Summary
Dit werk presenteert een protocol voor het uitvoeren van een stereotaxic, neurochirurgische implantatie van micro-elektrode arrays in de common marmoset. Deze methode maakt het specifiek mogelijk elektrofysiologische opnames in vrij gedragen dieren, maar kan gemakkelijk worden aangepast aan elke andere soortgelijke neurochirurgische ingreep in deze soort (bv, canule voor Drug Administration of elektroden voor hersenstimulatie).
Abstract
Marmosets (Callithrix jacchus) zijn kleine niet-menselijke primaten die aan populariteit winnen in biomedisch en preklinisch onderzoek, waaronder de neurowetenschappen. Fylogenetisch, deze dieren zijn veel dichter bij de mens dan knaagdieren. Ze vertonen ook complexe gedragingen, waaronder een breed scala aan vocaliisaties en sociale interacties. Hier wordt een effectieve stereotaxic neurochirurgische ingreep voor implantatie van opname elektrode arrays in de common Hapalomys beschreven. Dit protocol geeft ook informatie over de pre-en postoperatieve stappen van dierenverzorging die nodig zijn om een dergelijke operatie succesvol uit te voeren. Tot slot toont dit protocol een voorbeeld van lokaal veld potentieel en Spike activiteit opnames in een vrijelijk gedragen Hapalomys 1 week na de chirurgische ingreep. Over het algemeen biedt deze methode de mogelijkheid om de hersenfunctie te bestuderen in wakker en vrij het gedragen van marmosets. Hetzelfde protocol kan gemakkelijk worden gebruikt door onderzoekers die met andere kleine primaten werken. Daarnaast kan het gemakkelijk worden aangepast om andere studies die implantaten vereisen, zoals stimulerende elektroden, micro injecties, implantatie van optroden of begeleiden cannulas, of ablatie van discrete weefsel regio's.
Introduction
Gewone zijdeaapjes (Callithrix jacchus) krijgen erkenning als een belangrijk modelorganisme in veel onderzoeksgebieden, waaronder neurowetenschappen. Deze primaten van de nieuwe wereld vormen een belangrijk aanvullend diermodel voor zowel knaagdieren als andere niet-menselijke primaten (Nhp's), zoals de rhesus macaque. Net als knaagdieren zijn deze dieren klein, gemakkelijk te manipuleren en relatief zuinig om te verzorgen en te fokken1,2,3,4, in vergelijking met grotere nhp's. Bovendien hebben deze dieren een neiging tot jumelage en hoge feconiteit ten opzichte van andere nhp's1,2,3. Een ander voordeel dat de Hapalomys heeft over vele andere primaten is dat moderne moleculaire biologie tools3,4,5,6,7 en een gesequenced genoom2 ,3,4,5,8 zijn gebruikt om ze genetisch te wijzigen. Zowel knock-in dieren met lentivirus5, en knock-out dieren met behulp van zink-vinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie Activator-achtige Effector NUCLEASEN (Talens)7, hebben opgeleverd levensvatbare oprichter dieren.
Een voordeel ten opzichte van knaagdieren is dat marmosets, als primaten, phylogenetisch dichter bij de mens zijn3,5,6,9,10,11. Net als mensen, zijn zijdeaapjes diurnale dieren die afhankelijk zijn van een sterk ontwikkeld visueel systeem om veel van hun gedrag10te begeleiden. Verder vertonen zijdeaapjes gedrags complexiteit, waaronder een breed scala aan sociaal gedrag, zoals het gebruik van verschillende vocaliisaties3, waardoor onderzoekers vragen kunnen beantwoorden die niet mogelijk zijn in andere soorten. Vanuit een neurowetenschappelijk perspectief hebben marmotten lissencefalie hersenen, in tegenstelling tot de meer gebruikte rhesus makaak9. Bovendien, zijdeaapjes hebben een centraal zenuwstelsel vergelijkbaar met de mens, met inbegrip van een meer sterk ontwikkelde prefrontale cortex9. Samen positioneren al deze kenmerken zijdeaapjes als een waardevol model om de hersenfunctie in gezondheid en ziekte te bestuderen.
Een gemeenschappelijke methode voor het bestuderen van hersenfunctie impliceert het implanteren van elektroden in anatomisch specifieke locaties door middel van stereotaxic neurochirurgie. Dit zorgt voor een chronische registratie van de neurale activiteit in verschillende doelgebieden in wakker en vrij gedragen dieren12,13. Stereotaxic Neurochirurgie is een onmisbare techniek die wordt gebruikt in veel onderzoekslijnen, omdat het precieze targeting van neuroanatomische regio's mogelijk maakt. In vergelijking met makaak en knaagdieren literatuur, er zijn minder gepubliceerde studies beschrijven de stereotaxic Neurochirurgie specifiek voor de marmoset, en ze hebben de neiging om sparse detail van de stappen die betrokken zijn bij de operatie te bieden. Bovendien richten de mensen met meer detail zich voornamelijk op procedures voor de opname van elektrofysiologie in hoofd-ingetogen dieren14,15,16,17.
Om de bredere adoptie van zijdeaapjes als modelorganisme in neurowetenschappelijk onderzoek te vergemakkelijken, definieert de huidige methode specifieke stappen die nodig zijn voor een succesvolle stereotaxic Neurochirurgie in deze soort. Naast de implantatie van opname arrays, zoals beschreven in de huidige methode, kan dezelfde techniek worden aangepast voor vele andere experimentele uiteinden, waaronder implantatie van stimulerende elektroden voor de behandeling van ziekten18 of causaal rijden circuit gedrag19; implantatie van geleidings canules voor extractie en kwantificering van neurotransmitters20, injecties van reagentia, met inbegrip van die voor het inducerende ziekte modellen12 of voor circuit tracing studies15; ablatie van discrete weefsel gebieden21; implantatie van optroden voor optogenetische studies22; implantatie van optische Vensters voor corticale microscopische analyse23; en implantatie van electrocorticografische (ECoG) arrays24. Het algemene doel van deze procedure is dus het beschrijven van de chirurgische stappen die betrokken zijn bij de implantatie van micro-elektrode arrays voor chronische elektrofysiologische opnames in het vrijelijk gedragen van marmosets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door het ethisch comité van het Santos Dumont Institute (protocol 02/2015AAS).
1. chirurgie voorbereiding
- Bevestig elke elektrode-array aan een elektrodehouder die compatibel is met het stereotaxic frame dat moet worden gebruikt.
- Sluit één elektrodehouder aan op de stereotaxic micromanipulator en stel één micro draad in op de interaurale coördinaten. Herhaal dit voor de extra elektrode arrays en houders, indien nodig.
Opmerking: de interaurale coördinaat van elke verwarmings kan worden gebruikt om de implantatie coördinaten voor de gehele array te berekenen, omdat de relatieve afstand tussen de micro draden constant is. Wanneer de array bundels heeft met verschillende lengtes, is de interaurale coördinaat van de langste draad het handigste om te gebruiken voor het instellen van de interaurale Zero. - Maak de elektrode houders los van de stereotaxic micromanipulator en Steriliseer de assemblages (elektrode bevestigd aan de elektrodehouder) in een ultraviolette licht (UV) kast gedurende ten minste 2 uur.
- Bevestig een 24 G naald aan een stereotaxic sonde houder, sluit deze aan op de micro manipulator en stel de interaurale coördinaten in voor de punt van de naald.
Opmerking: voorafgaand aan de operatie moeten de coördinaten van alle craniotomieën vooraf worden gedefinieerd als een omtrek 200 μm2 groter dan de anteroposterieure (AP) en Mediolaterale (ml) positie van de doel implantatie locatie van de array. Gebruik de 24 G naald sonde houder om de positie van de craniotomieën in de schedel te bepalen op basis van de nulinteraurale coördinaten. - Maak de sonde houder los van de micro manipulator en Steriliseer de montage in een UV-kast gedurende ten minste 2 uur.
- Verzamel 6 − 8 Titanium of roestvrijstalen schroeven. Soldeer een massadraad tot de helft van hen.
- Organiseer en steriliseer alle overgebleven instrumenten, apparatuur en Disposables die nodig zijn voor de operatie.
2. preoperatieve procedures
Opmerking: in deze studie werden twee volwassen mannelijke zijdeaapjes (Callithrix jacchus) met een gewicht van 320 – 370 g gebruikt. Zorg ervoor dat het dier niet heeft gegeten voor 6 h voorafgaand aan de inductie van anesthesie.
- Anesthetiseer het dier met een intramusculaire injectie van atropine (0,05 mg/kg) om de speekselvloed en bronchiale afscheidingen te verminderen. Controleer het gebrek aan pedaal responsen.
- Na 5 min. Breng ketamine (10 − 20 mg/kg) intramusculair aan.
- Scheer het hoofd van het dier met een elektrische kapper.
- Dien tramadol (2 mg/kg) intramusculair toe als een algemene pijnstiller.
- Het dier te intuberen.
- Met behulp van een masker, bloot de Hapalomys aan Isofluraan in 1 − 2% zuurstof met een debiet van 1 − 5 L/min voor het opwekken van diepe anesthesie. Wanneer het dier diep anesthetized, verminderen en handhaven van Isofluraan tot 1 − 3 L/min.
- Bevestig een elastische band aan de chirurgische tafel met tape.
- Positioneer de Hapalomys in een liggende positie met het hoofd naar de technicus en plaats de elastische band in de mond van de Hapalomys achter zijn kannen.
Opmerking: het is het beste om het hoofd zodanig te positioneren dat het rugoppervlak naar de vloer wordt gericht en het gezicht naar de technicus gaat. - Veeg met een sonde met wattenstaafje de tong van de marmoset droog en pak hem in één hand om de mond open te houden.
- Spray 10% lidocaïne op het uiteinde van de endotracheale buis.
- Plaats de ongeboeid, 2,0 mm diameter endotracheale buis in de luchtpijp tot de 4,0 cm Mark is bij de ingang van de luchtpijp.
- Bevestig de buis aan de anesthesie-eenheid met de kunstmatige ventilator ingesteld op 40 Adems/min en bevestig de juiste expansie en contractie van de borst.
Opmerking: op dit moment moeten de Isofluraan en zuurstof worden geleverd via de endotracheale buis, niet het masker. - Verwijder de elastische band uit de mond van de marmoset zodat de endotracheale buis aan de kaak kan worden geplakt.
- Plaats de Hapalomys in een gevoelige positie in lijn met het stereotaxic frame en bevestig het hoofd van het dier in het stereotaxic frame.
- Plaats eerst de punt van de rechteroor balk in de rechter gehoorgang van het dier.
- Plaats vervolgens de punt van de linkeroor balk in de linker gehoorgang.
- Plaats het hoofd van het dier in het midden van het stereotaxsche frame en bevestig de oorstangen op hun plek.
- Plaats het mondstuk in de mond van het dier en pas de hoogte aan zodat het de smaak van het dier raakt. Op hetzelfde moment, plaats de orbitale staven op het onderste oppervlak van het orbitale bot.
- Zorg ervoor dat het onderste oppervlak van de orbitale bot horizontaal is uitgelijnd met het midden van de oor staven.
- Sluit een draagbare Pulse Oximeter aan op de hand van de marmoset. Zorg ervoor dat de hartslag binnen 154 − 180 klopt/min (BPM) voor de duur van de operatie; vaak een hartslag boven 200 BPM impliceert dat het dier wakker wordt. Zorg ervoor dat de zuurstofverzadiging hoger is dan 95%. Het kan af en toe dalen tot 90% zonder schade.
Opmerking: als de hartslagmeter onder de 154 BPM daalt, verlaagt u de Isofluraan. - Positioneer de rectale temperatuursonde aangesloten op een homeothermische verwarmingspad in de anus, met de gewenste temperatuur ingesteld voor 37 °C. Plak deze sensor op de tail om deze vast te zetten.
- Breng steriel oftalmisch smeermiddel aan op de ogen.
- Reinig en Desinfecteer het hoofd van het dier met chloorhexidine en Povidon jodium alvorens het dier met een chirurgische veld te bedekken.
Opmerking: Voer alle volgende chirurgische ingrepen uit onder aseptische omstandigheden.
3. chirurgische ingrepen
- Breng lokaal analgeticum subcutaan (bijvoorbeeld lidocaïne 20 mg/mL, 0,1 mL) op de plaats van de beoogde incisie. Maak een incisie in de middenlijn van de hoofdhuid.
- Blootstellen en voorbereiden van het oppervlak van de schedel.
- Verwijder voorzichtig de temporale spier van de schedel. Gebruik eerst een scalpel om de fascia bij het inbrengen in de schedel te snijden. Vervolgens, voorzichtig scheiden de temporale spier van de cranium met behulp van een beenvlies raspatory.
- Verwijder het periosteum van alle blootgestelde cranium met behulp van een beenvlies raspatory.
- Regel het bloeden met een steriel wattenstaafje, indien nodig.
- Reinig het botoppervlak met waterstofperoxide.
- De locatie van de craniotomie afbakenen door de hoeken te markeren met ondiepe Braam gaten in het botoppervlak. Vervolgens, boor de omtrek van de craniotomie met behulp van een tandheelkundige boor op maximale snelheid (d.w.z. 350.000 rpm). Voeg een paar druppels steriele zoutoplossing over de schedel toe tijdens het boren om oververhitting te voorkomen. Meet de positie van de craniotomie en de coördinaten van het elektrode implantaat met betrekking tot de interaurale coördinaten.
- Implantaat schroeven in de schedel.
- Boor 6 − 8 schroefgaten in de cranium.
- Implantaat de schroeven zodanig dat elke grond draad gesmolten schroef grenst aan en in de nabijheid van een ongewijzigde schroef (dat wil zeggen, zonder een aarddraad aangesloten).
- Wind elke aardedraad rond de aangrenzende, ongewijzigde schroef.
- Voeg een druppel zilverkleurige verf toe tussen de grond draad en elke schroef.
- Verwijder het bot in het midden van de craniotomie met behulp van een tang met een gebogen punt (bijv. McPherson-Tang). Houd de dura mater gehydrateerd met een steriele zoutoplossing.
- Verwijder de dura mater. Gebruik een steriele hypodermische naald (25 of 26 G) met de schuine kant gebogen bij ongeveer 90 ° om het oppervlak van de dura mater weg van het hersen oppervlak te prikken en op te tillen. Snijd vervolgens de dura mater met micro schaar. Houd de blootgestelde hersenen gehydrateerd met zoutoplossing.
Opmerking: als significante durale bloedingen worden waargenomen, gebruik dan causale of steriele absorberende gelatine sponzen gedrenkt in thrombine25. - Implantaat micro elektrode arrays.
- Bevestig de gesteriliseerde elektrodehouder en elektrode-array aan de stereotaxic micromanipulator.
- Positioneer de micromanipulator zodanig dat de elektrode op de gewenste anteroposterieure en Mediolaterale coördinaten staat.
- Verlaag de elektrode-array tot de punt van de langste bundel het oppervlak van de hersenen raakt.
- Steek de array langzaam in het hersenweefsel totdat de dorsoventral coördinaten bereikt zijn.
- Bedek de blootgestelde cortex met kleine stukjes steriele, absorberende gelatine sponzen.
- Bevestig de elektrode aan de schedel door het toepassen van tandheelkundige acryl op de blootgestelde schedel, een schroef, en de elektrode.
- Maak de elektrodehouder los en verwijder deze uit de micro manipulator.
- Herhaal de implantatie procedure van stap 3,7 met de extra arrays, indien nodig.
- Wind samen en las de grond draden van de afzonderlijke arrays en schroeven. Gebruik zilver verf om een brug rond de Las te vormen om ervoor te zorgen dat een elektrische verbinding is bereikt.
- Met behulp van tandheelkundige acryl, maak een stevige headcap rond de laterale omvang van de arrays, en volledig bij de grond draden en elke blootgestelde schedel en schroeven.
- Plaats indien nodig een ondersteunings balk in de headcap. Dit kan een stevige plastic cilinder zijn zoals die van een wattenstaafje. Sluit het op zijn plaats met de tandheelkundige acryl.
Opmerking: dit kan nuttig zijn bij het beveiligen van de elektrofysiologie kabel connectors op zijn plaats, maar kan onnodig zijn, afhankelijk van de gebruikte apparatuur. In de huidige methode, een soortgelijke steun staaf wordt aangebracht op het hoofdpodium zodanig dat een elastische band kan robuust houden de hoofd stadia op zijn plaats op de connectors. - Hecht de huid rond de dop.
4. postoperatieve herstel
- Breng antiseptische oplossing (bijv. chloorhexidine) rond de wond aan.
- Schakel de Isofluraan toevoer uit, maar niet de zuurstof en verwijder het dier uit het stereotaxic frame.
- Plaats het dier op het verwarmingskussen met de zuurstof die door de endotracheale buis wordt onderhouden.
- Verwijder de endotracheale buis wanneer de eerste tekenen van neurogene reflexen, zoals Laryngospasmen, worden waargenomen.
- Blijf de zuurstof met een masker leveren totdat het dier duidelijke tekenen van verdoving herstel presenteert, zoals beschermende reflexen, houdings Toon, en pogingen om te ambulëren.
- Plaats het dier in een schone kooi in een herstel ruimte voor 24 − 48 uur voordat het dier naar zijn huis kooi wordt verplaatst. Huis elk geïmplanteerd dier individueel.
Opmerking: omdat zijdeaapjes geneigd zijn om de kooi wanden te beklimmen, gebruik je een kooi met gladde wanden of Bedek je de kooi wanden met een glad oppervlak om te voorkomen dat het dier valt. - In het eerste uur na de operatie, observeer het dier om te letten op tekenen van nood of ongecoördineerd hoofdcontact tegen de zijkant van de kooi.
- Antibiotica toedienen (bijv. enrofloxacine 5 mg/kg, subcutaan, eenmaal daags 5 − 7 dagen), analgetica (bijv. oraal tramadol 1 mg/kg, elke 8 h gedurende 3 − 5 dagen) en ontstekingsremmende geneesmiddelen (bijv. dexamethason 0,5 − 1,5 mg/kg, subcutaan, eenmaal daags 1 − 3 dagen) .
NB: na een geslaagde operatie zullen de dieren binnen 3 − 5 dagen volledig hersteld worden.
5. chronische elektrofysiologische opnames in vrij gedragen zijdeaapjes
- Start de elektrofysiologische opnamesessies ten minste 1 week na de operatie.
Opmerking: gewend de dieren aan de onderzoeker en experimentele omgevingen voordat u begint met alle experimentele procedures voor ten minste 1 maand. - Aan het begin van elke sessie, zachtjes anesthetiseren het dier met behulp van Isofluraan (1 − 5 L/min, 1% O2).
Opmerking: Volg de richtlijnen van de relevante instelling met betrekking tot de sedatie van kleine primaten. Als het opnemen van sessies zijn zeer frequent, wennen aan de dieren moeten worden behandeld, zodat de kabels kunnen worden aangesloten zonder anesthesie. - Verbind de elektrode arrays met een commercieel neurale opnamesysteem.
- Plaats het dier in de experimentele kamer.
Opmerking: de experimentele kamer die hier wordt gebruikt is een kubieke acryl doos (0,45 m x 0,45 m x 0,45 m) ontworpen om de hoeveelheid en het patroon van spontane motorische activiteit26,27te evalueren. - Wacht 30 minuten voordat u begint met de opnames om ervoor te zorgen dat het dier volledig is hersteld van anesthesie.
Opmerking: Isoflurane heeft een snelle begin-en offset actie waardoor snelle sedatie mogelijk is en28wordt wakker. Zodra de Isofluraan toevoer is uitgeschakeld, begint het dier wakker te worden. Het dier is wakker wanneer het in de rechtopstaande positie blijft en kan in de experimentele kamer zonder te vallen kunnen ambuleren. Dit duurt minder dan 15 minuten. Om de afwezigheid van sedatieve effecten te garanderen, begint u de opnames 30 min nadat de Isofluraan is stopgezet. - Bevestig de positie van de micro-elektrodenarray implantaten postmortem door NISSL-kleuring na bevestiging en het snijden van het weefsel29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van deze studie was het beschrijven van een stereotaxic neurochirurgische ingreep voor implantatie van micro-elektrode arrays voor elektrofysiologische opnames in de gewone marmoset. Een typische operatie (van anesthesie inductie tot anesthesie herstel) zal duren ongeveer 5 − 7 h, afhankelijk van het aantal arrays geïmplanteerd. Hier werden twee arrays symmetrisch geïmplanteerd, één in elk hersen halfrond. Elke array bevatte 32 roestvrijstalen micro draden, gerangschikt in zeven bundels die gericht zijn op verschillende structuren van het basale ganglia-corticothalamische circuit (Figuur 1), maar het elektrode ontwerp en de beoogde hersengebieden kunnen variëren, afhankelijk van de Experiment. Na succesvolle operaties en postoperatieve ingrepen moet het dier binnen 3 − 5 dagen volledig worden teruggewonnen. Als de array is geaard en goed geïmplanteerd, zal het mogelijk zijn om spikes (Figuur 2a) en lokale veld potentialen (Figuur 2b) op te nemen in vrij gedragen dieren gedurende enkele weken of maanden, voordat een volwassen gliotische litteken wordt vastgesteld 13,30. De elektrofysiologische gegevens die in het hier beschreven experimentele paradigma worden verzameld, zijn bijvoorbeeld effectief gebruikt om de gelijktijdige activiteit van verschillende gebieden van het basale ganglia-corticothalamische circuit te bestuderen tijdens spontane, op de grond motoriek in een model van de ziekte van Parkinson26.
Tot slot, een succesvolle operatie impliceert ook het implanteren van de arrays in de beoogde structuren. Niet-invasieve beeldvormings methodieken, zoals MRI of tomografie, kunnen worden uitgevoerd na de operatie en voorafgaand aan het begin van experimentele opnames. Het gebruik van een dergelijke methode is alleen mogelijk als de specifieke implantaten die worden gebruikt, worden vervaardigd om verenigbaar te zijn met dergelijke technieken, en als de onderzoeker toegang heeft tot geschikte kleine dier apparatuur. De uiteindelijke bevestiging kan ook postmortem worden uitgevoerd. Nissl bevlekt secties met elektrode sporen kunnen worden gebruikt om de positie van elke geïmplanteerde micro draad nauwkeurig te bepalen (Figuur 3). Merk op dat elektrode sporen in coronale secties verschijnen als tranen in het weefsel. Dus extreme zorg moet worden gebruikt wanneer snijden wordt uitgevoerd om de kans op het maken van artefacten die de interpretatie zal verdringen verminderen.
Figuur 1: micro-elektrode-array voor implantatie bij kleine primaten. De array bestaat uit 32 roestvrijstalen micro draden. De draden waren 50 μm in diameter en werden georganiseerd in zeven bundels die gericht waren op het bereiken van de volgende gebieden: primaire motor cortex (M1), Putamen (put), caudaat (cd), globus pallidus (GPe), ventrolaterale en ventroposterieure laterale thalamische kern (VPL), en subthalame Nucleus (STN). De interelektrode-afstand in elke bundel was 300 μm. De onderlinge bundel afstand is afhankelijk van de doel coördinaten voor elke hersenregio. Meer gedetailleerde informatie over het ontwerp en de fabricage van de micro-elektrode array vindt u in Nicolelis31, lehew en nicolelis32, en dizirasa et al.33. Schaalbalk = 5 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatief elektrofysiologisch resultaat na een geslaagde operatie. Het linker paneel toont Spike activiteit van twee neuronen (gele en groene golfvormen) opgenomen van een elektrode. Het rechter paneel toont lokale veld potentiële oscillaties opgenomen van 14 elektroden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Nissl-gekleurd weefsel gedeelte dat een elektrode spoor aantoont. Deze sectie (anteroposterior coördinaat, ten opzichte van de interaurale lijn: + 8,0, volgens de Atlas door Paxinos en Watson34) toont een elektrode spoor met de punt op het Putamen, zoals aangegeven door de zwarte driehoek. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit werk geeft een gedetailleerde beschrijving van de procedures die betrokken zijn bij de implantatie van micro elektrode-opname arrays in de hersenen van de Hapalomys. Dit zelfde protocol kan gemakkelijk worden gebruikt bij het implanteren van elektroden, of het nu zelfgemaakte of commercieel beschikbaar is, in andere kleine primaten. Bovendien kan het gemakkelijk worden aangepast voor andere experimentele uiteinden die precieze targeting van hersenstructuren vereisen. Daarom is dit protocol doelgericht vaag met betrekking tot stereotaxic coördinaten en craniale boor technieken, omdat dit de aspecten zijn die het meest kunnen variëren. Bijvoorbeeld, voor het implanteren van de arrays gebruikt in deze operatie, craniotomieën werden uitgevoerd om twee van de juiste grootte ramen te openen in elke halfrond. Echter, bij het implanteren van stevige, individuele structuren, zoals gids cannulas, noch dit noch de durectomie is nodig. In plaats daarvan zal een eenvoudig Braam gat naar het niveau van de Dura volstaan. Evenzo, wanneer niet-elektrische implantaten betrokken zijn, is het niet nodig dat de schroeven worden geaard. Dus, stap 3,9 in het chirurgische protocol kan worden weggelaten. In plaats daarvan, tandheelkundige acryl kan worden gebruikt om gewoon bedekken de blootgestelde schedel, implantaat, en schroeven.
Ongeacht het specifieke experimentele doel van de stereotaxic Neurochirurgie, is een succesvolle implementatie van de gegeven procedure grotendeels rond goede chirurgische praktijken. Dit betekent dat strenge protocollen moeten worden gevolgd om de operatie onder aseptische omstandigheden uit te voeren om postoperatieve infecties te voorkomen35. Enkele van de meest kritieke momenten zijn inducerende en het verwijderen van anesthesie. Het is daarom van essentieel belang dat de vitale tekenen van het dier (hartslag, bloed zuurstofverzadiging en lichaamstemperatuur) worden bewaakt gedurende de gehele chirurgische ingreep36. Als een afname van de hartslag met een gelijktijdige daling van de zuurstofverzadiging optreedt, bevestigt u dat de borstkas normaal opblaast en leegloopt, anders kan de verbinding met de Ademhalings machine fout zijn. Het eerste wat kan worden gedaan om te proberen om de hartslag en zuurstofverzadiging te herstellen is om de Isofluraan concentratie te verlagen. Als dit het probleem niet oplost, kan atropine intramusculair worden toegediend om de hartslag te verhogen en te proberen het dier te stabiliseren. Dit moet uiterst voorzichtig gebeuren, omdat eerdere ervaring laat zien dat een hartslag boven 200 BPM zonder voldoende Isofluraan het dier zal ontwaken.
In tegenstelling tot knaagdieren worden alle coördinaten in primaten meestal gemeten ten opzichte van de interaurale coördinaat, niet de bregma en Lambda34. Daarom is het belangrijk om de interaurale nulcoördinaten van de elektrode-arrays en andere sondes te meten alvorens het hoofd van het dier in het stereotaxsche apparaat te bevestigen. Bovendien wordt in zijdeaapjes het horizontale vlak gedefinieerd als het vlak dat door de ondermarge van het orbitale bot en het midden van de uitwendige gehoorgang loopt. Het is dus belangrijk om het onderste oppervlak van het orbitale bot met het midden van de oor staven af te stemmen voordat de kop in het stereotaxic frame wordt vastge- Bovendien hebben de temporele spieren van de Hapalomys betrekking op een groot deel van de cranium. Dus, veel neurale doelwitten vereisen craniotomieën worden uitgevoerd onder of in zeer nauwe nabijheid van deze spier massa. Omdat deze spieren belangrijk voor de Hapalomys communicatie38zijn, moet de chirurg langzaam en voorzichtig loskoppelen van deze spier massa van de schedel om schade te minimaliseren.
Onderzoekers die bekend zijn met gedrags werkzaamheden waarbij knaagdieren of zijdeaapjes betrokken zijn, moeten zich bewust zijn van een aantal beperkingen bij het uitvoeren van elektrofysiologie in vrij gedragen nhp's. Ten eerste, in de huidige regeling en andere met een hoge dichtheid arrays of meerdere arrays, is het waarschijnlijk dat inducerende licht anesthesie nodig zal zijn om de kabel connectors te bevestigen, zelfs na een passende gegegegegegegeis. Deze procedure, binnen het toepassingsgebied van de regelgevings richtlijnen van NIH en andere landen, moet spaarzaam worden uitgevoerd om de mentale en fysieke stress op de marmoset te verminderen. Bovendien, het is van cruciaal belang dat de onderzoeker ervoor zorgen dat het dier volledig is hersteld van de anesthesie voordat u begint met het verzamelen van gegevens, anders kan de anesthesie de gegevens te vinden39. Een andere gerelateerde beperking is de fysieke aanwezigheid van de kabel zelf. Terwijl draadloze opname oplossingen beschikbaar worden40, leggen de meer gebruikelijke bedrade opties een fysieke beperking op het dier. Ten slotte zal de experimentele kamer die wordt gebruikt ook het bereik van gedragingen die beschikbaar zijn voor de marmoset beperken. In tegenstelling tot knaagdieren vertonen zijdeaapjes uniek gedrag (bijvoorbeeld klimmen) dat niet mogelijk is afhankelijk van de gebruikte experimentele kamer.
Vooruitgang in de materiële wetenschappen en engineering leiden tot de nieuwe neurale interfaces41. Effectieve neuro chirurgische ingrepen, zoals beschreven in dit manuscript, zullen onderzoekers toelaten om deze nieuwe en toekomstige tools in marmosets te implementeren. In combinatie met de gelijktijdige ontwikkelingen in de moleculaire biologie3,4,5, hebben zijdeaapjes het potentieel om onderzoeken van belangrijke basis-en klinische vragen in de neurowetenschappen mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Bernardo Luiz graag bedanken voor technische assistentie bij het filmen en bewerken. Dit werk werd gesteund door het Santos Dumont Institute (ISD), het Braziliaanse Ministerie van onderwijs (MEC) en Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de nível Superior (CAPES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| 683 Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | 55-0000 | |
| Anesthesia Assembly | BRASMED | COLIBRI | |
| Barber Clippers | Mundial | HC-SERIES | |
| Dental Drill | Norgen | B07-201-M1KG | |
| Homeothermic Heating Pad and Monitor | Harvard Apparatus, Inc. | 50-7212 | |
| Marmoset Stereotaxic Frame | Narishige Scientific Instrument Lab | SR-6C-HT | |
| Patient Monitor and Pulse Oximeter | Bionet Co., Ltd | BM3 | |
| Stereotaxic Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | SM-15R | |
| Surgical Microscope | Opto | SM PLUS IBZ | |
| Instruments | |||
| Allis tissue forceps | Sklar | 36-2275 | |
| Alm Retractor, rounded point, 4x4 teeth | Rhosse | RH11078 | |
| Angled McPherson Forceps | Oftalmologiabr | 11301A | |
| Curved Surgial Scissors | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8422 | |
| Curved Tissue Forceps | Sklar | 47-1186 | |
| Delicate Dissection forceps | WPI | WP5015 | |
| Dental Drill Bit | Microdont | ISO.806.314.001.524.010 | |
| Essring Tissue Forceps | Sklar | 19-2460 | |
| FG 1/4 Dental Drill Bit | Microdont | ISO.700.314.001.006.005 | |
| Halsey Needle Holder | WPI | 15926-G | |
| Halstead Mosquito forceps | WPI | 503724-12 | |
| Hemostatic Forceps, Straight | Sklar | 17-1260 | |
| Jewler Forceps | Sklar | 66-7436 | |
| McPherson-Vannas Optathalmic microscissor, 3 mm point | Argos Instrumental | ARGOS-4004 | |
| Pereosteal Raspatory | Golgran | 38-1 | |
| Scalpal Handle | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8354 | |
| Screwdrivers | Eurotool | SCR-830.00 | |
| Sodering Iron | Hikari | 21K006 | |
| Surgical Scissor | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8400 | |
| Toothed forceps | WPI | 501266-G | |
| Disposables/Single Use | |||
| 1 ml sterile syringe with 26 G needle | Descarpack | 7898283812785 | |
| 130 cm x 140 cm surgical field, presterilized | ProtDesc | 7898467276344 | |
| 24G Needle, presterilized | Descarpack | 7898283812846 | |
| 50 cm x 50 cm surgical field, presterilized | Esterili-med | 110100236 | |
| Cotton Tipped Probes, Presterilized | Jiangsu Suyun Medical Materials Co. LTD | 23007 | |
| Cotton tipped Qutips | Higie Topp | 7898095296063 | |
| Electrode Array | Home made | ||
| Endotracheal tube without cuff, internal diameter 2.0 mm, outer diameter 2.9 mm | Solidor | 7898913077201 | |
| Tinned copper wire, 0.15 mm diameter | |||
| M1.4x3 Stainless steel screws | USMICROSCREW | M14-30M-SS-P | |
| Medical Tape | Missner | 7896544910102 | |
| Nylon surgical sutures | Shalon | N540CTI25 | |
| Scalpal Blade, presterilized | AdvantiVe | 1037 | |
| solder | Kester | SN63PB37 | |
| Sterile Saline 0.9% | Isofarma | 7898361700041 | |
| Sterile Surgical Gloves | Maxitex | 7898949349051 | |
| Sterile Surgical Gown | ProtDesc | 7898467281208 | |
| Surgical Gauze, 15 cm x 26 cm presterilized | Héika | 7898488470315 | |
| Gelfoam | Pfizer | ||
| Drugs/Chemicals | |||
| 0.25mg/ml Atropine | Isofarma | ||
| 10% Lidocaine Spray | Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda. | 7896676405644 | |
| 2.5% Enrofloxacino veterinary antibiotic | Chemitec | 0137-02 | |
| Dexametasona Veterinary Anti inflammatory | MSD | R06177091A-00-15 | |
| Hydrogen Peroxide | Farmax | 7896902211537 | |
| Isoflourane | BioChimico | 7897406113068 | |
| Jet Acrylic polymerization solution | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Jet Auto Polymerizing Acrylic | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Ketamine 10% | Syntec | ||
| Lidocaine and Phenylephrine 1.8 ml local anesthetic | SS White | 7892525041049 | |
| Povidone-Iodine solutiom | Farmax | 7896902234093 | |
| Riohex 2% surgical Soap | Rioquímica | 7897780209418 | |
| Silver Paint | SPI Supplies | 05002-AB | |
| Tramadol chloride 50 mg/ml | União Química | 7896006245452 | |
| Refresh gel (polyacrylic acid) | Allergan |
References
- Okano, H., Hikishima, K., Iriki, A., Sasaki, E. The common marmoset as a novel animal model system for biomedical and neuroscience research applications. Seminars in Fetal and Neonatal Medicine. 17 (6), 336-340 (2012).
- Harris, R. A., et al. Evolutionary genetics and implications of small size and twinning in callitrichine primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (4), 1467-1472 (2014).
- Kishi, N., Sato, K., Sasaki, E., Okano, H. Common marmoset as a new model animal for neuroscience research and genome editing technology. Development, Growth & Differentiation. 56 (1), 53-62 (2014).
- Sasaki, E. Prospects for genetically modified non-human primate models, including the common marmoset. Neuroscience Research. 93, 110-115 (2015).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Sasaki, E. Creating Genetically Modified Marmosets. The Common Marmoset in Captivity and Biomedical Research. , 335-353 (2019).
- Sato, K., et al. Generation of a Nonhuman Primate Model of Severe Combined Immunodeficiency Using Highly Efficient Genome Editing. Cell Stem Cell. 19 (1), 127-138 (2016).
- Sato, K., et al. Resequencing of the common marmoset genome improves genome assemblies and gene-coding sequence analysis. Scientific Reports. 5, 16894 (2015).
- Chaplin, T. A., Yu, H. H., Soares, J. G. M., Gattass, R., Rosa, M. G. P. A Conserved Pattern of Differential Expansion of Cortical Areas in Simian Primates. Journal of Neuroscience. 33 (38), 15120-15125 (2013).
- Mitchell, J. F., Leopold, D. A. The marmoset monkey as a model for visual neuroscience. Neuroscience Research. 93, 20-46 (2015).
- Brok, H. P. M., et al. Non-human primate models of multiple sclerosis: Non-human primate models of MS. Immunological Reviews. 183 (1), 173-185 (2001).
- Santana, M. B., et al. Spinal Cord Stimulation Alleviates Motor Deficits in a Primate Model of Parkinson's disease. Neuron. 84 (4), 716-722 (2014).
- Ribeiro, M., Santana, M. B., Araujo, M. Neuronal signal description after chronic stainless-steel microelectrode array implants in marmosets. , Available from: http://www.canal6.com.br/cbeb/2014/artigos/cbeb2014_submission_766.pdf (2014).
- MacDougall, M., et al. Optogenetic manipulation of neural circuits in awake marmosets. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1286-1294 (2016).
- Wakabayashi, M., et al. Development of stereotaxic recording system for awake marmosets (Callithrix jacchus). Neuroscience Research. 135, 37-45 (2018).
- Johnston, K. D., Barker, K., Schaeffer, L., Schaeffer, D., Everling, S. Methods for chair restraint and training of the common marmoset on oculomotor tasks. Journal of Neurophysiology. 119 (5), 1636-1646 (2018).
- Sedaghat-Nejad, E., et al. Behavioral training of marmosets and electrophysiological recording from the cerebellum. Journal of Neurophysiology. , (2019).
- Kringelbach, M. L., Owen, S. L., Aziz, T. Z. Deep-brain stimulation. Future Neurology. 2 (6), 633-646 (2007).
- Talakoub, O., Gomez Palacio Schjetnan, A., Valiante, T. A., Popovic, M. R., Hoffman, K. L. Closed-Loop Interruption of Hippocampal Ripples through Fornix Stimulation in the Non-Human Primate. Brain Stimulation. 9 (6), 911-918 (2016).
- Oddo, M., Hutchinson, P. J. Understanding and monitoring brain injury: the role of cerebral microdialysis. Intensive Care Medicine. 44 (11), 1945-1948 (2018).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical Deconstruction of Parkinsonian Neural Circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
- Hammer, D. X., et al. Longitudinal vascular dynamics following cranial window and electrode implantation measured with speckle variance optical coherence angiography. Biomedical Optics Express. 5 (8), 2823-2836 (2014).
- Komatsu, M., Kaneko, T., Okano, H., Ichinohe, N. Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Surgical Techniques for Chronic Implantation of Microwire Arrays in Rodents and Primates. , CRC Press/Taylor & Francis. (2008).
- Santana, M. B., et al. Spinal Cord Stimulation Alleviates Motor Deficits in a Primate Model of Parkinson's disease. Neuron. 84 (4), 716-722 (2014).
- Santana, M., Palmér, T., Simplício, H., Fuentes, R., Petersson, P. Characterization of long-term motor deficits in the 6-OHDA model of Parkinson's disease in the common marmoset. Behavioural Brain Research. 290, 90-101 (2015).
- Misra, S., Koshy, T. A review of the practice of sedation with inhalational anaesthetics in the intensive care unit with the AnaConDa device. Indian Journal of Anaesthesia. 56 (6), 518-523 (2012).
- Freire, M. A. M., et al. Distribution and Morphology of Calcium-Binding Proteins Immunoreactive Neurons following Chronic Tungsten Multielectrode Implants. PLOS ONE. 10 (6), 0130354 (2015).
- Budoff, S., et al. Astrocytic Response to Acutely- and Chronically Implanted Microelectrode Arrays in the Marmoset (Callithrix jacchus) Brain. Brain Sciences. 9 (2), 19 (2019).
- Dzirasa, K., Fuentes, R., Kumar, S., Potes, J. M., Nicolelis, M. A. L. Chronic in vivo multi-circuit neurophysiological recordings in mice. Journal of Neuroscience Methods. 195 (1), 36-46 (2011).
- Nicolelis, M. A. L., et al. Chronic, multisite, multielectrode recordings in macaque monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 11041-11046 (2003).
- Lehew, G., Nicolelis, M. A. L. State-of-the-Art Microwire Array Design for Chronic Neural Recordings in Behaving Animals. , CRC Press/Taylor & Francis. (2008).
- Paxinos, G., Watson, C., Petrides, M., Rosa, M., Tokuno, H. The Marmoset Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Science Publishing Co Inc. San Diego. (2012).
- Brown, M. J., Pearson, P. T., Tomson, F. N. Guidelines for animal surgery in research and teaching. American Journal of Veterinary Research. 54 (9), 1544-1559 (1993).
- Flecknell, P. A. Anaesthesia of Animals for Biomedical Research. British Journal of Anaesthesia. 71 (6), 885-894 (1993).
- Kurihara, S., et al. A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset (Callithrix jacchus). Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Boer, R. A., de Vries, A. M. O., Louwerse, A. L., Sterck, E. H. M. The behavioral context of visual displays in common marmosets (Callithrix jacchus). American Journal of Primatology. 75 (11), 1084-1095 (2013).
- Kudo, C., Nozari, A., Moskowitz, M. A., Ayata, C. The impact of anesthetics and hyperoxia on cortical spreading depression. Experimental Neurology. 212 (1), 201-206 (2008).
- Ghomashchi, A., et al. A low-cost, open-source, wireless electrophysiology system. 2014 36th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 3138-3141 (2014).
- Fu, T. M., Hong, G., Viveros, R. D., Zhou, T., Lieber, C. M. Highly scalable multichannel mesh electronics for stable chronic brain electrophysiology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), 10046-10055 (2017).
