Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

כירורגיה סטריאוטקאית עבור השרשה של מערכים מיקרואלקטרודה ב מרמוסטמצוי

Published: September 29, 2019 doi: 10.3791/60240
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1,3
1Edmond and Lily Safra International Institute of Neuroscience, Santos Dumont Institute, 2Neuroscience Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Physiological Sciences, Health Sciences Center, Federal University of Espírito Santo
* These authors contributed equally

Summary

עבודה זו מהווה פרוטוקול לביצוע השרנית, השתלת נוירו-ניתוחית של מערכים מיקרואלקטרודה במרסט המשותף. שיטה זו מאפשרת באופן מפורש הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בבעלי חיים מתנהגים בחופשיות, אך ניתן להתאים בקלות לכל התערבות נוירולוגית דומה אחרת במין זה (למשל, צינורית עבור מינהל התרופות או אלקטרודות לגירוי מוחי).

Abstract

מרמוסטים (הקליריות) הם יונקים קטנים שאינם אנושיים, אשר צוברים פופולריות במחקר ביו-קליני, כולל מדעי המוח. פילוגנטית, החיות האלה קרובות. יותר לבני אדם מאשר מכרסמים הם גם מציגים התנהגויות מורכבות, כולל מגוון רחב של התאמות ואינטראקציות חברתיות. כאן, הליך נוירוניתוחי כירורגי יעיל להשתלה של מערכי אלקטרודה הקלטה במרסט המשותף מתואר. פרוטוקול זה מפרט את הצעדים שלפני ואחרי הניתוח של טיפול בבעלי חיים הנדרשים לבצע ניתוח מוצלח כזה. לבסוף, פרוטוקול זה מציג דוגמה של פוטנציאל שדה מקומי הקלטות של פעילות ספייק ב מרמוסט התנהגות חופשית 1 שבוע לאחר ההליך הכירורגי. באופן כללי, שיטה זו מספקת הזדמנות ללמוד את תפקוד המוח הערה ובחופשיות מתנהג מרמוסטים. הפרוטוקול אותו ניתן להשתמש בקלות על ידי החוקרים עובדים עם פרימטים קטנים אחרים. בנוסף, ניתן לשנות אותו בקלות כדי לאפשר מחקרים אחרים הדורשים שתלים, כגון מגרה אלקטרודות, מיקרוזריקות, השרשה של optrodes או צינורית מדריך, או אבלציה של אזורי רקמה דיסקרטית.

Introduction

מרמוסטים משותפים (מיקפון) הם צוברים הכרה כאורגניזם מודל חשוב בתחומים רבים של מחקר, כולל מדעי המוח. הפרימטים החדשים של העולם החדש מייצגים דגם בעלי חיים חשוב ומשלים לשני מכרסמים ופרימטים לא אנושיים אחרים (NHPs), כגון מקוק רזוס. כמו מכרסמים, בעלי חיים אלה הם קטנים, קל לתמרן, וחסכוני יחסית לטיפול ולהתרבות1,2,3,4, לעומת nhps גדול. יתר על כן, בעלי חיים אלה יש נטייה לתאומים ופוריות גבוהה ביחס nhps אחרים1,2,3. יתרון נוסף מרמוסט יש מעל פרימטים רבים אחרים היא כי כלים ביולוגיה מולקולרית מודרני3,4,5,6,7 ו הגנום רציף2 ,3,4,5,8 . שימשו כדי לשנות אותם גנטית שני בעלי חיים הדפיקה באמצעות וירוס5, ובעלי חיים לנקוש באמצעות הנוקלאוסים של אצבעות אבץ (ZFNs) ותמלול activator כמו נוקלאוסיס (talens)7, הניבו חיות מייסד קיימא.

יתרון ביחס מכרסמים הוא כי מרמוסטים, כמו פרימטים, הם phylogenetically קרוב לבני אדם3,5,6,9,10,11. כמו בני אדם, מרמוסטים הם בעלי חיים יומי התלויים במערכת חזותית מפותחת מאוד להנחות הרבה מההתנהגות שלהם10. יתר על כן, מרמוסטים את המורכבות ההתנהגותית, כולל מגוון רחב של התנהגויות חברתיות כגון שימוש בהסברים שונים3, המאפשר לחוקרים לטפל בשאלות שאינן אפשריות במינים אחרים. מנקודת מבט נוירולוגית, מרמוסטים יש מוחות lissencephaly, בניגוד לשימוש נפוץ יותר רזוס מקוק9. יתר על כן, מרמוסטים יש מערכת העצבים המרכזית דומה לבני אדם, כולל קליפת ראש מפותחת יותר מפותח9. ביחד, כל המאפיינים הללו עמדות מרמוסטים כמודל יקר ללמוד תפקוד המוח בריאות ומחלות.

שיטה נפוצה ללמידה בתפקוד המוח כרוכה בזריעת אלקטרודות במיקומים ספציפיים מבחינה אנטומית באמצעות נוירוכירורגיה סטריאוטקאית. הדבר מאפשר הקלטה כרוכרותית של הפעילות העצבית באזורי יעד שונים, ומתנהגים באופן חופשי בעלי חיים12,13. נוירוכירורגיה סטריאוטקאית היא טכניקה הכרחית בשימוש בקווים רבים של מחקר, כפי שהיא מאפשרת מיקוד מדויק של אזורים נוירואנטומיים. לעומת מקוק וספרות מכרסמים, יש פחות מחקרים שפורסמו המתארים את הנוירוכירורגיה סטריאוטקאית ספציפיים למרסט, והם נוטים לספק פירוט דליל של השלבים המעורבים בניתוח. יתר על כן, אלה עם פירוט רב יותר בעיקר להתמקד בהליכים עבור הקלטת אלקטרופיזיולוגיה בעלי חיים מאופקים הראש14,15,16,17.

על מנת להקל על אימוץ רחב יותר של מרמוסטים כאורגניזם מודל במחקר מדעי המוח, השיטה הנוכחית מגדירה צעדים ספציפיים הנחוצים עבור נוירוכירורגיה מוצלחת סטריאוטקאית במין זה. בנוסף השרשה של מערכי הקלטה, כפי שמפורט בשיטה הנוכחית, אותה טכניקה יכולה להיות מותאמת לקצוות ניסיוניים רבים אחרים, כולל השרשה של האלקטרודות הגירוי לטיפול במחלות18 או causally נהיגה התנהגות מעגל19; השרשה של צינורית מדריך לחילוץ וכימות של נוירוטרנסמיטורים20, זריקות של ריאגנטים, כולל אלה עבור גרימת מודלים מחלות12 או עבור לימודי העקיבה מעגלים15; אבלציה של אזורים רקמה דיסקרטית21; השרשה של optrodes עבור לימודי אלקטרואופטיקה22; השרשה של חלונות אופטיים לניתוח מיקרוסקופית קורטיקלית23; והשרשה של מערכים electrocorticographic (ECoG)24. כך, המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר את השלבים המנתחים המעורבים השרשה של מערכי מיקרואלקטרודה עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות כרונית באופן חופשי התנהגות מרמוסטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם למוסדות הלאומיים של מדריך הבריאות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים ואושרה על ידי ועדת האתיקה של מכון סנטוס דומונט (פרוטוקול 02/2015AAS).

1. הכנת כירורגיה

  1. חברו כל מערך אלקטרודה למחזיק אלקטרודה התואם למסגרת הסטריאוטקאית שישמשו.
  2. חברו מחזיק אלקטרודה אחד למיקרומניפולציה הסטריאוטקאנית והגדר את המיקרוגל לנקודת הציון הבין-שמיעה. במידת הצורך יש לחזור על המערכים והמחזיקי האלקטרודות הנוספים.
    הערה: ניתן להשתמש בקואורדינטות הבין-שמיעה של כל המיקרוגל כדי לחשב את קואורדינטות ההשתלה עבור המערך כולו, משום שהמרחק היחסי בין המיקרוגל הוא קבוע. כאשר למערך יש צרורות באורכים שונים, קואורדינטת השמיעה של החוט הארוך ביותר היא הנוחה ביותר לשימוש לקביעת האפס הפנימי.
  3. ניתוק מחזיקי האלקטרודות מהמיקרומניפולציה הסטריאופתית ומעקר את ההרכבות (האלקטרודה המצורפת למחזיק האלקטרודות) בארון אור אולטרה סגול (UV) לפחות 2 h.
  4. חברו את המחט ל -24 גר' למחזיק בדיקה סטריאוטיפתית, חברו אותו למיקרומניפולציה וקבעו את נקודות הציון הבין-שמיעה לקצה המחט.
    הערה: לפני הניתוח, הקואורדינטות של כל כריתת הגולגולת יש להיות מוגדרות מראש כמו היקפית 200 יקרומטר2 גדול יותר מאשר anteroposterior (AP) ו מדיה (ML) מיקום של אתר השתלת היעד של המערך. השתמש 24 G-המחט המקדח ההרכבה המחזיק כדי לקבוע את המיקום של כריתת הגולגולת במוח על בסיס קואורדינטות אפס שמיעה.
  5. נתק את מחזיק הגשוש מהמיקרומניפולציה ועקר את ההרכבה בארון UV לפחות 2 שעות.
  6. לאסוף 6-8 ברגים טיטניום או נירוסטה. . הלחמה הייתה כבל קרקע לחצי מהם
  7. ארגן ועקר את כל הכלים, הציוד והמכשירים הנותרים הדרושים לניתוח.

2. הליכים מוקדמים

הערה: שני מרמוסטים זכרייםמבוגרים (הג משחק) במשקל 320 – 370 גרם שימשו במחקר זה. ודא כי בעל החיים לא אכל 6 h לפני האינדוקציה של הרדמה.

  1. להוריד את החיה עם הזרקת השרירים של אטרופין (0.05 מ"ג/ק"ג) כדי להפחית את הפרשות הריר והסימפונות. בדוק אם יש מחסור בתגובות פדלים.
  2. לאחר 5 דקות להחיל קטמין (10 למעלה 20 מ"ג/ק"ג) תוך הקפדה.
  3. גלח את ראשו של בעל החיים באמצעות קוצץ ספרים חשמלי.
  4. ניהול טרמדול (2 מ"ג/ק"ג) בפנים באופן משני כאבים כלליים.
  5. . לסדר את החיה
    1. באמצעות מסכה, לחשוף את המרסט ל-isofלאנה ב-1-2% חמצן עם קצב הזרימה של 1-5 L/min כדי לגרום להרדמה עמוקה. כאשר החיה מורדם עמוקות, הפחת ושמור על isofלינה עד 1-3 L/min.
    2. הצמדת רצועה אלסטית לטבלה הכירורגית עם הקלטת.
    3. מקמו את המרסט בתנוחת פרקדן עם הראש לכיוון הטכנאי ומניחים את הרצועה האלסטית בפה של מרמוסט מאחורי הכלבים.
      הערה: מומלץ למקם את הראש כך שמשטח העורף מופנה לכיוון הרצפה ופניו כלפי הטכנאי.
    4. באמצעות בדיקה משופעת כותנה, לנגב את לשונו של מרמוסט, ולתפוס אותו ביד אחת כדי לשמור על הפה פתוח.
    5. רסס 10% לידוקאין על. קצה צינור הקנה
    6. הכנס את הצינור הבלתי מאזוק, 2.0 מ"מ בקוטר של שפופרת לתוך קנה הנשימה עד לסימן 4.0 ס מ בכניסה של קנה הנשימה.
    7. חברו את הצינורית להרכבת ההרדמה עם המאוורר המלאכותי ל40 נשימות/דקות ולאישור התרחבות והתכווצות של החזה.
      הערה: בזמן זה יש להעביר את האיזו, והחמצן דרך צינורית האנדוקנה, ולא המסכה.
    8. הסירו את הרצועה האלסטית מהפה של המרסט, כך שצינור האנדוקנה יכול להיות מודבק ללסת.
  6. הצב את המרסט בתנוחה מועדת בשורה עם המסגרת הסטריאוטקאית ותקן את ראשו של בעל החיים לתוך המסגרת הסטריאוטקתית.
    1. ראשית, הכנס את קצה פס האוזן הימני לתעלת השמיעה הימנית של בעל החיים.
    2. לאחר מכן, הכנס את קצה שורת האוזן השמאלית לתעלת השמיעה השמאלית.
    3. מרכז את ראש החיה במרכז המסגרת הסטריאוטקאית ותקן את פסי האוזן במקומם.
    4. הכנס את הפיה לתוך פיו של בעל החיים והתאם את גובהו כך שייגע בהחך של בעל החיים. במקביל, למקם את הסורגים במשטח התחתון של העצם מסלולית.
    5. ודאו שהמשטח התחתון של עצם האורביטל מיושר אופקית עם מרכז פסי האוזן.
  7. . להתחבר לידו של מרמוסט ודא שקצב הלב הוא בטווח של 154-180 פעימות/דקות (bpm) למשך הניתוח; לעתים קרובות קצב הלב מעל 200 bpm מרמז על החיה הוא מתעורר. ודא כי רווית החמצן היא מעל 95%. זה עלול מדי פעם לרדת ל 90% ללא נזק.
    הערה: על קצב הלב לרדת מתחת 154 bpm, להקטין את isofלוריאן.
  8. הצב את הטמפרטורה פי הטבעת מחובר למשטח חימום ביתיות לתוך פי הטבעת, עם הטמפרטורה הרצויה להגדיר עבור 37 ° c. הקלטת חיישן זה לזנב כדי לשמור אותו קבוע במקום.
  9. החלת חומר סיכה סטרילי לעיניים.
  10. לנקות ולחטא את ראשו של בעל החיים עם כלורקסאידין ו-povidone יוד לפני כיסוי החיה עם שדה כירורגי.
    הערה: בצע את כל ההליכים המנתחים הבאים בתנאים אספטי.

3. הליכי ניתוח

  1. החל תת-עורי כאבים מקומיים (למשל, לידוקאין 20 מ"ג/mL, 0.1 mL) באתר של החתך המיועד. לעשות חתך בקו האמצע של הקרקפת.
  2. לחשוף ולהכין את פני השטח של הגולגולת.
    1. מנתק בזהירות את השריר. הזמני מהגולגולת ראשית, השתמשו באזמל כדי לחתוך. את הfascia בכניסה לגולגולת לאחר מכן, הפרד בעדינות את השריר הזמני מהגולגולת תוך שימוש בשיטת הקרום.
    2. הסירו את הקרום מכל הגולגולת. החשופה בעזרת קרום החזה
    3. שלוט על הדימום באמצעות ספוגית כותנה סטרילית, אם יש צורך בכך.
    4. נקו את משטח העצמות. עם מי חמצן
  3. מסמן את המיקום של פתיחת הגולגולת על ידי סימון הפינות שלו עם חורים בגולגולת רדוד לתוך משטח העצם. ואז, לקדוח את המערכת של הפיום הגולגולת באמצעות מקדחה שיניים במהירות מקסימלית (כלומר, 350,000 rpm). הוסיפו כמה טיפות של תמיסת מלח סטרילית על הגולגולת תוך כדי קידוח כדי למנוע התחממות יתר. למדוד את המיקום של הפיום הגולגולת ואת הקואורדינטות של שתל האלקטרודה ביחס לקואורדינטות הבין-שמיעה.
  4. . בורגי שתל לתוך הגולגולת
    1. . מקדחה 6-8 חורים לברגים לתוך הגולגולת
    2. השתל את הברגים כך שכל בורג תיל התמזגו ברגים סמוכים ובסמיכות של בורג ללא שינה (כלומר, בלי חוט הקרקע מחובר אליו).
    3. רוח כל חוט הקרקע סביב הבורג הסמוך, שאינו משולם.
    4. מוסיפים טיפה של צבע כסף בין התיל הקרקעי לבין כל בורג.
  5. להסיר את העצם במרכז הפיום הגולגולת באמצעות מלקחיים עם טיפ מעוקל (למשל, מלקחיים מקפירסון). שמור על מאטר הקרום. עם תמיסת מלח סטרילית
  6. . הסר את הקרום הדורה השתמשו במחט סטרילית תת-עורית (25 או 26 גרם) עם השיקוע כפוף בקירוב כ 90 ° כדי לנקב ולהרים את המשטח של המאטר דורא הרחק ממשטח המוח. אז תחתוך את הקרום. עם מיקרו-מספריים שמור על המוח החשוף. מהתייבשות בתמיסת מלח
    הערה: אם הדימום ריר משמעותי הוא נצפתה, השימוש בניקוי הג או הג סופג סטרילי ספוגים בקריבטין25.
  7. . מערכים של שתל מיקרואלקטרודה
    1. חברו את מחזיק האלקטרודה העקר ואת מערך האלקטרודות למיקרומניפולציה הסטריאוטקאית.
    2. הצב את המיקרומניפולציה כך שהאלקטרודה תהיה בקואורדינטות הanteroposterior והמיוחלות הרצויות.
    3. הנמך את מערך האלקטרודות עד שקצה הצרור הארוך ביותר ייגע במשטח המוח.
    4. הכנס לאט את המערך לתוך רקמת המוח עד שהוא מגיע לנקודות הציון הגסולזיות.
    5. לכסות את קליפת המוח חשוף עם חתיכות קטנות של ספוגים הג עקר וסופג.
    6. לאבטח את האלקטרודות לגולגולת על ידי החלת אקריליק שיניים לגולגולת חשוף, בורג אחד, ואת האלקטרודה.
    7. נתק את מחזיק האלקטרודות והסר אותו מהמיקרומניפולציה.
  8. חזור על תהליך ההשתלה משלב 3.7 עם המערכים הנוספים, במידת הצורך.
  9. הרוח יחד לרתך את חוטי הקרקע של מערכים וברגים נפרדים. השתמש בצבע כסף כדי ליצור גשר סביב הריתוך כדי להבטיח חיבור חשמלי הושג.
  10. באמצעות אקריליק שיניים, לעשות כובע ראש חסון סביב היקף לרוחב של המערכים, ולגמרי לחלוטין את חוטי הקרקע ואת כל הגולגולת וברגים חשופים.
  11. במידת הצורך, הכנס סרגל תמיכה לתוך המכסה הקדמי. זה יכול להיות צילינדר פלסטיק חסון כמו אלה מתוך ספוגית כותנה. תנעלו את זה במקום. עם אקריליק שיניים
    הערה: הדבר עשוי לסייע באבטחת מחברי כבל האלקטרופיזיולוגיה במקומם, אך ייתכן שאין צורך לעשות זאת בהתאם לציוד שבשימוש. בשיטה הנוכחית, מוצמדת מוט תמיכה דומה לשלב הראש, כך שהלהקה האלסטית יכולה להחזיק את שלבי הראש במקומם על המחברים.
  12. . תפר את העור מסביב למכסה הראש

4. שחזור שלאחר הניתוח

  1. החל תמיסת חיטוי (למשל, כלורהקדין) סביב הפצע.
  2. והוציאו את החיה מהמסגרת. הסטריאוטקאית
  3. הניחו את החיה על משטח החימום עם החמצן המתוחזק דרך צינורית האנדוקנה.
  4. להסיר את צינור האנדוקנה כאשר הסימנים הראשונים של רפלקסים נוירוגניים, כגון laryngospasms, הם נצפו.
  5. המשיכו לספק את החמצן עם מסכה עד שהחיה מציגה סימנים ברורים של התאוששות מהרדמה, כגון רפלקסים מגינים, הטון הפוסט, וניסיונות לambulate.
  6. מניחים את החיה בתוך כלוב נקי בחדר התאוששות 24 עד 48 שעות לפני הזזת החיה לכלוב הבית שלה. הבית כל חיה מושתל בנפרד.
    הערה: מכיוון שמרסטים נוטים לטפס על קירות הכלוב, להשתמש בכלוב עם קירות חלקים או לכסות את קירות הכלוב עם משטח חלק כדי למנוע את החיה מליפול.
  7. בשעה הראשונה שלאחר הניתוח, התבונן בבעל החיים לצפייה בסימני מצוקה או במגע בראש כנגד צד הכלוב.
  8. ניהול אנטיביוטיקה (למשל, enrofloxacin 5 מ ג/ק"ג, תת-עורי, פעם ביום עבור 5-7 ימים), משככי כאבים (למשל, טרמדול אוראלי 1 מ"ג/ק"ג, כל 8 h עבור 3-5 ימים) ותרופות אנטי דלקתיות (g., דקאמת1 0.5 ליטר וחצי מ"ג/ק"ג, תת-עורי, פעם ביום עבור 1-3 ימים) .
    הערה: לאחר ניתוח מוצלח, בעלי חיים יהיו משוחזרים באופן מלא תוך 3-5 ימים.

5. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות כרוניות במרסטים מתנהגים בחופשיות

  1. התחל את ההקלטה האלקטרופיסיולוגית לפחות שבוע לאחר הניתוח.
    הערה: הHabituate את בעלי החיים לחוקר ולסביבות נסיוניות לפני שמתחילים את כל ההליכים הניסיוניים לפחות חודש אחד.
  2. בתחילת כל מפגש, הפילו בקלות את החיה באמצעות איזוofלבנה (1-5 L/דקות, 1% O2).
    הערה: בצע את ההנחיות הרלוונטיות של המוסד לגבי הרגעה של יונקים קטנים. אם מפגשי ההקלטה תכופים מאוד, habituate החיות שיטופלו כך שניתן יהיה לחבר כבלים ללא הרדמה.
  3. חברו את מערכי האלקטרודה. למערכת הקלטה מסחרית
  4. מניחים את החיה. בתוך התא הנסיוני
    הערה: החדר הניסיוני המשמש כאן הוא תיבת אקריליק מעוקב (0.45 m x 0.45 m x 0.45 m) נועד להעריך את כמות ותבנית של פעילות מוטורית ספונטנית26,27.
  5. המתן 30 דקות לפני תחילת ההקלטות כדי להבטיח את החיה הוא התאושש באופן מלא מן ההרדמה.
    הערה: Isofלאנה יש התחלה מהירה פעולה היסט המאפשר הרגעה מהירה התעוררות28. , ברגע שאספקת האספקה מבוטלת. החיה תתחיל להתעורר בעל החיים ער כאשר הוא נשאר בתנוחה זקופה ויכול לambulate בחופשיות בחדר הניסיוני מבלי ליפול. . זה לוקח פחות מ -15 דקות כדי להבטיח את היעדר כל אפקטי הרגעה, התחל את ההקלטות 30 דקות לאחר הפסקה של isofלאנה.
  6. לאשר את המיקום של השתלים מערך מיקרואלקטרודה בעקבות הצביעת NISSL לאחר תיקון והסדרת הרקמה29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מטרת המחקר הזה הייתה לתאר הליך נוירוניתוחי כירורגי להשתלה של מערכי מיקרואלקטרודה להקלטות אלקטרופיזיולוגיות במרסט המשותף. ניתוח אופייני (החל מאינדוקציה הרדמה להתאוששות הרדמה) יימשך כ 5-7 שעות, תלוי במספר מערכים מושתל. , שני מערכים היו מושתלים באופן סימטרי. אחד בכל חצי מימדי המוח כל מערך הכיל 32 המיקרוגל פלדת אל-חלד מסודרים בשבעה צרורות התמקדות מבנים מסוימים של המעגל הבסיס ganglia-corticothalamic (איור 1), אבל עיצוב האלקטרודה ואזורי המוח ממוקדות עשוי להשתנות בהתאם ל ניסוי. לאחר ניתוח מוצלח של ניתוחים מוצלחים, על בעל החיים להיות משוחזר לחלוטין תוך 3-5 ימים. אם המערך היה מקורקע והושתל כראוי זה יהיה אפשרי להקליט קוצים (איור 2A) ופוטנציאל השדה המקומי (איור 2a) בעלי חיים מתנהגים בחופשיות במשך מספר שבועות או חודשים, לפני שנוצר צלקת בוגרת gliotic 13,30. כדוגמה, הנתונים אלקטרופיסיולוגיים שנאספו בפרדיגמה הניסיונית שתוארה כאן נעשה שימוש יעיל כדי ללמוד את הפעילות הזמנית של אזורים שונים של המעגל הבסיס ganglia-corticothalamic במהלך ספונטני, מבוסס על קרקע תנועה במודל של מחלת פרקינסון26.

לבסוף, ניתוח מוצלח כרוך גם בנטיעת המערכים לתוך המבנים המיועדים. מתודולוגיות דימות לא פולשנית, כגון MRI או טומוגרפיה ניתן לבצע בעקבות הניתוח ולפני תחילת ההקלטות הנסיוניות. השימוש במתודולוגיה כזו יהיה אפשרי רק אם השתלים הספציפיים ששימשו לשימוש מיוצרים כתואמים לטכניקות כאלה, ואם לחוקר יש גישה לציוד בעל-חיים קטן ומתאים. ניתן גם לבצע את האישור האולטימטיבי לאחר המוות. מוכתם nissl סעיפים המכילים פסי אלקטרודה ניתן להשתמש כדי לקבוע במדויק את המיקום של כל המיקרוגל מושתל (איור 3). שים לב כי פסי האלקטרודה בסעיפים הקורונאליות מופיעים כדמעות ברקמה. לכן יש להשתמש בטיפול הקיצוני כאשר הדבר מבוצע כדי להקטין את הסיכוי ליצור חפצים שיגמלו בפרשנות.

Figure 1
איור 1: מערך מיקרואלקטרודה להשתלה בפרימטים קטנים. המערך היה מורכב מ32 נירוסטה. החוטים היו 50 יקרומטר בקוטר והיו מאורגנים בשבעה חבילות שנועדו להגיע לתחומים הבאים: קליפת המנוע העיקרית (M1), putamen (לשים), מזונבת (Cd), גלובוס pallidus (gpe), ונטרוצדדי ו ונטרופאל לרוחב הגרעין הרוחבי (vpl), ו גרעין תת-תלמי (STN). מרווח בין האלקטרודות בכל צרור היה 300 μm. המרווח בין החבילה תלוי בקואורדינטות היעד של כל אזור מוח. מידע מפורט יותר על עיצוב מערך microelectrode וייצור ניתן למצוא בניקולאוס31, Lehew וניקולאוס32, ודיז'טעם ואח '33. סרגל בקנה מידה = 5 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התוצאה האלקטרולוגית הייצוגית לאחר ניתוח מוצלח. הפאנל השמאלי מראה פעילות ספייק של שני נוירונים (הצהוב צורות גל ירוק) הקליט מתוך אלקטרודה אחת. הלוח הימני מציג תנודות פוטנציאליות בשדה המקומי שנרשמו מ -14 אלקטרודות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הרקמה המוכתמת של ניססל הפגנת מסלול אלקטרודה. סעיף זה (anteroposterior תיאום, יחסית לקו הבינשמיעה: + 8.0, על פי האטלס על ידי Paxinos ו-Watson34) מתאר מסלול אלקטרודה עם הקצה של Putamen, כפי שמצוין על ידי המשולש השחור. סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עבודה זו מספקת תיאור מפורט של ההליכים המעורבים השרשה של מערכי הקלטה מיקרואלקטרודה במוח מרמוסט. אותו פרוטוקול ניתן להשתמש בקלות בעת השתלת אלקטרודות, אם ביתי או מסחרית זמין, בפרימטים קטנים אחרים. בנוסף, זה יכול להיות מותאם בקלות לקצוות ניסיוניים אחרים הדורשים התמקדות מדויקת של מבני המוח. לכן, פרוטוקול זה הוא מעורפל בכוונה לגבי קואורדינטות סטריאוטקאיות וטכניקות קידוח הגולגולת, כי אלה הם ההיבטים שעשויים להשתנות ביותר. לדוגמה, כדי להשתיל את המערכים המשמשים בניתוח זה, השתמשו בניתוחי הגולגולת כדי לפתוח שני חלונות בגודל מתאים בכל אחד מהאונה. עם זאת, כאשר השתילה מבנים חזקים, כגון באמצעות צינורית מדריך, לא זה ולא הניתוח הנדרש. במקום זאת, יהיה מספיק בור בר פשוט לרמת הדורא. באופן דומה, כאשר שתלים לא חשמליים מעורבים זה לא הכרחי כדי הברגים להיות מקורקע. לכן, שלב 3.9 בפרוטוקול הכירורגי יכול להיות מושמט. במקום זאת, אקריליק שיניים ניתן להשתמש רק כדי לכסות את הגולגולת חשוף, השתל, וברגים.

ללא קשר למטרה הניסיונית הספציפית של נוירוכירורגיה הסטריאוטקאית, יישום מוצלח של ההליך הנתון סובב במידה רבה סביב נוהלי ניתוח טובים. משמעות הדבר היא כי פרוטוקולים קפדניים חייב להיות בעקבותיו כדי לבצע את הניתוח בתנאים אספטי כדי למנוע זיהומים הניתוח הפוסט-מנתחים35. חלק מהרגעים הקריטיים ביותר. הם גרימת והסרת הרדמה לכן חיוני כי הסימנים החיוניים של בעל החיים (קצב הלב, רווית חמצן בדם, טמפרטורת הגוף) להיות מנוטרים במהלך כל ההליך הכירורגי36. אם ירידה בקצב הלב עם ירידה במקביל ברוויית החמצן מתרחשת, לאשר כי החזה הוא מנפח והשטפת באופן נורמלי, אחרת החיבור למכונת הנשימה עלולה להיות אשמה. הדבר הראשון שניתן לעשות כדי לנסות לשחזר את קצב הלב ואת רוויית החמצן היא להקטין את הריכוז isofלאנה. אם זה לא פותר את הבעיה, אטרופין עשוי להיות מנוהל באופן פנימי כדי להגדיל את קצב הלב ולנסות לייצב את החיה. זה חייב להיעשות בזהירות רבה, כי הניסיון הקודם מראה כי קצב הלב מעל 200 בדקה ללא מספיק isofלאנה לעורר את החיה.

בניגוד למכרסמים, קופים כל הקואורדינטות מדודות בדרך כלל יחסית לקואורדינטות הבין-שמיעה, לא לברגמה ולמדא34. לכן, חשוב למדוד את הקואורדינטות הבין-שמיעה של מערכי האלקטרודה והבדיקות האחרות לפני תיקון ראש החיה במנגנון הסטריאוטקאלי. יתר על כן, ב מרמוסטים המישור האופקי מוגדר כמטוס עובר דרך השוליים הנמוכים של העצם מסלולית ומרכז השמיעה החיצונית מטוס. לכן, חשוב ליישר את המשטח התחתון של עצם המים במרכז פסי האוזן לפני תיקון הראש במסגרת הסטריאוטקאית. יתר על כן, שרירי הרקה של מרמוסט לכסות שטח רחב של הגולגולת. לפיכך, מטרות עצביות רבות דורשות כריתת גולגולת להתבצע תחת או בסמיכות רבה לשרירים האלה. מאחר ששרירים אלה חשובים עבור תקשורת מרמוסט38, המנתח חייב לאט ובזהירות לנתק את השרירים מהגולגולת כדי למזער את הנזק.

החוקרים מכירים בעבודה התנהגותית מעורבים או מכרסמים או מרמוסטים צריכים להיות מודעים מספר מגבלות כאשר ביצוע ביצועים אלקטרופיזיולוגיה התנהגות חופשית NHPs. ראשית, בהסדר הנוכחי ובאחרים הכרוכים במערכים בעלי צפיפות גבוהה או במערכים מרובים, סביר להניח שגרימת הרדמה קלה תידרש לחבר את מחברי הכבלים, גם לאחר הרגלה המתאים. הליך זה, בעוד שבהיקף ההנחיות הרגולטוריות של NIH ושל מדינות אחרות, יש לבצע בחסכנות כדי להקטין את הלחץ המנטלי והפיזי על המרסט. יתר על כן, זה קריטי כי החוקר להבטיח את בעל החיים הוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה לפני תחילת רכישת נתונים, אחרת ההרדמה עלולה לבלבל את הנתונים39. הגבלה קשורה נוספת היא הנוכחות הפיזית של הכבל עצמו. בעוד שפתרונות הקלטה אלחוטיים הופכים לזמינים40, האפשרויות הקוויות השכיחות יותר להטיל הגבלה פיזית על החיה. לבסוף, החדר הנסיוני בשימוש יהיה גם להגביל את טווח ההתנהגויות הזמינות למרסט. שלא כמו מכרסמים, מרמוסטים להציג התנהגויות ייחודיות (למשל, טיפוס) זה לא יהיה אפשרי בהתאם לחדר הנסיוני בשימוש.

ההתקדמות במדעי החומרים וההנדסה מובילה לממשק העצבי הספר41. הליכים נוירופלסטיים יעילים, כגון האחד המתואר בכתב יד זה, יאפשר לחוקרים ליישם אלה כלים חדשים והקרובה ביותר מרמוסטים. בשילוב עם ההתפתחויות במקביל בביולוגיה מולקולרית3,4,5, מרמוסטים יש את הפוטנציאל לאפשר חקירות של שאלות בסיסיות וקליניות חשוב במדעי המוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לברנרדו Luiz לקבלת סיוע טכני עם הצילום והעריכה. עבודה זו נתמכת על-ידי מכון סנטוס דומונט (ISD), משרד החינוך הברזילאי (MEC) וקורדנדסיו דה איסואסאלדה (שכמיות).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipments
683 Small Animal Ventilator Harvard Apparatus, Inc. 55-0000
Anesthesia Assembly BRASMED COLIBRI
Barber Clippers Mundial HC-SERIES
Dental Drill Norgen B07-201-M1KG
Homeothermic Heating Pad and Monitor Harvard Apparatus, Inc. 50-7212
Marmoset Stereotaxic Frame Narishige Scientific Instrument Lab SR-6C-HT
Patient Monitor and Pulse Oximeter Bionet Co., Ltd BM3
Stereotaxic Micromanipulator Narishige Scientific Instrument Lab SM-15R
Surgical Microscope Opto SM PLUS IBZ
Instruments
Allis tissue forceps Sklar 36-2275
Alm Retractor, rounded point, 4x4 teeth Rhosse RH11078
Angled McPherson Forceps Oftalmologiabr 11301A
Curved Surgial Scissors Harvard Apparatus, Inc. 72-8422
Curved Tissue Forceps Sklar 47-1186
Delicate Dissection forceps WPI WP5015
Dental Drill Bit Microdont ISO.806.314.001.524.010
Essring Tissue Forceps Sklar 19-2460
FG 1/4 Dental Drill Bit Microdont ISO.700.314.001.006.005
Halsey Needle Holder WPI 15926-G
Halstead Mosquito forceps WPI 503724-12
Hemostatic Forceps, Straight Sklar 17-1260
Jewler Forceps Sklar 66-7436
McPherson-Vannas Optathalmic microscissor, 3 mm point Argos Instrumental ARGOS-4004
Pereosteal Raspatory Golgran 38-1
Scalpal Handle Harvard Apparatus, Inc. 72-8354
Screwdrivers Eurotool SCR-830.00
Sodering Iron Hikari 21K006
Surgical Scissor Harvard Apparatus, Inc. 72-8400
Toothed forceps WPI 501266-G
Disposables/Single Use
1 ml sterile syringe with 26 G needle Descarpack 7898283812785
130 cm x 140 cm surgical field, presterilized ProtDesc 7898467276344
24G Needle, presterilized Descarpack 7898283812846
50 cm x 50 cm surgical field, presterilized Esterili-med 110100236
Cotton Tipped Probes, Presterilized Jiangsu Suyun Medical Materials Co. LTD 23007
Cotton tipped Qutips Higie Topp 7898095296063
Electrode Array Home made
Endotracheal tube without cuff, internal diameter 2.0 mm, outer diameter 2.9 mm Solidor 7898913077201
Tinned copper wire, 0.15 mm diameter
M1.4x3 Stainless steel screws USMICROSCREW M14-30M-SS-P
Medical Tape Missner 7896544910102
Nylon surgical sutures Shalon N540CTI25
Scalpal Blade, presterilized AdvantiVe 1037
solder Kester SN63PB37
Sterile Saline 0.9% Isofarma 7898361700041
Sterile Surgical Gloves Maxitex 7898949349051
Sterile Surgical Gown ProtDesc 7898467281208
Surgical Gauze, 15 cm x 26 cm presterilized Héika 7898488470315
Gelfoam Pfizer
Drugs/Chemicals
0.25mg/ml Atropine Isofarma
10% Lidocaine Spray Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda. 7896676405644
2.5% Enrofloxacino veterinary antibiotic Chemitec 0137-02
Dexametasona Veterinary Anti inflammatory MSD R06177091A-00-15
Hydrogen Peroxide Farmax 7896902211537
Isoflourane BioChimico 7897406113068
Jet Acrylic polymerization solution Artigos Odontológicos Clássico
Jet Auto Polymerizing Acrylic Artigos Odontológicos Clássico
Ketamine 10% Syntec
Lidocaine and Phenylephrine 1.8 ml local anesthetic SS White 7892525041049
Povidone-Iodine solutiom Farmax 7896902234093
Riohex 2% surgical Soap Rioquímica 7897780209418
Silver Paint SPI Supplies 05002-AB
Tramadol chloride 50 mg/ml União Química 7896006245452
Refresh gel (polyacrylic acid) Allergan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Okano, H., Hikishima, K., Iriki, A., Sasaki, E. The common marmoset as a novel animal model system for biomedical and neuroscience research applications. Seminars in Fetal and Neonatal Medicine. 17 (6), 336-340 (2012).
  2. Harris, R. A., et al. Evolutionary genetics and implications of small size and twinning in callitrichine primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (4), 1467-1472 (2014).
  3. Kishi, N., Sato, K., Sasaki, E., Okano, H. Common marmoset as a new model animal for neuroscience research and genome editing technology. Development, Growth & Differentiation. 56 (1), 53-62 (2014).
  4. Sasaki, E. Prospects for genetically modified non-human primate models, including the common marmoset. Neuroscience Research. 93, 110-115 (2015).
  5. Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
  6. Sasaki, E. Creating Genetically Modified Marmosets. The Common Marmoset in Captivity and Biomedical Research. , 335-353 (2019).
  7. Sato, K., et al. Generation of a Nonhuman Primate Model of Severe Combined Immunodeficiency Using Highly Efficient Genome Editing. Cell Stem Cell. 19 (1), 127-138 (2016).
  8. Sato, K., et al. Resequencing of the common marmoset genome improves genome assemblies and gene-coding sequence analysis. Scientific Reports. 5, 16894 (2015).
  9. Chaplin, T. A., Yu, H. H., Soares, J. G. M., Gattass, R., Rosa, M. G. P. A Conserved Pattern of Differential Expansion of Cortical Areas in Simian Primates. Journal of Neuroscience. 33 (38), 15120-15125 (2013).
  10. Mitchell, J. F., Leopold, D. A. The marmoset monkey as a model for visual neuroscience. Neuroscience Research. 93, 20-46 (2015).
  11. Brok, H. P. M., et al. Non-human primate models of multiple sclerosis: Non-human primate models of MS. Immunological Reviews. 183 (1), 173-185 (2001).
  12. Santana, M. B., et al. Spinal Cord Stimulation Alleviates Motor Deficits in a Primate Model of Parkinson's disease. Neuron. 84 (4), 716-722 (2014).
  13. Ribeiro, M., Santana, M. B., Araujo, M. Neuronal signal description after chronic stainless-steel microelectrode array implants in marmosets. , Available from: http://www.canal6.com.br/cbeb/2014/artigos/cbeb2014_submission_766.pdf (2014).
  14. MacDougall, M., et al. Optogenetic manipulation of neural circuits in awake marmosets. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1286-1294 (2016).
  15. Wakabayashi, M., et al. Development of stereotaxic recording system for awake marmosets (Callithrix jacchus). Neuroscience Research. 135, 37-45 (2018).
  16. Johnston, K. D., Barker, K., Schaeffer, L., Schaeffer, D., Everling, S. Methods for chair restraint and training of the common marmoset on oculomotor tasks. Journal of Neurophysiology. 119 (5), 1636-1646 (2018).
  17. Sedaghat-Nejad, E., et al. Behavioral training of marmosets and electrophysiological recording from the cerebellum. Journal of Neurophysiology. , (2019).
  18. Kringelbach, M. L., Owen, S. L., Aziz, T. Z. Deep-brain stimulation. Future Neurology. 2 (6), 633-646 (2007).
  19. Talakoub, O., Gomez Palacio Schjetnan, A., Valiante, T. A., Popovic, M. R., Hoffman, K. L. Closed-Loop Interruption of Hippocampal Ripples through Fornix Stimulation in the Non-Human Primate. Brain Stimulation. 9 (6), 911-918 (2016).
  20. Oddo, M., Hutchinson, P. J. Understanding and monitoring brain injury: the role of cerebral microdialysis. Intensive Care Medicine. 44 (11), 1945-1948 (2018).
  21. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  22. Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical Deconstruction of Parkinsonian Neural Circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
  23. Hammer, D. X., et al. Longitudinal vascular dynamics following cranial window and electrode implantation measured with speckle variance optical coherence angiography. Biomedical Optics Express. 5 (8), 2823-2836 (2014).
  24. Komatsu, M., Kaneko, T., Okano, H., Ichinohe, N. Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
  25. Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Surgical Techniques for Chronic Implantation of Microwire Arrays in Rodents and Primates. , CRC Press/Taylor & Francis. (2008).
  26. Santana, M. B., et al. Spinal Cord Stimulation Alleviates Motor Deficits in a Primate Model of Parkinson's disease. Neuron. 84 (4), 716-722 (2014).
  27. Santana, M., Palmér, T., Simplício, H., Fuentes, R., Petersson, P. Characterization of long-term motor deficits in the 6-OHDA model of Parkinson's disease in the common marmoset. Behavioural Brain Research. 290, 90-101 (2015).
  28. Misra, S., Koshy, T. A review of the practice of sedation with inhalational anaesthetics in the intensive care unit with the AnaConDa device. Indian Journal of Anaesthesia. 56 (6), 518-523 (2012).
  29. Freire, M. A. M., et al. Distribution and Morphology of Calcium-Binding Proteins Immunoreactive Neurons following Chronic Tungsten Multielectrode Implants. PLOS ONE. 10 (6), 0130354 (2015).
  30. Budoff, S., et al. Astrocytic Response to Acutely- and Chronically Implanted Microelectrode Arrays in the Marmoset (Callithrix jacchus) Brain. Brain Sciences. 9 (2), 19 (2019).
  31. Dzirasa, K., Fuentes, R., Kumar, S., Potes, J. M., Nicolelis, M. A. L. Chronic in vivo multi-circuit neurophysiological recordings in mice. Journal of Neuroscience Methods. 195 (1), 36-46 (2011).
  32. Nicolelis, M. A. L., et al. Chronic, multisite, multielectrode recordings in macaque monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 11041-11046 (2003).
  33. Lehew, G., Nicolelis, M. A. L. State-of-the-Art Microwire Array Design for Chronic Neural Recordings in Behaving Animals. , CRC Press/Taylor & Francis. (2008).
  34. Paxinos, G., Watson, C., Petrides, M., Rosa, M., Tokuno, H. The Marmoset Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Science Publishing Co Inc. San Diego. (2012).
  35. Brown, M. J., Pearson, P. T., Tomson, F. N. Guidelines for animal surgery in research and teaching. American Journal of Veterinary Research. 54 (9), 1544-1559 (1993).
  36. Flecknell, P. A. Anaesthesia of Animals for Biomedical Research. British Journal of Anaesthesia. 71 (6), 885-894 (1993).
  37. Kurihara, S., et al. A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset (Callithrix jacchus). Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  38. Boer, R. A., de Vries, A. M. O., Louwerse, A. L., Sterck, E. H. M. The behavioral context of visual displays in common marmosets (Callithrix jacchus). American Journal of Primatology. 75 (11), 1084-1095 (2013).
  39. Kudo, C., Nozari, A., Moskowitz, M. A., Ayata, C. The impact of anesthetics and hyperoxia on cortical spreading depression. Experimental Neurology. 212 (1), 201-206 (2008).
  40. Ghomashchi, A., et al. A low-cost, open-source, wireless electrophysiology system. 2014 36th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 3138-3141 (2014).
  41. Fu, T. M., Hong, G., Viveros, R. D., Zhou, T., Lieber, C. M. Highly scalable multichannel mesh electronics for stable chronic brain electrophysiology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), 10046-10055 (2017).

Tags

מדעי המוח סוגיה 151 מרמוסט ניתוח סטריאוטקאית אלקטרופיזיולוגיה נוירוכירורגיה פרימטים לא אנושיים מערך מיקרואלקטרודה
כירורגיה סטריאוטקאית עבור השרשה של מערכים מיקרואלקטרודה ב מרמוסט<em>מצוי</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Budoff, S. A., Rodrigues Neto, J.… More

Budoff, S. A., Rodrigues Neto, J. F., Arboés, V., Nascimento, M. S. L., Kunicki, C. B., Araújo, M. F. P. d. Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset (Callithrix jacchus). J. Vis. Exp. (151), e60240, doi:10.3791/60240 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter