Summary
Detta arbete presenterar ett protokoll för att utföra en stereotaxic, Neurokirurgisk implantation av mikroelektrodmatriser i den gemensamma Marmoset. Denna metod möjliggör specifikt elektrofysiologiska inspelningar i fritt beter djur men kan lätt anpassas till någon annan liknande neurokirurgiska ingrepp i denna art (t. ex. kanyl för läkemedelsadministrering eller elektroder för hjärnstimulering).
Abstract
Marmosets (Callithrix jacchus) är små icke-mänskliga primater som ökar i popularitet inom biomedicinsk och preklinisk forskning, inklusive Neurosciences. Phylogenetiskt, dessa djur är mycket närmare människor än gnagare. De visar också komplexa beteenden, inklusive ett brett spektrum av vocalizations och sociala interaktioner. Här beskrivs ett effektivt stereotaxic neurokirurgiskt ingrepp för implantation av inspelnings elektroder i den gemensamma Goeldisapa. Detta protokoll specificerar också de pre-och postoperativa steg av djuromsorg som krävs för att framgångsrikt utföra en sådan operation. Slutligen, detta protokoll visar ett exempel på lokala fält potential och Spike aktivitet inspelningar i en fritt beter Goeldisapa 1 vecka efter det kirurgiska ingreppet. Sammantaget ger denna metod en möjlighet att studera hjärnans funktion i vaken och fritt beter sig marmosets. Samma protokoll kan lätt användas av forskare som arbetar med andra små primater. Dessutom kan det lätt modifieras för att tillåta andra studier som kräver implantat, såsom stimulerande elektroder, mikroinjektioner, implantation av optroder eller guide kanyl, eller ablation av diskreta vävnads områden.
Introduction
Vanliga silkesapor (Callithrix jacchus) vinner erkännande som en viktig modellorganism inom många forskningsområden, inklusive neurovetenskap. Dessa nya världen primater utgör en viktig kompletterande djurmodell till både gnagare och andra icke-mänskliga primater (NHPs), såsom Rhesus macaque. Som gnagare, dessa djur är små, lätt att manipulera, och relativt ekonomiskt att ta hand om och föda upp1,2,3,4, jämfört med större NHPS. Dessutom har dessa djur en benägenhet för vänortssamarbete och hög fecunditet i förhållande till andra NHPS1,2,3. En annan fördel som Goeldisapa har över många andra primater är att moderna molekylärbiologi verktyg3,4,5,6,7 och en sekvenserade Genome2 ,3,4,5,8 har använts för att genetiskt modifiera dem. Både Knock-in djur med lentivirus5, och knock-out djur med zink-finger nukleaser (zfns) och transkription Activator-liknande effektor nukleaser (talens)7, har gett livskraftiga grundare djur.
En fördel i förhållande till gnagare är att marmosets, som primater, är phylogenetiskt närmare människor3,5,6,9,10,11. Liksom människor, silkesapor är dagaktiva djur som är beroende av en högt utvecklad visuellt system för att vägleda mycket av deras beteende10. Ytterligare, silkesapor uppvisar beteendemässig komplexitet, inklusive ett brett spektrum av sociala beteenden såsom användning av olika vocalizations3, gör det möjligt för forskare att ta itu med frågor som inte är möjliga i andra arter. Ur ett neurovetenskapligt perspektiv, silkesapor har Lissencefali hjärnor, till skillnad från de mer vanliga Rhesus makak9. Dessutom, silkesapor har ett centralt nervsystem som liknar människor, inklusive en mer högt utvecklad prefrontala cortex9. Tillsammans, alla dessa egenskaper positionera silkesapor som en värdefull modell för att studera hjärnans funktion i hälsa och sjukdom.
En vanlig metod för att studera hjärnans funktion innebär att implantera elektroder på anatomiskt specifika platser med hjälp av stereotaxic neurokirurgi. Detta låter för chronical inspelning av den neural aktiviteten i olikt uppsätta som mål områden i vaken och som beter fritt djur12,13. Stereotaxic neurokirurgi är en oumbärlig teknik som används i många linjer av forskning, eftersom det möjliggör exakt inriktning av neuroanatomiska regioner. Jämfört med makak och gnagare litteratur, det finns färre publicerade studier som beskriver stereotaxic neurokirurgi specifika för Marmoset, och de tenderar att ge glesa detalj av de steg som ingår i operationen. Dessutom, de med större detaljfokus främst på förfaranden för elektrofysiologi inspelning i head-återhållsamma djur14,15,16,17.
För att underlätta ett bredare antagande av silkesapor som modellorganism i neurovetenskap forskning, definierar den nuvarande metoden specifika steg som krävs för en lyckad stereotaxic neurokirurgi hos denna art. Förutom implantation av inspelnings kedjor, som beskrivs i denna metod, kan samma teknik anpassas för många andra experimentella ändar, inklusive implantation av stimulerande elektroder för behandling av sjukdomar18 eller causally körning krets beteende19; implantation av guide kanyl för extraktion och kvantifiering av signalsubstanser20, injektioner av reagenser, inklusive de för att inducera sjukdomsmodeller12 eller för krets spårnings studier15; ablation av diskreta vävnads regioner21; implantation av optroder för optogenetiska studier22; implantation av optiska fönster för kortikal Mikroskopisk analys23; och implantation av elektrokortikografiska (ECoG) arrayer24. Således är det övergripande målet för detta förfarande att beskriva de kirurgiska steg som ingår i implantation av mikroelektrodmatriser för kroniska elektrofysiologiska inspelningar i fritt beter sig marmosets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök utfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur och godkänts av Santos Dumont Institute etikkommittén (protokoll 02/2015AAS).
1. förberedelse av kirurgi
- Anslut varje elektrod disk till en elektrodhållare som är kompatibel med den stereotaxic-ram som ska användas.
- Anslut en elektrodhållare till stereotaxic micromanipulator och Ställ in en mikrokabel till de interfonetiska koordinaterna. Upprepa detta för ytterligare elektrod kedjor och hållare, om nödvändigt.
Anmärkning: interaural koordinaten för någon microwire kan användas för att beräkna implantation koordinater för hela matrisen, eftersom det relativa avståndet mellan mikrotrådarna är konstant. När matrisen har buntar med olika längder är interaural koordinaten för den längsta tråden den mest praktiska att använda för att ställa in interaural Zero. - Lossa elektrod hållarna från stereotaxic micromanipulator och sterilisera sammansättningarna (elektrod fästa vid elektrodhållaren) i ett UV-skåp (ultraviolett ljus) i minst 2 timmar.
- Fäst en 24 G nål till en stereotaxic sondhållare, Anslut den till micromanipulator och Ställ in interaural koordinater för spetsen av nålen.
Anmärkning: före operationen måste koordinaterna för alla kraniotomier vara fördefinierade som en omkrets 200 μm2 större än anteroposterior (AP) och snett (ml) position av matrisens mål implantations plats. Använd 24 G nål-sondhållaren församling för att bestämma placeringen av kraniotomier i skallen baserat på noll interfonetiska koordinater. - Lossa sondhållaren från mikromanipulatorn och sterilisera monteringen i ett UV-skåp i minst 2 h.
- Samla in 6 − 8 Titan-eller rostfria skruvar. Löd en jord tråd till hälften av dem.
- Organisera och sterilisera alla kvarvarande instrument, utrustning och engångsartiklar som krävs för operationen.
2. preoperativa förfaranden
Observera: två vuxna manliga silkesapor (Callithrix jacchus) som väger 320 – 370 g användes i denna studie. Se till att djuret inte har ätit för 6 h före induktion av anestesi.
- Anesthetize djuret med en intramuskulär injektion av atropin (0,05 mg/kg) för att minska salivering och bronkial sekret. Kontrollera bristen på pedal svar.
- Efter 5 min applicera ketamin (10 − 20 mg/kg) intramuskulärt.
- Raka djurets huvud med en elektrisk Frisör klippare.
- Administrera Tramadol (2 mg/kg) intramuskulärt som ett allmänt analgetikum.
- Intubera djuret.
- Med hjälp av en mask, exponera Goeldisapa till isofluran i 1 − 2% syre med en flödeshastighet av 1 − 5 L/min för att inducera djup anestesi. När djuret är djupt anesthetized, minska och bibehålla isofluran till 1 − 3 L/min.
- Fäst ett elastiskt band på operationsbordet med tejp.
- Placera Goeldisapa i ett liggande läge med huvudet mot teknikern och placera det elastiska bandet i Goeldisapa mun bakom dess canines.
Obs: det är bäst att placera huvudet så att dorsala ytan är riktad mot golvet och dess ansikte är mot teknikern. - Med hjälp av en bomulls tippad sond torkar du upp Marmoset-tungan och tar tag i den i ena handen för att hålla munnen öppen.
- Spraya 10% lidokain på spetsen av endotrakealröret.
- Sätt i uncuffed, 2,0 mm diameter endotrakealtub i luftstrupen tills 4,0 cm markeringen är vid ingången av luftstrupen.
- Fäst röret till anestesi församling med den konstgjorda ventilatorn inställd på 40 andetag/min och bekräfta korrekt expansion och sammandragning av bröstet.
Obs: vid denna tid isofluran och syre bör levereras via endotrakealtub, inte masken. - Ta bort det elastiska bandet från Marmoset mun så endotrakealtub kan tejpade i käken.
- Placera Goeldisapa i en liggande position i linje med stereotaxic-ramen och fäst djurets huvud i stereotaxic-ramen.
- Först sätter spetsen på höger öra bar i djurets högra hörselgången.
- Därefter sätter spetsen på vänster öra bar i den vänstra hörselgången.
- Centrera djurets huvud i mitten av stereotaxic-ramen och fäst öron listerna på plats.
- Sätt in munstycket i djurets mun och justera dess höjd så att det vidrör djurets gom. Samtidigt, placera orbital barer på den nedre ytan av orbital benet.
- Se till att den nedre ytan av orbital benet är horisontellt i linje med mitten av öron stänger.
- Anslut en bärbar pulsoximeter till Marmoset ' s hand. Se till att hjärtfrekvensen är inom 154 − 180 beats/min (BPM) under hela operationen; ofta en hjärtfrekvens över 200 BPM innebär att djuret vaknar. Se till att syremättnaden är över 95%. Det kan ibland sjunka till 90% utan skada.
Obs: om hjärtfrekvensen sjunker under 154 BPM, minska isofluran. - Placera den rektala temperatursonden ansluten till en homeothermic värmedyna i anus, med önskad temperatur inställd för 37 ° c. Tejpa denna sensor till svansen för att hålla den fast på plats.
- Applicera steril Oftalmologiskt smörjmedel i ögonen.
- Rengör och desinficera djurets huvud med klorhexidin och povidon jod innan du täcker djuret med ett kirurgiskt fält.
Anmärkning: utför alla följande kirurgiska ingrepp under aseptiska förhållanden.
3. kirurgiska ingrepp
- Applicera lokalt analgetikum subkutant (t. ex. lidokain 20 mg/mL, 0,1 mL) på platsen för det avsedda snittet. Gör ett snitt i mittlinjen i hårbotten.
- Exponera och förbereda ytan av skallen.
- Ta försiktigt loss den temporala muskeln från kraniet. Använd först en skalpell för att skära fascian vid dess införande i skallen. Sedan försiktigt separera temporala muskeln från kraniet med hjälp av en periost raspatory.
- Ta bort periostet från alla exponerade kraniet med hjälp av en periost raspatory.
- Kontrollera blödningen med en steril bomullspinne, om nödvändigt.
- Rengör benytan med väteperoxid.
- Avgränsa placeringen av kraniotomi genom att markera dess hörn med grunda Burr hål i benytan. Sedan, borra ut omkretsen av kraniotomi med hjälp av en tandborren vid maximal hastighet (dvs., 350 000 rpm). Tillsätt några droppar steril saltlösning över skallen under borrning för att förhindra överhettning. Mät placeringen av kraniotomi och koordinaterna för elektrod implantatet med avseende på de interfonetiska koordinaterna.
- Implantat skruvarna i skallen.
- Borra 6 − 8 skruvhålen i kranium.
- Implantatet skruvarna så att varje jord tråd smält skruv är i anslutning till och i närheten av en oförändrad skruv (dvs utan en jord tråd fäst vid den).
- Linda varje jordtråd runt den intilliggande, oförändrade skruven.
- Tillsätt en droppe silver färg mellan jordtråden och varje skruv.
- Ta bort benet i mitten av kraniotomi med hjälp av tång med en böjd spets (t. ex., McPherson pincett). Håll dura mater hydrerad med steril saltlösning.
- Ta bort dura mater. Använd en steril Hypodermic nål (25 eller 26 G) med avfasning böjd på cirka 90 ° för att punktera och lyfta ytan av dura mater bort från hjärnans yta. Sedan klippa dura mater med microsax. Håll den exponerade hjärnan hydrerad med saltlösning.
Anmärkning: om signifikant dural blödning observeras, Använd diatermi eller sterila absorberande gelatin svampar indränkt i trombin25. - Mikroelektrodmatriser för implantat.
- Fäst den steriliserade elektrodhållaren och elektrod matrisen på stereotaxic micromanipulator.
- Placera micromanipulatorn så att elektroden är på önskad anteroposterior och mediolaterala koordinater.
- Sänk elektrod matrisen tills spetsen på det längsta bunten vidrör hjärnans yta.
- Sakta in matrisen i hjärnvävnaden tills den når dorsoventral koordinater.
- Täck den exponerade cortex med små bitar av sterila, absorberande gelatin svampar.
- Säkra elektroden till skallen genom att applicera Dental akryl på den exponerade skallen, en skruv och elektroden.
- Lossa elektrodhållaren och ta bort den från mikromanipulatorn.
- Upprepa implantations proceduren från steg 3,7 med de extra matriserna om det behövs.
- Linda ihop och svetsa jord trådarna i de separata arrayer och skruvar. Använd silver färg för att bilda en bro runt svetsen för att säkerställa en elektrisk anslutning har uppnåtts.
- Med hjälp av Dental akryl, gör en robust headcap runt den laterala omfattningen av arrayer, och helt inlägga marken ledningar och alla utsatta skalle och skruvar.
- Om det behövs sätter du i ett stöd fält i headcap. Detta kan vara en robust plast cylinder som de från en bomullspinne. Försegla den på plats med Dental akryl.
Obs: Detta kan vara till hjälp för att säkra elektrofysiologi kabelkontakter på plats, men kan vara onödigt beroende på vilken utrustning som används. I denna metod fästs en liknande stödstång på huvudscenen så att ett elastiskt band kan hålla huvudstegen på plats på kontakterna. - Sutur huden runt headcap.
4. postoperativ återhämtning
- Applicera antiseptisk lösning (t. ex. klorhexidin) runt såret.
- Stäng av isofluran utbudet men inte syre och ta bort djuret från stereotaxic ramen.
- Placera djuret på värmeplattan med det syre som upprätthålls genom endotrakealröret.
- Ta bort endotrakealröret när de första tecknen på neurogena reflexer, såsom laryngospasmer, observeras.
- Fortsätt att förse syret med en mask tills djuret uppvisar tydliga tecken på anestesi återhämtning, såsom skyddande reflexer, postural ton och försök att ambulera.
- Placera djuret i en ren bur i ett återhämtnings rum under 24 − 48 timmar innan djuret flyttas till sin hem bur. Hus varje implanterat djur individuellt.
Obs: eftersom silkesapor tenderar att klättra på bur väggarna, Använd en bur med släta väggar eller Täck bur väggarna med en slät yta för att förhindra att djuret faller. - Under den första timmen efter operationen, Observera djuret för att titta på tecken på ångest eller okoordinerade huvudkontakt mot sidan av buren.
- Administrera antibiotika (t. ex. enrofloxacin 5 mg/kg, subkutant, en gång dagligen i 5 − 7 dagar), analgetika (t. ex., oral Tramadol 1 mg/kg, varje 8 h för 3 − 5 dagar) och antiinflammatoriska läkemedel (t. ex. dexametason 0,5 − 1,5 mg/kg, subkutant, en gång dagligen under 1 − 3 dagar) .
Anmärkning: efter en lyckad operation kommer djuren att återvinnas helt inom 3 − 5 dagar.
5. kroniska elektrofysiologiska inspelningar i fritt beter sig silkesapor
- Starta de elektrofysiologiska inspelningssessionerna minst 1 vecka efter operationen.
Notera: habituate djuren till forskare och experimentella miljöer innan du påbörjar alla experimentella procedurer för minst 1 månad. - I början av varje session, lätt bedra djuret med isofluran (1 − 5 L/min, 1% O2).
Anmärkning: Följ relevant institutions riktlinjer gällande sedering av små primater. Om inspelningen sessioner är mycket frekventa, vänja djuren som skall hanteras så att kablarna kan anslutas utan bedövning. - Anslut elektrod arrayer till en kommersiell neurala inspelningssystem.
- Placera djuret inne i experiment kammaren.
Anmärkning: den experimentella kammaren används här är en kubisk akryl låda (0,45 m x 0,45 m x 0,45 m) för att utvärdera mängden och mönstret av spontan motor aktivitet26,27. - Vänta 30 min innan inspelningarna för att säkerställa att djuret helt återvinns från anestesi.
Obs: Isoflurane har en snabb debut och offset åtgärder som möjliggör snabb sedering och uppvaknande28. När isofluran utbudet är avstängd, djuret kommer att börja vakna. Djuret är vaken när det stannar i upprätt ställning och kan ambulera fritt i experiment kammaren utan att falla. Detta tar mindre än 15 min. För att säkerställa frånvaron av lugnande effekter, börja inspelningarna 30 min efter att isofluran har upphört. - Bekräfta placeringen av microelektrod array implantat efter slakt av NISSL färgning efter fixering och snittning vävnaden29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syftet med denna studie var att beskriva en stereotaxic neurokirurgiska ingrepp för implantation av mikroelektrodmatriser för elektrofysiologiska inspelningar i den gemensamma Marmoset. En typisk kirurgi (från anestesi induktion till anestesi återhämtning) kommer att pågå i cirka 5 − 7 h, beroende på antalet matriser implanteras. Här var två matriser symmetriskt implanterade, en i varje hjärnhalva. Varje array innehöll 32 rostfria microwires arrangerade i sju buntar som riktar sig till flera strukturer i basal ganglier-kortikothalamic krets (figur 1), men elektrod designen och riktade hjärnregioner kan variera beroende på Experiment. Efter lyckad kirurgi och postoperativa procedurer ska djuret återvinnas helt inom 3 − 5 dagar. Om matrisen har jordats och implanterats korrekt kommer det att vara möjligt att spela in spikar (figur 2A) och lokala fält potentialer (figur 2b) i fritt beter djur över flera veckor eller månader, innan en mogen gliotiska ärr är etablerad 13,30. Som ett exempel har de elektrofysiologiska data som samlats in i det experimentella paradigm som beskrivs här effektivt använts för att studera den samtidiga aktiviteten i olika regioner i den basala ganglierna-kortikothalamic krets under spontan, markbaserad Locomotion i en modell av Parkinsons sjukdom26.
Slutligen, en lyckad operation innebär också att implantera arrayer i de riktade strukturerna. Metoder för icke-invasiv avbildning, såsom MRT eller tomografi, kan utföras efter operationen och innan experimentella inspelningar påbörjas. Användning av sådana metoder kommer endast att vara möjlig om de specifika implantat som används är tillverkade för att vara förenliga med sådan teknik, och om forskaren har tillgång till lämplig utrustning för små djur. Slutlig bekräftelse kan också utföras efter döden. Nissl-färgade sektioner som innehåller elektrod spår kan användas för att exakt bestämma positionen för varje implanterad mikrotråd (figur 3). Observera att elektrod spår i koronala sektioner visas som tårar i vävnaden. Således extrem försiktighet måste användas när snittning utförs för att minska risken för att skapa artefakter som kommer att blanda ihop tolkningen.
Figur 1: Mikroelektrodmatris för implantation i små primater. Matrisen bestod av 32 rostfria microwires. Trådarna var 50 μm i diameter och organiserades i sju buntar syftar till att nå följande områden: primär motorisk Cortex (M1), putamen (PUT), caudatus (CD), globus pallidus (GPe), ventrolaterala och ventroposterior laterala thalamic Nucleus (VPL), och subthalamic Nucleus (STN). Mellanelektrod avståndet i varje bunt var 300 μm. Interbundle-avståndet beror på målkoordinaterna för varje hjärnregion. Mer detaljerad information om mikroelektrod array design och tillverkning finns i Nicolelis31, Lehew och nicolelis32, och dizirasa et al.33. Scale bar = 5 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativt elektrofysiologiskt resultat efter en lyckad operation. Den vänstra panelen visar Spike aktivitet av två neuroner (gula och gröna vågformer) inspelade från en elektrod. Den högra panelen visar lokala fält potentiella svängningar inspelade från 14 elektroder. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Nissl-färgade vävnads sektion som visar ett elektrod spår. Detta avsnitt (anteroposterior koordinat, i förhållande till interaural linje: + 8,0, enligt Atlas av Paxinos och Watson34) skildrar en elektrod spår med spetsen på putamen, vilket indikeras av den svarta triangeln. Scale bar = 1 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete ger en detaljerad beskrivning av de förfaranden som ingår i implantation av mikroelektrod inspelnings arrayer i Goeldisapa hjärnan. Samma protokoll kan lätt användas när implantera elektroder, vare hemlagad eller kommersiellt tillgänglig, i andra små primater. Dessutom, det kan lätt anpassas för andra experimentella ändar som kräver exakt inriktning av hjärnans strukturer. Därför är detta protokoll målmedvetet vagt när det gäller stereotaxic-koordinater och kranialborrnings tekniker, eftersom dessa är de aspekter som kan variera mest. Till exempel, att implantatet de matriser som används i denna operation, craniotomies utfördes för att öppna två lämpligt stora fönster i varje halvklotet. Men när implantera robusta, enskilda strukturer, såsom guide kanyl, varken detta eller durectomy är nödvändigt. Snarare en enkel Burr hål till nivån på Dura kommer att räcka. På samma sätt, när utrustning implantat är inblandade är det inte nödvändigt för att skruvarna ska jordas. Sålunda, steg 3,9 i det kirurgiska protokollet kan utelämnas. Istället kan Dental akryl användas för att helt enkelt täcka den exponerade skalle, implantat, och skruvar.
Oavsett det specifika experimentella målet för stereotaxic neurokirurgi, framgångsrikt genomförande av det givna förfarandet kretsar i stor utsträckning kring goda kirurgiska metoder. Detta innebär att rigorösa protokoll måste följas för att utföra operationen under aseptiska förhållanden för att förhindra postoperativa infektioner35. Några av de mest kritiska ögonblicken inducerar och tar bort anestesi. Det är därför viktigt att vitala tecken på djuret (hjärtfrekvens, blodsyremättnad, och kroppstemperatur) övervakas under hela kirurgiska ingrepp36. Om en sänkning av hjärtfrekvensen med en samtidig droppe i syremättnad inträffar, bekräfta att bröstet är blåsa och tömma normalt, annars anslutningen till andnings maskinen kan vara fel. Det första som kan göras för att försöka återvinna hjärtfrekvensen och syremättnad är att minska isofluran koncentrationen. Om detta inte löser problemet, atropin kan administreras intramuskulärt att öka hjärtfrekvensen och försöka stabilisera djuret. Detta måste göras extremt försiktigt, eftersom tidigare erfarenheter visar att en hjärtfrekvens över 200 BPM utan tillräcklig isofluran kommer att väcka djuret.
Till skillnad från gnagare, i primater alla koordinater mäts vanligtvis i förhållande till interaural koordinaten, inte bregma och lambda34. Därför är det viktigt att mäta de interfonetiska nollkoordinaterna för elektroderna och andra sonder innan de fixerar djurets huvud i stereotaxic-apparaten. Dessutom, i silkesapor horisontalplanet definieras som det plan som passerar genom den nedre marginalen av orbital benet och mitten av den yttre hörselgången. Sålunda, det är viktigt att anpassa den nedre ytan av orbital benet med mitten av örat barer innan fastställande huvudet i stereotaxic ram. Dessutom täcker de timliga musklerna i Goeldisapa ett stort område av kraniet. Således, många neurala mål kräver kraniotomier som skall utföras under eller i mycket nära närhet till denna muskulatur. Eftersom dessa muskler är viktiga för Goeldisapa kommunikation38, kirurgen måste sakta och försiktigt ta bort denna muskulatur från kraniet för att minimera skador.
Forskare bekanta med beteendemässiga arbete som involverar antingen gnagare eller silkesapor bör vara medvetna om flera begränsningar när de utför elektrofysiologi i fritt beter NHPS. För det första, i det nuvarande arrangemanget och andra med hög densitet arrayer eller flera matriser, är det troligt att inducera ljus anestesi kommer att krävas för att fästa kabelkontakterna, även efter lämplig habituation. Detta förfarande, även inom ramen för NIH: s och andra länders regelverk riktlinjer, bör utföras sparsamt för att minska den mentala och fysiska stressen på Marmoset. Dessutom är det viktigt att forskaren se till att djuret helt återvinns från anestesi innan du påbörjar datainsamling, annars kan anestesi blanda ihop data39. En annan relaterad begränsning är den fysiska närvaron av kabeln själv. Medan trådlösa inspelnings lösningar blir tillgängliga40, de vanligare trådbundna alternativ införa en fysisk begränsning på djuret. Slutligen kommer den experimentella kammare som används också att begränsa utbudet av beteenden som är tillgängliga för Marmoset. Till skillnad från gnagare, uppvisar silkesapor unika beteenden (t. ex. klättring) som inte kommer att vara möjligt beroende på experiment kammaren som används.
Framsteg inom materialvetenskap och ingenjörskonst leder till romanen neurala gränssnitt41. Effektiva neurokirurgiska ingrepp, såsom det som beskrivs i detta manuskript, kommer att göra det möjligt för forskare att genomföra dessa nya och kommande verktyg i marmosets. Kombinerat med den samtidiga utvecklingen inom molekylärbiologi3,4,5, harsilkesapor potential att möjliggöra utredningar av viktiga grundläggande och kliniska frågor inom neurovetenskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja tacka Bernardo Luiz för teknisk assistans med filmning och redigering. Detta arbete stöddes av Santos Dumont Institute (ISD), brasilianska undervisningsministeriet (MEC) och Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior (CAPES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| 683 Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | 55-0000 | |
| Anesthesia Assembly | BRASMED | COLIBRI | |
| Barber Clippers | Mundial | HC-SERIES | |
| Dental Drill | Norgen | B07-201-M1KG | |
| Homeothermic Heating Pad and Monitor | Harvard Apparatus, Inc. | 50-7212 | |
| Marmoset Stereotaxic Frame | Narishige Scientific Instrument Lab | SR-6C-HT | |
| Patient Monitor and Pulse Oximeter | Bionet Co., Ltd | BM3 | |
| Stereotaxic Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | SM-15R | |
| Surgical Microscope | Opto | SM PLUS IBZ | |
| Instruments | |||
| Allis tissue forceps | Sklar | 36-2275 | |
| Alm Retractor, rounded point, 4x4 teeth | Rhosse | RH11078 | |
| Angled McPherson Forceps | Oftalmologiabr | 11301A | |
| Curved Surgial Scissors | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8422 | |
| Curved Tissue Forceps | Sklar | 47-1186 | |
| Delicate Dissection forceps | WPI | WP5015 | |
| Dental Drill Bit | Microdont | ISO.806.314.001.524.010 | |
| Essring Tissue Forceps | Sklar | 19-2460 | |
| FG 1/4 Dental Drill Bit | Microdont | ISO.700.314.001.006.005 | |
| Halsey Needle Holder | WPI | 15926-G | |
| Halstead Mosquito forceps | WPI | 503724-12 | |
| Hemostatic Forceps, Straight | Sklar | 17-1260 | |
| Jewler Forceps | Sklar | 66-7436 | |
| McPherson-Vannas Optathalmic microscissor, 3 mm point | Argos Instrumental | ARGOS-4004 | |
| Pereosteal Raspatory | Golgran | 38-1 | |
| Scalpal Handle | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8354 | |
| Screwdrivers | Eurotool | SCR-830.00 | |
| Sodering Iron | Hikari | 21K006 | |
| Surgical Scissor | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8400 | |
| Toothed forceps | WPI | 501266-G | |
| Disposables/Single Use | |||
| 1 ml sterile syringe with 26 G needle | Descarpack | 7898283812785 | |
| 130 cm x 140 cm surgical field, presterilized | ProtDesc | 7898467276344 | |
| 24G Needle, presterilized | Descarpack | 7898283812846 | |
| 50 cm x 50 cm surgical field, presterilized | Esterili-med | 110100236 | |
| Cotton Tipped Probes, Presterilized | Jiangsu Suyun Medical Materials Co. LTD | 23007 | |
| Cotton tipped Qutips | Higie Topp | 7898095296063 | |
| Electrode Array | Home made | ||
| Endotracheal tube without cuff, internal diameter 2.0 mm, outer diameter 2.9 mm | Solidor | 7898913077201 | |
| Tinned copper wire, 0.15 mm diameter | |||
| M1.4x3 Stainless steel screws | USMICROSCREW | M14-30M-SS-P | |
| Medical Tape | Missner | 7896544910102 | |
| Nylon surgical sutures | Shalon | N540CTI25 | |
| Scalpal Blade, presterilized | AdvantiVe | 1037 | |
| solder | Kester | SN63PB37 | |
| Sterile Saline 0.9% | Isofarma | 7898361700041 | |
| Sterile Surgical Gloves | Maxitex | 7898949349051 | |
| Sterile Surgical Gown | ProtDesc | 7898467281208 | |
| Surgical Gauze, 15 cm x 26 cm presterilized | Héika | 7898488470315 | |
| Gelfoam | Pfizer | ||
| Drugs/Chemicals | |||
| 0.25mg/ml Atropine | Isofarma | ||
| 10% Lidocaine Spray | Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda. | 7896676405644 | |
| 2.5% Enrofloxacino veterinary antibiotic | Chemitec | 0137-02 | |
| Dexametasona Veterinary Anti inflammatory | MSD | R06177091A-00-15 | |
| Hydrogen Peroxide | Farmax | 7896902211537 | |
| Isoflourane | BioChimico | 7897406113068 | |
| Jet Acrylic polymerization solution | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Jet Auto Polymerizing Acrylic | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Ketamine 10% | Syntec | ||
| Lidocaine and Phenylephrine 1.8 ml local anesthetic | SS White | 7892525041049 | |
| Povidone-Iodine solutiom | Farmax | 7896902234093 | |
| Riohex 2% surgical Soap | Rioquímica | 7897780209418 | |
| Silver Paint | SPI Supplies | 05002-AB | |
| Tramadol chloride 50 mg/ml | União Química | 7896006245452 | |
| Refresh gel (polyacrylic acid) | Allergan |
References
- Okano, H., Hikishima, K., Iriki, A., Sasaki, E. The common marmoset as a novel animal model system for biomedical and neuroscience research applications. Seminars in Fetal and Neonatal Medicine. 17 (6), 336-340 (2012).
- Harris, R. A., et al. Evolutionary genetics and implications of small size and twinning in callitrichine primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (4), 1467-1472 (2014).
- Kishi, N., Sato, K., Sasaki, E., Okano, H. Common marmoset as a new model animal for neuroscience research and genome editing technology. Development, Growth & Differentiation. 56 (1), 53-62 (2014).
- Sasaki, E. Prospects for genetically modified non-human primate models, including the common marmoset. Neuroscience Research. 93, 110-115 (2015).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Sasaki, E. Creating Genetically Modified Marmosets. The Common Marmoset in Captivity and Biomedical Research. , 335-353 (2019).
- Sato, K., et al. Generation of a Nonhuman Primate Model of Severe Combined Immunodeficiency Using Highly Efficient Genome Editing. Cell Stem Cell. 19 (1), 127-138 (2016).
- Sato, K., et al. Resequencing of the common marmoset genome improves genome assemblies and gene-coding sequence analysis. Scientific Reports. 5, 16894 (2015).
- Chaplin, T. A., Yu, H. H., Soares, J. G. M., Gattass, R., Rosa, M. G. P. A Conserved Pattern of Differential Expansion of Cortical Areas in Simian Primates. Journal of Neuroscience. 33 (38), 15120-15125 (2013).
- Mitchell, J. F., Leopold, D. A. The marmoset monkey as a model for visual neuroscience. Neuroscience Research. 93, 20-46 (2015).
- Brok, H. P. M., et al. Non-human primate models of multiple sclerosis: Non-human primate models of MS. Immunological Reviews. 183 (1), 173-185 (2001).
- Santana, M. B., et al. Spinal Cord Stimulation Alleviates Motor Deficits in a Primate Model of Parkinson's disease. Neuron. 84 (4), 716-722 (2014).
- Ribeiro, M., Santana, M. B., Araujo, M. Neuronal signal description after chronic stainless-steel microelectrode array implants in marmosets. , Available from: http://www.canal6.com.br/cbeb/2014/artigos/cbeb2014_submission_766.pdf (2014).
- MacDougall, M., et al. Optogenetic manipulation of neural circuits in awake marmosets. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1286-1294 (2016).
- Wakabayashi, M., et al. Development of stereotaxic recording system for awake marmosets (Callithrix jacchus). Neuroscience Research. 135, 37-45 (2018).
- Johnston, K. D., Barker, K., Schaeffer, L., Schaeffer, D., Everling, S. Methods for chair restraint and training of the common marmoset on oculomotor tasks. Journal of Neurophysiology. 119 (5), 1636-1646 (2018).
- Sedaghat-Nejad, E., et al. Behavioral training of marmosets and electrophysiological recording from the cerebellum. Journal of Neurophysiology. , (2019).
- Kringelbach, M. L., Owen, S. L., Aziz, T. Z. Deep-brain stimulation. Future Neurology. 2 (6), 633-646 (2007).
- Talakoub, O., Gomez Palacio Schjetnan, A., Valiante, T. A., Popovic, M. R., Hoffman, K. L. Closed-Loop Interruption of Hippocampal Ripples through Fornix Stimulation in the Non-Human Primate. Brain Stimulation. 9 (6), 911-918 (2016).
- Oddo, M., Hutchinson, P. J. Understanding and monitoring brain injury: the role of cerebral microdialysis. Intensive Care Medicine. 44 (11), 1945-1948 (2018).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical Deconstruction of Parkinsonian Neural Circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
- Hammer, D. X., et al. Longitudinal vascular dynamics following cranial window and electrode implantation measured with speckle variance optical coherence angiography. Biomedical Optics Express. 5 (8), 2823-2836 (2014).
- Komatsu, M., Kaneko, T., Okano, H., Ichinohe, N. Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Surgical Techniques for Chronic Implantation of Microwire Arrays in Rodents and Primates. , CRC Press/Taylor & Francis. (2008).
- Santana, M. B., et al. Spinal Cord Stimulation Alleviates Motor Deficits in a Primate Model of Parkinson's disease. Neuron. 84 (4), 716-722 (2014).
- Santana, M., Palmér, T., Simplício, H., Fuentes, R., Petersson, P. Characterization of long-term motor deficits in the 6-OHDA model of Parkinson's disease in the common marmoset. Behavioural Brain Research. 290, 90-101 (2015).
- Misra, S., Koshy, T. A review of the practice of sedation with inhalational anaesthetics in the intensive care unit with the AnaConDa device. Indian Journal of Anaesthesia. 56 (6), 518-523 (2012).
- Freire, M. A. M., et al. Distribution and Morphology of Calcium-Binding Proteins Immunoreactive Neurons following Chronic Tungsten Multielectrode Implants. PLOS ONE. 10 (6), 0130354 (2015).
- Budoff, S., et al. Astrocytic Response to Acutely- and Chronically Implanted Microelectrode Arrays in the Marmoset (Callithrix jacchus) Brain. Brain Sciences. 9 (2), 19 (2019).
- Dzirasa, K., Fuentes, R., Kumar, S., Potes, J. M., Nicolelis, M. A. L. Chronic in vivo multi-circuit neurophysiological recordings in mice. Journal of Neuroscience Methods. 195 (1), 36-46 (2011).
- Nicolelis, M. A. L., et al. Chronic, multisite, multielectrode recordings in macaque monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 11041-11046 (2003).
- Lehew, G., Nicolelis, M. A. L. State-of-the-Art Microwire Array Design for Chronic Neural Recordings in Behaving Animals. , CRC Press/Taylor & Francis. (2008).
- Paxinos, G., Watson, C., Petrides, M., Rosa, M., Tokuno, H. The Marmoset Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Science Publishing Co Inc. San Diego. (2012).
- Brown, M. J., Pearson, P. T., Tomson, F. N. Guidelines for animal surgery in research and teaching. American Journal of Veterinary Research. 54 (9), 1544-1559 (1993).
- Flecknell, P. A. Anaesthesia of Animals for Biomedical Research. British Journal of Anaesthesia. 71 (6), 885-894 (1993).
- Kurihara, S., et al. A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset (Callithrix jacchus). Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Boer, R. A., de Vries, A. M. O., Louwerse, A. L., Sterck, E. H. M. The behavioral context of visual displays in common marmosets (Callithrix jacchus). American Journal of Primatology. 75 (11), 1084-1095 (2013).
- Kudo, C., Nozari, A., Moskowitz, M. A., Ayata, C. The impact of anesthetics and hyperoxia on cortical spreading depression. Experimental Neurology. 212 (1), 201-206 (2008).
- Ghomashchi, A., et al. A low-cost, open-source, wireless electrophysiology system. 2014 36th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 3138-3141 (2014).
- Fu, T. M., Hong, G., Viveros, R. D., Zhou, T., Lieber, C. M. Highly scalable multichannel mesh electronics for stable chronic brain electrophysiology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), 10046-10055 (2017).
