrylic polymerization solution | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Jet Auto Polymerizing Acrylic | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Ketamine 10% | Syntec | ||
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References
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