Summary
Bu çalışma, mikroelektrot dizilerinin ortak marmoset'e stereotaksik, nöroşirürjik implantasyonu gerçekleştirmek için bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem özellikle serbestçe davranan hayvanlarda elektrofizyolojik kayıtları sağlar, ancak bu türdeki diğer benzer nöroşirürjik müdahalelere (örneğin, ilaç yönetimi için kanül veya beyin stimülasyonu için elektrotlar) kolayca adapte edilebilir.
Abstract
Marmosets(Callithrix jacchus)nörolojik bilimler de dahil olmak üzere biyomedikal ve klinik öncesi araştırmalarda popülerlik kazanıyor küçük insan dışı primatlar vardır. Filogenetik olarak, bu hayvanlar insanlara kemirgenlerden çok daha yakındır. Ayrıca, çok çeşitli vokaller ve sosyal etkileşimler de dahil olmak üzere karmaşık davranışlar sergilerler. Burada, ortak marmoset elektrot dizileri kayıt implantasyonu için etkili bir stereotaksik nöroşirürjik prosedür açıklanmıştır. Bu protokol aynı zamanda hayvan bakımının ameliyat öncesi ve sonrası adımlarını da başarıyla gerçekleştirebilmek için gerekli olan ayrıntıları ile tamamlanmaktadır. Son olarak, bu protokol cerrahi işlemden 1 hafta sonra serbestçe davranan bir marmoset yerel alan potansiyeli ve başak aktivite kayıtları bir örnek gösterir. Genel olarak, bu yöntem uyanık ve serbestçe marmosets davranan beyin fonksiyonu çalışma için bir fırsat sağlar. Aynı protokol kolayca diğer küçük primatlar ile çalışan araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Buna ek olarak, elektrotlar, mikroenjeksiyonlar, optrodes veya rehber kanüllerin implantasyonu veya ayrık doku bölgelerinin ablasyon gibi implantlar gerektiren diğer çalışmalar, izin vermek için kolayca değiştirilebilir.
Introduction
Ortak marmosets(Callithrix jacchus) araştırma birçok alanda önemli bir model organizma olarak tanıma kazanıyor, nörobilim de dahil olmak üzere. Bu yeni dünya primatları, rhesus makak gibi hem kemirgenler hem de insan olmayan diğer primatlar (NHP) için önemli bir tamamlayıcı hayvan modelini temsil eder. Kemirgenler gibi, bu hayvanlar için bakım ve doğurmak için küçük, işlemek kolay, ve nispeten ekonomik1,2,3,4, büyük NHPs ile karşılaştırıldığında. Ayrıca, bu hayvanların diğer NHPs1göre eşleştirme ve yüksek fecundity için bir eğilim var,2,3. Marmoset diğer birçok primatlar üzerinde sahip olduğu bir diğer avantajı modern moleküler biyoloji araçları3,4,5,6,7 ve sıralı genom2 ,3,4,5,8 genetik olarak değiştirmek için kullanılmıştır. Her iki knock-in hayvanlar lentivirus5kullanarak , ve çinko-parmak nükleazlar kullanarak knock-out hayvanlar (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar (TALENS)7, canlı kurucu hayvanlar vermiştir.
Kemirgenler ile ilgili bir avantaj marmosets, primatlar gibi, filogenetik insanlara yakınolmasıdır 3,5,6,9,10,11. Insanlar gibi, marmosets davranışlarını10çok rehberlik etmek için son derece gelişmiş bir görsel sisteme bağlı diurnal hayvanlardır. Ayrıca, marmosets farklı vokalizasyonkullanımı gibi sosyal davranışların geniş bir yelpazede de dahil olmak üzere davranış karmaşıklığısergilemek 3, araştırmacılar diğer türlerde mümkün olmayan sorulara hitap etmek için izin. Bir nörobilimsel açıdan bakıldığında, marmosets lissencephaly beyinleri var, daha yaygın olarak kullanılan rhesus makak aksine9. Ayrıca, marmosets daha yüksek gelişmiş prefrontal korteks 9 dahil olmaküzere, insanlara benzer merkezi bir sinir sistemi var. Birlikte, tüm bu özellikleri sağlık ve hastalık beyin fonksiyonu çalışma için değerli bir model olarak marmosets pozisyon.
Beyin fonksiyonlarını incelemek için yaygın bir yöntem stereotaksik nöroşirürji yoluyla anatomik olarak belirli yerlerde elektrotlar implante içerir. Bu uyanık ve serbestçe hayvanlar12,13davranan farklı hedef alanlarda nöral aktivitenin kronik kayıt sağlar. Stereotaksik nöroşirürji, nöroanatomik bölgelerin kesin olarak hedeflemesine olanak sağladığı ndan, birçok araştırma hattında kullanılan vazgeçilmez bir tekniktir. Makak ve kemirgen literatürile karşılaştırıldığında, marmoset özgü stereotaksik nöroşirürji açıklayan daha az yayınlanmış çalışmalar vardır, ve onlar cerrahi dahil adımları seyrek detay sağlamak eğilimindedir. Ayrıca, daha fazla ayrıntı ile olanlar esas olarak baş-ölçülü hayvanlarda elektrofizyoloji kayıt prosedürleri odaklanmak14,15,16,17.
Marmosetlerin nörolojik araştırmalarda model organizma olarak daha geniş bir şekilde benimsenmesini kolaylaştırmak için, mevcut yöntem bu türde başarılı bir stereotaksik nöroşirürji için gerekli belirli adımları tanımlar. Kayıt dizilerinin implantasyonuna ek olarak, mevcut yöntemde de belirtildiği gibi, aynı teknik hastalıkların tedavisi için uyarıcı elektrotların implantasyonu da dahil olmak üzere diğer birçok deneysel uça uyarlanabilir18 veya nedensel olarak sürüş devre davranışı19; nörotransmitterlerin ekstraksiyonve niceleme için kılavuz kanüllerin implantasyonu20, reaktif enjeksiyonları, bu hastalık modelleri indükleyen için olanlar da dahil olmak üzere12 veya devre izleme çalışmaları15; ayrık doku bölgelerinin ablasyon21; optogenetik çalışmalar için optrodes implantasyonu22; kortikal mikroskobik analiz için optik pencerelerin implantasyonu23; ve elektrokortikografik (ECoG) dizilerinin implantasyonu24. Bu nedenle, bu işlemin genel amacı serbestçe davranan marmosets kronik elektrofizyolojik kayıtlar için mikroelektrot dizilerinin implantasyonu nda yer alan cerrahi adımları ana hatlar etmektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri, Ulusal Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Sağlık Enstitüleri Rehberi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiştir ve Santos Dumont Enstitüsü Etik Komitesi (protokol 02/2015AAS) tarafından onaylanmıştır.
1. Cerrahi hazırlık
- Her elektrot dizisini kullanılacak stereotaksik çerçeveyle uyumlu bir elektrot tutucuya takın.
- Stereotaksik mikromanipülatöre bir elektrot tutucusu bağlayın ve bir mikro kabloyu interaural koordinatlara ayarlayın. Gerekirse ek elektrot dizileri ve tutucular için bunu tekrarlayın.
NOT: Mikro teller arasındaki göreceli uzaklık sabit olduğundan, herhangi bir mikrokablonun interaural koordinatları tüm dizinin implantasyon koordinatlarını hesaplamak için kullanılabilir. Dizi farklı uzunluklarda demetleri olduğunda, en uzun telin interaural koordinatı, interaural sıfırı ayarlamak için kullanılacak en uygun olandır. - Elektrot tutucuları stereotaksik mikromanipülatörden ayırın ve montajları (elektrot tutucuya bağlı elektrot) ultraviyole ışık (UV) dolabında en az 2 saat sterilize edin.
- Stereotaksik bir sonda tutucuya 24 G iğne takın, mikromanipülatöre bağlayın ve iğnenin ucu için interaural koordinatları ayarlayın.
NOT: Ameliyattan önce, tüm kraniotomilerin koordinatları, dizinin hedef implantasyon bölgesinin anteroposterior (AP) ve mediolateral (ML) konumundan 200 μm2 daha büyük bir çevre olarak önceden tanımlanmalıdır. Kafatasındaki kraniyotomilerin sıfır interaural koordinatlarına göre konumunu belirlemek için 24 G iğne sondası tutucu montajını kullanın. - Prob tutucuyu mikromanipülatörden ayırın ve montajı uv kabininde en az 2 saat sterilize edin.
- 6−8 titanyum veya paslanmaz çelik vidaları toplayın. Lehim yarısına bir zemin tel.
- Ameliyat için gerekli olan tüm geri kalan aletleri, ekipmanları ve tek kullanımlık malzemeleri organize edin ve sterilize edin.
2. Ameliyat öncesi işlemler
NOT: Bu çalışmada 320-370 g ağırlığında iki yetişkin erkek marmoset(Callithrix jacchus)kullanılmıştır. Anestezi indüksiyonundan önce hayvanın 6 saat boyunca yemek yemediğinden emin olun.
- Salivasyon ve bronşiyal salgıları azaltmak için atrofin (0.05 mg/kg) bir intramüsküler enjeksiyon ile hayvan anestezi. Pedal yanıtlarının eksikliğini kontrol edin.
- 5 dk sonra ketamin (10−20 mg/kg) intramüsküler olarak uygulayın.
- Elektrikli berber makasını kullanarak hayvanın kafasını tıraş edin.
- Tramadol (2 mg/kg) intramüsküler olarak genel analjezik olarak uygulayın.
- Hayvanı entübe et.
- Bir maske kullanarak, marmoset iğofluran için maruz 1−2% oksijen bir akış hızı ile 1−5 L/dk derin anestezi indüklemek için. Hayvan derinden anestezi aldığında, isofluran'ı 1−3 L/dk'ya düşürün ve koruyun.
- Bantile cerrahi tabloya elastik bir bant takın.
- Marmoset'i başı teknisyene doğru kafayla bir supine pozisyonda yerleştirin ve elastik bandı marmosetin ağzına, kanlarının arkasına yerleştirin.
NOT: Başın sırt yüzeyinin zemine, yüzünün teknisyene doğru dönük olması için konumlandırmak en iyisidir. - Pamuk uçlu bir sonda kullanarak, bez marmoset dilini kuru, ve ağız açık tutmak için bir elinde kavramak.
- Sprey 10% lidokain endotrakeal tüp ucunda.
- 4.0 cm işareti trakeanın girişinde olana kadar 2,0 mm çapındaki endotrakeal tüpü trakeanın içine yerleştirin.
- 40 nefes/dk'ya ayarlanmış yapay ventilatör ile tüpü anestezi tertibatına takın ve göğsün düzgün genişlemesini ve kasılmasını onaylayın.
NOT: Şu anda isoflurane ve oksijen endotrakeal tüp yoluyla değil, maske ile teslim edilmelidir. - Endotrakeal tüp çeneye bantlanabilir böylece marmoset ağzından elastik bant çıkarın.
- Marmosetstereotaksik çerçeve doğrultusunda eğilimli bir konumda marmoset yerleştirin ve stereotaksik çerçeve içine hayvanın başını düzeltmek.
- İlk olarak, sağ kulak çubuğunun ucunu hayvanın sağ işitsel kanalına takın.
- Daha sonra sol kulak çubuğunun ucunu sol işitsel kanala takın.
- Hayvanın kafasını stereotaksik çerçevenin ortasına ortala ve kulak çubuklarını yerinde sabitle.
- Ağızlığı hayvanın ağzına takın ve hayvanın damak zevkine dokunacak şekilde yüksekliğini ayarlayın. Aynı zamanda, orbital kemiğin alt yüzeyinde yörünge çubukları konumlandırın.
- Orbital kemiğin alt yüzeyinin kulak çubuklarının merkeziyle yatay olarak hizalandığından emin olun.
- Taşınabilir bir darbe oksimetresini marmoset'in eline bağlayın. Ameliyat süresince kalp hızının 154−180 atım/dak (bpm) içinde olduğundan emin olun; genellikle 200 bpm üzerinde bir kalp hızı hayvan uyanıyor anlamına gelir. Oksijen doygunluğu %95'in üzerinde olduğundan emin olun. Bazen zarar görmeden %90'a düşebilir.
NOT: Kalp hızı 154 bpm'nin altına düşerse, isoflurane azaltın. - Homeothermic Isıtma yastığına bağlı rektal sıcaklık sondasını anüse yerleştirin ve istenilen sıcaklık 37 °C'ye ayarlayın. Sabit tutmak için bu sensörü kuyruğuna bantlayın.
- Gözlere steril oftalmik yağ uygulayın.
- Bir cerrahi alan ile hayvan kapsayan önce klorheksidin ve povison iyot ile hayvanın başını temizleyin ve dezenfekte.
NOT: Aşağıdaki tüm cerrahi işlemleri aseptik koşullarda gerçekleştirin.
3. Cerrahi prosedürler
- Yerel analjezik subkutan (örneğin, lidokain 20 mg/mL, 0.1 mL) istenilen kesi yerinde uygulayın. Kafa derisinin orta hattında bir kesi yapın.
- Kafatasının yüzeyini ortaya çıkar ve hazırlayın.
- Temporal kası kafatasından dikkatlice ayırın. İlk olarak, kafatası içine sokulması nda fasya kesmek için bir neşter kullanın. Sonra, yavaşça bir periosteal raspatory kullanarak kafatası temporal kas ayırın.
- Periosteal raspatory kullanarak tüm maruz kranium gelen periost çıkarın.
- Gerekirse steril pamuklu bir bezle kanamayı kontrol edin.
- Kemik yüzeyini hidrojen peroksitle temizleyin.
- Kemik yüzeyine sığ çapak delikleri ile köşelerini işaretleyerek kraniyotominin yerini belirleyin. Daha sonra, maksimum hızda bir diş matkap kullanarak kraniyotomi nin çevresini delin (yani, 350.000 rpm). Aşırı ısınmayı önlemek için delme sırasında kafatası üzerinde steril tuzlu birkaç damla ekleyin. Kraniyotominin konumunu ve elektrot implantının koordinatlarını interaural koordinatlara göre ölçün.
- İmplant kafatasına vida lar.
- Kafatasına 6−8 vida deliği delin.
- Vidaları, her zemin teli erimiş vidanın, değiştirilmemiş bir vidaya bitişik ve yakınında olacak şekilde (yani, bir zemin teli bağlı olmadan) yerleştirin.
- Rüzgar bitişik, değişmemiş vida etrafında her zemin tel.
- Zemin tel ve her vida arasında gümüş boya bir damla ekleyin.
- Konisli uçlu çifenler kullanarak kraniyotominin merkezindeki kemiği çıkarın (örneğin, McPherson forceps). Dura mater steril salin ile sulu tutun.
- Dura mater'ı çıkarın. Dura mater'in yüzeyini beyin yüzeyinden çıkarmak ve kaldırmak için yaklaşık 90° eğimli steril bir hipodermik iğne (25 veya 26 G) kullanın. Sonra, mikrosk ile dura mater kesti. Maruz kalan beyni tuzlu suyla nemlendirin.
NOT: Önemli dural kanama gözlenirse, trombin25'ebatırılmış katutery veya steril emici jelatin süngerler kullanın. - İmplant mikroelektrot dizileri.
- Sterilize elektrot tutucuyu ve elektrot dizisini stereotaksik mikromanipülatöre takın.
- Mikromanipülörü elektrotun istenilen anteroposterior ve mediolateral koordinatlarda olması için konumlandırın.
- En uzun paketin ucu beyin yüzeyine değene kadar elektrot dizisini düşürün.
- Dorsoventral koordinatlara ulaşana kadar diziyi yavaşça beyin dokusuna yerleştirin.
- Steril küçük parçalar ile maruz korteks kapağı, emici jelatin süngerler.
- Elektrodu, maruz kalan kafatasına, bir vidaya ve elektrota dental akrilik uygulayarak kafatasına sabitle.
- Elektrot tutucuyu ayırın ve mikromanipülatörden çıkarın.
- Gerekirse ek dizilerle 3.7.
- Rüzgar birlikte ve ayrı diziler ve vidazemin teller kaynak. Bir elektrik bağlantısı elde edilmiş olduğundan emin olmak için kaynak etrafında bir köprü oluşturmak için gümüş boya kullanın.
- Diş akrilik kullanarak, dizilerin yanal ölçüde etrafında sağlam bir headcap yapmak, ve tamamen zemin telleri ve herhangi bir maruz kafatası ve vidalar kapsayacak.
- Gerekirse, başlık içine bir destek çubuğu takın. Bu bir pamuklu bez olanlar gibi sağlam bir plastik silindir olabilir. Diş akrilik ile yerine mühür.
NOT: Bu, elektrofizyoloji kablo konektörlerinin yerinde güvenliğinde yararlı olabilir, ancak kullanılan ekipmana bağlı olarak gereksiz olabilir. Mevcut yöntemde, benzer bir destek çubuğu baş aşamasına elastik bir bant konektörler üzerinde baş aşamalarını sağlam bir şekilde tutabilen şekilde yapıştırılır. - Başlığın etrafındaki deriyi dikin.
4. Ameliyat sonrası iyileşme
- Yaranın etrafına antiseptik solüsyon (örn. klorheksidin) uygulayın.
- Isoflurane kaynağı kapatın ama oksijen değil ve stereotaksik çerçeve hayvan kaldırın.
- Endotrakeal tüp aracılığıyla muhafaza oksijen ile ısıtma yastığı üzerine hayvan yerleştirin.
- Laringospazmlar gibi nörojenik reflekslerin ilk belirtileri gözlendiğinde endotrakeal tüpü çıkarın.
- Hayvan koruyucu refleksler, postural ton gibi anestezik iyileşme net belirtileri sunana kadar bir maske ile oksijen tedarik tutun ve ambulate çalışır.
- Hayvanı ev kafesine taşımadan önce 24−48 saat boyunca temiz bir kafesin içine yerleştirin. Her bir hayvanı ayrı ayrı barındırın.
NOT: Marmoset kafes duvarlarına tırmanmaya eğilimli olduğundan, pürüzsüz duvarları ile bir kafes kullanmak veya hayvan düşmesini önlemek için pürüzsüz bir yüzey ile kafes duvarları kaplayın. - Ameliyattan sonraki ilk saat içinde, kafesin yan tarafına karşı sıkıntı veya koordinasyonsuz baş teması belirtileri izlemek için hayvan gözlemleyin.
- Antibiyotikler (örneğin, enrofloksasin 5 mg/kg, subkutan olarak, günde bir kez 5−7 gün), analjezikler (örn. oral tramadol 1 mg/kg, her 8 saat 3−5 gün) ve anti-inflamatuar ilaçlar (örn. dexamethason 0.5−1.5 mg/kg, subkutan, günde bir kez 1−3 gün) .
NOT: Başarılı bir ameliyattan sonra hayvanlar 3−5 gün içinde tamamen iyileşirler.
5. Serbestçe davranan marmosets kronik elektrofizyolojik kayıtlar
- Ameliyattan en az 1 hafta sonra elektrofizyolojik kayıt seansları başlatın.
NOT: En az 1 ay boyunca tüm deneysel işlemlere başlamadan önce hayvanları araştırmacı ya da deneysel ortamlara hazır hale getirmek. - Her seansın başında, isofluran (1−5 L/dk, %1 O2)kullanarak hayvanı hafifçe anestezi edin.
NOT: Küçük primatların sedasyonu ile ilgili ilgili kurumun yönergelerine uyun. Kayıt seansları çok sık sayılsa, kabloların anestezi olmadan bağlanabilmesi için kullanılacak hayvanları alışkanlık haline getirmek. - Elektrot dizilerini ticari bir sinirsel kayıt sistemine bağlayın.
- Hayvanı deney odasına yerleştirin.
NOT: Burada kullanılan deney odası, spontan motor aktivitesinin miktarını ve desenini değerlendirmek üzere tasarlanmış kübik akrilik kutudur (0,45 m x 0,45 m x 0,45 m)26,27. - Hayvanın anesteziden tamamen iyileştiğinden emin olmak için kayıtlara başlamadan önce 30 dakika bekleyin.
NOT: Isoflurane hızlı sedasyon ve uyandırma sağlayan hızlı bir başlangıç ve ofset eylem vardır28. Isofluran emdiri kapatıldıktan sonra hayvan uyanmaya başlar. Hayvan dik pozisyonda kaldığında uyanıktır ve düşmeden deneysel odada serbestçe ambulate olabilir. Bu işlem 15 dakikadan az sürer. Herhangi bir yatıştırıcı etkisi olmamasını sağlamak için, izofluran kesildikten sonra kayıtları 30 dk başlar. - Mikroelektrot dizilimi implantlarının pozisyonunu nissl boyama ile doğrulayın ve dokuyu onardıktan sonra29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmanın amacı, ortak marmoset elektrofizyolojik kayıtlar için mikroelektrot dizilerinin implantasyonu için stereotaksik nöroşirürjik bir prosedürü tanımlamaktır. Tipik bir ameliyat (anestezi indüksiyonundan anestezi iyileşmesine kadar) implante edilen dizi sayısına bağlı olarak yaklaşık 5−7 saat sürer. Burada, simetrik olarak implante edildi, her beyin yarımküresinde bir tane. Her dizi, bazal ganglia-kortikohalamik devrenin çeşitli yapılarını hedefleyen yedi demet halinde düzenlenmiş 32 paslanmaz çelik mikrotel içeriyordu(Şekil 1),ancak elektrot tasarımı ve hedeflenen beyin bölgeleri Deney. Başarılı cerrahi ve postoperatif işlemlerden sonra hayvan 3−5 gün içinde tamamen iyileşmiş olmalıdır. Dizi topraklanmış ve düzgün implante edilmişse, olgun gliotikbir yara izi kurulmadan önce, birkaç hafta veya ay boyunca serbestçe davranan hayvanlarda ani (Şekil 2A) ve yerel alan potansiyellerini (Şekil 2B) kaydetmek mümkün olacaktır. 13,30. Örnek olarak, burada açıklanan deneysel paradigmada toplanan elektrofizyolojik veriler, spontan, yer tabanlı sırasında bazal ganglia-kortikokarik devrenin farklı bölgelerinin eşzamanlı aktivitesini incelemek için etkin bir şekilde kullanılmıştır. Parkinson hastalığı26bir modelde hareket .
Son olarak, başarılı bir ameliyat da hedeflenen yapılariçine dizileri implanting içerir. Ameliyat sonrası ve deneysel kayıtlara başlamadan önce MRG veya tomografi gibi non-invaziv görüntüleme metodolojileri yapılabilir. Bu tür bir metodolojinin kullanımı, ancak kullanılan spesifik implantların bu tekniklerle uyumlu olarak üretilmesi ve araştırmacının uygun küçük hayvan ekipmanlarına erişimi varsa mümkün olacaktır. Nihai onay da postmortem yapılabilir. Elektrot parçaları içeren Nissl lekeli kesitler, implante edilen her mikrotelin konumunu tam olarak belirlemek için kullanılabilir(Şekil 3). Koronal kesitlerde elektrot izleri dokuda gözyaşı olarak görünür dikkat edin. Bu nedenle, yorumla şaşılacak eserler oluşturma olasılığını azaltmak için bölümleme yapıldığında aşırı özen kullanılmalıdır.
Şekil 1: Küçük primatlarda implantasyon için mikroelektrot dizisi. Dizi 32 paslanmaz çelik mikrotellerden oluşuyordu. Teller 50 μm çapında ydı ve aşağıdaki alanlara ulaşmayı amaçlayan yedi demet halinde düzenlenmiştir: primer motor korteks (M1), putamen (Put), kositat (Cd), globus pallidus (GPe), ventrolateral ve ventroposterior lateral talamik çekirdek (VPL) ve subtalamik çekirdek (STN). Her paketteki elektrot aralığı 300 μm idi. Paketler arası aralık her beyin bölgesinin hedef koordinatlarına bağlıdır. Mikroelektrot dizi tasarımı ve üretimi hakkında daha ayrıntılı bilgi Nicolelisbulunabilir 31, Lehew ve Nicolelis32, ve Dizirasa veark. 33. Ölçek çubuğu = 5 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Başarılı bir ameliyat sonrası elektrofizyolojik sonuç. Sol panel, bir elektrottan kaydedilen iki nöronun (sarı ve yeşil dalga formları) ani aktivitesini gösterir. Sağ panel, 14 elektrottan kaydedilen yerel alan potansiyelini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Nissl lekeli doku bölümü bir elektrot izi gösteren. Bu bölüm (anteroposterior koordinat, interaural çizgigöre: +8.0, Paxinos ve Watson34tarafından atlas göre) Putamen de ucu ile bir elektrot parça tasvir, siyah üçgen tarafından belirtildiği gibi. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, marmoset beyninde mikroelektrot kayıt dizilerinin implantasyonunda yer alan prosedürlerin ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır. Aynı protokol, diğer küçük primatlarda ev yapımı veya ticari olarak mevcut olsun, elektrotlar implante ederken kolayca kullanılabilir. Ayrıca, kolayca beyin yapılarının hassas hedefleme gerektiren diğer deneysel biter için adapte edilebilir. Bu nedenle, bu protokol stereotaksik koordinatlar ve kranial sondaj teknikleri ile ilgili kasıtlı olarak belirsizdir, çünkü bunlar en çok farklılık gösterebilecek hususlardır. Örneğin, bu ameliyatta kullanılan dizileri yerleştirmek için, kraniyotomiler her yarımkürede uygun büyüklükte iki pencere açmak için yapıldı. Ancak, kılavuz kanüller gibi sağlam, bireysel yapılar implante ederken, ne bu ne de durektomi gereklidir. Bunun yerine, dura seviyesine basit bir çapak delik yeterli olacaktır. Benzer şekilde, elektriksel olmayan implantlar söz konusu olduğunda vidaların topraklanmalarına gerek yoktur. Böylece cerrahi protokolde 3.9. Bunun yerine, diş akrilik sadece maruz kafatası, implant ve vidakapsayacak şekilde kullanılabilir.
Stereotaksik nöroşirürji özel deneysel hedefi ne olursa olsun, verilen prosedürün başarılı uygulanması büyük ölçüde iyi cerrahi uygulamalar etrafında döner. Bu da ameliyat sonrası enfeksiyonları önlemek için ameliyatıa aseptik koşullarda yapılabilmesi için sıkı protokollerin izlenmesi gerektiği anlamına gelir35. En kritik anlardan bazıları anesteziyi indükleme ve çıkarmadır. Bu nedenle hayvanın hayati belirtileri (kalp hızı, kan oksijen doygunluğu ve vücut ısısı) tüm cerrahi işlem36boyunca izlenmesi esastır. Oksijen doygunluğu eşzamanlı bir düşüş ile kalp hızında bir azalma oluşursa, göğüs şişirme ve normal söndürme olduğunu teyit, aksi takdirde solunum makinesine bağlantı hatalı olabilir. Kalp hızı ve oksijen doygunluğu kurtarmak için denemek için yapılabilir ilk şey izofluran konsantrasyonunu azaltmaktır. Bu sorunu çözmezse, atropin kalp hızını artırmak ve hayvan stabilize etmek için girişimi intramusküler olarak verilebilir. Bu son derece ihtiyatlı yapılmalıdır, çünkü önceki deneyimler yeterli isofluran olmadan 200 bpm'nin üzerindeki bir kalp hızının hayvanı uyandıracağını göstermektedir.
Kemirgenlerin aksine primatlarda tüm koordinatlar genellikle interaural koordinata göre ölçülür, bregma ve lambda34değil. Bu nedenle, stereotaksik cihazda hayvanın başını sabitlemeden önce elektrot dizilerinin ve diğer probların interaural sıfır koordinatlarını ölçmek önemlidir. Ayrıca, marmosets yatay düzlem orbital kemik alt marjı ve dış işitsel meatus merkezi geçen düzlem olarak tanımlanır. Bu nedenle, stereotaksik çerçeve içinde baş sabitleme önce kulak çubuklarının merkezi ile orbital kemiğin alt yüzeyi hizalamak önemlidir. Ayrıca, marmoset temporal kasları kafatası geniş bir alanı kapsamaktadır. Bu nedenle, birçok sinirsel hedefler altında veya bu kas çok yakın yapılması için kraniyotomi gerektirir. Bu kaslar marmoset iletişim iúlemi için önemli olduğundan38,cerrah yavaş ve dikkatli bir şekilde kafatası bu kas ayırmak gerekir hasarı en aza indirmek için.
Kemirgenler veya marmosetler içeren davranışsal çalışmalara aşina araştırmacılar serbestçe NHPs davranan elektrofizyoloji yaparken çeşitli sınırlamalar farkında olmalıdır. İlk olarak, mevcut düzenleme ve yüksek yoğunluklu diziler veya birden fazla dizi içeren diğerleri, bu ışık anestezi indükleyen uygun alışma sonra bile, kablo konektörleri takmak için gerekli olması muhtemeldir. Bu prosedür, NIH'nin ve diğer ülkelerin düzenleyici yönergeleri kapsamında iken, marmoset üzerindeki zihinsel ve fiziksel stresi azaltmak için tutumlu bir şekilde yapılmalıdır. Ayrıca, araştırmacı hayvan tamamen veri toplama başlamadan önce anestezi kurtarıldı sağlamak önemlidir, aksi takdirde anestezi veri39şaşırtmak olabilir . İlgili bir diğer sınırlama da kablonun fiziksel varlığıdır. Kablosuz kayıt çözümleri40kullanılabilir hale gelirken, daha yaygın kablolu seçenekleri hayvan üzerinde fiziksel bir kısıtlama empoze. Son olarak, kullanılan deneysel oda da marmoset için mevcut davranış aralığı nı kısıtlar. Kemirgenlerin aksine, marmosetler kullanılan deneysel odaya bağlı olarak mümkün olmayacak benzersiz davranışlar (örneğin, tırmanma) görüntüler.
Malzeme bilimi ve mühendisliğindeki gelişmeler yeni sinirsel arayüzlere yol açmaktadır41. Etkili nöroşirürjik prosedürler, bu el yazması nda açıklanan gibi, araştırmacılar marmosets bu yeni ve gelecek araçları uygulamak için izin verecektir. Moleküler biyoloji de eşzamanlı gelişmeler ile birlikte3,4,5, marmosets nörolojiönemli temel ve klinik soruların araştırılmasına izin potansiyeline sahip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar bernardo Luiz filme ve düzenleme ile teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Santos Dumont Enstitüsü (ISD), Brezilya Eğitim Bakanlığı (MEC) ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| 683 Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | 55-0000 | |
| Anesthesia Assembly | BRASMED | COLIBRI | |
| Barber Clippers | Mundial | HC-SERIES | |
| Dental Drill | Norgen | B07-201-M1KG | |
| Homeothermic Heating Pad and Monitor | Harvard Apparatus, Inc. | 50-7212 | |
| Marmoset Stereotaxic Frame | Narishige Scientific Instrument Lab | SR-6C-HT | |
| Patient Monitor and Pulse Oximeter | Bionet Co., Ltd | BM3 | |
| Stereotaxic Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | SM-15R | |
| Surgical Microscope | Opto | SM PLUS IBZ | |
| Instruments | |||
| Allis tissue forceps | Sklar | 36-2275 | |
| Alm Retractor, rounded point, 4x4 teeth | Rhosse | RH11078 | |
| Angled McPherson Forceps | Oftalmologiabr | 11301A | |
| Curved Surgial Scissors | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8422 | |
| Curved Tissue Forceps | Sklar | 47-1186 | |
| Delicate Dissection forceps | WPI | WP5015 | |
| Dental Drill Bit | Microdont | ISO.806.314.001.524.010 | |
| Essring Tissue Forceps | Sklar | 19-2460 | |
| FG 1/4 Dental Drill Bit | Microdont | ISO.700.314.001.006.005 | |
| Halsey Needle Holder | WPI | 15926-G | |
| Halstead Mosquito forceps | WPI | 503724-12 | |
| Hemostatic Forceps, Straight | Sklar | 17-1260 | |
| Jewler Forceps | Sklar | 66-7436 | |
| McPherson-Vannas Optathalmic microscissor, 3 mm point | Argos Instrumental | ARGOS-4004 | |
| Pereosteal Raspatory | Golgran | 38-1 | |
| Scalpal Handle | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8354 | |
| Screwdrivers | Eurotool | SCR-830.00 | |
| Sodering Iron | Hikari | 21K006 | |
| Surgical Scissor | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8400 | |
| Toothed forceps | WPI | 501266-G | |
| Disposables/Single Use | |||
| 1 ml sterile syringe with 26 G needle | Descarpack | 7898283812785 | |
| 130 cm x 140 cm surgical field, presterilized | ProtDesc | 7898467276344 | |
| 24G Needle, presterilized | Descarpack | 7898283812846 | |
| 50 cm x 50 cm surgical field, presterilized | Esterili-med | 110100236 | |
| Cotton Tipped Probes, Presterilized | Jiangsu Suyun Medical Materials Co. LTD | 23007 | |
| Cotton tipped Qutips | Higie Topp | 7898095296063 | |
| Electrode Array | Home made | ||
| Endotracheal tube without cuff, internal diameter 2.0 mm, outer diameter 2.9 mm | Solidor | 7898913077201 | |
| Tinned copper wire, 0.15 mm diameter | |||
| M1.4x3 Stainless steel screws | USMICROSCREW | M14-30M-SS-P | |
| Medical Tape | Missner | 7896544910102 | |
| Nylon surgical sutures | Shalon | N540CTI25 | |
| Scalpal Blade, presterilized | AdvantiVe | 1037 | |
| solder | Kester | SN63PB37 | |
| Sterile Saline 0.9% | Isofarma | 7898361700041 | |
| Sterile Surgical Gloves | Maxitex | 7898949349051 | |
| Sterile Surgical Gown | ProtDesc | 7898467281208 | |
| Surgical Gauze, 15 cm x 26 cm presterilized | Héika | 7898488470315 | |
| Gelfoam | Pfizer | ||
| Drugs/Chemicals | |||
| 0.25mg/ml Atropine | Isofarma | ||
| 10% Lidocaine Spray | Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda. | 7896676405644 | |
| 2.5% Enrofloxacino veterinary antibiotic | Chemitec | 0137-02 | |
| Dexametasona Veterinary Anti inflammatory | MSD | R06177091A-00-15 | |
| Hydrogen Peroxide | Farmax | 7896902211537 | |
| Isoflourane | BioChimico | 7897406113068 | |
| Jet Acrylic polymerization solution | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Jet Auto Polymerizing Acrylic | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Ketamine 10% | Syntec | ||
| Lidocaine and Phenylephrine 1.8 ml local anesthetic | SS White | 7892525041049 | |
| Povidone-Iodine solutiom | Farmax | 7896902234093 | |
| Riohex 2% surgical Soap | Rioquímica | 7897780209418 | |
| Silver Paint | SPI Supplies | 05002-AB | |
| Tramadol chloride 50 mg/ml | União Química | 7896006245452 | |
| Refresh gel (polyacrylic acid) | Allergan |
References
- Okano, H., Hikishima, K., Iriki, A., Sasaki, E. The common marmoset as a novel animal model system for biomedical and neuroscience research applications. Seminars in Fetal and Neonatal Medicine. 17 (6), 336-340 (2012).
- Harris, R. A., et al. Evolutionary genetics and implications of small size and twinning in callitrichine primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (4), 1467-1472 (2014).
- Kishi, N., Sato, K., Sasaki, E., Okano, H. Common marmoset as a new model animal for neuroscience research and genome editing technology. Development, Growth & Differentiation. 56 (1), 53-62 (2014).
- Sasaki, E. Prospects for genetically modified non-human primate models, including the common marmoset. Neuroscience Research. 93, 110-115 (2015).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Sasaki, E. Creating Genetically Modified Marmosets. The Common Marmoset in Captivity and Biomedical Research. , 335-353 (2019).
- Sato, K., et al. Generation of a Nonhuman Primate Model of Severe Combined Immunodeficiency Using Highly Efficient Genome Editing. Cell Stem Cell. 19 (1), 127-138 (2016).
- Sato, K., et al. Resequencing of the common marmoset genome improves genome assemblies and gene-coding sequence analysis. Scientific Reports. 5, 16894 (2015).
- Chaplin, T. A., Yu, H. H., Soares, J. G. M., Gattass, R., Rosa, M. G. P. A Conserved Pattern of Differential Expansion of Cortical Areas in Simian Primates. Journal of Neuroscience. 33 (38), 15120-15125 (2013).
- Mitchell, J. F., Leopold, D. A. The marmoset monkey as a model for visual neuroscience. Neuroscience Research. 93, 20-46 (2015).
- Brok, H. P. M., et al. Non-human primate models of multiple sclerosis: Non-human primate models of MS. Immunological Reviews. 183 (1), 173-185 (2001).
- Santana, M. B., et al. Spinal Cord Stimulation Alleviates Motor Deficits in a Primate Model of Parkinson's disease. Neuron. 84 (4), 716-722 (2014).
- Ribeiro, M., Santana, M. B., Araujo, M. Neuronal signal description after chronic stainless-steel microelectrode array implants in marmosets. , Available from: http://www.canal6.com.br/cbeb/2014/artigos/cbeb2014_submission_766.pdf (2014).
- MacDougall, M., et al. Optogenetic manipulation of neural circuits in awake marmosets. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1286-1294 (2016).
- Wakabayashi, M., et al. Development of stereotaxic recording system for awake marmosets (Callithrix jacchus). Neuroscience Research. 135, 37-45 (2018).
- Johnston, K. D., Barker, K., Schaeffer, L., Schaeffer, D., Everling, S. Methods for chair restraint and training of the common marmoset on oculomotor tasks. Journal of Neurophysiology. 119 (5), 1636-1646 (2018).
- Sedaghat-Nejad, E., et al. Behavioral training of marmosets and electrophysiological recording from the cerebellum. Journal of Neurophysiology. , (2019).
- Kringelbach, M. L., Owen, S. L., Aziz, T. Z. Deep-brain stimulation. Future Neurology. 2 (6), 633-646 (2007).
- Talakoub, O., Gomez Palacio Schjetnan, A., Valiante, T. A., Popovic, M. R., Hoffman, K. L. Closed-Loop Interruption of Hippocampal Ripples through Fornix Stimulation in the Non-Human Primate. Brain Stimulation. 9 (6), 911-918 (2016).
- Oddo, M., Hutchinson, P. J. Understanding and monitoring brain injury: the role of cerebral microdialysis. Intensive Care Medicine. 44 (11), 1945-1948 (2018).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical Deconstruction of Parkinsonian Neural Circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
- Hammer, D. X., et al. Longitudinal vascular dynamics following cranial window and electrode implantation measured with speckle variance optical coherence angiography. Biomedical Optics Express. 5 (8), 2823-2836 (2014).
- Komatsu, M., Kaneko, T., Okano, H., Ichinohe, N. Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Surgical Techniques for Chronic Implantation of Microwire Arrays in Rodents and Primates. , CRC Press/Taylor & Francis. (2008).
- Santana, M. B., et al. Spinal Cord Stimulation Alleviates Motor Deficits in a Primate Model of Parkinson's disease. Neuron. 84 (4), 716-722 (2014).
- Santana, M., Palmér, T., Simplício, H., Fuentes, R., Petersson, P. Characterization of long-term motor deficits in the 6-OHDA model of Parkinson's disease in the common marmoset. Behavioural Brain Research. 290, 90-101 (2015).
- Misra, S., Koshy, T. A review of the practice of sedation with inhalational anaesthetics in the intensive care unit with the AnaConDa device. Indian Journal of Anaesthesia. 56 (6), 518-523 (2012).
- Freire, M. A. M., et al. Distribution and Morphology of Calcium-Binding Proteins Immunoreactive Neurons following Chronic Tungsten Multielectrode Implants. PLOS ONE. 10 (6), 0130354 (2015).
- Budoff, S., et al. Astrocytic Response to Acutely- and Chronically Implanted Microelectrode Arrays in the Marmoset (Callithrix jacchus) Brain. Brain Sciences. 9 (2), 19 (2019).
- Dzirasa, K., Fuentes, R., Kumar, S., Potes, J. M., Nicolelis, M. A. L. Chronic in vivo multi-circuit neurophysiological recordings in mice. Journal of Neuroscience Methods. 195 (1), 36-46 (2011).
- Nicolelis, M. A. L., et al. Chronic, multisite, multielectrode recordings in macaque monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 11041-11046 (2003).
- Lehew, G., Nicolelis, M. A. L. State-of-the-Art Microwire Array Design for Chronic Neural Recordings in Behaving Animals. , CRC Press/Taylor & Francis. (2008).
- Paxinos, G., Watson, C., Petrides, M., Rosa, M., Tokuno, H. The Marmoset Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Science Publishing Co Inc. San Diego. (2012).
- Brown, M. J., Pearson, P. T., Tomson, F. N. Guidelines for animal surgery in research and teaching. American Journal of Veterinary Research. 54 (9), 1544-1559 (1993).
- Flecknell, P. A. Anaesthesia of Animals for Biomedical Research. British Journal of Anaesthesia. 71 (6), 885-894 (1993).
- Kurihara, S., et al. A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset (Callithrix jacchus). Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Boer, R. A., de Vries, A. M. O., Louwerse, A. L., Sterck, E. H. M. The behavioral context of visual displays in common marmosets (Callithrix jacchus). American Journal of Primatology. 75 (11), 1084-1095 (2013).
- Kudo, C., Nozari, A., Moskowitz, M. A., Ayata, C. The impact of anesthetics and hyperoxia on cortical spreading depression. Experimental Neurology. 212 (1), 201-206 (2008).
- Ghomashchi, A., et al. A low-cost, open-source, wireless electrophysiology system. 2014 36th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 3138-3141 (2014).
- Fu, T. M., Hong, G., Viveros, R. D., Zhou, T., Lieber, C. M. Highly scalable multichannel mesh electronics for stable chronic brain electrophysiology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), 10046-10055 (2017).
